JPH0436735B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はリポソームの製造法に関する。 脂質の閉鎖小胞であるリポソームは、広く生体
膜のモデルとしてその物理化学的諸性質の研究に
利用されてきた。またリポソームはその内部に
種々の薬剤を保持することが可能であるために、
マイクロカプセルの一種として難経口吸収性薬剤
の吸収促進、制癌剤等の細網内皮系組織へのター
ゲツテイング、免疫賦活剤等の活性増強等の応用
研究が数多くなされている。リポソームがこれら
の研究に盛んに用いられている主な理由は、リポ
ソームの膜構成成分自体が生体由来の脂質である
ために毒性が少ないこと、生体の種々の膜との親
和性が高いことなどが挙げられる。一方これらリ
ポソームの製法としては大部分膜成分物質である
脂質の溶解剤としてクロロホルム、エーテル、ベ
ンゼン、エタノール、ヘキサン等を用いており、
また脂質の可溶化剤としてコール酸、トライトン
Ｘ−100及びその他の界面活性剤を用いている。
従つて前者の場合には有機溶媒を減圧、加温、不
活性ガスのバブリング等により除去せねばならな
いし、最終製品中の残留溶媒が問題となる。ま
た、これら調製方法をそのまま工業的生産に結び
つけるには保安上及び安全作業上の問題の他、操
作技術上の困難さ等がある。更に後者の場合には
最終製品から透析またはゲル濾過によつて用いた
界面活性剤を分離除去する必要がある。 有機溶媒あるいは界面活性剤等を用いずにリポ
ソームを調製するものとしては、アニーリング
法、凍結融解法の他、特開昭57−82310号及び同
57−82311号に示される凍結乾燥法などがある。
アニーリング法では、リン脂質−水分散液をリン
脂質の相転移温度（Tc）以下にて超音波照射し、
構造欠損（structural defect）を起こしたSUV
（小さな一枚膜リポソーム）をいつたん製し、そ
の後にTc以上でインキユベーシヨンして融合さ
せLUV（大きな一枚膜リポソーム）を調製する手
法をとつている。凍結融解法では、大豆リン脂質
に緩衝液を加え20〜35℃で20分間超音波照射して
SUVをいつたん製し、次にドライアイス−エタ
ノールですばやく凍結し更に室温に戻して融解さ
せ30℃で軽く超音波照射して融合させることによ
りLUVを調製する手法をとつている。また凍結
乾燥法ではリン脂質を水性溶媒中に分散させた後
凍結乾燥し、これを水性溶媒中に再分散させるこ
とによりリポソームを製するものである。本来リ
ン脂質は水和されて初めてラメラー構造を持つた
リポソームになるわけであるが、単なるTc以上
ではリン脂質はなかなか水性溶液によつて水和さ
れず、リポソームもできにくい。従つてTc付近
で適用しても能率、効率の面で決して優れている
とは言い難く、又一部の膜成分物質即ちジセチル
ホスフエートの如き単独で液晶相を持たない膜成
分物質が膜の中に入りにくいなどの欠点がある。 本発明者らはこれらの状況に鑑み、従来その有
用性についてはあまり顧みられなかつた有機溶媒
を全く使用せずにリポソームを調製する方法、即
ちただ単に脂質を水性溶媒中に分散させる方法に
注目し、その改良について鋭意検討した結果、リ
ポソームを構成する通常の膜成分物質と水性溶液
とを混ぜて膨潤させ撹拌する際、従来言われてい
た脂質が水和したラメラー相（２分子膜）での相
転移温度（Tc）ではなく、粉末結晶としての相
転移温度（Tα）以上でかつ低くても50℃にて行
うことにより（Tα＞Tc）均一なリポソームを効
率良くしかも大量に製することができることを見
出し、本発明を完成するに至つた。一般に中性脂
質であるホスフアチジルコリン、スフインゴミエ
リン、ホスフアチジルエタノールアミンの場合、
