JPH08280396A

JPH08280396A - トレハロースの製造法

Info

Publication number: JPH08280396A
Application number: JP8846395A
Authority: JP
Inventors: Satoo Kubota; 悟夫窪田; Tadashi Wada; 正和田; Masahisa Oguchi; 真央大口; Takafumi Sano; 孝文佐野; Kazuo Oishi; 一男大石; Masaaki Yamagishi; 政昭山岸; Toshiya Ota; 俊也太田
Original assignee: Shizuoka Prefecture; Fuji Seito Co Ltd
Current assignee: Shizuoka Prefecture; Fuji Seito Co Ltd
Priority date: 1995-04-13
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 1996-10-29

Abstract

(57)【要約】【構成】シュードモナス属に属し、マルトースをトレ
ハロースに転換し得る能力を有する微生物の菌体又は菌
体処理物を、マルトースに作用させることを特徴とする
トレハロースの製造法。【効果】トレハロースを容易にかつ効率的に製造する
ことができ、またバイオリアクターを利用することによ
りトレハロースを安価に大量生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、トレハロース（Ｏ−α
−Ｄ−glucopyranosyl−（１→１）−α−Ｄ−glucopyr
anoside ）の製造法に関し、特に微生物の菌体又は菌体
処理物を用いてマルトースからトレハロースを製造する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、グルコース２分子がα
（１，１）結合した非還元性の二糖類で、天然界では昆
虫、酵母、カビ、細菌、担子菌、紅藻、地衣類、植物マ
ンナン、ワムシ、無脊椎動物、顕花植物等に広く分布し
ている。このトレハロースは、水分子が重なった構造と
類似しているため、生物体内では生命に不可欠な水の代
役となり、細胞やタンパク質、核酸等を乾燥や凍結から
守る生体保護機能及び天然保存剤としての機能を有して
いる。従って、トレハロースは、医薬品、診断薬、ホル
モン、受精卵、精子、生理活性物質、酵素、微生物等の
有用物質や食品保存剤として用いることができ、また化
粧品に加えることにより保水剤として用いることもでき
る。

【０００３】また、トレハロースはストレプトコッカス
ミュータンス（Streptococcus mutans）等の虫歯菌に
よる不溶性グルカンや酸を生成せず、ショ糖による不溶
性グルカンの生成を抑える等の抗うしょく性を有してい
る。そのうえ、砂糖に比べて甘味が低く、人体に吸収さ
れ難いため、トレハロースは低カロリー甘味料として有
効に用いることができる。さらに、トレハロースは、血
清や肝臓中のコレステロールの蓄積を抑える作用を有す
るとともに、腸内におけるビフィズス菌の増殖因子とし
ての生理活性機能も有しているため、それらの作用・機
能を利用した医薬品や健康食品が期待されている。

【０００４】従来、トレハロースの製造法としては、パ
ン酵母の天然物から抽出する方法、ノカルディア（Noca
rdia）属等に属する微生物を用いた発酵による方法、ブ
レビバクテリウム（Brevibacterium）属等に属する微生
物による培養法（特開平5-211882号公報）、ミクロコッ
カス（Micrococcus）属又はダイノコッカス（Deinococc
us）属に属する微生物による培養法（特開平6-319578号
公報）、ラクトバチルスブレビス（Lactobacillus br
evis）由来のマルトースフォスフォリラーゼ及びユーグ
レナグラチリス（Euglena gracilis）由来のトレハロー
スフォスフォリラーゼによりマルトースから生成する方
法（特開昭63-60998号公報）、α−グルコース−１−リ
ン酸及びグルコースにトレハロースフォスフォリラーゼ
を作用させてトレハロースを生成する酵素法（特開平6-
189779号公報）などが知られている。

【０００５】しかしながら、上記培養法においては、培
養液中のトレハロースの蓄積量は２％以下と少なく、ま
た上記酵素法においては、酵素の大量供給が困難であ
る、長期安定性に欠ける、酵素活性が低いなどの点で問
題があり、酵素をバイオリアクターとして用いてトレハ
ロースを連続的に大量生産するには適していなかった。
マルトースフォスフォリラーゼ及びトレハロースフォス
フォリラーゼを用いる特開昭63-60998号公報記載の発明
では、それらをバイオリアクターとして用いてマルトー
スからトレハロースを製造しているが、各酵素について
異なる複数の微生物を用いており、非常に煩雑であると
いう問題があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、トレ
ハロースを容易にかつ効率的に製造する方法、さらには
バイオリアクターを利用することによりトレハロースを
安価に大量生産できる方法を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者等は、マルトースをトレハロースまで
転換できる酵素を菌体内に有するシュードモナス属に属
する微生物の菌体又は菌体処理物を使用することによ
り、トレハロースを容易にかつ効率的に製造できるこ
と、及びその微生物の菌体又は菌体処理物をバイオリア
クターとして用いることにより、トレハロースを安価に
大量生産できることを見出し、本発明を完成した。

