JPH0429353B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発見は、Ｌ−あるいはＤ−体のシスチンあ
るいはシステインのラセミ化方法に関する。従来
Ｌ−あるいはＤ−アミノ酸を酵素的にラセミ化す
る方法はいくつか知られている。 例えば、バチルス属、シユードモナス属、スト
レプトコツカス属、細菌の生産するアラニンラセ
マーゼ（EC5.1.1.1）を使用する方法がある（朝
倉書店、酵素ハンドブツク、丸尾文治、田宮信雄
監修、1982、p727）。しかしながら、Ｌ−あるい
はＤ−体のシスチンあるいはシステインのラセミ
化方法は、知られていない。 本発明者らは、Ｌ−あるいはＤ−体のシスチン
あるいはシステインのラセミ化方法を見い出すべ
く研究した結果、アルカリゲネス属、アクロモバ
クター属、アシネトバクター属、アグロバクテリ
ウム属、アースロバクター属、エアロモナス属、
バチルス属、ブレビバクテリウム属、ブレトノミ
セス属、コリネバクテリウム属、セルロモナス
属、シトロバクター属、クリプトコツカス属、キ
ヤンデイダ属、セフアロアスカス属、デバリオミ
セス属、エシエリヒア属、エルビニア属、エンテ
ロバクター属、フラボバクテリウム属、ジオトリ
カム属、ハフニア属、ハンセヌラ属、ジエンセニ
ア属、クルチア属、クルイヘラ属、クルブシエラ
属、クロエツケラ属、リポミセス属、ミクロコツ
カス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、
ナドソニア属、ノカルデイア属、プラノコツカス
属、シユードモナス属、プロテウス属、プロタミ
ノバクター属、パキソレン属、ピヒア属、ロドト
ルラ属、ロダロミセス属、ザルチナ属、スポロザ
ルチナ属、セラチア属、サルモネラ属、サツカロ
ミセス属、ストレプトミセス属、サツカロミコイ
デス属、トルロプシス属、トリコスポロン属、ト
レメラ属、タフリナ属、ビブリオ属、ウイツカー
ハミア属およびキサントモナス属に属する微生物
がＬ−あるいはＤ−体のシスチンあるいはシステ
インをラセミ化する事を見い出し、本研究を完成
するに至つた。 即ち本発明は、Ｌ−あるいはＤ−体のシスチン
あるいはシステインをラセミ化する能力を有する
微生物を水溶性媒体中にてＬあるいはＤ−体のシ
スチンあるいはシステインに作用せしめ、Ｌ−あ
るいはＤ−体のシスチンあるいはシステインをラ
セミ化せしめることを特徴とする、Ｌ−あるいは
Ｄ−体のシスチンあるいはシステインのラセミ化
法である。 本発明の微生物は具体的には以下のものがあ
る。

【表】

【表】 等がある。 Ｌ−あるいはＤ−体シスチンあるいはシステイ
ンに本発明の微生物を作用させる方法は、本微生
物をＬ−あるいはＤ−体システインを含む培地中
で培養しても良いし、またはこれらの微生物の培
養液、菌体または菌体処理物を水溶液中でＬ−あ
るいはＤ−体システインに接触せしめても良い。 これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地
を用いて、培養の初めから、あるいは培養の途中
でＬ−、Ｄ−体あるいはDL−体のシスチンある
いはシステインを添加して培養すればよい。 本微生物の培養のために用いられる培地はＬ−
あるいはＤ−体のシスチンあるいはシステインを
含むほかは通常の炭素源、窒素源、無機イオンを
含有する通常の培地である。 更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を
添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルジコール類、
その他が適宜使用される。窒素源としては、アン
モニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、そ
の他が用いられる。無機イオンとしては、マグネ
シウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、Hz４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、
培養液より分離された菌体、洗浄された菌体など
いずれも使用可能である。菌体処理物としては凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、界面
活性剤等と接触せしめた菌体、リゾチームで処理
した菌体、超音波にさらした菌体、機械的に摩砕
した菌体等のほか、これら菌体処理物から得られ
