JPH04187094A - キチン分解物の製造法 - Google Patents
キチン分解物の製造法Info
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- JPH04187094A JPH04187094A JP2319860A JP31986090A JPH04187094A JP H04187094 A JPH04187094 A JP H04187094A JP 2319860 A JP2319860 A JP 2319860A JP 31986090 A JP31986090 A JP 31986090A JP H04187094 A JPH04187094 A JP H04187094A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
本発明は１例えば腸内有用細菌の増殖因子、甘味料等と
して利用可能なキチン分解物の製造法に関し、更に詳し
くは特定の微生物が生産するキチン分解酵素を利用した
製造法に関する。
して利用可能なキチン分解物の製造法に関し、更に詳し
くは特定の微生物が生産するキチン分解酵素を利用した
製造法に関する。
「従来の技術」
従来、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン等のキチン分解物は、主として化学的方法に
より製造されている。例えば、ジ−Ｎ−アセチルキトビ
オースは、カニやエビの甲殻を原料として、濃塩酸で、
４０℃程度の条件下に、数時間加水分解した後、活性炭
カラムクロマトグラフィーで分離、精製することにより
調製されている。また、Ｎ−アセチルグルコサミンは、
カニやエビの甲殻を、濃塩酸で、１００℃程度の条件下
に、１時間程度加水分解し、得られたＤ−グルコサミン
塩酸塩を、無水酢酸でＮ−アセチル化する化学合成によ
って調製されている。
ルコサミン等のキチン分解物は、主として化学的方法に
より製造されている。例えば、ジ−Ｎ−アセチルキトビ
オースは、カニやエビの甲殻を原料として、濃塩酸で、
４０℃程度の条件下に、数時間加水分解した後、活性炭
カラムクロマトグラフィーで分離、精製することにより
調製されている。また、Ｎ−アセチルグルコサミンは、
カニやエビの甲殻を、濃塩酸で、１００℃程度の条件下
に、１時間程度加水分解し、得られたＤ−グルコサミン
塩酸塩を、無水酢酸でＮ−アセチル化する化学合成によ
って調製されている。
［発明が解決しようとする課題ｊ
しかしながら、上記酸加水分解によりキチン分解物を製
造する方法においては、濃塩酸等の強酸を用いなければ
ならず、しかも高温で反応させるため、特殊な装置が必
要であり、エネルギーコストもかかる。
造する方法においては、濃塩酸等の強酸を用いなければ
ならず、しかも高温で反応させるため、特殊な装置が必
要であり、エネルギーコストもかかる。
また、酸加水分解の場合、キチンの分解物は、単量体及
び種々のキチンオリゴ糖の混合物として得られるため、
例えばジ−Ｎ−アセチルキトビオースを単一の化合物と
して得るには、カラムクロマトグラフィーなどで精製し
なければならず、その収率は、キチン原料に対して約１
０％程度とがなり低い。
び種々のキチンオリゴ糖の混合物として得られるため、
例えばジ−Ｎ−アセチルキトビオースを単一の化合物と
して得るには、カラムクロマトグラフィーなどで精製し
なければならず、その収率は、キチン原料に対して約１
０％程度とがなり低い。
更に、酸加水分解すると、グルコシド結合の分解と同時
に脱アセチル化がおこるため、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンを得る場合には、加水分解した後に、Ｎ−アセチル化
反応を行なわなければならない。こうして製造されたＮ
−アセチルグルコサミンは、化学合成品であるため１食
品素材としては利用されていないのが現状である。
に脱アセチル化がおこるため、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンを得る場合には、加水分解した後に、Ｎ−アセチル化
反応を行なわなければならない。こうして製造されたＮ
−アセチルグルコサミンは、化学合成品であるため１食
品素材としては利用されていないのが現状である。
このため、化学的方法によらず、食品素材として利用可
能なキチン分解物を、収率よく、容易に製造する方法と
して、微生物が生産するキチン分解酵素を利用する方法
が種々報告されている。キチンを分解する微生物として
は、セラチア［５ｅｒｒａｔｉａｌ属（Ｍｏｎｒｅａｌ
、 Ｊ等、１９８５年）、ビブリオ属ｆＶｉｂｒｉｏｌ
属（内円等、１９７９年）、シュードモナスｉＰｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓｌ属（滝口等、１９８５年）、アニロモ
ナス（Ａｅｒｏａ＋ｏｎａｓｌ属（矢吹等、１９８３年
）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌ属（滝口等、 １９
８９年）等が今までに報告されている６ 本発明の目的は、自然界から今までに報告されていない
キチン分解能を有する微生物を検索し、この微生物の生
産するキチン分解酵素を利用して、食品素材として利用