【０００８】即ち、本発明は、シュードモナス属に属
し、マルトースをトレハロースに転換し得る能力を有す
る微生物の菌体又は菌体処理物を、マルトースに作用さ
せることを特徴とするトレハロースの製造法である。ま
た、本発明は、前記微生物がシュードモナス sp.Ｆ−１
（Pseudomonas sp.F-1）であることを特徴とする、トレ
ハロースの製造法である。さらに、本発明は、前記微生
物の菌体又は菌体処理物を、夾雑妨害酵素抑制剤の存在
下にマルトースに作用させることを特徴とするトレハロ
ースの製造法である。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
用いる微生物は、シュードモナス属に属し、マルトース
をトレハロースに転換し得る能力を有する微生物であれ
ばいずれの菌株であってもよい。そのような菌株として
は、公知の菌でもよいし、新たに土壌、海水等から分離
した菌であってもよく、さらにはそれらの菌株に変異処
理等を施すことによりトレハロース合成能を向上させた
変異株であってもよい。好ましい菌株の具体例として
は、シュードモナス sp.Ｆ−１（Pseudomonas sp. F-
1）が挙げられる。

【００１０】シュードモナス sp.Ｆ−１（Pseudomonas
sp. F-1）は、本発明者らが新たに土壌より分離したト
レハロース合成能を有する菌株である。シュードモナス
sp.Ｆ−１（Pseudomonas sp. F-1）のスクリーニング
法の一例を以下に示す。菌株を含む土壌サンプルを滅菌
水に懸濁して適宜希釈し、それを好ましくはグルコース
寒天平板培地（グルコース0.5 ％、ペプトン0.5 ％、酵
母エキス0.3 ％及び寒天1.5 ％）に塗抹する。この培地
を30℃程度で約24時間保温し、生じたコロニーの内生育
のよい菌を寒天平板培地に釣菌し、単離する。次に、生
育した菌を、例えば液体培地（グルコース１％、ニュウ
トリエントブロス（DIFCO 社製）４％）て20時間程度振
とう培養を行い、培養液を遠心分離して菌体を回収す
る。この菌体に約１／20容量のトルエンを添加し、15秒
間程度激しく振とうする。

【００１１】この処理菌体にマルトースを加え、37℃程
度で約20時間反応させた後、遠心分離する。次いで、高
速液体クロマトグラフィーによって標準のトレハロース
とリテンションタイムが一致するピークが確認できる菌
株を選抜すればよい。このようにして得られるシュード
モナス sp.Ｆ−１（Pseudomonas sp. F-1）の菌学的性
質は表１〜表３に示すとおりである。

【００１２】

【表１】

【００１３】

【表２】

【００１４】

【表３】

【００１５】以上の菌学的性質を有する菌株Ｆ−１を、
バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バ
クテオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacter
iology）第２巻1986年に従って検索した結果、この菌株
はシュードモナス（Pseudomonas ）属に属する菌株であ
ると同定された。このシュードモナス sp.Ｆ−１（Pseu
domonas sp. F-1 ）は、平成７年１月30日付で、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM P-147
47として寄託されている。

【００１６】上記微生物の培養に用いる培地としては、
通常使用されるものであればよく、炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、マルトース、澱粉、粗糖、廃
糖蜜等を単独で又は混合して用いることができる。窒素
源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
スティープリカー、尿素等の有機窒素源のほか、硫酸、
硝酸、燐酸等のアンモニウム塩などの無機窒素源を単独
で又は混合して用いることができる。無機塩類として
は、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、マンガン、鉄等の硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、硝酸
塩、燐酸塩等をそれぞれ単独で又は組み合わせて用いる
ことができる。

【００１７】培養は、振とう培養又はジャーファーメン
ターを用いて通気条件下で行うことができる。培地のpH
は５〜８の範囲内が好ましく、培養温度は20〜35℃の範
囲内が好ましく、培養時間は１〜３日間が好ましい。培
養終了後の培養液からの菌体の回収は、遠心分離等の濾
過分離によって行えばよい。