その脂肪酸鎖長や不飽和度によらず固体としての
融点は高く各々230、205、196℃であることが知
られている。しかしながら実際にはこれら固体と
しての融点よりはるかに低い温度にて、これらの
脂質は吸熱的な相変化をし、脂肪酸鎖の部分が溶
けて液体状態になる。即ち液晶へと相変化するこ
とが知られている。例えばジパルミトイルホスフ
アチジルコリンの場合には、ラメラー相（２分子
膜）の状態では41℃に相転移温度がある。この温
度がよくいわれる脂質の相転移温度（Tc）であ
るが、これは脂質が水の中で完全に水和され（レ
シチン１分子に対し10分子の水が水和し、それ以
上の水は自由水となる）てラメラー相（２分子
膜）を形成しているときの相転移温度を意味して
いる。ジパルミトイルホスフアチジルコリンの場
合、水和した状態即ちラメラー相（２分子膜）の
状態では相転移温度は41℃にあるが、粉末結晶状
態では65℃（１水和物結晶）あるいは93℃（無水
物結晶）に相転移温度が存在する。そしてただ単
にリン脂質を水性溶媒中に分散させ温度を単に
Tc以上にしても、水界面と接したリン脂質は水
和されてこの温度で流動性を持つてはいるが、粉
末結晶内部のリン脂質は水和されず固体状態にあ
るといえる。ここで撹拌等の機械的振動を与える
と水界面と接し水和されたリン脂質だけが水性溶
媒中にリポソームとして分散していくことにな
る。 このように単なるTc以上で行う従来の方法は、
粉末結晶状態のリン脂質−水界面で徐々にラメラ
ー構造（２分子膜）を生成させ小胞化させていく
という方法があるがために、能率、効率の面で優
れた方法とは言いがたい。これに対し本発明によ
れば、リン脂質の粉末結晶状態即ち無水物結晶あ
るいは１水和物結晶としての相転移温度（Tα）
に注目して行うために能率、効率の面で上述の方
法よりはるかに優れている。即ちTα以上では水
性溶媒中に粉末結晶状態で分散しているリン脂質
は、水界面のリン脂質ばかりでなく内部のリン脂
質も液体状態にあるために非常に水和されやすい
状態にある。ここで撹拌等の機械的振動を与えて
やれば内部のリン脂質も瞬時に水和されながらリ
ポソーム化して水性溶媒中に分散していくことに
なる。かかる新知見に基いてなされたのが本発明
である。 本発明において使用される膜成分物質として
は、例えばホスフアチジルコリン、ホスフアチジ
ルエタノールアミン、ホスフアチジルセリン、ホ
スフアチジルイノシトール、リゾホスフアチジル
コリン、スフインゴミエリン、卵黄レシチン、大
豆レシチン等に代表されるリン脂質の他、糖脂
質、ジアルキル型合成界面活性剤等の一種又は二
種以上の混合物が主体となる。なお、これに膜安
定化剤としてコレスタン、コレステロール等のス
テロール類を、荷電物質としてジセチルホスフエ
ート、ホスフアチジン酸、ガングリオシド、ステ
アリルアミン等を、更に酸化防止剤としてα−ト
コフエロール等を加えて膜成分物質を形成させて
もよい。 これらリポソーム製剤の膜成分物質の引率は何
ら限定されるべきものではないが、好ましくは脂
質１重量部に対しステロール類を０〜２重量部程
度、荷電物質を0.1重量部程度加えるのが適して
いる。 また膜成分物質を分散させる水性溶媒として
は、水、生理食塩水、緩衝液、糖類の水溶液及び
これらの混合液等が好ましく使用される。 膜成分物質との使用比率は膜成分物質１重量部
に対し、10〜1000重量部程度が適当である。 本発明のリポソームに保存させる薬剤として
は、特に制限はないがサイトシンアラビノシド、
メトトレキセートに代表される制癌剤、ペニシリ
ンＧに代表される抗生物質、インシユリン、イン
ターフエロン、グルコアミラーゼに代表されるた
んぱく質、デキストランに代表される多糖類、
