JPS5869224A - ポリβ―ヒドロキシ酪酸エステル共重合体及びその産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この宅明け、ポリβ−ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと略
記する）に関している。

ＰＨＢは、微生物、細胞内部士粒子伏のエネルギー貯蔵
物質として、種々の微生物、′王としてバクテリアによ
り蓄積される。

このような細ｌ＠から抽出したＰＨ８は、次の繰返し単
位の熱可塑性ポリエステルであシ、−〇・ＣＨ（ＣＨ３
）　ＣＨ２Ｃ０− 急速に比較的高いレベル例えば７０％またはそれμ上の
オーダーまで結晶化する。この結晶化挙動は、重合体ｋ
　Ｖｙｌｌえば成形用材料として使用すると傘には、し
ばしば欠点となる。

このＰＩ（Ｂの（ル晶化は、重合体鎖に非頑似拳置体の
学位を組み入れることで変性できることが判明した。　
　　　′： かぐして微生物をある種の有機酸の存在下において特定
の条畔下で培養することにより小割合のコモノマ一単位
を重合体鎖中へ導入することができる。そのような酸の
一例はプロピオン酸である。

この発明は以下の理論に何ら拘束されるものではないが
、そのような重合体をもたらす代謝経路は下記の如くで
あると考えられる。下記において、 ＣｏＡＳＨは、末エステル化補酵素Ａである。

したがってＣＨ３ＣＯ８ＣｏＡは補酵素Ａのアセチルチ
オエステルで、一般にアセチルＣｏＡ　と称されている
。

ＮＡＤＰは、酸化状態のニコチン酸アミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェートである。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈｚは、還元されたＮＡＤＰである。

微生物によるＰＨＨの生合成における第１工程は、アセ
チルＣｏＡの合成と考えられる。これは、例えば補酵素
Ａと酢酸エステルから、またはピルベートｃｊｋ水化物
のグリコリシス（解糖）生成物であるか、またはオキサ
ロアセテート（トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルまた
はクレブスサイクルの一員である）の脱カルボキシル化
で生成する〕の脱カルボキシル化により形成される。

したがって、アセチルＣｏＡ源としての酢酸エステルで
、ＰＨＢは次の諸反応を含む代謝経路で産生される： チオキナーゼ （１）　ＣＨ３・ＣＯ・０−＋ｃｏＡＩＩＳＨＣＨ８Ｉ
ＩＣ０１１ＳＩＩＣｏＡ＋ＯＨ−β−ケトチオラーゼ ＋２１　２Ｃｔ（３＊Ｃ０５ＳｓＣｏＡＣ＆ｌＩＣ０・
ＣＨ２・ＣＯ＠Ｓ・ＣｏＡ＋ＣＯＡ＠ＳＨすダクターゼ ＋３）　　　ＣｋＩ３・ＣＯ・Ｃ１（２１１ＣＯ・Ｓ　
＠ＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ，−−−一一−−ｍ−ＣＨ８＠Ｃ
ＨＯＨ・ＣＨ２ΦＣ０−８＠ＣｏＡ＋ＮＡＤＰ（６−ヒ
ドロキシブチリルＣｏＡ） ポリメラーゼ （４）　　ＣＨ３・ＣＨＯＨＩＩＣｌ（２ＩＩＣＯ＠５
ＬＩＣＯＡ−〇〇Ｃ１（（ＣＨ３）・ＣＨ２＠ＣＯ−＋
ＣｏＡＳＨ（重合体中の繰返し単位） 従って反応（４）は、主長中の重合体鎖に一つの−０・
ＣＨ（Ｃ）１３）・ＣＩ（２拳Ｃ〇−単位を付加する。

関与する酵素類がプロピオン酸に関して特異性を欠くの
で、対応する経路は下記の如（であると考えられる。

（１ａ）ＣＩ（３＋１Ｃ几−Ｃｏｏ″″＋ｃｏＡＩＩＳ
Ｈ−−一−ＣＨ３脅Ｃ１（２・ＣＯ・Ｓ＠ＣＯＡ＋　０
Ｈ（２ａ）ＣＩ（８・ＣＨＱ・ＣＯ・５１１ＣｏＡ＋Ｃ
Ｈ８・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡ−→Ｃ１（３・ＣＨ２・ＣＯ・
Ｃｆ（２働ＣＯ・ＳΦＣｏＡ＋ＣｏＡｅＳｔ（（３ａ　
）　　ＣＩ（ａ＠　Ｃ５・ＣＯ・Ｃ１（２１１Ｃｏ　・
Ｓ　Ｃｏ　Ａ＋ＮＡＤＰＨ２→Ｃル＠Ｃ１（２＠ＣＥＤ
ｆ（’ＣｋＩ２＠■・５ＩＩＣＯＡ＋ＮＡＩ）Ｐ（４ａ
　）　　ＣＨｓ　・ＣＨ２・ａ（肘ｓｃｉ％　”■・Ｓ
＠ＣｏＡ　−ｍ−→−（）”ＣＭ（Ｃ２ｆ（ｓ）　”Ｃ
Ｈ２”ＣＯ−＋ＣＯＡ”ＳＨすなわち、ＰＨ８がペンダ
ント状メチル基を有するのと対照的にペンダント状メチ
ル基を有する繰返し単位が重合体鎖中へ導入される。

６−ヒドロキシ醋酸１ｆｆｆ、即ち次の学位−０ＣＨ（
Ｃ）Ｌ、）Ｃｔ（２ＣＯ− および他の単位金そ、り池の学位と共に含むある種の重
合体は、既に文献に記載されている。

エチレン性不飽和を示すといわれる赤外バンドを示す重
合体が、１）ａｖｉｓ　　によりｒＡｐｐｌｉｅｄＭｉ
ｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙｊ±２（１９６４）ｐ、５Ｕ１〜
３Ｕ４に宅表されている。１）ａｖｉｓによって、６−
ヒドロキシ船酸単位および次の６−ヒドロキシ−２−ブ
テノン酸重信 −ＱＣ（ＣＨ３）＝　ＣＨＣＯ− を含む共重合体であるとされているこれら重合体は、Ｎ
ｏｃｏｒｄｉａをｎ−ブタンで培養して産生された。

Ｗａｌｌｅｎ外はｒＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｅｌ　５ｃ
ｉｅｎｃｅａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６　（１９７
２）ｐ、　１６１〜１６４および旦（１９７４）ｐ、５
７６〜５７９に、活性汚泥から学離し反覆洗浄後融点９
７〜１００℃で、β−ヒドロキシ酪酸単泣および次の６
−ヒトロキシバレリ了ン酸単位 −ＯＣＲ（Ｃ２Ｈ３）　ＣＨ２ＣＯ− を１：５の比で富む重合体ｅ％表している。

Ｍａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ外は、ｒＩＵＰＡｃ　　ＩＶ
Ｉａｃｒ。

Ｆｌｏｒｅｎｃｅ　　１ソ８０　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｏｎ　ｌＶｈｃｒｏｍｏｌ
ｅｓ　Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ　Ｊ２（１９８０）ｐ、２７
２〜２．７５に、この重合体の研究を報告し、王として
６−ヒトロキシノ（レリアン醸嘔位を言むことを碓認し
ている。

ＵＳＰ３２７５６１０には、ある種の微生物、特にＮｏ
ｃａｒｄｉａ　ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ　　を炭素原
子４個を含むカルボン酸で培養することによるポリエス
テルの微生物学的産生法が示されている。

その実施例２および３では、それぞれ６−ブテノン酸お
よび２−ヒドロキシ酪酸を用い、重合体は示された融点
の１７８〜１８４℃のオーダーからポリ６−ヒドロキシ
酪酸エステルであると見られる。しかし、実施例１では
、２−メチルアクリル酸（すガわちメタクリル酸）を用
い、得られた重合体は同定してないが、融点２１５〜２
２０℃ヲ有シかつメチルエチルケトンに可溶性と説明さ
れている。これと対照的に、この発明の主とし６−ヒド
ロキシ酪酸残基を含む共重合体は、融点１８０℃以下で
冷メチルエチルケトンに不溶性である。

ＰＨＢ蓄積性微生物を、適当な基質、即ちエネルギーお
よび炭素源で好気培養すると、微生物は増殖のための必
須要素の一つまたはそれ以上が消尽されるまで増殖する
。以下においてこの微生物の増殖を、′繁殖″と称する
。１１：Ｔ４必須要素の一つが消尽されたと傘、その後
の繁殖は、もしあったとしても極めて限られた程髪であ
るが、基質が消尽されない限り、ＰＨ８は微生物に蓄積
される。

ある樺の微生物では、ＰＨＢ誘宅抑制因子（例えば１つ
またはそれ以上の繁殖必須要素の制限）が存在しなくて
も、微生物の繁殖中にＰＨＢは蓄積するであろう；しか
じ、構造的にＰＨＢを産生する微生物の場合を除き、こ
のように蓄積したＰＬ（Ｂの址は一般に少量で、代表的
には得られる細胞の約１０ｗｔ％以下である。

