JPH0443942A - 細胞分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、フローサイトメトリーを適用した細胞分析
装置に関し、詳しく言えば、細胞光情報を処理する過程
での、細胞光情報の収集に関する。

（ロ）従来の技術 フローサイトメトリーは、例えば蛍光色素で標識された
細胞又は粒子を細い液流中に流し、流体力学的焦点合わ
せ効果により１列になって流れる細胞の一つ一つにレー
ザ光を照射し、細胞より生じる散乱光や蛍光の強度、す
なわち細胞光情報を瞬時に測定し、細胞を分析するもの
である。このフローサイトメトリーは、大量の細胞を高
速度かつ高精度に分析できる特長を有し、臨床検査から
研究用まで広く利用されている。

上記フローサイトメトリーを適用した細胞分析装置とし
ては、細い液流を形成するためのフローセルと、このフ
ローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する光源（例
えばレーザ）と、この光ビームが照射された細胞より細
胞光情報を検出し電気信号に変換する光検出器と、この
電気信号に変換された細胞光情報の解析処理等を行うコ
ンピュータを備えてなるものが知られている。

この細胞分析装置は、赤血球、白血球、培養細胞等、各
種細胞の分析に適用できるものである。

例えば、血液中のリンパ球サブセット分析の場合には、
蛍光色素で標識されたモノクローナル抗体をヒト血液に
反応させ、その後、この血液を溶血処理したものが試料
として用いられる。

フローセル内を流れる試料細胞には、レーザビームが照
射され、４つのパラメータ、すなわち前方散乱光強度１
．．９０”散乱光強度Ｔ、。、緑色蛍光強度Ｉ９、赤色
蛍光強度■、が、それぞれ検出器で検出され、細胞光情
報（以下単にデータという場合がある）が得られる。上
記試料中には、リンパ球の他に、単球、顆粒球等が含ま
れており、得られたデータ中には、リンパ球についての
データの他に、単球、顆粒球等についてのデータも含ま
れることになる。従って、リンパ球についてのデータを
他の細胞のデータより選別して収集する必要が生じる。

そこで、細胞の大きさと内部構造を表すとされる前方散
乱光強度１．．９０°散乱光強度■、。を直交座標軸と
するサイトグラムを作成する〔第４図（ａ）参照〕。こ
のサイトグラムにおいて、ｂはリンパ球の分布、Ｃは単
球の分布、ｄは顆粒球の分布をそれぞれ示している。な
お、三角形の領域ｆはノイズ処理で除かれた部分である
。このサイトグラム上で、例えばリンパ球の分布すを含
む、多角形又は楕円の分析領域（ウィンドウと呼ばれる
ことが多い）Ｂを設定して、この分析領域に属する（斜
線を付した領域に属する）細胞のデータを、他の細胞の
データより選別して収集する。この分析領域は、操作者
がマウスやデジタイザを用いて手動設定したり、あるい
は自動的に設定される（いわゆるオートトリガ、例えば
特願昭６３−１９３０３３号、特願昭６３−１９３０７
２号参照）。

こうして収集されたリンパ球のデータについて、さらに
緑色蛍光強度■９、赤色蛍光強度ｉ、について演算処理
、例えば、第４図（ｂ）に示すように、１、−１．のサ
イトグラムを作成して、陽性率の算出が行われる。

（ハ）発明が解決しようとする課題 上記細胞分析装置において、試料はヒト血液より調製さ
れることが多いが、血液はヒトの病態を多様に反映し、
■、。−■。サイトグラム上の分布においても複雑なパ
ターンを呈し、帰属を異にする細胞の分布が多様に重畳
して、目的細胞集団をサイトグラム上で特定できないこ
とがある。

例えば、上記リンパ球サブセント分布において、健常者
の場合には、第４図（ａ）に示すように細胞集団は３つ
に大別され、その内すのリンパ球分布を含む分析領域Ｂ
を設定し、この分析領域Ｂ内に属するリンパ球データを
用いて蛍光解析を行うのは先に述べたとおりである。し
かしながら、白血病患者の場合には、第４図（Ｃ）に示
すように、リンパ球と他の細胞とが重畳した分布ｅとな
ることがあり、分析領域Ｂを正確に設定できなくなる。

