JPH04500220A - 医薬組成物およびウイルス阻害方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 医薬組成物およびウイルス阻害方法 発明の背景 本発明は、医薬組成物およびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の阻害方法、なら びに特には抗ウイルス効果を達成する量の１．５−ジデオキシ−１，５−イミノ −Ｄ−グルシド・−ル（デオキシノジリマイシン）のＮ−ブチル誘導体と３′− アジド−３′デオキシチミジン（ＡＺＴ）との相乗作用的組合せ（合剤）に関し 、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ関連コンブレタス（ＡＲＣ ）の治療に存用性を有するものである。

後天性免疫不全症候群は、わずか数年前までは医学的に珍しいものであったが、 今では深刻な疾患である。従って１．ＩＤｓに対する医薬およびワクチンの開発 には多大な努力かなされている。ＡＩＤｓＩＤ外スは、１９８３年に！＆肋に同 定され、数種の名称により記述されてきており、また免疫系細胞内にて複製可能 であって、ニオ１によりＴ４”　Ｔ細胞（またはＣＤ４”細胞）を完全な−５０ ０（１９８４）参照。

このライ）Ｌスは、ｌ／Ｆ−ロウィルスであることが確立されているか、リンパ 節症関連ウィルス（ＡＲＶ）またはＡＩＤＳ−関連ウィルス（ＡＲＶ）として知 られている。

２種類の異なったＡＩ　Ｄ　Ｓウィルス、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２か記述さ れている。ＨＩＶ−１は、１９８３年にＭｏｎｔａｇｎｉｅｒおよびパリのパス ツール研究所の共同研究者らにより最初に同定され（Ａｎｎ、　Ｖｆｒｏｌ、　 ｒｎｓｔ。

Ｐａ５ｔｅｕｒ　１．３５Ｅ、１１９−１３４（１９８４））、一方ＨＩＶ−２ は、１９８６年、Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒおよび彼の共同研究者らによって単離さ れた（Ｎａｔｕｒｅ　３２６．　６６２（１９８７））。ここにおいて使用され ているように、■（）ｖは一般的意味においてこれらのウィルスをさす。

ＡＩＤＳの分子生物学は解明さね、定義され始めたが、この疾患に関しては更に 研究され、理解されなければならない。さしあたって有力な抗−ＡＩＤＳ剤およ びワクｉ　チンの研究において多くの方法が検討されている。ＡＩＤＳワクチン の開発は、ＨＩＶに対する防護的免疫の理解の欠如、該ウィルスの遺伝的変化の 程度、およびＨＴ■感染の有力な動物モデルの欠如によって妨げられている。例 えばにｏｆｆおよびＨｏｔｈ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１　、　４２６−４３２ （１９８８）参照。

ＨＩＶ＋、：感染したヒトの治療のための薬剤およびワクチン設計の一方法は、 分子生物学者が得た該ウィルスの宿主細胞への侵入と感染、複製、および他の細 胞への感染と続く複製的ライフサイクルについての知識に依存している。ＨＩＶ の複製的サイクル中に抗ウィルス的治療の有力な標的となるある種のウィルス特 異的段階がある。

Ｈｉｒｓｃｈら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、 ３１．　８３９−４３　（１９８７）。

ＡＩＤＳ治療用に米国食品医薬局（ＦＤＡ）により認可された最初の薬剤は、以 前の名称であるアジドチミジン（Ａ　Ｚ　Ｔ）のちとにより良く知られているシ トプシン（ｚｉｄｏｘ・ｕｄｉｎｅ）である。化学的にはこの薬剤は、３′−ア ジド−３′−デオキシチミジンであり、次の構造式を存している： ＡＺＴは、細胞性キナーゼ類によりトリホスフェートの形態に転換され、これは ＨＩ　Ｖ逆転写酵素の強力な競合的阻害剤であり、従ってＨＩＶ複製の初期段階 を妨害する。

この薬剤は、該ウィルスの複製をインビトロにおいて阻害することか示されたた め、最初にＡＩＤＳに対する有力な武器として選択された。このような試験は、 有力な抗−ＡＩＤＳ剤の初期のスクリーニングおよび試験のみに実際的な方法で ある。