【００１８】培養によって得られた上記菌体は、生菌の
ままで用いるか、凍結乾燥するか又はトルエン、アセト
ン等で処理して用いるか、さらには公知の固定化法、例
えば包括法、担体結合法、架橋法等で固定化し、固定化
菌体として用いてもよい。包括法としては、カラギーナ
ンやアルギン酸等の天然高分子又はモノマーやプレポリ
マーによる合成高分子を用いる方法が挙げられる。担体
結合法としてはキトサン等に吸着させる方法がある。架
橋法には、グルタルアルデヒド等を用いることができ
る。

【００１９】また、菌体を公知の菌体破砕法、例えば超
音波破砕法、フレンチプレス破砕法、ガラスビーズ破砕
法、ダイノミル破砕法等により破砕して酵素を抽出し、
その抽出液を粗酵素液として、菌体と同様に固定化して
固定化酵素として用いることができる。粗酵素液は、硫
安沈殿による塩析法、限外濾過膜による濃縮法、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフ
ィー又はゲル濾過クロマトグラフィーによる分離等の組
み合わせにより精製して精製酵素として用いることもで
きる。本発明において、菌体処理物とは、上記のような
菌体の破砕物、磨砕物、固定化菌体、又はそれらから単
離した粗製もしくは精製酵素、それら酵素を固定化した
固定化酵素等をいうものとする。

【００２０】本発明では、上記菌体又は菌体処理物をマ
ルトースに作用させることによってトレハロースを製造
する。本発明において重要なことは、培養液中あるいは
菌体内よりトレハロースを抽出精製する方法とは異な
り、基質であるマルトースに菌体又は菌体処理物を直接
に作用させてトレハロースまで転換させることである。
反応液中の成分は糖がほとんどであり、他の有機物等を
含まないため、従来技術と比較して反応液からのトレハ
ロースの分離精製が非常に容易である。

【００２１】また、その酵素活性は高いため、効率的に
トレハロースを製造することができ、従来の酵素法のよ
うにマルトースフォスフォリラーゼについてある種類の
微生物、トレハロースフォスフォリラーゼについて別の
種類の微生物を用いなくてはならないという煩雑さがな
いため、簡単にトレハロースを製造することができる。

【００２２】この反応における基質としてのマルトース
の濃度は、10mM〜２Mが好ましい。また、反応温度は30
〜60℃、pHは５〜９が好ましく、１〜200 時間反応させ
るのが好ましい。pHを一定に維持するためには、リン酸
緩衝液を使用するのが好ましい。固定化菌体又は固定化
酵素として使用する場合、連続法によって行うこともで
き、例えばそれらをカラムに詰めて、バイオリアクター
として、回分式と同様の反応条件で１ヵ月から１年間連
続通液を行うことにより、トレハロースを安価に連続的
に大量生産することができる。

【００２３】本発明では、上記反応液に夾雑妨害酵素抑
制剤を添加することにより、マルトースをトレハロース
に転換させる酵素活性を向上させることができる。夾雑
妨害酵素抑制剤としては、ＥＤＴＡ（Ethylenediaminet
etraacetic acid ）等のキレート剤が挙げられ、特にＥ
ＤＴＡを用いるのが好ましい。その添加量としては、0.
1 〜10mMが好ましい。

【００２４】反応終了後、遠心分離又は限外濾過等の濾
過分離により、反応液から菌体又は菌体処理物を除去す
る。得られた上清又は濾液より、活性炭やイオン交換樹
脂クロマトグラフィーを用いてトレハロース画分を集め
る。イオン交換樹脂クロマトグラフィーは、Na型又はCa
型の陽イオン交換樹脂を用いて擬似移動床法によって行
うのが好ましい。次いで、得られた画分を濃縮して、エ
タノールによる晶析法等によりトレハロースを晶出させ
る。また、必要により再結晶を行って精製することがで
きる。本発明では、菌体又は粗製もしくは精製酵素を担
体に固定化することにより、その固定化菌体又は固定化
酵素を繰り返し使用でき、その結果、連続的に大量にト
レハロースをマルトースから製造することができる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００２６】（実施例１）菌株の分離静岡県の土壌より採取した土壌サンプル１ｇを10mlの滅
菌水に懸濁して適宜希釈し、その0.1 mlをグルコース寒
天平板培地（グルコース0.5 ％、ペプトン0.5％、酵母
エキス0.3 ％及び寒天1.5 ％）に塗抹した。この平板培
地を30℃の孵卵器で24時間保温し、生じたコロニーの内
生育のよい菌を寒天平板培地に釣菌し、単離した。次
に、生育した菌の１白金耳を、10mlの液体培地（グルコ
ース１％、ニュウトリエントブロス（DIFCO 社製）４
％）を入れた50ml容大型試験管に接種し、30℃で20時間
振とう培養を行い、培養液を遠心分離して菌体を回収し
た。この菌体に１／20容量のトルエンを添加し、15秒間
激しく振とうした。

