JPH0433439B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は醗酵法によるＳ−アデノシルメチオニ
ンの製造方法に関し、更に詳しくは、メチオニン
含有液体培地中でサツカロマイセス属に属する微
生物を培養することにより高純度のＳ−アデノシ
ルメチオニンを高収率かつ経済的に製造する方法
に関する。 Ｓ−アデノシルメチオニン（以下、SAMと略
称する）は生体内において脂肪、蛋白質、糖類な
どの代謝に関与する重要な生理活性物質である。
而して近時かかるSAMに肝血症、過度脂血症、
動脈硬化症、抑うつ病および精神病型の精神病発
現、変性関節症神経病痛覚、不眠症などに対する
治療効果のあることが見い出されており、その大
量生産が期待されている。 従来、SAMの工業的製造方法としてはサツカ
ロマイセス属酵母をメチオニン含有液体培地で培
養し、該微生物菌体中に蓄積したSAMを抽出、
精製する方法が知られている〔例えばジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem）229，1037頁（1957）〕。しかし、か
かる方法で得られる菌体内のSAM含量は、たか
だか３％位であり、その菌体抽出液中にはSAM
と分離し難いアデニン関連物質やニンヒドリン反
応陽性物質を多く含んでいるため、精製が非常に
困難であつた。特にアデニン、Ｓ−アデノシルホ
モシステインやメチルチオアデノシン（以下、
MTAと略称する）との分離が難しく、かかる欠
点が克服すべくいくつかのSAM精製法が知られ
ているが、（例えば特公昭−46−13680号、同46−
21079号、同53−20998号、特開昭56−145299号な
ど）、いずれの方法も高純度、高回収率かつ経済
的にSAMを得るには不充分であつた。 また、キヤンデイダ属、ピキア属、ハンゼヌラ
属、ロドトルラ属などに属する酵母を培養し、菌
体内や培養液中にSAMを生成蓄積せしめる方法
も公知であるが（例えば特公昭52−17118号）、か
かる方法においても菌体内SAMの精製は困難で
あり、また培地中には種々の代謝産物やSAMの
分解物がSAMと共存しているため培地からの
SAMの回収はより困難であつた。 そこで本発明者らは醗酵法によるSAMの工業
的製造法に関し鋭意検討を加えた結果、菌体内の
SAM含量を従来技術では達成しえなかつた一定
値以上にすると、菌体内に存在するSAMと分離
し難い不純物の量が相対的に極めて少なくなり、
かかる微生物菌体を用いることにより精製が極め
て容易になり、高純度のSAMが高回収率かつ経
済的に製造できることを見い出し本発明を完成す
るに到つた。 かくして本発明によれば、SAM生産能を有す
る微生物をメチオニン含有液体培地で培養し乾燥
菌体基準で10重量％以上のSAMとSAM蓄積量に
対して、0.1重量％以下のMTAを菌体内に蓄積せ
しめたのち、菌体を培地から分離し、次いで菌体
からSAMを安定な形で収得することを特徴とす
るSAMの製造方法が提供される。 本発明において用いられる微生物はサツカロマ
イセス属に属し、SAM産生能を有し、かつメチ
オニン含有液体培地中で菌体内に乾燥菌体基準で
SAMを10重量％以上、MTAをSAM蓄積量に対
して0.1重量％以下蓄積しうるものである。その
具体例としてサツカロマイセス・セレビジエ
IFO2342，サツカロマイセス・セレビジエ
IFO2343，サツカロマイセス・セレビジエ
IFO2345，サツカロマイセス・セレビジエ
IFO2346，サツカロマイセス・セレビジエ
IFO2347，協会９号酵母などが例示される。また
これら菌株の天然及び人工変異菌も前記の性質を
具備するものであるかぎり、同様に使用すること
ができる。 本発明においては、かかる微生物を用いて菌体
内SAM含量が10重量％以上、好ましくは12重量
％以上になるまで培養を行うことが必須の要件で
ある。この際、SAM含量が10重量％未満である
と、MTA等のアデニン関連物質やニンヒドリン
反応陽性物質の含有量が相対的に多く、そのため
SAMの精製を効率的に実施することができない。 SAM含量を10重量％以上にするための培養条
件はMTA含量がSAM含量に対して0.1重量％以
下であれば特に制限されるものではないが、メチ
オニン、炭素源、窒素源、無機塩及び有機微量栄
養源を含有する液体培地中で好気的条件下で行う