可能なキチン分解物を収率よく製造する方法を提供する
ことにある。
能なキチン分解物を、収率よく、容易に製造する方法と
して、微生物が生産するキチン分解酵素を利用する方法
が種々報告されている。キチンを分解する微生物として
は、セラチア［５ｅｒｒａｔｉａｌ属（Ｍｏｎｒｅａｌ
、 Ｊ等、１９８５年）、ビブリオ属ｆＶｉｂｒｉｏｌ
属（内円等、１９７９年）、シュードモナスｉＰｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓｌ属（滝口等、１９８５年）、アニロモ
ナス（Ａｅｒｏａ＋ｏｎａｓｌ属（矢吹等、１９８３年
）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌ属（滝口等、 １９
８９年）等が今までに報告されている６ 本発明の目的は、自然界から今までに報告されていない
キチン分解能を有する微生物を検索し、この微生物の生
産するキチン分解酵素を利用して、食品素材として利用
可能なキチン分解物を収率よく製造する方法を提供する
ことにある。
「課題を解決するための手段」
本発明者らは、上記目的に沿って、キチンを効率的に分
解する菌株を各種のサンプルから検索した結果、土壌中
より分離したクロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｌ属に属する特定の微生物がキチン分解能
に優れており、その培養濾液をキチンに作用させると高
い収率でジ−Ｎ−アセチルキトビオースが生成され、ま
た、この微生物の菌体をシーＮ−アセチルキトビオース
に作用させるとＮ−アセチルグルコサミンが生成される
ことを見出し１本発明を完成するに至った。
解する菌株を各種のサンプルから検索した結果、土壌中
より分離したクロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｌ属に属する特定の微生物がキチン分解能
に優れており、その培養濾液をキチンに作用させると高
い収率でジ−Ｎ−アセチルキトビオースが生成され、ま
た、この微生物の菌体をシーＮ−アセチルキトビオース
に作用させるとＮ−アセチルグルコサミンが生成される
ことを見出し１本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明のキチン分解物の製造法は。
クロモバクテリウムｆｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌ属に属し、キチン分解能を有する微生物を、キチンを
含む培地で培養し、この培養物から調製した濾液成分及
び／又は菌体成分を、キチンに作用させることを特徴と
する。
ｌ属に属し、キチン分解能を有する微生物を、キチンを
含む培地で培養し、この培養物から調製した濾液成分及
び／又は菌体成分を、キチンに作用させることを特徴と
する。
以下、本発明について好ましい態様を挙げて更に詳細に
説明する。
説明する。
り０モバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌ属に属し、キチン分解能を有する微生物としては、本
発明者らが土壌中から分離したクロモバクテリウムｓｐ
、 Ｎ−４１（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｐ
、 Ｎ−４１１が好ましく利用される。この細菌の菌学
的性質は、次の通りである。
ｌ属に属し、キチン分解能を有する微生物としては、本
発明者らが土壌中から分離したクロモバクテリウムｓｐ
、 Ｎ−４１（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｐ
、 Ｎ−４１１が好ましく利用される。この細菌の菌学
的性質は、次の通りである。
ｆａ）形態
（１１細胞の形：がん菌
（２）細胞の大きさ： ０．５５Ｘ １．４μｍ（３）
運動性：あり （４）鞭毛：極単毛 （５）ダラム染色・陰性 （ｂｌ生育状態 （１１肉汁寒天平板培養 周辺が透明で中心が白色、扁
平で平滑で ありやや光沢１色素 を産生じない。
運動性：あり （４）鞭毛：極単毛 （５）ダラム染色・陰性 （ｂｌ生育状態 （１１肉汁寒天平板培養 周辺が透明で中心が白色、扁
平で平滑で ありやや光沢１色素 を産生じない。
（２）肉汁寒天斜面培養：全体がやや透明でコロニーが
明確で ない。
明確で ない。
（３）肉汁液体培養０表面発育無、培地全体が混濁する
。
。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化しない。
穿刺孔
に沿って生育す
る。
（５）リドマスミルク：酸性、ミルクを液化しない。
ｆｃｌ生理学的性質
ｉｌ＋硝酸塩の還元、陽性
（２）脱窒反応 陰性
ｉ３１ＭＲ反応：陽性
＋４１ＶＰテスト：陰性
（５）インドールの生成：陰性
（６）硫化水素の生成：陰性
（７）デンプンの加水分解：陽性
（８）クエン酸の利用：陽性
（９）無機窒素源：陰性
（１０）色素の生成・陰性
（１１）ウレアーゼ・陰性
（１２）オキシダーゼ・陽性
（１３）カタラーゼ：陽性
（１４）生育の温度範囲、１０〜３９℃（１５）生育の
ｐＨ範囲＝５．０〜９．０（１６）酸素に対する態度二
連性嫌気性（１７）糖類からの酸及びガスの生成の有無
（糖類） （酸の生成）（ガスの生成）Ｌ−アラビノ