したがって、／匂チ式培養で繁殖したとき　ｋｇ構造的
ＰＨＢを産生じない微生物は、１つまたはそれ以上の繁
殖必須要素が消尽される壕では、殆んどまたは全くＰＨ
Ｂを蓄積せず繁殖し、その鎌做生吻はＰＨＢを合成する
。

従って共重せ体を産生させるには、６−ヒドロキシ酪酸
単位μ外のコポリマー学位を与える酸またはその誘導体
を、重合体蓄積期間中に存在する基質の少な（とも一部
として１吏用することが必要である。６−ヒドロキシ酪
酸重信頃外のコポリマー重信を与える酸またはその誘導
体を、この明細書では「基質のコモノマー成分」（また
は単に「コモノマー成分」）と称することがある。

培養条件が、ポリエステル（例えばＰＨＢ）が顕著には
蓄積されないような培養条件でりると基質のコモノマー
成分は、しばしば微生物により別の経過で代謝３れ、例
えは了セチルＣｏＡまたはＴＣＡサイクルの一員になり
、共重合体は産生されなくなる。したがって、−例とし
て、何らの繁殖制限なしてはプロピオン酸は微生物によ
り代謝され、プロピオニルＣｏＡ　を経て次いで炭酸ガ
スを取り込みメチルマロニルＣｏＡ、次いでＴＣＡサイ
クルの一員であるサクシネートになる。

そのような別の経路による「基質のコモノマー成分」の
代謝は、ＰＨＢｋｆＪ造的に産生ずる微生物を用いる場
合にも起こる。従って、ｆ１１＠的ＰＨＢ蓄積微生物を
用いる場合でさえも、繁殖のためには必須であるがＰＨ
Ｂ蓄積のためには必須ではない−またはそれ以上の要素
の縦が制限された条件下で微生物を培養することによシ
重合体を蓄積させるのが好ましい。繁殖のための必須要
素を制限し、かくして重合体が微生物によって蓄積され
る条件下で、微生物を培養する場合でさえも、基質のコ
モノマー成分の幾分かは、アセチルＣｏＡまたはＴＣＡ
サイクルのメンバーをもたらす経路により代謝されるこ
とがある。このことにより、コモノマー成分が重合体蓄
積段階中の唯一の基質であるときにさえも、微生物は、
共重合体へ導入されるだめの６−ヒドロキシ幅酸争位な
らびにそれ以外のコポリマ一単位を合成しうるのである
。またプロピオネ−１７１−ラの６−ヒドロキシバレレ
ートの産生について上記に示唆した代謝経路によって示
されるように、一つの工程、すなわち反応（２ａ）では
、プロピオニルＣｏＡとアセチルＣｏＡ　との反応が行
われる。従って、プロピオネートが唯一の基質であると
Ａには、プロピオネートの幾分かは代謝されて了セチル
ＣｏＡ　　となシ、６−ヒトロキシバレリ了ン酸嘔位が
産生されつる。

上記に示した共重合体中に６−ヒトロキシバレリアン酸
重信をもたらす諸代謝経路に加えて、基質のコモノマー
成分として１重々の池の物質を用いることによりその也
の反応が起こりうる。

例えは、その曲のヒドロキシ置換カルボン酸は、（もし
例えば了セチルＣｏＡ　またはプロピオニルＣｏＡ　ｋ
もたらす他の経路によって代謝されなければ）場合によ
っては、゛ポリメラーゼによって重合体中へ導入するこ
とも可能であり、例えば、 ＨＯｌｌＣＲＲ・（ＣＲＲ）ｎ＠Ｃ０ＩＩＣＯＡ−ｍ−
→−０・ＣＲＲ（ＣＲＲ）ｎ　＠ＣＯ−＋　ＣｏＡＳ、
ｔ（〔ここにｎはゼロ−１−たり整数であり、Ｒ，Ｒ。

ＲおよびＲは同一かまたは相異なっていてよ（、炭化水
素基（例：アルキル、アラルキル、了り−ルまたはアル
カリール基）；ハローおよびヒドロキシ−置換炭化水素
；ヒドロキシ；ハロゲン原子；および水素原子；から選
択される〕。

もちろん、ｎ＝１およびＲ＝Ｒ＝Ｒ＝水素である場合、
もしＲがメチル基であるならば、ヒドロキシカルボン酸
は、代謝されて直接に６−ヒドロキシ酪酸単位を与える
６−ヒドロキシ酪酸である。

好ましくは、基Ｒ，Ｒ，ＲおよびＲのそれぞれは、４よ
り少ない炭素原子を含む。一般に１　　　１１　　　１
＋’　　　　　　　　４Ｒ、Ｒ、ＲおよびＲのうちの少
な（とも一つは水素である。ｎはゼロ、１または２であ
るのが好ましい。

そのようなヒドロキシカルボン酸は、そのままの状態で
基質のコモノマー成分の一部または全部として添加され
ても、あるいはその他のコモノマー成分材料から微生物
によって合成されてもよい。

アクリル酸、６−クロルプロピオ／酸および６−ヒドロ
キシプロピオン酸のような酸は、６−ヒドロキシｔＷ５
ｎ単位とその他の単位を含む重合体を与えうろことが判
明した。若干の場合に、コレラの他の学位のすべては、
６−ヒトロキシバレリアン鍍単位であるが、別の場合に
は他の単位（すなわち前記定義の第位Ａであって、６−
ヒトロキシバレリ了ン酸単泣と関連して生じうるもの）
は、就中、下記（ｉ）　、　（ｉｉ）を示すプロトンお
よび　Ｃｎｍｒスペクトルによって同定される。

（ｉ）　　４．５　ｐｐｍにおけるプロトンｎｍｒ　　
）リプレット。

（ｉｉ）　　５９．８９および６３．８６ｐｐｍ　にお
ける３ Ｃｎｍｒノヒーク（テトラメチルシラン［４対照）。

これらのｎｍｒ　　データから、これらの単位は６−ヒ
ドロキシプロピオン酸学位（ｎ＝１、Ｒ＝Ｒ＝Ｒ−Ｒ＝
Ｈ）であると確１ぎされる。

共重合体は４−ヒドロキシカルボン酸φ位（ｎ−＝　２
、Ｒ’＝ＣＩ（、、Ｒ＝Ｒ＝ＦＬ　＝Ｈ）”ｋ含むこと
もある。

６−ヒドロキシプロピオン酸革位および／または４−ヒ
ドロキシバレリ了ン酸拳位は、中間体の ＣＨａ・ＯＨ＠Ｃル・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡおよびＣＨ１３
＠ＣＨＯＨＩＩＣ几・Ｃ八・ＣＯ・Ｓ・ＣｏＡから由来
することもありうる。前者は６−ヒドロキシプロピオネ
ートおよびＣｏＡ１１ＳＨから生成されうる。それ自体
で供給されるμ外に、６−ヒドロキシプロピオネートは
アクリレートの水和反応 ＣＨ，＝ＣＨ”Ｃｏｏ−＋Ｈ，０−ＣＨＯＨ−ＣＨ，−
ＣＯＯ−により、または６−クロルプロピオネートのυ
０水分解 Ｃ几α・ＣＨ，・αη−＋ＯＨ−→皿くル・σσにｒに
よシ生成されうる。４−ヒドロキシバレリルＣｏＡＩｄ
、アセチルＣｏＡとアクリルＣｏＡの縮合、それに続く
還元、すなわち ａＬ・ＣＯ＠５Ｌ１ＣｏＡ十ＣＩ（ｌＩ＝部・ＣＯ・５
１１ＣＯＡ−一−Ｃ市・ｃｏ−ｃＨ＝ｃＨ−Ｃ６−ｓ□
・ＣＯＡ＋Ｃ０Ａ−８Ｈ−・Ｃ０１１ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ
・Ｓ＠ＣＯＡ＋２ＮＡＤＰＨｒ−今（１（、・ＣＨＯＨ
・Ｃｆ（２ＣＨ２働ＣＯ・Ｓ＊ＣｏＡ＋　２ＮＡＤＰに
よって生成されうる。

同様に４−ヒドロキシバレリルＣｏＡ　Ｉｄ、６−ヒド
ロキシ−または６−クロル−プロピオネートから、アセ
チルＣｏＡ　　との縮合およびｊ脱水（６−クロルプロ
ピオネートの場合には中間の加水分解工程を行う）の反
１忍により生成しうる。

従って、この発明の方法により、６−ヒドロキシ酪酸単
位 １　−０・ＣＨ（ＣＨ３）・ＣＨ２−Ｃ０−を下記式の
単位 １１　−０・ＣＲＲ・（ＣＲＲ）ｎ＠ＣＯ−と共に含む
共重合体τ得ることが可能である。