DNA、RNAの如き核酸類、ビタミンＡに代表さ
れるビタミン類などの他、サリチル酸ナトリウム
のような一般薬物が用いられ、一般にはこれ等は
水性溶媒に溶解して用いる。 本発明にもとづいてリポソーム製剤を製するに
は以下の如き手順によれば良い。 まず用いる膜成分物質自体の粉末結晶としての
相転移温度（Tα）を求めるが、一般に示差相差
熱分析（DSC）による熱的分析が速くて簡便で
ある。 ここで用いる膜成分物質自体とは、無水物結晶
状態であれ１水和物結晶状態であれ限定はされな
いが、一般には無水のリン脂質は吸湿性が強く容
易に１水和物を形成してしまうことが知られてい
る。ここでいう粉末結晶としての相転移温度
（Tα）は、卵黄レシチン、スフインゴミエリンに
代表される単独で液晶相をもつ脂質の場合には脂
肪酸鎖の部分が液体状態になる、即ち、液晶へ相
変化する温度を意味し、固体としての融点（mp）
を意味しているのではない（Tc＜Tα≪mp）。ま
た、ステアリルアミン、ジセチルホスフエート、
コレスタンに代表される単独では液晶相をもたな
い脂質の場合には、いわゆる固体としての融点
（mp）を意味している。DSCの測定における昇温
速度は２〜４℃／minが適当であり、各々得られ
たピークの補外開始温度を相転移温度（Tα）と
すれば良い。 このようにして測定した各種の脂質膜成分の
Tαを、そのTcと対比して下表に示す。

【表】 次に所定量の薬剤を含有する水性溶媒をとり、
あらかじめ膜成分物質の粉末結晶としての相転移
温度（Tα）以上に加温しておく。ここで膜成分
物質として何種類かを混合して用いる場合には、
用いる膜成分物質の中で最も粉末結晶としての相
転移温度（Tα）が高いものに合わせることが望
ましい。 従来のただ単に脂質のTc以上に加温する方法
では、このステアリルアミン、ジセチルホスフエ
ートの如き単独で液晶相を持たない膜成分物質が
無視されており、従つて、ジセチルホスフエート
のような高い融点（70℃）の物質が、例えばジパ
ルミトイルホスフアチジルコリン（Tc−41℃）
と共に処方された場合、リポソームの膜の中に入
りにくかつた理由がここにあると考えられる。 次にこの水性溶媒中に所定量を膜成分物質を加
えると、膜成分物質はすぐに水性溶媒中に膨潤し
始める。この時撹拌操作を行うことにより、薬剤
を保持した均一のリポソームが再現製良く得られ
ることになる。この膨潤、撹拌操作もTα以上で
行うが、この水性溶媒と膜成分物質の混合におい
ては、添加順序は任意である。 この撹拌においては撹拌機の選択によりできる
リポソームの粒径は影響を受けやすい。即ちプロ
ペラミキサーの如く比較的緩和な撹拌機を用いた
場合には大きな粒径のリポソームができやすい
し、ホモミキサーの如く比較的せん断力の強い撹
拌機を用いた場合には、小さな粒径のリポソーム
ができやすい。また更に小さな粒径のリポソーム
を製するには超音波乳化機、高圧乳化機等を用い
るのも良いし、径を均一にするため限外濾過膜
法、例えばポリカーボネート製メンブラン・フイ
ルターによつて粒径分布をコントロールすること
も可能である。 なお、同一処方内で薬剤のリポソームへの保持
率を高めるには保持させる薬剤を少量の水性溶媒
に溶かしこみ、これをまず膜成分物質との混合に
用いて、最後に残りの水性溶媒を加えて希釈した
方がよい。 このようにして薬剤を保持した均一粒径のリポ
ソーム製剤が再現製良く、しかも大量に得ること
もできるが、このリポソーム製剤ぱこのまま使用
しても良く、また透析、ゲル濾過、遠心分離等の
手段によりリポソームに保持されなかつた薬剤を
分離除去して使用しても良い。 既知のリポソーム調製法に比して本発明法が優