ース −− 〇−キシロース − −Ｄ−グルコース
十 −（糖類） （酸の生成）（ガ
スの生成）ローマンノース ＋ −Ｄ−
フラクトース ＋ − Ｄ−ガラクトース − − 麦芽糖 −− ショ糖 − 乳糖 −− トレハロース −− 〇−ソルビット − Ｄ−マンニット −− イノジット − − グリセリン − デンプン − ｆｄｌ その他の諸性質 グルコン酸の酸化 陰性 エスクリンの分解：陰性 アルギニンの分解゛陰性 リジンの脱炭酸反応：陰性 オルニチンの脱炭酸反応：陰性 フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰性塩化ナトリウム
の耐性、６％塩化ナトリウム含有肉汁培地中で生 育しない シアン化カリウムの耐性：陰性 フォスファターゼ：陰性 ペクチナーゼ−陰性 レシチナーゼ・陰性 ゼラチンの液化、陰性 カゼインの分解：陰性 ＤＮａｓｅ：陰性 乳酸の酸化・陽性 シアン化水素の生成：陰性 ビブリオスタティック試薬２．４−ジアミノ−６，７−
ジイツブロビルブテリジンｆＯ／１２９１ に対する反
応性・陰性 ＧＣ含量： ６３．１ ｍｏ１％ 水閘は通性嫌気性のかん菌で、極単毛を有して運動性が
あり、オキシダーゼ及びカタラーゼが陽性で、グルコー
スから発酵により酸を生成する。
ｐＨ範囲＝５．０〜９．０（１６）酸素に対する態度二
連性嫌気性（１７）糖類からの酸及びガスの生成の有無
（糖類） （酸の生成）（ガスの生成）Ｌ−アラビノ
ース −− 〇−キシロース − −Ｄ−グルコース
十 −（糖類） （酸の生成）（ガ
スの生成）ローマンノース ＋ −Ｄ−
フラクトース ＋ − Ｄ−ガラクトース − − 麦芽糖 −− ショ糖 − 乳糖 −− トレハロース −− 〇−ソルビット − Ｄ−マンニット −− イノジット − − グリセリン − デンプン − ｆｄｌ その他の諸性質 グルコン酸の酸化 陰性 エスクリンの分解：陰性 アルギニンの分解゛陰性 リジンの脱炭酸反応：陰性 オルニチンの脱炭酸反応：陰性 フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰性塩化ナトリウム
の耐性、６％塩化ナトリウム含有肉汁培地中で生 育しない シアン化カリウムの耐性：陰性 フォスファターゼ：陰性 ペクチナーゼ−陰性 レシチナーゼ・陰性 ゼラチンの液化、陰性 カゼインの分解：陰性 ＤＮａｓｅ：陰性 乳酸の酸化・陽性 シアン化水素の生成：陰性 ビブリオスタティック試薬２．４−ジアミノ−６，７−
ジイツブロビルブテリジンｆＯ／１２９１ に対する反
応性・陰性 ＧＣ含量： ６３．１ ｍｏ１％ 水閘は通性嫌気性のかん菌で、極単毛を有して運動性が
あり、オキシダーゼ及びカタラーゼが陽性で、グルコー
スから発酵により酸を生成する。
このような性質についてパージエイズマニュアル・才ブ
・システマチック・バイオテクノロジー（１９８４１に
より検索すると、ビブリオ属、アエロモナス属、プレジ
オモナス属、クロモバクテリウム属が該当する。
・システマチック・バイオテクノロジー（１９８４１に
より検索すると、ビブリオ属、アエロモナス属、プレジ
オモナス属、クロモバクテリウム属が該当する。
しかし、その他の性質について水閘とこれらの属とを比
較すると、ビブリオ属とは、６％塩化ナトリウムの耐性
がなく、ビブリオスタティック試薬（０／１２９ ）に
感作しない点で異なる。また、アエロモナス属とは、イ
ンドールの生成、Ｄ−グルコースよりガスの生成、Ｄ−
マンニットの発酵、ＤＮａｓｅが陰性である点が異なる
。更に、プレジオモナス属とは、ビブリオスタティック
試薬１０／１２９）に感作せず、インドールを生成しな
い点で異なる。
較すると、ビブリオ属とは、６％塩化ナトリウムの耐性
がなく、ビブリオスタティック試薬（０／１２９ ）に
感作しない点で異なる。また、アエロモナス属とは、イ
ンドールの生成、Ｄ−グルコースよりガスの生成、Ｄ−
マンニットの発酵、ＤＮａｓｅが陰性である点が異なる
。更に、プレジオモナス属とは、ビブリオスタティック
試薬１０／１２９）に感作せず、インドールを生成しな
い点で異なる。
更に、検索を行なうと、水閘は、上記性質の他に、 ｐ
Ｈ５より下で生育できない、乳酸を酸化してＣＯ□を生
成する、硝酸塩を還元する、クエン酸を資化する、ＧＣ
含量が６３．１ ｍｏ１％である等の性質を有している
ことから、クロモバクテリウム属に類似する。水閘は、
クロモバクテリウム属の特徴である紫色色素を生成しな
いが、パージエイズマニュアル・才ブ・システマチック
・バイオテクノロジー（１９８４）には、クロモバクテ
リウム属の中にも色素非生産菌があることが記載されて
いる。このような理由から、水閘は、クロモバクテリウ
ム属に属する細菌であると同定した。
Ｈ５より下で生育できない、乳酸を酸化してＣＯ□を生
成する、硝酸塩を還元する、クエン酸を資化する、ＧＣ
含量が６３．１ ｍｏ１％である等の性質を有している
ことから、クロモバクテリウム属に類似する。水閘は、
クロモバクテリウム属の特徴である紫色色素を生成しな
いが、パージエイズマニュアル・才ブ・システマチック
・バイオテクノロジー（１９８４）には、クロモバクテ
リウム属の中にも色素非生産菌があることが記載されて
いる。このような理由から、水閘は、クロモバクテリウ
ム属に属する細菌であると同定した。