〔上記式においてｎはゼロまたは整数であり、Ｒ、Ｒ、
ＲおよびＲのそれぞれは、炭化水素基（例えばアルキル
、アラルキル、了リールまたはアルカリール基）；ハロ
ーおよびヒドロキ’、’−ｖ換炭化水素基；ヒドロキシ
基：ノーロゲン原子；および水素原子；力・ら選択され
るが、ｎ−が１、そしてＲ，ＲおよびＲがそれぞれ水素
原子であるならばＲはメチル基でないことを条件とする
〕。好ましくは、Ｒ、Ｒ、ＲおよびＲのそれぞれは４個
より少ない炭素原子を含む。好ましくはｎはゼロ、１ま
たは２である。

共重合体は単位Ｈの２μ上のタイプを含むことがある。

好ましくは単位Ｈの少な（とも幾分かにおいてｎ＝１、
Ｒ＝Ｒ＝Ｒ＝ＨそしてＲ−エチルである。

プラスチック材料として実用的であるためには、重合体
はｉｏ、ｕｏ、ｏ以上の重址平均分子敏Ｍｗ　（例えば
ゲル滲透クロマトグラフ法によって測定）を有すべきで
ある。

共重合体中の燥返し単位１１の割合は、共重合体の全繰
返し単位の０．１ないし５０モル係、軛特に１ないし４
０モル係である。場合によっては、微生物により得られ
る重合体は、繰返し単位Ｉのホモ車合体と繰返し単位Ｉ
および■を含む共重合体との混合吻である。この場合、
重合体中の繰返し単位■の全体の割合は、全繰返し単位
の０．１ないし５０モルチである。蹟も好ましくは、繰
返し単位１１の４０合は、６ないし６０モルチである。

顕著な割合のコモノマー卓立１１を得るには、基質のコ
モノマー成分中の化学結合炭素の敵は、微生物によって
重合体が蓄積されつつあるような培養条件期間中に存在
する基質中の全化学結合炭素の少なくとも２重１％、好
ましくは少なぐとも１０重量％であるべＡである。

そのような期間中は、コモノマー成分は基質中に存在す
るカルボン酸（またはその誘導体）のみであるのが好ま
しいが、場合によってはアセテートが存在することもあ
る。

この発明によれば、ポリエステルを４積で傘る微生物を
、水性培地中において水溶性の資化性炭素含有基質で培
養し、その際に培養の少な（とも一部期間昧その１救主
吻によってポリエステルが蓄積される条件下で培養を行
うことにより、熱可塑性ポリエステルを離生させる方法
において、少なくともポリエステルが４積する培養期間
部分中は、該資化性炭素含有基質は、該ポリエステル蓄
積条注下で微生物によって代謝されて、−ｏ＠ｃＨ（Ｃ
Ｈ’ａ）・ＣＨ，・ＣＯ−繰遅し単位からもっばら構成
されるもの以外のポリエステルとなる有域酸もしくは有
機酸誘導体を含むこと、かつ該酸もしくは酸誘導体中の
化学結合炭素の敵は該ポリエステル蓄積期間中に存在す
る基質中の全化学結合炭素の少なくとも２重徽係をなす
ことを特徴とする上記熱可塑性ポリエステルの微生物学
的産生方法が提供される。

水性培地中のコモノマー成分の濃度はＬｌ、Ｌｌ５　ｆ
／ｌμ上であるべきであり、好ましくは０．１〜５２／
ｌのｌ＄に度であろう。従って、コモノマー成分の水溶
解度は０．０５ｆ＃μ上であるべきで、また培養を品度
において所望のコモノマー成分濃度を与えるのに充分で
なければならないことは明かであろう。

コモノマー成分は、酸自体であっても、あるイハ、塩、
エステル（ヒドロキシ置笑酸の場合、ラクトン類を含む
）、無水物、了ミドまたはノ・ライドであってよい。

前述のように、培養ＡＡ間の少な（とも一部は、微生物
の増殖にとって必須であるがポリエステルの蓄積のため
には必須でない要素を制限した条件下で培養を行うのが
好ましい。最も便宜な増殖要素の制限は窒素の制限であ
る。この理由のため、窒素制限を採用する場合、基質は
窒素を含まないことが好ましく、従ってアミド類は余り
好ましい基質ではない。

共重合体を生じうる酸は、培養が重合体蓄積段階にある
と底に慄返し単位１のみを与えない酸であるべきである
。従ってこの点から望甘しくない酸の例としては、酢酸
、５−ヒドロキシ酪酸、ＴＣＡサイクルのメンバー、な
らびに培養が重合体蓄積段階にあるときにアセチルＣｏ
Ａおよび／またはＴＣＡサイクルのメンバーのみを与え
る酸類がある。かぐして、不鴫当な酸としては、ホスホ
グリセリン酸、ピルビン酸、クエン酸、イソクエン酸、
σ−ケトグルタル酸、サクシン酸、フマル酸、マレイン
酸、リンゴ酸、オキサル酢酸、オキサロサクシン酸、ア
コニチン酸、およびメチルマロン酸がある。アミノ酸も
同様に不適当である。共重合体を与えないことが判明し
たその他の酸としては、ギ酸、酪酸、フェニル酢酸、安
息香酸、クロル酢酸、２−クロロプロピオン酸、６−ヒ
ドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、２−クロロ酪酸、
２−メチルアクリル酸、２，６−シメチルアクリル酸、
６．６−シメチルアクリル酸、乳酸、グリオキシル酸お
よびグリコール酸がある。

共重合体を与えることが判明した酸としては、プロピオ
ン酸、６−ヒドロキシプロピオン酸、６−クロロプロピ
オン酸、６−ニトキシプロビオン酸、２−ヒドロキシ酪
酸、イソ酪酸、およびアクリル酸がある。受用しうるそ
の他の酸としては、奇数の炭素原子を含む高級飽和カル
ボン酸、例えばバレリン酸、ヘプタン酸、ピバリン酸お
よび置換プロペン酸（例：２−および６−クロロプロペ
ン酸）がある。

前述の通り、場合によっては、微生物は酸に別の作用を
行うこともある。したがって、イソ酪酸はｎ＝１、Ｒ＝
　Ｒ，＝　Ｒ＝１（、Ｒ−イソプロピル基の繰返し嗅立
１１を与える。ｎ＝１、Ｒ２＝Ｒ＝Ｒ＝Ｈ，Ｒ−エチル
基の繰返し単位１１は、微生ｉが共重合体への代謝、経
路中で、メチル基を水素で置換することを示している。

共重合体を与えうる好ましい酸は、プロピオン酸、イソ
ラフ醒およびアクリル酸である。そのような酸の適当な
誘導体としては、アルカリ金鴫塩および低級アルキルエ
ステル（アルキル基が１〜４個の炭素原子をよむもの）
がある。

特に適当なエステルとしては、プロピオン肩のメチル、
エチル、イソプロピル、プロピル、ブチルおよびイソブ
チルエステル更；イン市域のメチルおよびエチルエステ
ル類；ならびにアクリル酸のメチルおよびエチルエステ
ル類；がある。

共重合体形成性の酸（または酸誘導体）の混合物は、基
質のコモノマー成分として１吏用できる。例えばプロピ
オン酸とアクリル酸との（混合物を用いて興味ある結束
が得られている。

前述のように、ＰＨＢを構造的に産生ずる微生物を用い
る場合でさえも、ポリエステル”が蓄積される微生物培
養期間を、増殖には必須であるがポリエステル蓄積には
必須でない栄養素の制限の条件下に実施するの力ｉ好ま
しい。

基質および酸素（これは一般に培養槽の水性培地に空気
を注入して供給される）に加えて、各種の栄養塩類が微
生物が繁殖で六るために必要である。したがって、一般
に資化できる形態の次の元素源（普通は水溶性塩）が必
要である：窒素、リン、イオウ、カリ、ナトリウム、マ
グネシウム、カルシウムおよび鉄とともに微量元素、例
えばマンガン、亜鉛および銅。酸素の醗酵器への供給を
制限してポリエステル蓄積を誘導することも可能である
が、１種またはそれμ上の栄＃塩の−Ｉｌｔを制限する
のが好ましい。市１］限するのに最も実用的な元素はＰ
窒素、リンであり、余シ好ましくないのはマグネシウム
、イオウまたはカリである。これらの中でも、窒素（こ
れはアンモニウム塩で供給するのが便利である）の量を
制限するのが最も好ましい。必要とされる資化性窒素の
緻は、ポリエステル４積の少ない細胞の所望直置の約８
〜１５％である。