このため、使用された蛍光色素標識モノクローナル抗体
の陽性率が大きく異なる問題点があった。

一方、試料中のある細胞集団を除いた、他の細胞集団す
べてについて分析を行いたい場合もある。

例えば、上記試料についてリンパ球を除いた部分につい
て分析を行いたい場合には、第４図（ｄ）に示すように
、リンパ球の分布すを除いて分析領域を設定しなければ
ならないが、ｋの領域がリンパ球の分布すに属さないに
もかかわらず、分析領域より漏れてしまい、分析が正確
に行えなくなる問題点もあった。

この発明は、上記に鑑みなされたもので、必要な細胞集
団のデータを、的確に特定して選別収集し、複雑なサイ
トグラムパターンの解析を精度よく行うことを目的とし
ている。

（ニ）課題を解決するための手段 上記課題を解決するため、この発明の細胞分析装置は、
以下の１〜ＩＸに列記する構成を有している。

ｉ：細胞浮遊液が流されるフローセルと、ｉｉ；このフ
ローセル内を流れる細胞に光ビームを照射する光源と、 ｊｉ＝この光ビームが照射されたそれぞれの細胞につい
て、複数のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細
胞光情報検出手段と、 ｉｖ：この細胞光情報検出手段で得られる、１又は２以
上のパラメータに基づいて分析領域を設定する分析領域
設定手段と、 Ｖ：この分析領域設定手段で設定された分析領域内で、
目的とする細胞集団の細胞光情報を収集する第１の細胞
光情報収集手段と、 ｖｉ：前記細胞光情報検出手段で検出された細胞光情報
及び前記第１の細胞光情報収集手段で収集された目的細
胞集団の細胞光情報を演算処理する細胞光情報演算処理
手段と、 ｖｉ：この細胞光情報演算処理手段の演算処理結果を出
力する出力手段とを備えてなるものにおいて、 ｖｍ：前記分析領域設定手段で設定された分析領域外の
細胞光情報を、補集合的に収集する第２の細胞光情報収
集手段を備え、 ｉＸ：前記細胞光情報演算処理手段は、前記第１の細胞
光情報収集手段又は第２の細胞光情報収集手段で収集さ
れた細胞光情報を選択して演算処理することを特徴とす
るものである。

（ホ）作用 この発明の細胞分析装置は、細胞光情報の収集を行う際
に、目的細胞集団を特定するのに、部分集合的に特定し
たり、補集合的に特定することで、散乱光サイトグラム
上での目的細胞集団の特定をより正確に行い、分析の精
度、特に陽性率決定の精度を向上させることができる。

（へ）実施例 この発明の一実施例を第１図乃至第３図に基づいて以下
に説明する。

第２図は、実施例細胞分析装置の構成を示す図である。

２は、オートサンプラーであり、その試料ランク２ａに
は複数の試料容器３、・・・、３が装填されている。こ
の試料ランク２ａは、図示しない駆動機構により駆動さ
れ、指定の試料を、試料吸引チューブ４直下に位置させ
る。さらに、このオートサンプラー２は、図示しない振
とう機構、冷却機構を備えており、定時的に試料を振と
うすると共に、装填された試料容器３、・・・、３内の
試料を低温（例えば４°Ｃ〜１０°Ｃ）に保持する。

前記試料吸引チューブ４は、三方弁５の１つのボートに
接続されている。三方弁５の他の２つのボートには、試
料送液チューブ６ａ、６ｂがそれぞれ接続されており、
試料送液チューブ６ａと試料吸引チューブ４、あるいは
試料送液チューブ６ａと６ｂとを連通させることができ
る。試料送液チューブ６ａの他端には、試料ポンプ７が
設けられている。一方、試料送液チューブ６ｂの他端は
、シース液送液チューブ８内に開口している。

このシース液送液チューブ８は、一端が送液ポンプ９に
接続され、他端がフローセル１０に接続されている。フ
ローセル１０は、石英ガラス等により構成され、内部の
フローチャふル１０ａ内にシースフローが形成され、流
体力学的焦点合わせ効果により、試料中の細胞又は粒子
がフローチャネル１０ａ中心軸上を一列になって流され
る。