次に、種について検討すると、水閘は、紫色色素の生成
、シアン化水素の生成、ゼラチンの液化、卵黄反応、カ
ゼインの分解、アルギニンの分解、トレハロース及びデ
ンプンからの酸の生成がいずれも陰性であり、ＭＲテス
トが陽性であることから、クロモバクテリウム・ビオラ
セウムとは異なり、また、色素を生成せず、４℃で生育
せず、３０℃以上で生育し、ＧＣ含量が異なる等の点か
ら、クロモバクテリウム・フラビアタイルとも、 異な
る。したがって、水閘は、クロモバクテリウム属に属す
る新種であると判断され、本発明者らは、本菌株をクロ
モバクテリウムｓｐ、Ｎ−４１（Ｃｈｒｏ＋ｍｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｗ＋ ｓｐ、 Ｎ−４１１と命名した。本菌
株は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１１７７９号として寄託されている。
、シアン化水素の生成、ゼラチンの液化、卵黄反応、カ
ゼインの分解、アルギニンの分解、トレハロース及びデ
ンプンからの酸の生成がいずれも陰性であり、ＭＲテス
トが陽性であることから、クロモバクテリウム・ビオラ
セウムとは異なり、また、色素を生成せず、４℃で生育
せず、３０℃以上で生育し、ＧＣ含量が異なる等の点か
ら、クロモバクテリウム・フラビアタイルとも、 異な
る。したがって、水閘は、クロモバクテリウム属に属す
る新種であると判断され、本発明者らは、本菌株をクロ
モバクテリウムｓｐ、Ｎ−４１（Ｃｈｒｏ＋ｍｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｗ＋ ｓｐ、 Ｎ−４１１と命名した。本菌
株は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１１７７９号として寄託されている。
前述したように、今までに報告されているキチン分解能
を有する微生物は、セラチアｆＳｅｒｒａｔｉａｌ属、
ビブリオ属ｆＶｉｂｒｉｏｌ属、シュードモナスｉＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｌ属、アエロモナスｆＡｅｒｏ＋ｎ
ｏｎａｓｌ属、バチルスｆＢａｃｉｌｌｕｓｌ属等であ
るが、クロモバクテリウム属に属するキチン分解能を有
する微生物についての報告はない。
を有する微生物は、セラチアｆＳｅｒｒａｔｉａｌ属、
ビブリオ属ｆＶｉｂｒｉｏｌ属、シュードモナスｉＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｌ属、アエロモナスｆＡｅｒｏ＋ｎ
ｏｎａｓｌ属、バチルスｆＢａｃｉｌｌｕｓｌ属等であ
るが、クロモバクテリウム属に属するキチン分解能を有
する微生物についての報告はない。
本菌株の分離は以下のようにして行なった。すなわち、
土壌試料を、１．０％コロイドキチンと、０．１％にＨ
，ＰＯ４と、００２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０とを含む液
体培地に添加し、３０℃で、２４時間振盪培養した後、
菌が生育したものについて、上記と同様の培地に寒天を
２％添加した平板培地に塗布し、３０℃で、７２時間培
養し、コロイドキチンが溶解してできる透明環が大きい
コロニーを採取した８更に、同様な培地を用いて培養を
繰り返し、目的とする微生物を純化した。
土壌試料を、１．０％コロイドキチンと、０．１％にＨ
，ＰＯ４と、００２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０とを含む液
体培地に添加し、３０℃で、２４時間振盪培養した後、
菌が生育したものについて、上記と同様の培地に寒天を
２％添加した平板培地に塗布し、３０℃で、７２時間培
養し、コロイドキチンが溶解してできる透明環が大きい
コロニーを採取した８更に、同様な培地を用いて培養を
繰り返し、目的とする微生物を純化した。
本発明で用いる微生物は、上記方法により分離されたも
のに限らず、クロモバクテリウム属に属し、キチン分解
能を有するものであれば、自然界から分離した菌、寄託
機関の保存菌株、あるいはキチン分解能を高めるために
変異させた菌株等、いずれの菌株であってもよい。
のに限らず、クロモバクテリウム属に属し、キチン分解
能を有するものであれば、自然界から分離した菌、寄託
機関の保存菌株、あるいはキチン分解能を高めるために
変異させた菌株等、いずれの菌株であってもよい。
次に、上記微生物の培養方法について説明すると、培地
としては、キチンと、その他の栄養源とを含む液体培地
が好ましく採用される。キチンとしては、コロイドキチ
ンが好ましく用いられる。
としては、キチンと、その他の栄養源とを含む液体培地
が好ましく採用される。キチンとしては、コロイドキチ
ンが好ましく用いられる。
コロイドキチンは、エビやカニの甲殻を塩酸やアルカリ
で処理し、得られた粗キチンを冷塩酸に溶解させた後、
多量の水に分散させることにより調製することができる
。培地中におけるコロイドキチンの濃度は、１１口〜１
０．０％とするのが好ましい、その他の栄養源としては
、例えば窒素源、無機塩などが用いられる。窒素源とし
ては、ペプトンを０．０１〜０，５％添加することが好