れているところは次の点である。 (1) 有機溶媒をいつさい使わずにリポソームの調
製が可能である。従つて、保安上、安全作業
上、及び生物学的安全性上問題ない。 (2) 製造は非常に簡便で、特別な装置や操作技術
は必要としない。 調製時の温度制御に留意するのみで良い。 (3) 薬剤の保持率の高いリポソーム製剤が得られ
る。 (4) スケールアツプが容易であり、リポソーム製
剤の工業的生産が可能である。 (5) 膜成分物質の中で一部使いにくいものもある
が（例えばコレステロールは融点が148℃と高
く、温度制御だけで膜の構成成分の一部として
入れるには若干時間がかかる。この場合、コレ
スタンなどの融点の低いステロール類によつて
代用が可能である。）、ほとんどの脂質で調製可
能である。従来のTc以上でただ単にリン脂質
粉末結晶を大量の水性溶媒中で撹拌する方法で
は、ジセチルホスフエートの如き単独で液晶相
を持たない膜成分物質が膜の中に入りにくいう
欠点があつたが、本発明によれば容易に膜中に
入れることができる。 次に実施例により本発明を例示するが、これら
の実施例は何ら本発明を限定するものではない。 実施例 １ 市販のＬ−α−ジミリストイルホスフアチジル
コリン（Ｌ−α−DMPC、純度98％、Tc−23℃）
を粉末結晶状態のまま熱的分析（DSC）にかけ
Tαを求めたところ45℃（昇温速度４℃／min）
であつた。 次にリポソームに保持させるモデル薬物として
グルコースを選び、0.28Mグルコース水溶液50ml
を水浴上55℃（＞Tα）に加温した。ここに上記
Ｌ−α−DMPC 0.7ｇを加え撹拌し均一に膨潤せ
しめた後、50〜55℃（＞Tα）にてホモミキサー
により２分間撹拌し室温に戻したところ、グルコ
ールを保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得ら
れた。 このリポソーム懸濁液0.5mlをとりセフアデツ
クスＧ−50を用いてゲル濾過（１cmφ×18cm、生
理食塩水５℃）し、リポソームに保持されなかつ
たグルコースを分離除去した。次いでリポソーム
画分のグルコースを常法従つて、油／水 分配に
より水層中に抽出し定量したところ、保持率は
9.3％であつた。 またゲル濾過して得たリポソーム画分を光学顕
微鏡（日本光学、広視野顕微鏡）により観察した
ところ、粒径1μｍ前後の均一な球状を呈してい
た。更に遠心分離を行い、得られた沈澱物につき
DSCによる熱測定を行つたところ、23℃（＝Tc）
付近にピークが認められた。 比較例 １ 実施例１と同一の処方で行い、グルコース水溶
液の加温は30℃（＞TcかつTα）、撹拌は25〜30
℃（＞TcかつTα）で行つた。ホモミキサーによ
る撹拌２分間では試料は均一に分散せず、撹拌を
中断すると沈澱物及び浮遊物が認められたことか
ら、リポソームが完全にはできないものと判断さ
れた。撹拌１時間後、均一な乳白色のリポソーム
懸濁液が得られ、この液を室温に戻した後その
0.5mlをとり実施例１と同様にゲル濾過を行つた
ところ、その保持率は5.1％であつた。 実施例 ２ 市販のＬ−α−ジパルミトイルホスフアチジル
コリン（Ｌ−α−DPPC、シグマ、純度98％、
Tc＝41℃）の粉末結晶状態でのTαをDSCにより
求めたところ54℃（昇温速度４℃／min）であつ
た。 このＬ−α−DPPC 1.0ｇに、あらかじめ65℃
（＞Tα）に保存した0.28Mグルコース水溶液50ml
を加えた後、60〜65℃（＞Tα）にてホモミキサ
ーにより２分間撹拌し室温に戻したところ、グル
コースを保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得
られた。 このリポソーム懸濁液0.5mlをとり実施例１と