醗酵は、水性培地１１当りポリエステル含有細胞の乾燥
電歇が少なくとも５ｖになるように行うのが好ましい。

したがって、もし例えばＰＨＢ含有緻４０蛸膚のＰＨＢ
含有、１胞を１０ｆ／ｌで作ろうとすれは、細胞繁殖量
制限のために培養槽に供給される必須栄養の盪け、ＰＨ
Ｂを含まない細胞６２／ｌの繁４を支持するのに要する
量である；したがって、もし窒素を繁殖制限栄養として
用いれば、ＰＨＢ’！１ｍ含まない細胞の窒素含有数は
約８〜１５ｗｔ％であるから、必要な資化性窒素の着は
約０．５〜０．９ｆ／ｌでアリ、例えばアンモニアイオ
ンＬ１．６〜１．２ｒ／ｌである。

培養は、例えばｐＨ，温度および曝気の程度（酸素を制
限栄養源としないと微）を当該微生物に対し常用する条
件下で行う。同１チに、用いる栄養塩類（その−用曖は
上記の条件を考Ｉ、イして決定される繁殖制限栄養源以
外のもの）は、当該微生物の繁殖に通常用いる曖である
。

微生物は、４易に代謝できる基質、例えば炭　゛水化物
で、重合体蓄積段階で制限すべき繁殖に必要な栄養源の
充分な置の存在下に、培養にょ９所望の重量まで繁殖さ
せ、次いで重合体蓄積を生じさせるＶ：殖要素制限の条
件下で培養するのが好ましい。場合によシ、繁殖段階の
少な（とも一部（また−合によっては金時についての基
質は、重合体蓄積段階で繰返し単位１になる酸（または
その誘導体）であってよい。

培養は、繁殖には必要であるが重合体蓄積には必要でな
い栄誉源の駿が不足ないし消尽したときに、重合体蓄積
が起こるバッチ式培養で行うことができる。別法として
、培養は、新鮮な水性培地および基質の添ｏｎ速度に対
応する速度で、培養槽からバクテリア細＠を富む水性培
地を連続的または間欠的に除去する連続式培養で行うこ
とができる。培養槽に供給する制限栄養源の曖は、槽か
ら除去した水性培地がこの栄養源を殆んど宮まぬような
せであり、そして槽から除去した水性培地を、次いでパ
ンチ戊または好ましくは連続式で操業する＃Ｊ２培養槽
に供給し、コモノマー成分をきむ拶丁鮮な漬誓の添ｖ口
で、通気培養全継続して重合体蓄積金蔵こさせるのが好
ましい。この追卯の培養工程で、追７．ａｄの基質およ
び栄養塩ｄｋ添Ｕロシてよいが、追υ口累殖は一般に好
ましくないので、聚りｕを制限するのに用いる栄誉源は
さらにｊＪＤえるべをではない。

しかし、第１４４に槽から別の１個またはそれμ上の培
養槽に供給した水性培地に、制限栄養源が若干の残′Ｉ
ＩＩｔａまれることおよび／またはその少献を添すロす
ることが、幼未的な操業に好ましいことは了解されよう
。

別法として、培養は一段連続式プロセスとして実施する
こともできる。栄養制限によりポリエステル蓄積を達成
するには、培養槽における培地の滞留時間を、微生物が
増殖して培養槽に供給された制限栄誉全中いノ（シ、か
つ次いで微生物がポリエステルを蓄積するのに充分であ
るように、長くする。

上記のバッチ式または連続式の何れの場合も、共重合体
繰返し単位ｎを与えるのに用いる酸（またはその誘導体
）は、繁殖に必要な栄養が消耗したと傘に起きる重合体
蓄積段階中の基質の一部または全部として用いられる。

こΩ酸は、繰返し単位Ｉを与える基質（例えば炭水物）
との混合物で用いるか、または唯一の基質であることも
ある；後者の場合、十分なコモノマー成分が、アセチル
ＣｏＡへの別の経路で代謝されて繰返し単位Ｉを与え、
例えばもし別の経路が反応（２ａ）を含めば、繰返し単
位Ｉｌを得るのに必要な任意のアセチルＣｏＡ、が用い
られる。

しかし、コモノマー成分が唯一の基質であれば、重合体
収駿は往々にして低下する。

コモノマー成分は、重合体蓄積段階の一部のみに存在さ
せることもで勇る；コモノマー成分が存在する重合体蓄
積段階の部分の前および／または後に起きる、重合体蓄
積段階の残部では、繰返し単位Ｉのみを与える捲質が、
唯一の基質であることがある。

場合によっては、面層の経路に必要な酵素をブロックす
ることおよび／′または必要な酵素合成の能力のない１
政生物を用いることにより、酸のアセチルＣｏＡへの曲
常の代謝全阻止することも可能である。しかし、実質的
収酸の重合体を得るために、繁殖に要する栄養を制限し
、好ましくは消耗した条件下での一定期間の培養が、一
般に好ましい。

培養は、蓄積ポリエステルの破が、バクテリア細胞の約
５Ｕ〜８０ｗｔｑｂになるように行うのが好ましい。

使用で六る微生物は、共重合体を製造しようとする酸ま
たはその塩會同化できる任意のポリ（６−ヒドロキシ陥
酸エステル蓄積性微生物である。バクテリアＡｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（従来は）ＬＹｄｒ
ｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ　ｅｕｔｒｏｐｈａ　として知ら
れていた）欅、例えばこの１の学術的研究に広（用いら
れたｔ−１１６株、［ＡＴＣＣＡ１７６９９、Ｊ　Ｇｅ
ｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７ソ）１
１５、ｐ、１８５〜１９２診照〕およびＨＩ３株の変異
株、例えば１１７７Ｂ、８６０１／Ｃ５，５５Ｕ１／Ｃ
２９および５）０１／Ｃ４１（それぞれｔｈｅ　Ｎａｔ
ｉｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ、ＴｏｒｒｙＲｅｓｅａ
ｒｃｈ　　５ｔａｔｉｏｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、５ｃｏ
ｔｌａｎｄに、１９８０年８月１８日に寄託した、ＮＣ
Ｉ　Ｂｉ２１６００．　１１５９ソ、１１５９７　およ
び１１５９８）が特に適している。ＡＴＣＣ番号は、ｔ
ｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　、　１２３０１　Ｐａｒｋ　Ｌａ
ｗｎＤｒｉｖｅ　。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２
　Ｕ−８，Ａ。

で与えられた番号である。上記の通り、繁殖段階中、炭
水化＆’に基質として用いるのが好ましい。Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　　Ｈ１６株（ＡＴ
ＣＣム１７６９９）は、グルコースを資化しないが、そ
の変異株例えは上記の１１／７Ｂ、８５０１／Ｃ’）、
５５Ｌ１１／Ｃ２９およびＳり０１／Ｃ４１は、グルコ
ースを資化で勇る。炭水化物、特にグルコースは、コス
トの面および微生物が効嚇的に−ｇ４できるので、繁殖
段階での好ましい基質である。

ポリエステルは、微生物細胞内部の顆粒として産生され
る。ポリエステルを含有する細胞は、例えばＵＳＰ３１
０７１７２に示すように、そのままで成形材料として用
いられるが、−役にポリエステル金、バクテリア細胞か
ら分離するのが好ましい。これは、細＠を細胞破壊、次
いで適当な爵剤でポリエステル全抽出することで達成さ
れる。適当な抽出処理の例は、ヨー口・ｌバ特許出７第
１！：１１２６号に記載されている。

上記のａ９、共徂廿体が実用で鳶るためには、共重合体
はゲル、参透クロマトグラフ法で測定した重量平均分子
ｔ（Ｍｗ）１０．ＬＩＬＩＯ１ｌ上を有しなければなら
ない。好ましくは、ｉｖｌｗは５０、ＯＵＯμ上、より
好ましくはｌ０ＬＩ、０ＯＬ１μ上、特に２ＬｌＯ，Ｕ
Ｏυμ上である。

共重合体は、濱にυ−立体配置ヲ有し、６−ビドロキシ
酪酸ホモ重合体よりも低い娘点を示す。

共重合体は、溶融Ｆｉ５を形品の製造に特に有用であり
、この場合６−ヒドロキシ酪酸ホモ重合体に匹敵する還
元結晶化度が好ましい。

特に興味深いのは、少敞の共重合体の塩化ビニル系重合
体の高分子ｔ　７Ｊｌ］工助剤としての用途である。こ
の応用では、共重合体の置は、塩化ビニル重合体に討し
Ｌｌ、５〜１０ｗｔチである。

この応用で最良の結果を得るには、共重合体はランダム
でなければならない。ランダム共重合体を得るには、コ
モノマ一単位ｌを得るのに用いる酸は、少な（とも繁殖
要素制限条件下での微生物の培＃ｄｌ’Ｊｌ［じて唯一
の基質として存在するのが好ましい。

共重合体は、浴融押出し区、好ましくは重合体のガラス
転移点（Ｔｇ）と融点との間の温監で、−付またはそれ
以上のロールｔ−，ＩＭさせて、フィルムの厚さを減少
しかつ若干の分子配向を導入するフィルムの製造にも用
いられる。