ましく、更に酵母エキスを０．Ｏ１〜０．５％添加する
のが好ましい、更に、無機塩トシテは、ＫＨ，ＰＯ，、
Ｍｇ５０４４ＨＪを添加するのが好ましく、必要に応じ
てＣａＣ１ｚを添加してもよい。培地のＰＨは、６〜８
に調整することが好ましい。培養は、振盪培養か、また
はジャーファーメンタ−を用いて行なうことが好ましく
、培養温度は２５〜３７℃の範囲が好ましく、培養時間
は１〜３日間が好ましい。
で処理し、得られた粗キチンを冷塩酸に溶解させた後、
多量の水に分散させることにより調製することができる
。培地中におけるコロイドキチンの濃度は、１１口〜１
０．０％とするのが好ましい、その他の栄養源としては
、例えば窒素源、無機塩などが用いられる。窒素源とし
ては、ペプトンを０．０１〜０，５％添加することが好
ましく、更に酵母エキスを０．Ｏ１〜０．５％添加する
のが好ましい、更に、無機塩トシテは、ＫＨ，ＰＯ，、
Ｍｇ５０４４ＨＪを添加するのが好ましく、必要に応じ
てＣａＣ１ｚを添加してもよい。培地のＰＨは、６〜８
に調整することが好ましい。培養は、振盪培養か、また
はジャーファーメンタ−を用いて行なうことが好ましく
、培養温度は２５〜３７℃の範囲が好ましく、培養時間
は１〜３日間が好ましい。
こうして培養した後、培養液を濾過、遠心分離等によっ
て濾液と菌体とに分離する。本発明では、この濾液と菌
体とを粗酵素としてキチン分解反応にそのまま利用する
ことができる。ただし、濾液は、更に透析、塩析、限外
濾過等によって精製して用いることもできる。また、菌
体は、リゾチームなとの溶菌酵素により溶解するか、又
は超音波破砕機などで破砕したものを用いることが好ま
しい。濾液中には、キチンを分解してジ−Ｎ−アセチル
キトビオースを生成するキチナーゼ活性が認められ、菌
体中には、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースを分解してＮ
−アセチルグルコサミンを生成するＮ−アセチルグルコ
サミニダーゼ活性（キチナ−ゼ活性）が認められる。本
発明では、上記の濾液及び／又は菌体から、公知の精製
手段によって、それぞれの活性画分を更に純粋に分離し
、精製した酵素を用いることもできる。したがって、本
発明における濾液成分及び／又は菌体成分とは、上記濾
液及び／又は菌体そのままでもよく、濾液及び／又は菌
体から調製された粗酵素でもよく、更には濾液及び／又
は菌体から分離、精製された純粋な酵素であってもよい
。
て濾液と菌体とに分離する。本発明では、この濾液と菌
体とを粗酵素としてキチン分解反応にそのまま利用する
ことができる。ただし、濾液は、更に透析、塩析、限外
濾過等によって精製して用いることもできる。また、菌
体は、リゾチームなとの溶菌酵素により溶解するか、又
は超音波破砕機などで破砕したものを用いることが好ま
しい。濾液中には、キチンを分解してジ−Ｎ−アセチル
キトビオースを生成するキチナーゼ活性が認められ、菌
体中には、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースを分解してＮ
−アセチルグルコサミンを生成するＮ−アセチルグルコ
サミニダーゼ活性（キチナ−ゼ活性）が認められる。本
発明では、上記の濾液及び／又は菌体から、公知の精製
手段によって、それぞれの活性画分を更に純粋に分離し
、精製した酵素を用いることもできる。したがって、本
発明における濾液成分及び／又は菌体成分とは、上記濾
液及び／又は菌体そのままでもよく、濾液及び／又は菌
体から調製された粗酵素でもよく、更には濾液及び／又
は菌体から分離、精製された純粋な酵素であってもよい
。
次に、キチンの分解反応について説明すると、キチンに
上記濾液成分を作用させてジ−Ｎ−アセチルキトビオー
スを生成する場合、基質としてはコロイドキチンが好ま
しく用いられ、コロイドキチンの濃度は１０〜ｌ０１０
％が好ましい。反応液中のキチナーゼ活性は、基質１ｇ
に対して１〜２０Ｕとすることが好ましい。反応条件は
、ｐＨ４〜８とし、温度３０〜６０℃で、２〜２４時間
行なうことが好ましい。反応液中には、ジ−Ｎ−アセチ
ルキトビオースが生成し、必要に応じて濃縮後、凍結乾
燥機、真空乾燥機、スプレードライヤーなどを用いて粉
末化することができる。
上記濾液成分を作用させてジ−Ｎ−アセチルキトビオー
スを生成する場合、基質としてはコロイドキチンが好ま
しく用いられ、コロイドキチンの濃度は１０〜ｌ０１０
％が好ましい。反応液中のキチナーゼ活性は、基質１ｇ
に対して１〜２０Ｕとすることが好ましい。反応条件は
、ｐＨ４〜８とし、温度３０〜６０℃で、２〜２４時間
行なうことが好ましい。反応液中には、ジ−Ｎ−アセチ
ルキトビオースが生成し、必要に応じて濃縮後、凍結乾
燥機、真空乾燥機、スプレードライヤーなどを用いて粉
末化することができる。
こうして得られたジ−Ｎ−アセチルキトビオースに上記
菌体成分を作用させると、Ｎ−アセチルグルコサミンを
生成させることができる。この場合、基質であるジ−Ｎ
−アセチルキトビオースの濃度は１．０〜２０％が好ま
しく、反応液中のキチナ−ゼ活性は基質１ｇ当たり１〜
１００とすることが好ましい１反応温度は２０〜５０℃
とし、反応時間は２〜２４時間とすることが好ましい。
菌体成分を作用させると、Ｎ−アセチルグルコサミンを
生成させることができる。この場合、基質であるジ−Ｎ