今日ＡＺＴは臨床的に使用されているが、ＡＺＴの深刻な欠点は、その毒性的副 作用である。実際にＦＤＡは、活性成分としてＡＺＴを含有する商業的に入手可 能な医薬組成物であるレトロビル（Ｒｅｔｒｏν１ｒ」）の能書に、顆粒球減少 症を含む血液学的毒性および輸血を必要とする重篤な貧血の警告を要求している 。従ってより良い抗Ａ１、ＤＳ剤の研究か継続されている。

より最近に、ある種のグルコシダーゼ阻害剤かＡＩＤＳウィルスに対する活性に ついて試験されている。ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質は高度にグリコジル化さ れているため、糖蛋白質ｇｐ１２０および膜内性糖蛋白質ｇｐ４１の翻訳中およ び翻訳後処理を妨害する化合物は、ウィルスの細胞への侵入を阻止するであろう 。Ｋａｒｐａｓら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　 ８５．　９２２９−９２３３（１９８８）。これらの化合物は、ＨＩＶ複製過程 においてＡＺＴとは異なる段階を妨害または阻止する。

育力な抗−Ａ　ＩＤＳ剤として示唆されているこのような３種の化合物は、カス タノスペルミン、１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）および２，５−ジヒド ロキシメチル−３，４−ジヒドロキシ−ピロリジン（ＤＭＤ８４．８１２０−８ ２２４　（＋９８７）：および参照。

このようにオーストラリアンチェスナツトの種から単離されたアルカロイドであ るカスタノスペルミンは、ＨＴＶの正常なグリコジル化を妨害し、これによりエ ンベロープ糖蛋白質を変質させ、ＨＩＶの標的細胞への侵入を阻止することが見 出された。しかしなから、カスタノスペルミンは天然超厚の限定された供給のた めに極めて高価であり、従って緊急に大規模量必要な薬剤としては現実的な候補 ではない。更には、カスタノスペルミンは０．７０■／イの投与量水準において 細胞毒性が示されている。Ｋａｒｐａｓら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ 、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　８５゜９２２９−９２３３　（１９８８）。

１９８７年７月２日発行のＰＣＴ国際出頼ＷＯ３７１０３９０３には、デオキシ ノジリマイシン（ＤＮＪ）のＮ−メトル誘導体が、ＨＩＶに対する活性を有する ものとし、てそのグルコシダーゼ阻害活性に基づいて具体的に示されている。し かしながら、引続いてＦｌｅｅｔ　らのＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２３７，１２８　 １３２（１９８８）によりず・＼でのグルコノダーゼＩ阻害剤がＨＴＶの有効な 阻害剤であるとは限らないことか示された。従って、他の何らかの機構かＨＩＶ ＩＩＩ害活性の原因となるであろう。

デオキシノジリマイシンのＮ−ブチル誘導体（Ｎ−ブチルＤＮＪ）は、対応する Ｎ−メチルおよびＮ−エチル誘導体により示される活性に比べ、非毒性濃度にお いてヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に対して増強された阻害活性を有すること が見出された。

Ｎ−ブチルＤＮＪは、次の化学構造を育している：立体異性を示すために、実線 および破線は、それぞれ紙面の上方および下方を向く結合を表している。

Ｎ−ブチルＤＮＪは、非−細胞毒性濃度においてウィルス力価を比類なく対数で ５以上に低減させるが、その一方Ｎ−メチルおよびＮ−エチル−デオキシノジリ マイシン誘導体は感染性ＨＩＶの収率を対数で２〜４低減させるにすぎない。こ のようにＮ−ブチル誘導体は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤｓ）の治療に対し て有意に可能性を存し、この薬剤の第１相臨床試験が最近公表されている。

ＨＩＶ感染患者の医薬治療において得られた上記の進歩とは別に、ＨＩＶに対し て効果的な非毒性治療は、組合せ療法の使用に関連する化学療法約手がかりが必 要であると信じられている。このような手法は、抗−ＨＩＶ治療においては広く 使用されてはいないが、癌の化学療法に加えて種々の細菌およびカビ感染の治療 においては成功している。ＨＩＶ複製サイクルを多重的部位で攻撃する薬剤を含 む抗−ＨＩ　Ｖ治療の組合せは、特に好ましい薬剤相互作用が起こる場合にはい くつかの優位点を提供する。