フローセルＩＯより流出した液は、廃液チューブ１１に
導かれて、廃液タンク１２に収容される。

なお、この細胞分析装置は、図示しないシース液タンク
を備えており、前記試料ポンプ７、送液ポンプ９にシー
ス液が補充される。また、オートサンプラー２、ポンプ
７．９等を含む送液系は密閉可能で、バイオハザードを
防止できる。

フローセル１０の周囲には、レーザ（光源）１４、光検
出器（細胞光情報検出手段）１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、
１５ｄが配設される。レーザ１４よりのレーザビーム！
は、フローチャネル１０ａを流れる細胞（又は粒子）に
照射される。この細胞よりは、信号光が発生するが、そ
の内前方方向のものは、前方散乱光として、レンズ１６
ａに集光されて、光検出器１５ａに入射する。１７は、
レーザビームｌが直接光検出器１５ａに入射するのを防
止するビームプロシカである。

一方、細胞よりの９０°方向の信号光は、レンズ１６ｂ
で集光される。この信号光はその一部がグイクロインク
ミラー１８ａで反射されて、９０゜散乱光検出用の光検
出器１５ｂに入射する。グイクロインクミラー１８ａを
透過した信号光は、さらにその一部がもう一つのダイク
ロイックミラー１８ｂにより反射されて、フィルタ１９
ａを透過して、緑色蛍光用の光検出器１５ｃに受光され
る。

ダイクロイックミラー１８ｂを透過した光は、フィルタ
１９ｂを透過して赤色蛍光用の光検出器工５ｄに受光さ
れる。なお、例えばレーザ１４には、アルゴンレーザや
ヘリウムネオンレーザ、前方散乱光用の光検出器１５ａ
にはホトダイオード、その他の光検出器１５ｂ、１５ｃ
、１５ｄには光電子増倍管が適用される。

光検出器１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄの受光信号は
、信号処理回路部２０で増幅されノイズを取除かれた後
、アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器２１によりデジ
タル信号に変換されて、ＭＰＵ２２に取り込まれる。

ＭＰＵ２２は、散乱光強度■９゜−１０サイトグラムを
作成する機能、この■、。−■。サイトグラム上でウィ
ンドウを設定する機能、ウィンドウ内又はウィンドウ外
でデータを収集する機能、収集されたデータについて蛍
光特性解析を行う機能、その他、試料ポンプ７、送液ポ
ンプ９及びオートサンプラー２を制御する機能等を有し
ている。

ＭＰＵ２２には、フロッピディスクドライブ２３、キー
ボード２４、ＣＲＴ２５及びプリンタ２６が接続されて
いる。フロッピディスクドライブ２３は、測定条件（プ
ロトコル）や測定データ等を、フロッピディスクに保存
させるためのものでる。キーボード２４は、プロトコル
の選択・設定あるいはその他の指令をＭＰＵ２２に入力
するためのものである。ＣＲＴ２５は、測定をモニタす
るためのものであり、プリンタ２Ｇは、ＭＰＵ２２の処
理結果、例えばサイトグラムやヒストグラム等をプリン
トアウトするためのものである。なお、図示しないがマ
ウス等の入力手段も接続される。

次に、実施例細胞分析装置の動作を説明する。

まず、分析目的に応じた処理が施された試料が、それぞ
れ試料容器３に入れられて、試料ラック２ａに装填され
る。例えば、リンパ球サブセットの解析を行う試料は、
患者の血液にフルオレセインインチオシアネート（Ｆ　
ＩＴＣ）で標識した０ＫＴ４モノクロ−ナノＧ抗体及び
ファイコニリスリン（ＰＥ）で標識した０ＫＴ８モノク
ロ一ナル抗体を反応させた後、溶血処理して得られる。