同様にゲル濾過（ただ室温）を行つたところ、そ
の保持率は14.6％であつた。 またゲル濾過して得たリポソーム画分を広視野
光学顕微鏡により観察したところ、粒径1μｍ前
後の均一な球状を呈していた。更に遠心分離を行
い、得られた沈澱物につきDSCによる熱測定を
行つたところ、41℃（＝Tc）付近にピークが認
められた。 比較例 ２ 実施例２と同一の処方で行い、グルコース水溶
液の加温は45℃（＞Tcかつ＜Tα）、撹拌は40〜
45℃（＞Tcかつ＜Tα）で行つた。ホモミキサー
による撹拌２分間では試料は均一に分散せず、室
温に戻したところ沈澱物及び浮遊物が認められた
ことから、リポソームが完全にはできないものと
判断された。撹拌１時間後、均一な乳白色のリポ
ソーム懸濁液が得られ、この液を室温に戻した後
その0.5mlをとり実施例２と同様にゲル濾過を行
つたところ、その保持率は10.4％であつた。 実施例 ３ 市販のDL−α−ジパルミトイルホスフアチジ
ルコリン（DL−α−DPPC、純度99％、Tc−41
℃）を粉末結晶状態でのTα₁をDSCにより求めた
ところ62℃（昇温速度４℃／min）であつた。同
様にステアリルアミン（SA）についてその融点
（Tα₂）を求めたところ41℃であつた。従つてこ
の系のTαを62℃（＝Tα₁）とした。 次に0.28Mグルコース水溶液50mlを100mlビー
カーにとり水浴にて75℃（＞Tα）に加温した。
ここに上記DL−α−DPPC 1.0ｇ及びSA40mgを
加え撹拌し均一に膨潤せしめた後、70〜75℃（＞
Tα）にてホモミキサーにより２分間撹拌し室温
に戻したところ、グルコースを保持した乳白色の
リポソーム懸濁液が得られた。このリポソーム懸
濁液0.5mlをとり実施例２と同様にゲル濾過を行
つたところ、その保持率は15.2％であつた。 またゲル濾過して得たリポソーム画分を広視野
光学顕微鏡により観察したところ、粒径1μｍ前
後の均一な粒状を呈していた。 比較例 ３ 実施例３と同様の処方で行い、グルコース水溶
液の加温は45℃（＞Tc、Tα₂かつ＜Tα₁）、撹拌
は41〜45℃（＞Tc、Tα₂かつ＜Tα₁）で行つた。
ホモミキサーによる撹拌２分間では試料は均一に
は分散せず、撹拌を止めると沈殿物及び浮遊物が
認められたことから、リポソームは完全にはでき
ていないものと判断された。 次に撹拌温度を50〜55℃（＞Tc、Tα₂かつ＜
Tα₁）に上げて更に撹拌を２分間行つたところ乳
白色の懸濁液が得られた。しかしながらこの懸濁
液を室温に戻した後、その0.5mlをとり実施例２
と同様にゲル濾過を行つたところ試料の一部が注
入口付近にとどまつていた。 カラムを通過したリポソーム画分につきグルコ
ースの保持率を求めたところ8.5％であつた。 実施例 ４ 膜成分物質として実施例３と同じDL−α−
DPPC（Tc＝41℃、Tα₁＝62℃）を用い、更にジ
セチルホスフエート（DCP）についてDSCによ
りその融点（Tα₂）を求めたところ70℃（昇温速
度４℃／min）であつた。従つてこの系のTαを
70℃（＝Tα₂）とした。 0.28Mグルコース水溶液50mlを水浴上75℃（＞
Tα）に加温した。ここにDL−α−DPPC 0.7ｇ
及びDCP55mgを加え撹拌し均一に膨潤せしめた
後、70〜75℃（＞Tα）にてホモミキサーにより
２分間撹拌し室温に戻したところ、グルコースを
保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得られた。 このリポソーム懸濁液0.5mlをとり実施例２と
同様にゲル濾過を行つたところ、その保持率は
13.8％であつた。 比較例 ４ 実施例４と同一の処方で行い、グルコース水溶