２種類の薬剤が組合された場合、それらは以下に議論されるように組合せ指標（ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ　）（ＣＩ）によって確立されているイン ビトロにおけるＨ１■複製に対する３種類の型の活性中の１つを有するであろう 。

１、　相加的効果二組合せにおける薬剤の活性が、別個に研究された場合の独立 した活性の和（または部分和）に等しい場合に、２つの薬剤は相加的であるとい う。

Ｚ　薬剤の相乗的対の組合せ効果は、別個に測定された場合の独立した活性の和 より大である。

３、　拮抗的効果：２種類の薬剤が拮抗的である場合に、組合せの活性は単独で 測定された場合の独立の効果の和より小さい。

組合せ治療の目的は、ＨＩＶ複製サイすル中の異なった部位を標的とし、広範囲 の細胞型においてウィルス複製に影響を与える能力を含む。また、該薬剤は組合 せにおいて付加的な毒性を示してはならない。組合せ治療の利点は、個々の薬剤 の毒性濃度以下での使用を可能とするインビトロにおける有力な相加的または相 乗的相互作用を含む。また、組合せ治療は、薬剤耐性ＨＩＶ変異株の出現をも防 止する。

種々の公知の抗−ＨＩＶ剤の組合せの研究はすでに行なわれている。例えば、Ａ 　Ｚ　Ｔまたは２’＋３′−ジデオキシシチジンのいずれかと組換えアルファー へインターフェロンとの組合せかインビトロにおいてＨＩＶを相乗的に阻害する ことか示されている。Ｈａｒｔｓｈｏｒｎら。

Ａｎｔｉｍｉｃ’ｒｏｂ、　、Ａｇ、　Ｃｈｅｎ＋ｏｔｈｅｒ、３１．　１６８ −７２　（１９８７）：Ｖｏｇｔら、Ｊ、Ｉｎｆｅｅｔ、Ｄｉｓ、１５８．　３ ７８−８５（１９８８）。ＡＺＴとアシクロビル等の他の組合せが相乗的である ことも示されている。ＭｉｔｓｕｙａらのＳ、　Ｂｒｏｄｅｒ纒、　Ａ　ｉ　Ｄ 　Ｓ、　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｃ ｈａｌｌｅｎｇｅｓ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ、、　ＮｅｗＹｏ ｒｋｏ　Ｌかしながら、ＡＺＴとリバビリン（１，β−Ｄ−リボフラノシルー１ １−１２−１−リアゾール−３−カルボキサミド）等の他の試験薬の組合せは、 インビトロにて拮抗的であることが示された。Ｖｏｇｔら、　５ｃｉｅｎｃｅ、 本発明により、Ｎ−ブチルＤＮＪとＡＺＴとの組合せが、インビトロにおいて付 加的な毒性無しにＨＴＶを相乗的に阻害することが見出された。こうして、ＡＺ ＴとＮ−ブチルＤＮＪとの各々が低投与量で使用され、従って各々の毒性的副作 用、特にはＡＺＴによるものを最少にする。

ＡＩＤＳまたはＡＲＣを患うヒトの治療のために適した本発明の組合せ中のＡＺ Ｔ成分の投与量は約５０■／日〜約１．２ｇ／日の範囲である。

ＡＩＤＳまたはＡＲＣを患うヒトの治療のために適した本発明の組合せ中のＮ− ブチルＤＮＪ成分の投与量は、約１■／ｋｇ／日〜約５００■／　ｋｇ　／日の 範囲である。実験動物における毒性試験は、Ｎ−ブチルＤＮＪが低毒性であるこ とを確立した。該薬剤は、それらの組合せの相加的または相乗的利点を達成する に充分な量をもって組合わされる。

本発明の詳細な説明 事項を特に指摘し、明確に請求しつつ請求の範囲を結論付けているが、本発明は 以下の記述により更に良く理解されるものと信じられる。

ＡＺＴおよびＮ−ブチルＤＮＪの供給源ＡＺＴは、Ｄｒ．　Ｐ．　Ａ．　Ｆｕｒ ｍａｎ，　Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ−ＷｅｌｌｃｏｍｅＣｏ．、　Ｒｅｓｅａｒｃｈ 　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ，　Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａから粉末形態 で得た。これを殺菌リン酸緩衝食塩水中に溶解させ、０．５ｍｌ／バイアルの分 別量で１ｍＭの濃度にて使用前には−　２０℃で保存した。