この宅間を、以下の実施例で説明する。

実施例１゜ プロピオネートの１ｍ虜の代謝では、プロピオネートは
サクシネートに５所し、これはＴＣＡす°イクルのオキ
サロ酢酸への１化、次いで脱カルボキシル化により了セ
チルＣｏＡ　　になる。オキサロ酢酸の脱カルボキシル
化では、両方の末端酸基は炭酸ガスとして除去される。

したがって、もしカルボキシ基に放射性ラベルした炭素
原子ライするプロピオネート、即ちｉ−Ｃ−プロピオネ
ートを、アセチルＣｏＡへの細胞変換に供給すれは、”
４ＣＯ２として放射化は失われる。

重合体への何らかの１４０の組込みは、プロピオニルＣ
ｏＡの６−ヒドロキシバレリルＣｏＡへの変換、引へ続
（重合からもたらされる。

Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ変異株Ｎ
ＣｌＢ１１５９９を、６．５９／ｌの蓄積ポリエステル
を支持するに充分な資化性窒素および基質としてのグル
コースｋｔむ水性培地Ａ’に中いるバッチ式醗酵器で、
好気Ｊ＠養により繁殖させた。水性培地Ａは、脱イオン
水１１当り次の組成を有していた。

（ＮＨ４）２　ＳＯ４２ｆ ＭｇＳＯ，・フルＯＯ，８ｔ Ｋｔ　８０４　　　　　　　　０．４５　ｆＨ３ＰＯ４
（１，１Ｍ）　　　　　　１２ｄＦ　ｅ　ＳＯ４・７Ｈ
ａＯ１５ＩＱ 微微光元素溶液　　　　２４ｍ／ 微量元素溶液は、脱イオン水１１当９次の組成を有して
いた。

Ｃｕ　ＳＯ４・５Ｈ２０Ｇ、　０２　ｔＺｎＳＯ，＊　
６Ｈ２ｏ　　　　　　ｏ、　１ｆＭｎ　ＳＯ４”　４Ｈ
Ｄ０．１　？ ＣａＣ１，−２Ｈ，，０２，６ｆ バイオマス＃度が４．５ｆ／ｌに達したとき、即ち系の
資化性窒素が枯渇した後、１−１４０−プロピオネ一一
トヲ含むプロピオン酸ソーダ１ｆ／ｌｋグルコースとと
もに醗酵器に９口え、醗酵を５分間継続した。次いで、
細胞を濾過により回収し、重合体をクロロホルムで抽出
した。ラベルした炭素は、殆んど完全にクロロ、ホルム
溶液にあり、ラベルした末端炭素原子が炭酸ガスとして
損失しなかったこと金示した。したがって、少な（とも
幾らかのプロピオネートは、了セチルＣｏＡ　　として
以外に重合体に組み込まれた。

実施例２．（比較例） Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　　変異
株ＮＣｌＢ１１５９９ｉ、脱イオン水１７！当９次の組
成を有する水性培地Ｂ４０（ＪＬ］ａｌを含む５１バッ
チ式醗酵器で、ｐＨ６，８，６４℃で好気培養にょシ繁
殖させた。

（ＮＨ４）２　ＳＯ４４ｙ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，８ｆ ＫｔＳＯ，０，４ｂ？ ＨｓＰＯ４（１，１Ｍ　）　　　　　１２ｍ１ＦｅＳ０
４・７Ｈ２０１５Ｉｎ９ 実施例１で用いた　　　　　２４ｍ１ 微緻元素溶液 グルコースを、８グ／ｈｒの割合で醗酵器に供給した。

培地Ｂの資化性窒素の量は、２６２のＰＨＢを含まぬ細
胞を支持するに充分であった。

４０時間後、細胞を遠心分離で回収した。細胞を凍結乾
燥し、重合体をクロロホルムで抽出した。

実施例６゜ 実施例２を繰返したが、細胞型＠５４ｆに達したとき、
グルコースの代りにプロピオン酸を２．８ｆ／ｈｒの割
合で醗酵器に供給した。

実施列４゜ 実施例６を繰返したが、プロピオン酸の供給は細胞重量
３９１に達したときに開始した。

実施例５゜ 実施例６を繰返したが、プロピオン酸の供給は、細胞重
置５６１に達したときに始めた。

実施例６゜ 実施例６を繰返したが、細胞重量４８ｆに達したとき、
プロピオン酸１２ｆを一度に添加した。

実施例Ｚ 実施例２を繰返したが、培地Ａを用い、グルコースの代
シにプロピオンｄｋ４ｒ／ｈｒの割合で、醗酵中を全体
を通じて供給した。

実施例ａ 実施例２を繰返したが、ａ胞重凌が６８７になっタト缶
、グルコースの代りに、グルコース５．２ｒ／’ｈｒ、
プロピオン酸２．８？／ｈｒの割合で、グルコースおよ
びプロピオン酸の混合物を醗酵器に供給した。

実施例９ 実施例８を繰返したが、細胞重量２８ｆに達したとき、
グルコース６．８９／ｈｒおよびプロピオン酸１．２ｆ
／ｈｒの割合で、混合物の供給を開始した。

実施例２〜９では、プロピオン酸は４００　ｔ／１を含
む溶液として添加した。

実施例１０゜ 実施例２を繰返したが、細胞重量が２Ｅｌに達したと負
、グルコースの代りにイソ酪酸を醗酵器に２ｆ／ｈｒの
割合で供給した。イソ酪酸は、１５０２／ｌを含む溶液
で添加した。

実施例６〜６および８〜１０では、「醗酵器に供給した
酸の重置」討「細胞重量が２６９に達した後（即ち系の
窒素が枯渇したとき）に醗酵器に供給したグルコースの
重量および醗酵器に供給した酸の重置の合計」の比が、
表１に示す値に達するまで、醗酵を継続した。

実施例１１゜ 実施例２を繰返したが、細胞重置が２６．４ｆに達した
とき、グルコースの代りに３−クロロプロピオン酸ｉ４
ｆ／ｈｒの割合で５時間醗酵器に供給した。

実施例１２゜ 実施例１１を繰返したが、６−クロロプロピオン酸の供
給は、細胞型１１３４．４ｆに達したと会に開始した。

実施例１６゜ 実施例１２を繰返したが、細胞型ｔ６０ｆに達したト専
、６−クロロプロピオン酸４ｆｔ一度に添加し、次いで
グルコースに６．８ｆ／ｈｒの割合で７時間供給した。

実施例１１〜１６では、６−クロロプロピオン酸は、５
０　ｆ／１３を含む溶液で添加した。

実施例１４゜ 実施例２を繰返したが、細胞重置６１２になったとき、
グルコースの代りにアクリル酸全４ｆ／ｈｒの割合で５
時間醗酵器に供給した。アクリル酸は、１００ｇ！／Ａ
をきむ溶液の形で添加した。

実施例２〜１４０屯合体中の各コモノマ一単位の量は、
（ａ）加水分解およびガスクロマトグラフ法および（ｂ
）　　Ｃ核磁気共鳴スペクトル法によシ決定した。

重合体の分子喰は、ゲル滲透過クロマトグラフ法で決定
した。

塩素分析も、実施例２，１１．１２および１６の重合体
について行った。

結果全表２に示した。

表２において、６−ｆ（Ｖは６−ヒトロキシバレリアン
酸拳位葡示し、ま現単泣Ａは前述の単位で、６−ヒドロ
キシプロピオン酸学位と考えられるものである。

６−クロロプロピオン酸からの塩素は、殆んど重合体に
見出されなかった。したがって、６−クロロプロピオン
酸の代謝中に塩素が失なわれて、その結果の生板物が代
謝δれて単位Ａおよび６−ヒトロキシバレリ了ン酸単位
を与えるｉうである。実施例１１〜１５の重合体の塩素
含量は、若干の塩素が単位■中に塩素含有基Ｒとして存
在していることを示し、おそらく、Ｒ＝ジクロロチル、
Ｒ＝Ｒ＝Ｒ＝Ｈ，ｎ＝１となっているのであろう。

高分解能　ＣＮ＋ＡＲを用いて、実施例６〜１０の共重
合体の単敞体配列を調べた。カルボニル基の炭素原子か
ら得られるシグナルは、その環境に応じて、異なる化学
シフトで起Ａることが判明した。したがって、１１およ
び■（ｎ＝１、Ｒ’＝Ｃ２Ｈ，、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ）を含
む重合体では、可能な配列は次の通りである。

Ａ、ブチレート−ブチレート Ｂ、バレレート−バレレート Ｃ，ブチレート−バレレート 実施例２〜１００重合体のＮＭＲ試験は、それぞれ１６
９．０７．１６９．２５および１６９．４４Ｆｐｍ　で
起きる６つの共鳴を示した。Ｍ、　Ｉ　ｉ　ｄ　ａ外（
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｓ　１１　（１９７８）ｐ４９０］
によれば、１６９．０７　ｐｐｍ　　での共鳴は、ブチ
レート−ブチレートの配列Ａであり、１６９．４４ｐｐ
ｍはバレレート−バレレートの配列Ｂである。推論によ
れば、１６９．２５ｐｐｍ　　でのシグナルは、ブチレ
ート−バレレートの配列Ｃから生じる。