液の加温及び撹拌は65℃前後（＞Tc、Tα₁かつ
＜Tα₂）で行つた。ホモミキサーによる撹拌を30
分間行つたが、乳白色の懸濁液が得られるもの
の、懸濁液中にDCPと思われる白色結晶が多く
認められ室温に戻して放置したところ沈降した。
これはこの温度での条件ではDL−α−DPPCは
水和されてリポソーム化するが、荷電物質である
DCPはその融点（Tα₂）が高いため、膜を構成す
る一成分となるに至らなかつたためであることが
示唆された。 この懸濁液の上層を0.5mlとり、実施例２と同
様にゲル濾過を行つたところその保持率は8.9％
であつた。 実施例 ５ 完全水添精製卵黄レシチン（IV＝１、リン脂
質99％以上、Tc＝45〜60℃、Tmax＝52℃）の
粉末結晶状態でのTα₁をDSCにより求めたところ
67℃（昇温速度４℃／min）であつた。また荷電
物質としてはジセチルホスフエート（DCP、Tα₂
＝70℃）を用いることとし、この系のTαを70℃
（＝Tα₂）とした。 次に上記完全水添精製卵黄レシチン11.0ｇ及び
DCP820mgをあらかじめ75℃（＞Tα）に保温し
た0.28Mグルコース水溶液300mlを加えた後、70
〜75℃（＞Tα）にてホモミキサーにより３分間
撹拌し室温に戻したところ、グルコースを保持し
た乳白色のリポソーム懸濁液が得られた。 このリポソーム懸濁液0.5mlをとり実施例２と
同様にゲル濾過を行つたところ、その保持率は
28.0％であつた。 比較例 ５ 実施例５と同一の処方で行い、グルコース水溶
液の加温及び撹拌は60〜65℃（＞Tc、＜Tα₁、
Tα）で行つた。ホモミキサーによる撹拌を30分
間行つたが、比較例４と同様懸濁液中にDCPと
思われる白色結晶が多く認められ、室温に戻して
放置したところ沈降した。 比較例４と同様、この懸濁液の上層を0.5mlと
り実施例２と同様にゲル濾過を行つたところその
保持率は19.0％であつた。 実施例 ６ 実施例５と同様にして0.28Mグルコース水溶液
の代わりに１％デキストランT40生理食塩水溶液
を、ホモミキサーの代わりにプロペラミキサーを
用いて調整したところ、デキストランT40を保持
した乳白色のリボソーム懸濁液が得られた。 このリポソーム懸濁液１mlをとりセフアローズ
CL−4Bを用いてゲル濾過（2.2cmφ×42cm、生理
食塩水）し、リポソームに保持されなかつたデキ
ストランT40を分離除去した。次いでリポソーム
画分のデキストランT40を常法に従つて油／水分
配により水層中に抽出し定量したところ、保持率
は21.2％であつた。 実施例 ７ 実施例６と同一処方で行つたが、デキストラン
T40は高濃度生理食塩水溶液で添加し、この段階
で撹拌してリポソームを調製し、その後残りの生
理食塩水を加えて希釈、撹拌した。即ち実施例６
と同様にまず完全水添精製卵黄レシチン11.0ｇ及
びDCP820mgをとり、あらかじめ75℃（＞Tα）
に保温した２％デキストランT40生理食塩水溶液
150mlを加えた後70〜75℃（＞Tα）にてプロペラ
ミキサーにより３分間撹拌した。この液を室温に
戻した後、更に生理食塩水150mlを加えて室温に
てプロペラミキサーにより２分間撹拌したとこ
ろ、デキストランT40を保持した乳白色のリポソ
ーム懸濁液が得られた。 このリポソーム懸濁液１mlをとり実施例６と同
様にゲル濾過を行つたところ、その保持率は29.7
％であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ リポソーム膜成分物質と水性溶液とを、粉末
   結晶としての膜成分の相転移温度（Tα）以上で
   かつ低くても50℃にて、撹拌することを特徴とす
   るリポソームの製造法。