た、Ｌ−あるいはＤ−体のシスチンあるいはシス
テインをラセミ化せしめる酵素活性を有する酵素
蛋白区分、更には、これらの菌体の固定化物、菌
体処理物の不溶化物、その他いずれも使用でき
る。水溶性媒体としては、水、バツフアーおよび
エタノール等の有機溶媒を含むものが使用でき
る。更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄
養素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、および金
属イオン等を水性媒体に添加することもできる。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しなが
ら、菌体とＬ−あるいはＤ−体のシスチンあるい
はシステインを接触せしめて作用せしめる場合に
は、Ｌ−あるいはＤ−体のシスチンあるいはシス
テインを含み、かつ微生物の生育に必要な炭素
源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水性
媒体が用いられる。更にビタミン、アミノ酸等の
有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得ら
れる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして１ないし10日間も培養を行えば、Ｌ−
あるいはＤ−体のシスチンあるいはシステインは
効率よくラセミ化される。 これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、
培養菌体あるいは菌体処理物をＬ−あるいはＤ−
体のシスチンあるいはシステインと接触せしめて
作用せしめる場合には、Ｌ−あるいはＤ−体のシ
スチンあるいはシステインと培養液、培養菌体あ
るいは菌体処理物を溶解またはけん濁した水性媒
体を10℃ないし70℃の適当な温度に調節し、PHを
４ないし８に保ちつつ、暫時静置または撹拌すれ
ばよい。かくして５ないし100時間も経過すれば
水性媒体中に多量のＬ−あるいはＤ−体のシスチ
ンあるいはシステインのラセミ化物が生成蓄積さ
れる。 このようにして得られたＬ−あるいはＤ−体の
シスチンあるいはシステインのラセミ化物を培養
液又は水溶液より採取する方法は、イオン交換樹
脂を用いる方法、等電点にて沈澱せしめる方法
等、通常の方法が採用される。 生成したアミノ酸の定量は高速液体クロマトで
測定する方法およびバイオアツセイで測定する方
法を用いた。 光学異性体は結晶の比旋光度を測定する事によ
つて、Ｄ，Ｌを定めた。 実施例 １ グルコース0.5g／dl、硫安0.3g／dl、
KH₂PO₄0.1g／dl、K₂HPO₄0.3g／dl、MgSO₄・
7H₂O0.05g／dl、FeSO₄・7H₂O0.001g／dl、
MnSO₄・4H₂O0.001g／dl、酵母エキス0.5g／dl、
ポリペプトン0.5g／dl、マルツエキス0.5g／dl、
Ｌ−システイン塩酸塩・1H₂O0.3g／dl、ピリド
キシン塩酸塩10mg／dlおよび炭酸カルシウム
4g／dl（別殺菌）（PH7.0）を500ml容フラスコに
50ml入れ、120℃で15分間殺菌した。 これに上記寒天培地で30℃にて24時間培養した
表−１に示す微生物を一白金耳接種し、30℃で24
時間振盪培養した。この培養液より菌体を遠心分
離により採取し、培養液と同量の生理食塩水で一
回洗浄し、菌体を集めた。この菌体をＤ−システ
イン塩酸塩・一水和物あるいはＬ−システイン塩
酸塩・一水和物1g／dl、ピリドキサール−5′−リ
ン酸20mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）
（終末10ml）に5g／dlになる様に添加し、30℃に
20時間保持反応した。Ｄ−システインがラセミ化
されて生成したＬ−システインの量並びにＬ−シ
ステインがラセミ化されて生成したＤ−システイ
ンの量をバイオアツセイ及び高速液体クロマトで
測定し、この結果を表−１に示した。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１に示した方法で、シユードモナス・テ
ストステロニATCC 11996を培養し、実施例１に
示したように菌体を集めた。この菌体をＬ−体ま
たはＤ−体シスチン1g／dl、ピリドキサール−