−アセチルキトビオースの濃度は１．０〜２０％が好ま
しく、反応液中のキチナ−ゼ活性は基質１ｇ当たり１〜
１００とすることが好ましい１反応温度は２０〜５０℃
とし、反応時間は２〜２４時間とすることが好ましい。
こうして得られたＮ−アセチルグルコサミンを含有する
反応液は、必要に応して濃縮後、凍結乾燥機、真空乾燥
機、スプレードライヤー等により乾燥して粉末化するこ
とができる。
反応液は、必要に応して濃縮後、凍結乾燥機、真空乾燥
機、スプレードライヤー等により乾燥して粉末化するこ
とができる。
上記反応においては、濾液成分や菌体成分を、適当な担
体に固定化して用いることもできる。また、キチンに濾
液成分と菌体成分とを同時に反応させてキチン分解物を
生成することもできる。更に、得られたキチン分解物を
、例えば活性炭カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、
高速液体クロマトグラフィーなどの分離・精製手段を組
合せて処理することにより、高純度に精製されたジ−Ｎ
−アセチルキトビオース及び／又はＮ−アセチルグルコ
サミンを得ることもできる。
体に固定化して用いることもできる。また、キチンに濾
液成分と菌体成分とを同時に反応させてキチン分解物を
生成することもできる。更に、得られたキチン分解物を
、例えば活性炭カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、
高速液体クロマトグラフィーなどの分離・精製手段を組
合せて処理することにより、高純度に精製されたジ−Ｎ
−アセチルキトビオース及び／又はＮ−アセチルグルコ
サミンを得ることもできる。
なお、本発明において、培養濾液のキチナーゼ活性、及
び菌体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性は、以下
のようにして測定した。
び菌体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性は、以下
のようにして測定した。
ｆｉｌ キチナーゼの活性測定
０．２％コロイドキチンを含む、ｐＨ５，２の０．２Ｍ
酢酸緩衝液１ＩｉＩ２に、試料（培養濾液） １ｍｌを
添加し、５０℃で、２０分間反応させる。次いで、反応
液に、シャール試薬３ｍβを添加し、沸騰温浴中で、１
５分間加熱する。冷却後、遠心分離して不純物を除去し
、４２０ｒ＋ｍの吸光度を測定する。この吸光度から、
生成した還元糖量を、Ｎ−アセチルグルコサミンを用い
た標準曲線より求める。１分間にＩｕａ＋ｏｌのＮ−ア
セチルグルコサミンを生成する酵素量を、酵素活性１単
位（Ｕ）とする。
酢酸緩衝液１ＩｉＩ２に、試料（培養濾液） １ｍｌを
添加し、５０℃で、２０分間反応させる。次いで、反応
液に、シャール試薬３ｍβを添加し、沸騰温浴中で、１
５分間加熱する。冷却後、遠心分離して不純物を除去し
、４２０ｒ＋ｍの吸光度を測定する。この吸光度から、
生成した還元糖量を、Ｎ−アセチルグルコサミンを用い
た標準曲線より求める。１分間にＩｕａ＋ｏｌのＮ−ア
セチルグルコサミンを生成する酵素量を、酵素活性１単
位（Ｕ）とする。
（２）Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（キトビオース
）の活性測定 ５ＩＩＩＭのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−ゲルコサミド０．２ＩＩＩＩ２と、ｐＨ７，０の０
．１Ｍリン酸緩衝液０．５１１１εと、試料（菌体破砕
液）０．３＋１２とを混合し、３７℃で、１０分間反応
させた後、０．２５Ｍ炭酸ナトリウム洛液２．０１１Ｅ
を添加して反応を停止し、４０５Ｅｍの吸光度を測定し
て、遊離したｐ−ニトロフェノールを定量する。１分間
に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量
を、酵素活性１単位（Ｕ）とする。
）の活性測定 ５ＩＩＩＭのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−ゲルコサミド０．２ＩＩＩＩ２と、ｐＨ７，０の０
．１Ｍリン酸緩衝液０．５１１１εと、試料（菌体破砕
液）０．３＋１２とを混合し、３７℃で、１０分間反応
させた後、０．２５Ｍ炭酸ナトリウム洛液２．０１１Ｅ
を添加して反応を停止し、４０５Ｅｍの吸光度を測定し
て、遊離したｐ−ニトロフェノールを定量する。１分間
に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量
を、酵素活性１単位（Ｕ）とする。
「作用・効果」
本発明によれば、今までに報告されていないクロモバク
テリウム属に属するキチン分解能を有する微生物を、キ
チンを含む培地で培養し、その培養物から調製された濾
液成分及び／又は菌体成分をキチンに作用させることに
より、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンなどのキチン分解物を高収率で製造すること
ができる。
テリウム属に属するキチン分解能を有する微生物を、キ
チンを含む培地で培養し、その培養物から調製された濾
液成分及び／又は菌体成分をキチンに作用させることに