Ｎ−ブチルＤＮＪは、叶．　Ｒ．　Ｍｕｅｌｌｅｒ．　Ｇ．　Ｄ．　Ｓｅａｒｌ ｅ＆　Ｃｏ．から粉末形態で得た。これを使用まで粉末形態にて４゜Ｃで保存し 、新鮮な薬剤溶液を各媒質変化毎に調製した。該Ｎ−ブチルＤＮＪは、無菌ろ過 二回蒸留水に溶解し、薬剤希釈物のｍａ前に無菌ろ過を行なった。

抗一ウイルス活性のアッセイ これらの例においては、抗−ウィルス剤の研究に使用されている種々のインビト ロアッセイの修飾を用いて本発明の種々の組合せの抗ウィルス活性を評価したＣ Ｈｏら。

（＋９８６））。

これらのアッセイのそれぞれのために、ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　ｒｎｓ ｔｊｔｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭａｒｙｌａｎｄのＤｒ、　Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ，Ｇａ１ｌｏから提供された非感染Ｈ９細胞ＣＰｏｐｏｖｉｃら、５ｃｉｅｎ ｃｅ、２２４．　４９７−５００　（１９８４）　）を、０．４ＸＩＯ＠細胞／ ｒｎＩの初期濃度で、ＲＰＭＩ−１６４０培地、２０％熱−不活性化胎児性ウシ 血清（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ　）　、Ｌ −グルタミン（２ｍＭ）、および抗生物質（ペニシリン、２５０　Ｕ、、、／− およびストし・ブトマイシン、２５０μｇ／−）を含むＲ−２０培養培地に５ｍ ｌ最終体積で、１”　−２５フラスコ（Ｐａ！ｃｏｎ。

Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｅｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１．１ｎｃｏｌ ｎ　Ｐａｒｋ、　ＮｅｗＪｅｒｓｅ）・）内にて培養した。

実験において、非感染８９ｍ胞（２ＸＩＯ’細胞）を５−のＲ−２０培地中にＴ −２５フラスコ中て靜濁した。

感染の倍率は、＋　ｘ　ｉ　ｏ’細胞あたり細胞非含有ＨＩＶ−ｌ　（ＨＴＬＶ −ＩＩ［Ｂ）　（Ｄｒ、　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｃ，Ｇａ１ｌＯから得た）の２５０組 織培養感染投与量（ＴＣＩＤｉ、）とした。

Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ　ら、　Ａｎｔｉｍｉｅｒｏｂ、　Ａｇ、　Ｃｈｅｍｏｔｈ ｅｒ、３１．　１６８−７２　（１９８７）参照。培養培地を４．７および１１ 日ロー、元の濃度の抗レトロウィルス剤を含む５−の置換培地に２−の細胞懸濁 物を再懸濁することによって交換した。種々に変化させた濃度のＮ−ブチルＤＮ ＪまたはＡＺＴを単独または組合せにおいて、細胞培養物にＨＩＶ単離物と同時 に添加した。、、該培養培地を４．７および１１日ロー交換し、またＮ−ブチル ＤＮＪ、ＡＺＴまたは両者を培地交換と共に各薬剤が元々存在した濃度を保つた めに添加した。

これらのアッセイにおいて、培養物の無細胞上澄液を、ＨＩＶ−１コア抗原ｐ２ ４産生、ウィルス性逆転写酵素活性（ＲＴ）または感染性ウィルスの産生を測定 するために７．１１および１４日口の１日以上から採取し、インビトロにおける ＨＩＶ複製に対する薬剤の単独または組合せでの効果を評価した。