実施例１０の重合体のＮＭＲの結果の定量的分析は、次
の結果を与えた。

配列Ａ（ブチレート−ブチレート）　　５５チ配列Ｂ（
バレレート−バレレート）　　　１４％配列Ｃ（ブチレ
ート−バレレート）　　　、５１％これらの結果は、実
施例１０の重合体が単位ＩおよびＩｆ（ｎ＝１、Ｒ＝Ｃ
，Ｈ５、Ｒ＝Ｒ＝Ｒ＝Ｈ）の共重合体を実質的量で含む
ことを、明らかに示している。しかし、繰返し単位１の
ホモ重合体の若干も存在する可能性がある。

実施例２〜１４の重合体は、全部Ｄ（−）立体配置を有
していた。

抽出したままの共重合体の溶融挙動は、コンピューター
データー分析骨のシュポン１０９０システムを用いて、
先ず差動走査熱計量法（ＤＳＣ）で決定した。ＤＳＣ法
を、１９０℃で圧縮成形し、完全に結晶化した製品を得
るために、プレス中に冷却した鎌の試料でも実施した。

それぞれの場合、見本は空気中で２０℃／分で加熱し、
吸熱溶融のスター）（Ｔｓ）およびピーク（Ｔｐ　）の
温度をその面積とともに記録した。了ニーリングした試
料の０口熱を２００℃まで継続し、完全に浴融させるた
め１分間等温にした後、試料を液体窒素中で急冷した。

非晶領域のガラス転＃温変（Ｔｇ）　ｋ決定するために
、ＤＳＣ試験に再び行った。最後に、密度勾配浮遊法に
より、了ニーリングした共重合体の密度を測定した。

結果を１表６に示す。

各共重合体の広い融点範囲は、共重合体がむしろ不均質
組成物であることを示している。しかし、溶融吸熱がよ
りシャープになりかつ面積が僅かに減少しているので、
了ニーリングしたとき、エステル交換による顕著なラン
ダム化が起きている。このことは、重合体はホモ重合体
の物理的混合物でな（、真玉共重合体であることの指標
である。

多重ＤＳＣピークが、実施例６，５．８および１０の抽
出したままの重合体で観察された。

溶融吸熱面積は、結晶化度の指標である。了ニーリング
後の実施例６〜１４の重合体は、全部実施例２の対照ホ
モ車合体よりも、著るしく結晶化度は低かった。

実施例１５゜ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　　変異
株ＮＣｌＢ１１５９９を、水性培地Ｃ（これはｉ地Ｂと
同じであるが、ＰＨ８を含まぬ細胞８．５ｆｌｌを支持
するのに充分な硫酸アンモニア５．２ｆ／１であった）
　４０　（Ｊ　ＣＪｍ、ｌｆ含む５１バ・ノチ式醗酵器
で、ｐＨ６，８，５４℃で好気培養により繁殖させた。

基質は、５．５ｆ／ｌ／ｈｒの割合で供給するグルコー
スであった。細胞濃度が７ｆ／ｌに達したとき、グルコ
ースに加えてプロピオン酸を１．５８ｆ／ｌ／ｈｒの割
合で供給した。細胞乾燥重置が１５ｆ／ｌに達したとき
、細胞を回収した。細胞懸濁液を噴霧乾燥し、脂質を乾
燥細胞のメタノール還流で抽出し、重合体をクロロホル
ム還流で抽出した。クロロホルム溶液をメタノール／水
混合物に添加する沈澱法により、重合体を回収した。

共重合体は、反覆単位ＩＩ　（Ｒ＝Ｃ＊Ｈ５、Ｒ＝Ｒ＝
Ｒ＝Ｈ，ｎ＝　１　）２０　モル％を含んでいた。

共重合体は、分子量、５５０，０００　　を有し、冷メ
チルエチルケトンに不溶性であった。共重合体２２を、
メチルエチルケトン１００ｍ１で１時間還流すると、全
を溶解した。溶液を冷却すると、ゼラチン状マスを生じ
た。これに対し、６−ヒドロキシ酪酸エステルホモ重合
（ｊａ２ｆｆメチルエチルケトン１００ｍ１と還流した
とき、溶解したホモ重合体は０．１２以下であった。メ
チルエチルケトンの代りにエタノールで、溶解度テスト
を反覆すると、１時間還流後、共重合体は約０．７１が
、ホモ重合体はＵ、０４ｆμ下が溶解した。

これに付し、Ｗａｌｌｅｎ　　外によｔ）　Ｅｎｖｉｒ
ｏｎｍｅｎ−ｔａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ　８１（１９７４）ｐ、５７６〜５７９
に記載の重合体は、熱エタノールに可溶性とされている
。

実施例１６゜ 水性培地り、ＥおよびＦ’ｋ、脱イオン水１１当り次の
組成で作った。

ＩＬ （ｋｌ）、　８０４　　　　　　１２　ｙＭｇＳ０４ｊ
７Ｈ２０１，２２ に２３０．　　　　　　　　　１．５ｆＣａＣ１，０，
１２ｆ ＦｅＳＯ，−７Ｈ，，００，１？ ＺｎＳＯ４＠　７Ｈ，、ＯＯ，ＯＯ６ｆＭｎ　ＳＯ４・
４Ｈ２００，００６９ ＣｕＳＯ，・５Ｈ２００，００１５ｆ Ｈ２ＳＯ４（濃厚）　　　　　　１ｍｌ培地Ｅ Ｈａ　ＰＯ４（１，１Ｍ　）　　　　　　２．４　ｍｌ
グルコース　　　　　　　４０ｆ 培地Ｆ ＨｓＰＯ４（１，１Ｍ）　　　　　　２．４ｍｌプロピ
オン酸　　　　　　　　４０２ 殺菌した公称容量２５０１バッチ式醗酵器に。

培地りおよびＥのほぼ等容置混合物を、１６０１のマー
クまで満たした。醗酵器中の培地の少量の試料で、窒素
含有量を分析した。次いで。

培養器にＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ
　変異株ＮＣＩＢ　　　１１５９９を接種し、醗酵を６
４°Ｃで、苛性ソーダｍ液の添加でｐＨを６．８に自動
的にコントロールして好気的に行った。

醗酵器に存在した資化性窒素の量は、ＰＨＢを含まぬ細
胞的１．２Ｋｆのみまでの微生物繁殖を行うのに充分で
あった。細胞重量が約１．０５Ｋｆに達したと転培地Ｅ
の供給を、６．５１／ｈｒの割合で開始した。

細胞重置が約１７００ｒに達したとき、培地Ｅの供給を
停止し、培地Ｆの供給を６．５１／ｈｒの割合で開始し
、細胞約２．６　Ｋｐが産生されるまで醗酵を継続した
。

次いで、細胞懸ｌｉｔ液を、遠心分離により濃度的６０
　ｆ／ｌ−４−ＣＩｊＮａＬ、、ＷｆＡ１’１ｊｊｌ＆
　Ｉ　Ｇｔ＆１．２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）　２ｆ
ｔとシルバーソンミキサーで２０℃で１５分間接触させ
て重合体を抽出した。ＤＣＥ相を、細胞の残骸を含む水
性相から分離し、濾過した。濾過したＤＣＥ相１容敏を
、メタノール／水（４／１．６藏）混合ｖＩＪ４容置に
加えて５重合体を沈澱させた。

沈澱重合体を炉別し、メタノールで洗浄してから、オー
ブンで１００℃で４時間乾燥した。

重合体は、ＤＳＣ法で決定して１６８℃で溶融吸熱のピ
ークを有し約１０Ｏ〜１８０℃の溶融範囲を有していた
。

実施例１Ｚ 実施列１６の醗酵処理を反覆したが、培地Ｅの供給から
培地Ｆの供給への切換えは、細胞重量が約６．５に９に
達したときに行った。培地Ｆは、１１．４１／ｈｒの割
合で４時間供給してから５．２１／ｈｒに低下させ、こ
のレベルをさらに９時間維持し、この段階で細胞重置は
約５．９　Ｋ、。

であった。

この実施例では、醗酵器に存在した資化性窒素の量は１
重合体を含まぬ細胞わずか約１．５ｋｇに微生物を繁殖
させるに充分であった。

細胞懸濁物を遠心分離で濃縮し、次いで実施列１５の方
法で、重合体ｔ−濃縮細胞懸濁液から抽出した。

実施例１ａ 実施例１６のようにして、２５０１醗酵器に装入、接種
を行った。資化性窒素の量は、重合体をよまぬ細胞わず
か約１．９　Ｋｇに、微生物を繁殖させるに充分であっ
た。実施例１６のようにして、醗酵を６４°Ｃ，ｐＨ６
，８・で好気的に行った。