【００２７】この処理菌体に50mMのマルトース１mlを加
え、37℃で20時間反応させた後遠心分離して、その上澄
みを高速液体クロマトグラフィー（カラム；YMC-03（山
村化学社製）、溶離液；アセトニトリル：水＝77：23、
流速；１ml／min 、温度；30℃、検出器；示差屈折計）
にて分析した。分析の結果、標準（和光純薬社製トレハ
ロース）とリテンションタイムが一致するピークが確認
された菌株を選抜した。本発明者らは、この菌株をシュ
ードモナス sp.Ｆ−１（Pseudomonas sp. F-1）と称す
ることとした。

【００２８】凍結乾燥菌体によるトレハロース製造シュードモナス sp.Ｆ−１（Pseudomonas sp. F-1）
を、液体培地（グルコース１％、ニュウトリエントブロ
ス（DIFCO 社製）４％）３リットルを含む５リットル容
ジャファメンターで30℃下、20時間培養した。培養後、
遠心分離により菌体を回収し、さらに菌体を蒸留水に懸
濁し、遠心分離により菌体を回収する作業を２回繰り返
し、菌体を洗浄した。集めた菌体を凍結乾燥し、粉末菌
体とした。

【００２９】基質となる反応液としては、100 mMのマル
トース（0.1M KH₂PO₄-K₂HPO₄ pH7.0）を用いた。この
反応液に粉末菌体を加え、37℃で24時間反応させた後、
遠心分離し、得られた上澄み液から高速液体クロマトグ
ラフィー（分取用カラム；アサヒパックNH2 （旭化成社
製）、溶離液；アセトニトリル：水：リン酸＝80：17：
３、カラム温度；40℃、流速；１ml／min ）を用いてト
レハロース画分を分取した。

【００３０】このトレハロース画分について核磁気共鳴
装置及び質量分析計により分析した結果、標準（和光純
薬社製トレハロース）のスペクトルと一致した。さらに
微生物（菌体外トレハラーゼ生産菌 Chaetomium aureu
m ）より分離精製したトレハラーゼと反応させたとこ
ろ、グルコースの生成が確認できた。この結果より、本
微生物によりマルトースから生成した物質は、トレハロ
ース（Ｏ−α−Ｄ−glucopyranosyl−（１→１）−α−
Ｄ−glucopyranoside ）であることが判明した。また、
実施例１における反応液中のトレハロース量を測定した
ところ、60mMトレハロースまで反応が進んでいた。これ
より、マルトースからトレハロースへの転換率は60％で
あると計算された。

【００３１】（実施例２）固定化菌体によるトレハロースの製造実施例１で調製したシュードモナス sp.Ｆ−１（Pseudo
monas sp. F-1）の凍結菌体２ｇを、0.9 ％NaCl溶液で
溶解して８mlとし、45℃で加温した。これに、予め45℃
に加温したカラギーナン溶液（カラギーナン２ｇを45ml
の0.3M KClで溶解したもの）を加えてよく混合し、その
後水浴中で冷却した。冷却後、500 mlの0.3M KClを加え
て４℃にて一夜放置した。ゲル化した固定化菌体を３mm
角に切断し、500 mlの0.3M KCl及び1000mlの0.1Mリン酸
バッファーpH7.0 で洗浄し、39.6ｇの固定化菌体を得
た。

【００３２】得られた固定化菌体８ｇに、6.25mlの１M
マルトース溶液（0.1Mリン酸バッファーpH7.0 含有）を
加えて45℃で振とう反応を行った。反応終了後、上澄み
液を高速液体クロマトグラフィーで定量した結果、７日
間で転換率約50％、200 mMのトレハロースが生成された
ことが分かった。