各ウィルス複製アッセイのため、非感染細胞を続けて洗浄することなくＨＩＶ− １に曝露させた。同時に、倍希釈した所定比の組合せ薬剤、または単独の薬剤を 各フラスコに添加した。細胞増殖および生存をトリバンブルー　（ｔｒｙｐａｎ 　ｂｌｕｅ　）染料排除法で評価した。すべてのアッセイにおいて、非感染およ び感染培養物を並行して維持した。薬剤処理毒性対照を、試験したいずれかの薬 剤の抗増殖効果による抗−ＨＴＶ−１効果を除くため、試験した各薬剤（単独ま たは組合せのいずれか）の最高濃度において維持した。

逆転写酵素活性を、ＨＩ　Ｖウィルス複製に対する本発明によるＡＺＴとＮ−ブ チルＤＮＪの組合せの効果の指４）に記述されている〕。

更に特定的には、該逆転写酵素アッセイにおいては以下に示す試薬を使用した。

ジチオス［／イ）・−ル（ＤＴ′ｒ）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌｓ。

ｒｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａから入Ｊした。ＰＥＧ３０００（ポ リエチ［・ングリーーール）は２、Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

Ｍｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓａｃｈ＋＋５ｅｔｔｓから入手１，７た。使用し、 たｔＲＮＡは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉ ｓｓｏｕｒｉから入手したタイプＸ−Ｓであ・つた。３Ｈ−ＴＴＰ　（トリチウ ム化ナミ、ラントリホスフェート）は、Ｄ　ｔ＋　Ｐ　ｏ口ｔ、　ＮｅｗＥＢＩ ａｎｄ　Ｎｕｅｌｅａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄａｃｔｓ、　Ｂｏｓｔｏ ｎ。

ｌ１ｌａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手（）た◇緩衝液Ａ ＊１．ＯＭ）−リス（ｐＨ７，８）　１２．５ｍｌ＊０．１Ｍエチレンジアミン 四酢酸　１．２５ｄ＊１０％トライトン′Ｘ−１００１，２５１ｎＩ＊グリセロ ール　２５０．００Ｗ１１ 水　２３５．　１０ｒｎｌ ＤＴＴ　（結晶）　０．７７ｇ ＫＣＩ（結晶）　３．７２ｇ ５００．００ｔ＋ｔｔ’ 溶液２ ＊ｌＯ％トライトンＸ−１００４５，００ｒｎｌ二回蒸留水　４５５．００ｄ ＫＣＩ（結晶）　１．６３ｇ ５００．００ｍｊ ＰＥＧ（３０％）、０．３Ｍ　ＮａＣｌＰＥＧ３０００　１５０．００ｇ ＮａＣ１１１，７０ｇ 水　５００．００ｙｄまで トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（１０％） ＴＣＡ　５０．００ｇ ビロリン酸すトリウム　４．４６ｇ 水　５００．００−まで ＊溶液は蒸留水にて調製した。

トリクロロ酢酸（５％） ＴＣＡ　１０００．００ｇ ピロリン酸ナトリウム　１７８．００ｇ水　２０．００１まで 万能緩衝液 ０．０１Ｍトリス（ｐ）１８．　０）および０．０１５Ｍ　ＮａＣｌ溶液 ０．２Ｍジチオスレイトール ０．３０９ｇ　ＤＴＴ １０．０−万能緩衝液 この溶液は一２α°Ｃに凍結して保存し、使用前に一度だけ解凍した。

ｌＯ■／ｄｔＲＮＡ ｔ　ＲＮＡは万能緩衝液中にて１０■／ｒｎｌに調製し、２０℃にて保存した。

１０単位／ｒＩＬｌｄＡまたはｒＡテンプレートオリゴｄＴテンプレートブライ マー（＃２７−７８７８および＃２７−７８６８、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　／　Ｐ 　−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒ ｓｅｙ）は、２．　５ｒｎｌの万能緩衝液中に溶解させ、ｌＯ単位／′−溶液と した。