5′−リン酸20mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）（終末10ml）に5g／dlになる様に添加し、
30℃に20時間保持反応した。Ｌ−あるいはＤ−シ
スチンがラセミ化されて生成したＤ−あるいはＬ
−シスチンの量をバイオアツセイ及び高速液体ク
ロマトで測定し、この結果を表−２に示した。

【表】 実施例 ３ 実施例１に示した培地からＬ−システイン塩酸
塩・一水和物を除いた培地に実施例１と同様の寒
天培地で培養したシユードモナス・テストステロ
ニ ATCC 11996を白金耳接種し、30℃で12時間
間振盪培養したのち、10g／dlのＤ−システイン
塩酸塩１水和物（KHOでPH7.0になる様に中和）
溶液を５ml加えて更に10時間培養した。Ｄ−シス
テインがラセミ化されて生成したＬ−システイン
をバイオアツセイで測定した結果0.25g／dlのＬ
−システイン塩酸塩・一水和物が生成していた。 実施例 ４ 実施例１と同様に培養し洗浄したアクロモバク
ター ヴイスコサス ATCC 12448の菌体をＬ−
システイン塩酸塩・一水和物あるいはＤ−システ
イン塩酸塩・一水和物1g／dl、ピリドキサール
−5′−リン酸20mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.0）（終末500ml）に5g／dlになる様に添加し
30℃に24時間保持した。この反応液中のシステイ
ン全量（Ｄ体、Ｌ体の和）を前述の高速液体クロ
マトで測定し、Ｌ−システインはバイオアツセイ
法で測定した。この結果を表−３に示した。

【表】 これらの反応液より菌体を遠心分離で除き、ダ
イヤイオンSK−1B（カチオン交換樹脂）を用い
て常法通り処理した。この溶離液よりシステイン
を塩酸塩として結晶化し、Ｌ−システインを基質
にした時は、3.2g、Ｄ−システインを基質にした
時は、2.9gのシステイン塩酸塩・一水和物を得
た。これらの結晶の旋光度を測定したところいず
れの場合も旋光度０で生成物はラセミ体である事
が判明した。 実施例 ５ 実施例４と同様に培養し、洗浄したアクロモバ
クター ヴイスコサス ATCC 12448の菌体を生
理食塩水に20g／dlになる様に懸濁した菌液５ml
に４％アルギン酸ナトリウム溶液５mlを加え混合
したのち、15g／dl塩化カルシウム溶液に、この
混合液を徐々に滴下し、ビーズ状の固定化菌体を
作成した。この固定化物全量をＤ−システイン塩
酸塩・一水和物を含む0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）20mlに投入し、30℃に５時間保持反応させ
た。この結果Ｄ−システインはラセミ化され、反
応液中には0.32g／dlのＬ−システイン塩酸塩・
一水和物が生成していた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルカリゲネス属、アクロモバクター属、ア
   シネトバクター属、アグロバクテリウム属、アー
   スロバクター属、エアロモナス属、バチルス属、
   ブレビバクテリウム属、ブレトノミセス属、コリ
   ネバクテリウム属、セルロモナス属、シトロバク
   ター属、クリプトコツカス属、キヤンデイダ属、
   セフアロアスカス属、デバリオミセス属、エシエ
   リヒア属、エルビニア属、エンテロバクター属、
   フラボバクテリウム属、ジオトリカム属、ハフニ
   ア属、ハンセヌラ属、ジエンセニア属、クルチア
   属、クルイヘラ属、クルブシエラ属、クロエツケ
   ラ属、リポミセス属、ミクロコツカス属、ミコプ
   ラナ属、ミクロバクテリウム属、ナドソニア属、
   ノカルデイア属、プラノコツカス属、シユードモ
   ナス属、プロテウス属、プロタミノバクター属、
   パキソレン属、ピヒア属、ロドトルラ属、ロダロ
   ミセス属、ザルチナ属、スポロザルチナ属、セラ
   チア属、サルモネラ属、サツカロミセス属、スト
   レプトミセス属、サツカロミコイデス属、トルロ
   プシス属、トリコスポロン属、トレメラ属、タフ
   リナ属、ビブリオ属、ウイツカーハミア属および
   キサントモナス属に属するＬ−あるいはＤ−体の
   シスチンあるいはシステインをラセミ化せしめる
   能力を有する微生物を水溶性媒体にてＬ−あるい
   はＤ−体のシスチンあるいはシステインに作用せ
   しめ、Ｌ−あるいはＤ−体のシスチンあるいはシ
   ステインをラセミ化せしめることを特徴とする、
   Ｌ−あるいはＤ−体のシスチンあるいはシステイ
   ンのラセミ化法。