細胞重量が約１．ＯＫ９に達したとき、培地Ｅおよび培
地Ｇｅそれぞれ８．７１／ｈｒおよび４．６１／ｈｒの
割合で供給を開始し、細胞重量が３、９　Ｋ、になるま
で継続した。

培地Ｇは、脱イオン水１１１当り次の組成を有していた
： Ｈ３ＰＯ３（１，１Ｍ　）　　　　　　　１．２　ｍｌ
プロピオン酸　　　　　　　　２０９ 細胞懸濁液を遠心分離で濃縮し、実施例１５の方法で、
重合体を濃縮細胞懸濁液から抽出した。

実施例１９゜ 実施例１７の処理を大規模で反覆し、公称各種１０００
１の醗酵器を用い、はぼ等容敏の培地りおよびＥでｂｏ
ｏｘマークまで満たした。

この実施例では、培地Ｅの供給は細胞重量的４９になっ
たと六に２５１／ｈｒの、４１合で開始し、培地Ｆの供
給は細胞重量的Ｂｘｙになったと轡６“７．５１／ｈｒ
の割合で開始した。培地ＥおよびＦの供給は、細胞重置
が約１０Ｋｇに達するまで継続した。存在する資化性窒
素の曖は、重合体を含まぬ細胞約４．１　Ｋｇまで微生
物を繁殖させるに充分であった。

実施例２０゜ 実施例１９を反覆したが、培地Ｆの供給割合は２５Ａ’
／ｈｒで、醗酵は細胞重量的１１ＫｇＫなるまで継続し
た。この場合、資化性窒素の瞳は、重合体を含まぬ細胞
約４匂まで微生物が繁殖するに充分であった。

実施例１６〜２０の重合体は、それぞれ６−ヒドロキシ
酪酸（ｔ（Ｂ）単位およびβ−ヒドロキシバレリ了ン酸
（ＨＶ）単位？、含す共重合体であり１重置平均分子敏
は３００，０ＯＬＩ以上であった。共重合体は、それぞ
れＤ（−）立体配ａを有していた。

実施列１６〜２０の各共重合体および６−ヒドロキシ酪
酸ホモ重合体１００重を部を、クロロホルム約１０重量
部およびタルク１重を部でスラリー化し、家庭用向ひき
機で室温で粒状化した。次いで、組成物を乾燥してクロ
ロホルムを除去し、１９０℃で抽出してから、再び粒状
化した。得られる粒状物を、１８５℃で試験用バーに射
出成形し、型温度６５℃および冷却時間２０秒を用いた
。引張特性を、ＡＳＴＭＩ）６３８−７７ａによｐｂＬ
Ｌｒａｓ１分の速度で測定し、衝撃強度をＡＳＴＭ　　
Ｄ２５６−７８により了イゾヴト衝撃試験で評１曲した
。

結果を、表４に示した。

実施例２１゜ 下記成分を室温で乾式混合し、ＰＶＣ配合物を作った： 重量部 （１）　　塩化ビニルホモ重合体（Ｋ６２）　　　　１
［ＪＯ（ｉｉ）　　ジ−Ｎ−ジチオグリコール酸エステ
ルベースのチオオクチ ルスズ錯体の安定化剤　　　　　　　　　　１．５（…
）メチルメタクリレート／ブタ ジェン／スチレンｐｖｃ衝撃 改善剤　　　　　　　　　　　　　　　　８（１ｖ）ワ
ックス（外部油滑剤）　　　　　　　　　０・８（ｖ）
グリセリルモノエステル （内部油滑剤）　　　　　　　　　　　　　１（Ｖｌ）
　　ＨＢ重合体（加工助剤）　　　　　　　　　２ＨＢ
重合体υロエ助剤は、次のものであった：（ａ）　　実
施例２で得た６−ヒドロキシ酪酸エステルホモ重合体　
　　　　。

（ｂ）　　実施例７の共重合体（共重合体Ａ）（ｃ）　
　実施例１６の共重合体（共重合体Ｂ）加工助剤は、約
１０ｗｔ４　　のクロロホルムでスラリー化し、家庭用
内ひき機で室温で粒状化し、乾燥し、１９０℃で溶融押
出し、再度粒状化し、ＰｖＣ乾燥混合物に配合する前に
、粒子寸法１５０μｍＢ下に粉砕した。

乾燥混合物を、次のようにして試験した：１、混合物５
０１を、５Ｋｐの重錘で負荷した圧力ラムの下で１８ｒ
ｐｍで回転し、１８０℃に維持しｆｃＢｒａｂｅｎｄｅ
ｒ　Ｐｌａｓｔｏｇｒａｐｈの混合ヘッドに投入した。

ゲル化が起きるに要した時間を、記録した。

２、混合物を冷圧縮してキャンドルにし、これを１７０
℃に維持し、直径１鵡およびランド長２０ｍの円形オリ
フィスを有するダイを取付けた押出しレオメータ−に装
入した。装入物が１７０℃にＤｏ熱された後、速度を増
加させながら押出した。押出し吻の外観を記録し、押出
し吻をダイから引張って溶融伸長性を評価した。

結果ケ、表５に示す。

表　５ この実施例は、塩化ビニル重合体加工助剤として、　共
重合体は、６−ヒドロキシ酪酸ホモ重合体より優れてい
ることを示している。よりランダム共重合体Ａは、明ら
かに共重合体Ｂよυ秀れている。

実施例２２゜ 培地Ｈを、次の組成で作った： （ＮＨ，九５ｏ４ｉｒ ＫＨ１ＩＰＯ４２ｆ （Ｎａ　）ｔＨＰｏ、　　　　　　５９ＭｇＳ０４拳７
Ｈ＋！ｏ　　　　　　　　　　　Ｏ，２ｆＣａＣ１，０
，０１ｆ ＦｅＳＯ，−７１（，００，ＯＱ　５　ｆＭｎＳＯ，・
４Ｈ，、Ｏ（１，００２１Ｎａ、ＣＯ，−１０Ｈ，００
，１ｆ （ＮＨｔ）ｔ　ｃｏ　　　　　　　１．５　ｆ脱イオン
水　　　　　　　全体で１１にする培地のｐＨは、７で
あった。

予じめメタクリル酸０．５ｆを溶解した培地Ｈ３Ｏ０ｍ
／！をそれぞれ含む８個の１１振とうフラスコに、　Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ　ａａ１ｍｏｎｉｃｏｌｏｒ株ＡＴＣＣ
１９１４９（７）種培養＊　５　ｒｎｌ　ｆ接種し、旋
回振とう磯で６２℃で培養した。

接種後２４時間、４８時間および７２時間の間隔で、各
フラスコにメタクリル酸０．５２づつを添加し、メタク
リル酸０．２５ｒの最終添υ口を９６時間後に行った。

接種後１０８時間で、各フラスコヲ検査した。どのフラ
スコでも、微生物の繁殖は殆んどなかった。フラスコ内
ｄ物を一緒にし、遠心分離して細胞のペレットにして、
オープンで乾燥してから計曖した。ベレ・ノド重置は、
２．８１ｆであった。接種物の細＠含有酸も決定し、６
９．７ｂｔ／ｌであった。したがって、接種物としてフ
ラスコに添υ口した細胞の全重量は、２．７９ｙであっ
た。

用いたメタクリル酸！１度では、この−株は。

メタクリル酸を貴化しなかった。

実施例２３．−４５゜ これらの実施では、ある範囲の酸および酸誘導体を、共
重合体ヶ与えうるか否かについてスクリーニング試験し
た。

使用した方法は下記の通シであった。

Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　　変異
株ＮＣｌＢ１１５９９を、悦イオン水１４当り下記の組
成の水性培地５５００〜４０００ｍ１ｆ入れた５１のハ
・ノチ戊醗酵器中でｐＨ６，８および６４℃において好
気培養した。

グルコース　　　　　　　　１７１ （ＮＨ，）２　ＳＯ４４９ ＭｇＳＯ４−７１（２００，８ｆ ｆ（ａ　Ｐ　０４　（１，１Ｍ　）　　　　　　　１２
　ｍ１ＦｅＳＯ４・フル０　　　　　　１５Ｉｎ？微量
元素溶液　　　　　　　　　６６ｍ１（実施例１のもの
） ｐＨは４Ｍ水酸化カリウム溶液および４Ｍ水酸化す）　
ＩＪウムの９＝１（容／容）混合物の自動添ｖ口により
６．８に制御した。このようなｐＨ制−のためのＫＯＨ
／ＮａＯＨ混合物の添加は、培地にカリウムおよびナト
リウムを供給する機能も果した。

資化性窒素（上記４ｔ／ｌの硫酸アンモニウムによって
与えられる）の量は、わずかに約６．５ｆ／ｌのＨＢ重
合体不含有細胞を支持するに足る酸であった。約１６　
ｆ／１１のグルコースが６．５ｆ／ｌのＨＢ重合体不含
有細＠全生じさせるのに必要とされるから、存在したグ
ルコースの看は、少しの炭素過剰を与えるのに足るもの
であった。残留グルコース濃度を監視し。