細胞分析装置の電源がオンされると、図示しないＲＯＭ
よりＭＰＵ２２にプログラムが読込まれ、システムが立
上がる（ステップ（以下ＳＴという）１、第１図参照〕
。次に、測定する試料に適合するプロトコルが選択・設
定される。このプロトコルには、光検出器１５ａ、１５
ｂ、１５ｃ、１５ｄの検出ゲインや補正演算等の測定条
件を内容とするものである。これは、試料の処理方法が
測定目的に応じて異なるためであり、例えば各処理に用
いられるモノクローナル抗体の細胞との反応性はそれぞ
れ異るため、光検出器１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ
の検出ゲインを変更する必要があり、また各モノクロー
ナル抗体と蛍光色素の結合様式がそれぞれ異なるため補
正演算もそれに応じて変更する必要がある。

ＳＴ２では、試料をフローセル１０に流して測定が行わ
れる。まず試料ラック２ａが駆動され最初に測定を行う
試料が入れられた試料容器３を試料吸引チューブ４直下
に位置させる。そして、三方弁５が試料吸引チューブ４
と試料送液チューブ６ａとを連通ずるように切り替えら
れ、試料吸引チューブ４が試料容器３内に降下し、試料
ポンプ７が吸引側に駆動されて、試料が試料送液チュー
ブ６ａに吸引される。

次に、三方弁５が試料送液チューブ６ａと６ｂとを連通
ずるように切り替えられ、試料ポンプ７が送液側に駆動
され、試料が送液チューブ８に送られる。一方、送液ポ
ンプ９が送液側に駆動され、シース液がフローセル１０
に送られる。フローチャネル１０ａ内では、シースフロ
ーが形成され流体力学的焦点合わせ効果により、細胞は
フローチャネル１０ａ中心軸上を一列になって流れてい
く。この細胞の一つ一つについてレーザビーム！が照射
され、前方散乱光強度■。、９０°散乱光強度■、。、
緑色蛍光強度Ｉ９、赤色蛍光強度■１がそれぞれ測定さ
れてい（。これら細胞光情報は、フロッピディスク等に
順次記憶されていく。

ＭＰＵ２２は、測定されたデータに基づき、散乱光強度
Ｉ、。＝■。サイトグラムを作成する（Ｓ７３）。この
■、。−１０サイトグラムは、ＣＲＴ２５に表示され、
操作者はマウス等を用いて、１９０　　ｔｏササイトグ
ラム上ウィンドウを設定する（Ｓｒ４）。なお、ウィン
ドウＢの設定は自動的に行う構成としてもよい（オート
トリガ）。

Ｓｒ１では、ウィンドウＢの再設定を行うか否かを判定
する。この判定は、操作者がＣＲＴ２５の表示を見て行
ってもよいし、また、ウィンドウ内について、■、。、
Ｉ０ヒストグラムを作成し、そのピーク位置、平均値、
標準偏差、変動係数を算出し、これらを基準値と比較し
て再設定を行うか否かを自動的に判定してもよい。この
判定がＹＥＳの場合にはＳｒ６へ、ＮＯの場合には５Ｔ
ＩＯへそれぞれ分岐する。

Ｓｒ６からＳｒ１からは、いわゆるネスティゲーション
によるウィンドウの再設定処理である。

例えば、白血病患者の場合には、■、。−！。サイトグ
ラムが第３図（ｂ）に示すように、リンパ球分布に他の
細胞の分布が重畳する時がありこのような場合には一応
重畳した分布ｅを囲むようにウィンドウＢを設定する（
Ｓｒ４）。このような場合には、Ｓｒ１の判定がＹＥＳ
となりＳｒ６へ分岐する。

Ｓｒ６では、ウィンドウＢ内に属する細胞のデータが収
集され、これらデータに基づいて蛍光強度１．−１．サ
イトグラムが作成される〔第３図（Ｃ）参照〕。このサ
イトグラム上で、分布ｉを囲むようにウィンドウＣが設
定される（Ｓｒ７）。

さらに、このウィンドウＣ外（斜線を付した部分）に属
するデータをＭＰＵ２２が収集し、収集されたデータに
ついて再び散乱光強度１９０　１０サイトグラムを作成
する〔第４図（（１）参照〕。このＩ、。−■。サイト
グラム上では、重畳した部分がとり除かれ、リンパ球の
分布すが現れる。そこで、リンパ球の分布すを正確に含
むウィンドウＢ°を再設定することができる。