より、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンなどのキチン分解物を高収率で製造すること
ができる。
こうして得られたキチン分解物は、微生物の生産する酵
素を利用して、比較的穏和な反応条件で製造されたもの
であるから、化学的方法によって分解したものと比べて
人体に対して安全であり、例えば腸内有用細菌の増殖因
子や、甘味料等として、食品分野、医薬品分野等におい
て自由に利用することができる。
素を利用して、比較的穏和な反応条件で製造されたもの
であるから、化学的方法によって分解したものと比べて
人体に対して安全であり、例えば腸内有用細菌の増殖因
子や、甘味料等として、食品分野、医薬品分野等におい
て自由に利用することができる。
「実施例」
参考例（培養濾液及び菌体破砕物の調製）前培養として
、ニュートリエンドブロス（デイフコ社製）０．８％溶
液１０ｍ℃を試験管に入れ、殺菌した後、クロモバクテ
リウムｓｐ、 Ｎ−４１を１白金耳摺種し、３０℃で、
１日間培養した。
、ニュートリエンドブロス（デイフコ社製）０．８％溶
液１０ｍ℃を試験管に入れ、殺菌した後、クロモバクテ
リウムｓｐ、 Ｎ−４１を１白金耳摺種し、３０℃で、
１日間培養した。
次に、本培養として、コロイドキチン２．５％、ペプト
ン０．１％、酵母エキス０．０５％、ＫＨ，ＰＯ４０，
１％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０２％を含有する液体
培地１βを、５２容フラスコに入れ、前培養終了液を接
種し、３０℃で、１日間振盪培養した。
ン０．１％、酵母エキス０．０５％、ＫＨ，ＰＯ４０，
１％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０２％を含有する液体
培地１βを、５２容フラスコに入れ、前培養終了液を接
種し、３０℃で、１日間振盪培養した。
得られた培ＩＩ液１！を、ＩＯ，［ｌ［１０回転で、
１０分間遠心分離して、培養濾液と、菌体とに分離した
。
１０分間遠心分離して、培養濾液と、菌体とに分離した
。
菌体は、水１００ｍ℃に懸濁し、卵白リゾチーム１００
ｍｇを添加し、水冷しながら１時間処理した。
ｍｇを添加し、水冷しながら１時間処理した。
次いて、この溶液を超音波破砕機で処理して菌体を完全
に破砕した後、水１００ｍＥを添加して、１２、（ｌｉ
）（１回転で、６０分間遠心分離して残渣を除去し、上
清を菌体破砕液とした。
に破砕した後、水１００ｍＥを添加して、１２、（ｌｉ
）（１回転で、６０分間遠心分離して残渣を除去し、上
清を菌体破砕液とした。
実施例１ （ジ−Ｎ−アセチルキトビオースの製造）
１０％コロイドキチン溶液２００ｇに、参考例で調製し
た培養濾液を、キチナーゼ活性で２００Ｕどなるように
添加し、５０°Ｃで、１２時間反応させた。
た培養濾液を、キチナーゼ活性で２００Ｕどなるように
添加し、５０°Ｃで、１２時間反応させた。
反応終了後、反応液の組成を、高速液体クロマトグラフ
ィーにより確認したところ、ジ−Ｎ−アセチルキトビオ
ースが検出された。この反応液を濃縮した後、凍結乾燥
してジ−Ｎ−アセチルキトビオースｌ１ｇを得た。
ィーにより確認したところ、ジ−Ｎ−アセチルキトビオ
ースが検出された。この反応液を濃縮した後、凍結乾燥
してジ−Ｎ−アセチルキトビオースｌ１ｇを得た。
なお、高速液体クロマトグラフィーの分析条件は下記の
とおりである。
とおりである。
カラム： ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＡ−０３１４，６Ｘ
２５０ｍｍｌ移動相 アセトニトリル、水＝７２：２８
流 速＝０８ｍβ／ｍｉｎ 温度３０℃ 検 出： ＵＶ ２１５ｒ＋＋ｎ 分析結果は第１図に示す６ 第１図において、ｌはＮ−アセチルグルコサミンの溶出
位置を示し、２はジ−Ｎ−アセチルキトビオースの溶出
位置を示す。第１図から、実施例２で得られた反応液は
、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースを主成分として含有す
ることがわかる。
２５０ｍｍｌ移動相 アセトニトリル、水＝７２：２８
流 速＝０８ｍβ／ｍｉｎ 温度３０℃ 検 出： ＵＶ ２１５ｒ＋＋ｎ 分析結果は第１図に示す６ 第１図において、ｌはＮ−アセチルグルコサミンの溶出
位置を示し、２はジ−Ｎ−アセチルキトビオースの溶出
位置を示す。第１図から、実施例２で得られた反応液は
、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースを主成分として含有す
ることがわかる。
また、１０％コロイドキチン溶液２００ｇ、すなわちキ
チン２０ｇから、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース１１ｇ
が得られ、収率が高いことがわかる。
チン２０ｇから、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース１１ｇ
が得られ、収率が高いことがわかる。
実施例２ （Ｎ−アセチルグルコサミンの製造）実施例
１で得られたジ−Ｎ−アセチルキトビオースｌＯｇを、
水１００ｍβに溶解した後、参考例で調製した菌体破砕
液を、Ｎ−アセチルグルコサミニターゼ活性として５０