【００３３】（実施例３）トレハロース合成粗酵素によるトレハロースの製造培養したシュードモナス sp.Ｆ−１（Pseudomonas sp.
F-1）の菌体を蒸留水で十分に洗浄後、菌体５ｇに30ml
の0.05Mリン酸バッファーpH7.0 を加え、氷中にて超音
波破砕機で細胞を破砕した。破砕処理液から遠心分離に
よって沈殿を除去し、上澄み液の粗酵素28mlを得た。こ
の粗酵素液に13.5ｇの硫酸アンモニウムを徐々に加え、
４℃にて一夜放置した。硫酸アンモニウムで沈殿した粗
酵素液を遠心分離にて回収し、その後0.1Mリン酸バッフ
ァーpH7.0 で再溶解し、同バッファーで透析を行い、粗
酵素12.5ml（2.5 単位）を得た。

【００３４】キトパールBCW2603 （富士紡績製）50mlを
４リットルの蒸留水で洗浄後、135mlの0.1Mリン酸バッ
ファーpH7.0 、2.25mlの蒸留水及び20mlの14％グルター
ルアルデヒド溶液を加えて混合し、２時間振とう反応を
行った。反応終了後、６リットルの蒸留水で洗浄し、活
性化キトパールを得た。活性化したキトパール10mlに粗
酵素液10mlを加え、４℃にて一夜振とうさせ、固定化さ
せた。固定化終了後、0.1Mリン酸バッファーpH7.0 でよ
く洗浄し、固定化酵素を得た。得られた固定化酵素10ml
に7.5 ｇのマルトース及び0.5Mリン酸バッファーpH7.0
を加え、蒸留水で20mlとし、37℃で振とう反応を行っ
た。反応終了後、上澄み液を高速液体クロマトグラフィ
ーで定量した結果、４日間で転換率約40％、412mMのト
レハロースが生成されたことが分かった。

【００３５】（実施例４）夾雑妨害酵素抑制剤ＥＤＴＡの効果実施例１で調製したシュードモナス sp.Ｆ−１（Pseudo
monas sp. F-1）の凍結菌体0.02ｇに、0.75mlの0.1Mリ
ン酸バッファーpH7.0 と、0.25mlの0.4Mマルトースと、
0.02mlの0.5MＥＤＴＡとを加えたトレハロース合成用の
反応液を調製した。また、0.5MＥＤＴＡの代わりに蒸留
水を用いる以外、同様の組成の反応液を調製した。両反
応液とも、37℃で20時間反応させた後遠心分離し、得ら
れた上澄み液から高速液体クロマトグラフィーを用いて
トレハロースの生成量を定量した。

【００３６】反応終了後の菌体は、0.1Mリン酸バッファ
ーpH7.0 で洗浄し、再び同様の条件下で反応させた。こ
のようにして反応を３回繰り返し、各反応液によるトレ
ハロース生成量を比較した。結果を表４に示す。

【００３７】

【表４】

【００３８】表４から明らかなように、ＥＤＴＡを添加
した反応液では、菌体を３回繰り返し使用してもトレハ
ロース生成量が低下しなかった。

【００３９】

【発明の効果】本発明によれば、トレハロースを容易に
かつ効率的に製造することができ、またバイオリアクタ
ーを利用することによりトレハロースを安価に大量生産
することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者佐野孝文静岡県庵原郡富士川町南松野1759−４ (72)発明者大石一男静岡県沼津市三園町７−１職住303 (72)発明者山岸政昭静岡県焼津市小川256の２ (72)発明者太田俊也静岡県駿東郡清水町柿田178−３職住301

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シュードモナス属に属し、マルトースを
トレハロースに転換し得る能力を有する微生物の菌体又
は菌体処理物を、マルトースに作用させることを特徴と
するトレハロースの製造法。
【請求項２】前記微生物が、シュードモナス sp.Ｆ−
１（Pseudomonas sp. F-1）であることを特徴とする、
請求項１記載のトレハロースの製造法。
【請求項３】前記微生物の菌体又は菌体処理物を、夾
雑妨害酵素抑制剤の存在下にマルトースに作用させるこ
とを特徴とする、請求項１記載のトレハロースの製造
法。
【請求項４】前記夾雑妨害酵素抑制剤がキレート剤で
あることを特徴とする、請求項３記載のトレハロースの
製造法。
【請求項５】前記キレート剤がＥＤＴＡであることを
特徴とする、請求項４記載のトレハロースの製造法。