５ＴＩＯでは、ＭＰＵ２２はこの再設定されたウィンド
ウ内′内（斜線を付して示す）についてデータを収集し
、再び蛍光強度１．−１．サイトグラム（あるいは■９
ヒストグラム、■、ヒストグラム）を作成し、陽性率の
算出等を行う、　Ｓｒ１の判定がＮＯで、直接５ＴＩＯ
に分岐してきた場合には、Ｓｒ４で設定されたウィンド
ウＢ内についてデータを収集し、同様の処理を行う。

また、リンパ球以外の細胞について蛍光特性解析を行い
たい場合には、第３図（ａ）に示すように、ウィンドウ
Ｂ外（斜線を付して示す）についてデータを収集し、蛍
光特性解析を行う。

５ＴＩＩでは、５ＴＩＯでの蛍光特性解析の結果がＣＲ
Ｔ２５に表示され、５Ｔ１２ではさらに、この結果がプ
リンタ２６よりプリントアウトされる。

５Ｔ１３では、さらに測定すべき試料があるか否かが判
定される。この判定がＹＥＳの場合には、ＳＴＩへ戻り
、ＮＯの場合には分析を終了する。

なお、この実施例では、リンパ球の分布を例に上げて説
明しているが、単球等白血球全般、赤血球、培養細胞等
の広範囲の試料の分析について本発明は適用可能である
。

（ト）発明の詳細 な説明したように、この発明の細胞分析装置は、分析領
域設定手段で設定された分析領域外の細胞光情報を、補
集合的に収集する第２の細胞光情報収集手段を備え、細
胞光情報演算処理手段は、第１の細胞光情報収集手段又
は第２の細胞光情報収集手段で収集された細胞光情報を
選択して演算処理することを特徴とするものであるから
、必要な細胞手段のデータを的確に特定して収集し、複
雑なサイトダラムパターンの解析をより精度よく行うこ
とができる利点を有している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の一実施例に係る細胞分析装置の動
作を説明するフロー図、第２図は、同細胞分析装置の構
成を説明するブロック図、第３図（ａ）、第３図（ハ）
、第３図（Ｃ）及び第３図（ｄ）は、ぞれぞれ同細胞分
析装置におけるウィンドウとデータを収集する領域との
関係を説明するサイトグラム、第４図（ａ）、第４図〜
）、第４図（Ｃ）及び第４図（ｄ）は、それぞれ従来の
細胞分析装置におけるウィンドウとデータを収集する領
域との関係を説明するサイトダラムである。 １０：フローセル、　　１４：レーザ、１５ａ１５ｂ１
５ｃ・１５ｄ：光検出器、２２：ＭＰＵ、　　　　２５
　：　ＣＲＴ、２６：プリンタ。 第 図 （ａ） ｌｓ。 第 図 （ｂ） 第 図 （ａ） ｌｓ。 第 図 （ｂ） 第 図 （Ｃ） 第 図 （ｄ） 第 図 （Ｃ） Ｉｓ。 第 図 （ｄ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞浮遊液が流されるフローセルと、このフロー
   セル内を流れる細胞に光ビームを照射する光源と、 この光ビームが照射されたそれぞれの細胞について、複
   数のパラメータよりなる細胞光情報を検出する細胞光情
   報検出手段と、 この細胞光情報検出手段で得られる、１又は２以上のパ
   ラメータに基づいて分析領域を設定する分析領域設定手
   段と、 この分析領域設定手段で設定された分析領域内で、目的
   とする細胞集団の細胞光情報を収集する第１の細胞光情
   報収集手段と、 前記細胞光情報検出手段で検出された細胞光情報及び前
   記第１の細胞光情報収集手段で収集された目的細胞集団
   の細胞光情報を演算処理する細胞光情報演算処理手段と
   、 この細胞光情報演算処理手段の演算処理結果を出力する
   出力手段とを備えてなる細胞分析装置において、 前記分析領域設定手段で設定された分析領域外の細胞光
   情報を、補集合的に収集する第２の細胞光情報収集手段
   を備え、 前記細胞光情報演算処理手段は、前記第１の細胞光情報
   収集手段又は第２の細胞光情報収集手段で収集された細
   胞光情報を選択して演算処理することを特徴とする細胞
   分析装置。