Ｕとなるように添加し、３７℃で、２００時間反応せた
６ 反応終了後、反応液の組成を、実施例１と同様に高速液
体クロマトグラフィーで確認したところ、Ｎ−アセチル
グルコサミンが検出された。
１で得られたジ−Ｎ−アセチルキトビオースｌＯｇを、
水１００ｍβに溶解した後、参考例で調製した菌体破砕
液を、Ｎ−アセチルグルコサミニターゼ活性として５０
Ｕとなるように添加し、３７℃で、２００時間反応せた
６ 反応終了後、反応液の組成を、実施例１と同様に高速液
体クロマトグラフィーで確認したところ、Ｎ−アセチル
グルコサミンが検出された。
この反応液を濃縮した後、凍結乾燥して、Ｎ−アセチル
グルコサミンｌｏｇを得た。
グルコサミンｌｏｇを得た。
第１図はキチンに培養濾液を作用させた反応液の組成を
高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を示す
図である。 図中、１はＮ−アセチルグルコサミンの溶出位置、２は
ジ−Ｎ−アセチルキトビオースの溶出位置を示す。
高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を示す
図である。 図中、１はＮ−アセチルグルコサミンの溶出位置、２は
ジ−Ｎ−アセチルキトビオースの溶出位置を示す。
Claims (3)
- （１）クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属に属し、キチン分解能を有する微生物を、キ
チンを含む培地で培養し、この培養物から調製した濾液
成分及び／又は菌体成分を、キチンに作用させることを
特徴とするキチン分解物の製造法。 - （２）前記微生物がクロモバクテリウムｓｐ．Ｎ−４１
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｎ−４１）
である請求項１記載のキチン分解物の製造法。 - （３）前記キチン分解物がジ−Ｎ−アセチルキトビオー
ス及び／又はＮ−アセチルグルコサミンである請求項１
または２記載のキチン分解物の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2319860A JP3026312B2 (ja) | 1990-11-22 | 1990-11-22 | キチン分解物の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2319860A JP3026312B2 (ja) | 1990-11-22 | 1990-11-22 | キチン分解物の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04187094A true JPH04187094A (ja) | 1992-07-03 |
| JP3026312B2 JP3026312B2 (ja) | 2000-03-27 |
Family
ID=18115046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2319860A Expired - Fee Related JP3026312B2 (ja) | 1990-11-22 | 1990-11-22 | キチン分解物の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3026312B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101293107B (zh) | 2008-06-13 | 2012-05-30 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所 | 广谱生物杀菌性空气过滤材料的制备方法 |
| CN119220472A (zh) * | 2024-11-06 | 2024-12-31 | 中国科学技术大学先进技术研究院 | 一种将甲壳类废弃物转化为紫色杆菌素的新型资源化技术 |
-
1990
- 1990-11-22 JP JP2319860A patent/JP3026312B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101293107B (zh) | 2008-06-13 | 2012-05-30 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所 | 广谱生物杀菌性空气过滤材料的制备方法 |
| CN119220472A (zh) * | 2024-11-06 | 2024-12-31 | 中国科学技术大学先进技术研究院 | 一种将甲壳类废弃物转化为紫色杆菌素的新型资源化技术 |
| CN119220472B (zh) * | 2024-11-06 | 2025-09-02 | 中国科学技术大学先进技术研究院 | 一种将甲壳类废弃物转化为紫色杆菌素的新型资源化技术 |
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|---|---|
| JP3026312B2 (ja) | 2000-03-27 |
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