また溶存酸素張力を追跡することにより、系が資化性窒
素に・欠乏した時点の明かな指示が得られた。この段階
でコモノマー成分（すなわち試験用の酸または酸誘導体
）の供給を開始し、合計で約０．１〜５７／ｌのコモノ
マー成分が添υ口されるまでその供給を続けた。

コモノマー成分の添カＯＮ了後、細＠を遠心分離で回収
した。遠心分離した細胞の試料を凍結乾燥し、その重合
体全クロロホルムで抽出した。

を合ｉをガスクロマトグラフ／質敏スペクトル（ＧＣＩ
ＶｉＳ）法（これには予備的なエステル交換工程が含ま
れる）またはｎｍｒスペクトル法（ＮＭＲ）によって分
析した。

結果を表６に示す。この表において、ＮｆＶＩＲの結果
は、ＮＭＲ法がエステル交換工程を含まず一層明確であ
ると考えられるので、可能な揚台に表示しである。

同様な結束は、実施列２６−４４において屋素が用い尽
された鏝にグルコースおよびコモノマー成分の混合物を
連続的に添加するように改変した培養を繰返えして実施
したと衣にも得られた。

実施例４６．−５１゜ ０．０８５／ｈｒの稀釈率（滞留時間の逆数）で約４１
の有効培地液容積を用いて、５１’の醗酵器中でｐＨ６
，８および６４℃においてＡｌｅａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅ
ｕｔｒｏｐｈｕ、　変異株ＮＣｌＢ１１５９９を連続好
気培養した。１更用水性培地は、脱イオン水１１当り下
記の組成であった。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ１００，８ｆ へＳｏ、　　　　　　　　　　　０．４５ｒＮａ２　Ｓ
Ｏ４０，０５？ Ｈａ　ＰＯ４（１，１Ｍ　）　ｆｌＫ　　　　　１２ｍ
ｌ微量元素溶液（実施例１のもの）　　　６６ｒｎｌま
た表７に示した各成分も醗酵器に連続的に供給した。

表　　　７ 窒素の量は、わずかに６．５ｔ／ｌのＨＢ重合体不含有
細胞を支持するに足る量であった。

ｐＨは、４Ｍ水酸化カリウム溶液および４Ｍ水酸化ナト
リウム溶液の９：１（容／容）混合物の自動添Ｏｎによ
って６．８に制御した。

醗酵は唯一の基質としてプロピオン酸を用いて開始した
。定常状態に達してから６日後に、水性紙＠懸濁生成物
のサンプルを採取し、次いでアクリル酸を、次第に増加
する量で補助基質として添加した。少なくとも６日間定
常状態下での醗酵を各アクリル酸濃度において実施し。

その後にそれぞれサンプル全採取した。水性細胞懸濁生
成物の各サンプルを遠心分離して細胞を回収し、次いで
凍結乾燥した。重合体を、クロロホルムで細胞から回収
し、次いでＮＭＲ法で分析した。結果を表８に示す。

実施例５２゜ この実施例では、窒素ではな（燐の制限下にＡｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　　変異株ＮＣｌＢ
１１５９９を６４℃で好気培養した。’Ｊｌの醗酵器に
、脱１オン水１１当り下記の組成の水性培地を仕込んだ
。

（ＮＨ，）２　ＳＯ４６，２ｙ Ｈａ　ＰＯ４（１，１Ｍ　）　　　　　　　　１．５ｍ
１ＭｇＳＯ４・フルＯＯ，８ｆ ＦｅＳＯ４・７Ｉ（２０１５〃ｉｐ 微置元装溶液（実施例１のもの）　　　　６６ｔｎｌ醗
酵時のｌ）Ｈは、４ＭのＫＯＨおよび４ＭのＮａＯＨの
９：１（ｇ／容）混合物の添カロにより自動的に６．８
に制御した。燐の量は８１／ｌのＨＢ重合体不含有細胞
を支持するに足るものであった。

醗酵器に４８時時間表うフラスコ培養物を接種し１次い
でｂｔ／ｌのグルコースを添加した。

十べてのグルコースが用い尽されたと負（この時点で細
胞濃度は約２．５ｆ／ｌ）、プロピオン酸ｋ＜５００ｆ
／ｌ（Ｄ溶液の杉で）、Ｌ）、Ｆ３ｆ／ｌ／時の速度で
５４時間添加した。

次いで細胞を回収し、重合体をクロロホルムで抽出し、
ＧＣＭＳ法で分析した。結果は下記の通りであった。

最終細胞濃度　　　　　　　　　２０ｆ７１重合体含緻
　　　　　　　　６０チ ５−ＨＶのモルチ　　　　　　　４０モルチ実施例５５
．−５７゜ これらの実施例ではＮｏｃａｒｄｉａ　Ｓａｌｍｏｎｉ
−ｃｏｌｏｒ種の二りの閑株をグルコース基質で培養し
１次いで檀々の酸を用いて重合体蓄積を誘導した。

各実施例において、２５０ｍ／の振とうフラスコに、脱
イオン水１１当り下記の成分を含む水性培地を５０ｍ１
仕込んだ。

グ、：Ｉ−ス　　　　　　　　１０ｆ ４ｔ（Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　１．９ＦＮａＨ
Ｐ０．　　　　　　　　　　１．５６ｆ（ＮＨ４）ｌ　
８０４　　　　　　　　　１．８　ｔＭｇ５Ｏ，・７）
（２０１Ｊ、２ｆ ＦｅＣ１，−６Ｈ，、ＯＯ，００１？ 微量元素溶液（犬殉例１のもの）　　　　　１ｍｌこの
水性培地のｐＨはＩＵであった。フラスコに微生物（表
９）全接種し、回旋振とう法で６０℃において２４時間
培養した。得られた懸酸アンモニウム全省略したもの）
の５０ｍ１中に再懸濁させた。再曇濁した細＠を６Ｏ°
Ｃでさらに２４時間振とうし１次いでその細胞懸濁液を
遠心分離した。得られた遠心分離ペレ・ノド伏の細胞ケ
メタノールで２回洗浄し、その重合体よｔを分析した。

重合体は００ＭＳ法で分析した。

結果ｌｒ表９に示す。

第１頁の続き 優先権主張　＠１９８１年１０月３０日■イギリス（Ｇ
Ｂ）■８１３０５１８６．９ ■１９８２年５月１２日■イギリス （ＧＢ）■８２１３６９７ ０発　明　者　レオナード・フレデリック・ライト イギリス国クリーブランド・ス トツクトンーオンーテイーズ・ ツートン・ザ・グリーン・ツー トン・ホール（番地なし）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリエステルを蓄積できる微生物を、水性培地中
   において水溶性の資化性炭素含有基質で培養し、その際
   に培養の少なくとも一部期間はその微生物によってポリ
   エステルが蓄積される条件下で培養を行うことにより熱
   可塑性ポリエステルを産生させる方法において、少なく
   ともポリエステルが蓄積している培養期間部分中は、該
   資化性炭素含有基質は、該ポリエステル蓄積条件下で微
   生物によって代謝されて、−〇・ＣＨ（Ｃル）・Ｃｆ−
   （２・ＣＯ−繰返し単位からもっばら構成されるもの以
   外のポリエステルとなる有機酸もしくは有礪酸誘導体金
   含むこと、そして核酸もしくは酸誘導体中の化学結合炭
   素の量は該ポリエステル蓄積期間中に存在する基質中の
   全化学結合炭素の少な（とも２重破係をなすこと、を特
   徴とする上記熱可塑性ポリエステル産生方法。
2. （２）＃生物の増殖にとって必須ではあるがポリエステ
   ルの蓄積にとっては必須ではない要素の−またはそれ以
   上を制限した条件下で、微生物によりポリエステルを蓄
   積させる特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）重量平均分子量が１０．ＵＬＩＬＩ　　ＬＪ上で
   あり、繰返し単位 １　　−０−ＣＨ（ＣＨ，、）−ＣＬ（２−ＣＯ−およ
   び繰返し単位 ＩＩ　　−０・ＣＲＲ・（ＣＲＲ）ｎψｃｏ−（ｎはゼ
   ロまたは整数であり、Ｒ，Ｒ，ＲおよびＲ４はそれぞれ
   炭化水素基；ハローおよびヒドロキシ−置換炭化水素基
   ；ヒドロキシ基；ハロゲン原子；および水素原ｆ；から
   選択され、但し、ｎが１そしてＲ２、Ｒ３およびＲがそ
   れぞれ水源原子であるときにはＲ１はメチル基でなくま
   たすべての基Ｒ１がエチル基であるとは限らないことを
   条件とする。）を含み、かつ上記繰返し学位■が全、媒
   収し単位の′０．１〜５０モル係を構成していることを
   特徴とする共重合体。