ことが好ましい。 メチオニンは通常0.2ｇ／dl以上の割合で添加
される。メチオニンの添加方法は一度に全量を添
加する方法、分割して順次添加する方法のいずれ
でもよいが、メチオニンの添加量が多い場合に前
者の方法を採用するとSAMの菌体内蓄積量が低
下する傾向をを示すので、このようなときには後
者の方法を採用するのが適切である。 炭素源としては、グルコース、シユクロース、
フラクトースなどの糖類；エタノール、グリセリ
ンなどのアルコール類；更にはこれらを含有する
澱粉加水分解液、糖蜜、大豆ホエー、果汁廃液、
魚加工廃液、醗酵廃液、パルプ廃液なども使用で
きる。また窒素源としては、尿素、コハク酸アン
モニウム、クエン酸アンモニウム、乳酸アンモニ
ウムなどが好ましい。無機塩としては燐酸カリウ
ム、燐酸ナトリウム、燐酸カルシウム、燐酸リチ
ウムなどの燐酸塩、塩化カリウムなどのカリウム
塩、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのナト
リウム塩、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム
などのマグネシウム塩、硫酸マンガン、塩化マン
ガンなどのマンガン塩、硫酸鉄、塩化鉄などの鉄
塩、亜鉛塩、銅塩、コバルト塩などの通常の無機
塩が必要に応じて適宜使用することができる。有
機微量栄養源としてはビタミン、アミノ酸、これ
らを含有する酵母エキス、肉エキス、麦芽エキ
ス、コーンステイーブリカー、カザミノ酸、大豆
粉、大豆加水分解物、ペプトン、トリプトン、カ
ゼイン分解液などが必要に応じて使用できる。 培養は好気的条件下で行うのが好ましく、通
常、培地のPHを３〜８、好ましくは3.5〜７に制
御しつつ、15℃〜45℃、好ましくは20℃〜35℃の
範囲で２日から10日間、培養することにより微生
物菌体中にSAMが生成蓄積される。 本発明においては、培養後、培地から菌体を分
離し、次いで菌体からのSAMの抽出及び精製が
行われる。これらの工程で用いられる方法はとく
に限定されるものではなく、公知の方法を用いれ
ばよい。すなわち培地から菌体を分離するにあた
つては、例えば遠心分離による方法、過による
方法などが例示され、また菌体からSAMを収得
するにあたつては、過塩素酸、塩酸、硫酸、ギ
酸、酢酸、ギ酸エステル、酢酸エステル、エタノ
ールなどのごとき抽出剤によりSAMを抽出後、
常法に従つて抽出液中のSAMを精製することに
よつて高純度の安定化されたSAMが得られる。 SAMの精製方法は特に限定されるものではな
く、例えば活性炭、強酸性カチオン交換樹脂、弱
酸性カチオン交換樹脂、キレート樹脂などを用い
るクロマトグラフイー法、ライネツケ塩、ピクリ
ン酸、リンタングステン酸、ピクロロン酸などを
用いてSAMを沈澱させて精製する方法、アセト
ン、エタノールなどの有機溶媒を用いてSAMを
析出させる方法などがあり、必要に応じて適宜組
み合わせて行うことができる。この際、SAMを
安定化して収得するために、硫酸、パラトルエン
スルホン酸、スルホサリチル酸などのごとき酸を
加えてSAMの塩または複塩の形で回収するのが
一般的である。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。 実施例 １ グルコース５ｇ／dl、ポリペプトン0.5ｇ／dl、
KH₂PO₄0.4ｇ／dl、K₂HPO₄0.4ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.02ｇ／dl、酵母エキス0.2ｇ／
dl、寒天２ｇ／dlからなる寒天斜面培地（PH6.0）
に２日間生育させたサツカロマイセス・セレビジ
エIFO2346の１白金耳を、シユクロース10ｇ／
dl、酵母エキス１ｇ／dl、KH₂PO₄0.4ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.01ｇ／dl、Ｌ−メチオニン1.0
ｇ／dl、ZnSO₄・7H₂O0.25mg／dl、MnSO₄４〜
6H₂O1.25mg／dlからなりPH6.0に調整、加熱滅菌
した培地10mlに植菌し、28℃で４日間振盪した。 遠心分離にて集菌し、生理食塩水で洗浄した
後、菌体を1.5N過塩素酵に懸濁し、室温で１時
間、振盪しSAMを抽出した。抽出液をペーパー
クロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフイ
ーで分析し、SAM、アデニン（以下、Adと略）、
Ｓ−アデノシルホモシステイン（以下、SAHと
略）、メチルチオアデノシンの分析を行い、結果
を第１表に示した。

【表】 この結果から、明らかなように乾燥菌体当りの
SAM含量が10重量％以上の場合にはMTA含量
がSAM蓄積量に対して0.1重量％以下であるな
ど、SAMと分離し難い不純物が少ないことがわ
かる。 実施例 ２ 実施例１と同じ培地で、培養時間、培地PH、培
養温度を変えてサツカロマイセス・セレビシエ
IFO2346を培養し、乾燥菌体当りのSAM含量が
異なる菌体を調整した。この菌体を実施例１と同
じ方法で抽出・分析を行い、結果を第２表に示し
た。

【表】 実施例 ３ グルコース５ｇ／dl、ポリペプトン0.5ｇ／dl、
KH₂PO₄0.4ｇ／dl、K₂HPO₄0.4ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.02ｇ／dl、酵母エキス0.2ｇ／dl
からなり、PH6.0に調整、加熱滅菌した培地10ml
に第３表に示す各種菌株を１白金耳接種し、28℃
にて24時間振盪培養した。 一方、シユークロース10ｇ／dl、酵母エキス１
ｇ／dl、KH₂PO₄0.4ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O0.01
ｇ／dl、尿素（別滅菌）1.5ｇ／dl、Ｌ−メチオ
ニン0.75ｇ／dl、CaCl₂・2H₂O0.02ｇ／dl、
ZnSO₄・7H₂O0.25mg／dl、FeSO₄・7H₂O0.25
mg／dl、MnSO₄４〜6H₂O1.25mg／dl、CuSO₄・
5H₂O2μｇ／dl、H₃BO₃2μｇ／dl、CoCl₂・6H₂
O0.2μｇ／dl、KI1μｇ／dlからなりPH6.0に調整
した培地１を２容発酵槽に入れ、殺菌後、上
記種培養液５mlを接種し、28℃で72時間、通気攪
拌培養を行つた。 培養後、遠心分離にて集菌し、生理食塩水で１
回洗浄した菌体を100mlの1.5N過塩素酸に懸濁
し、室温で１時間振盪しSAMを抽出した。次い
で遠心分離にて菌体残渣を除去した後、炭酸水素
カリウムを加えてPH4.5に調整し、生じた過塩素
酸カリウムの沈澱を遠心分離にて除去し、SAM
を含む抽出液を得た。抽出液中のSAMを定量し
その結果を乾燥菌体当りのSAM量として第３表
に示した。 この抽出液をSAM量として0.2ｇになるように
弱酸性陽イオン交換樹脂アンバーライトIRC−50
（H⁺型）50mlを詰めたカラムに通しSAMを吸着
させた。カラムに0.005N酢酸を通じて溶出液の
260nmに於ける吸光度が0.1以下になるまで洗浄
し、不純物を除去した。この時に要した0.2N酢
酸量を第３表に示した。次いでカラムに0.1N酢
酸を通じて溶出液の260nmに於ける吸光度が0.05
以下になるまでSAMを溶出した。この溶出液を
アンバーライトIRA900樹脂（OH^-型）で処理
し、PH3.0とした後、凍結乾燥してSAM硫酸塩を
得た。この時のSAMの回収率を第３表に示した。
セルロース薄層クロマトグラフイー、ペーパーク
ロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフイー
でSAMの純度を測定し、第３表に示した。

【表】 第３表から明らかなように、本発明例において
は不純物の除去に要する溶出液の量が少なくてす
み、SAM回収率、SAMの純度とも極めて良好で
あることが明らかである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｓ−アデノシルメチオニン産生能を有するサ
   ツカロマイセス・セレビジエに属する微生物であ
   つて、乾燥菌体基準で10重量％以上のＳ−アデノ
   シルメチオニンとＳ−アデノシルメチオニン蓄積
   量に対して0.1重量％以下のメチルチオアデノシ
   ンを菌体内に蓄積し得る微生物をメチオニン含有
   液体培地で培養し乾燥菌体基準で10重量％以上の
   Ｓ−アデノシルメチオニンとＳ−アデノシルメチ
   オニン蓄積量に対して0.1重量％以下のメチルチ
   オアデノシンを菌体内に蓄積せしめたのち、菌体
   を培地から分離し、次いで菌体からＳ−アデノシ
   ルメチオニンを安定な形で収得することを特徴と
   するＳ−アデノシルメチオニンの製造方法。