該溶液は０．５−の分別量として一２０℃にて保存し、使用前に解凍した。

無細胞上澄からのウィルス粒子のＰＥＧ沈殿を、２または３イの清明化培養物上 澄液に２分のｌのＰＥＧ沈殿溶液を加え、よく回転攪拌し、該混合物を４°Ｃに て一夜静置することによって行なった。次いで重力加速度の８００倍（〜２１０ Ｏｒｐｍ）にて４５分間遠心分離を行なって沈殿をベレット化した。引続き、上 澄液をすべて吸引除去し、沈殿物を立て、次いで再度吸引して乾燥ペレットを与 えた。次いで該沈殿をＬＯＯμｌの緩衝液Ａおよび５０μ！の溶液２を含む緩衝 液中に再懸濁し、ここで使用した元の上澄は２−であり、異なる体積の上澄液に 比例する体積の再懸濁緩衝液を使用した。該ベレットを、試験管中でパスツール ピペットを入れて回転させることによって再懸濁した。直ちにアッセイを行なわ ない場合には、該試料を一２０℃で凍結させた。該ＰＥＧ沈殿のすべての工程は 、閉栓遠心分離管内で行なわれた。

空気に曝す必要のあるいずれの工程もウィルスを不活性化する緩衝液Ａおよび溶 液２の添加が済むまではバイオハザードツー　ド内にて行なった。

試料のアッセイを、以下の逆転写酵素（ＲＴ）混合溶液を用いて行なった： ｒＡ混合溶液Ｘ　ｄＡ混合溶液× ＃試料　＃試料 ＲＴ混合溶液　（μｌ／試験管）　（μｌ／試験管）１Ｍトリス　４４ （ｐＨ７，８） ０．２Ｍ　ＤＴＴ　４　４ ｏ、２Ｍ　ＭｇＣＬ　５　５ 二回蒸留水　４７　４７ 万能緩衝液　２２．　５　２２．　５ ３Ｈ−ＴＴＰ　２．５　２．５ オリゴｄＴ、ポリｒＡ　５　５ （またはｄＡ） ＲＴ混合溶液を、試薬体積に試料数と対照用（ｄＡ混合溶液は、内部負対照であ った）の２とピペット損失のための２との和を乗じて調製した。続いて、９０μ ｌのｒＡまたはｄＡ混合溶液を、氷−水浴中に保ったエッペンドルフ試験管に加 えた（各試料について１つのｒＡおよび１つのｄＡ試験管）。次いで、各試料を １０μｌづつｒＡ試験管およびｄＡ試験管に加え、回転攪拌し、次いで３７℃の 水浴中で１時間熟成させた。

逆転写酵素活性を停止させるために、試料を水浴から外し、それらを氷水浴中に 置いた。次いで各試験管にｌＯμｌの冷却ｔＲＮＡ溶液を加え、更にｌ−の冷却 したｌＯ％ＴＣＡ溶液を加えた。該試験管を氷水浴中に２０−３０分間立ててお いた。

次いで２．４ａｏグラスフアイバーフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　）を５％ ＴＣＡ溶液につけた。該フィルターを真空源に装着されたサンプリングマニホー ルド（Ｍｉｌｌ　１ｐｏｒｅ、モデル１．２２５）上に置いた。続いて試料を該 フィルターに適用し、各試料試験管を１−に設定されたコーンウオール（ｃｏｒ ｎｗａｌｌ）シリンジを用いて５％ＴＣＡ溶液により該マニホールド中に４回す すぎ入れた。次いで、真空を保ちつつマニホールドウェルを素速く充填すること により、該フィルターを５％ＴＣＡにより２回洗浄した。減圧を停止し、マニホ ールドの各ウェルを７０％エタノールで満たし、再度真空をかける前に該フィル ターを約１５秒間保つことにより該フィルターを乾燥させた。

続いて、該フィルターを加熱ランプ下に１０−２０分装置いて乾燥させた。該乾 燥フィルターを１８ｒｎｌのシンチレーションバイアル（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎ ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中に入れたＯ次いで、１ ０１０−ｌ２’の計数用のベータフルオル（Ｂｅｔａｆｌｕｏｒ　）シンチレー ション液体（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｍａｎｖｉｌｌｅ 。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）を各バイアルに加え、バイアルに栓をした。

各試料を非特異的ポリ（ｄＡ）−オリゴ（ｄＴ）、！−、＊テンプレートを用い て試験した。

ｄＡカウント／分をｒＡカウント／分から差引いて結果を得、これに７．５を乗 じて正身のカウント７分／−を元の培養物上澄試料について変換した。１０３カ ウント／分／′−またはそれ以上の値を有する試料をＨＩＶ−１について正であ ると考えた。

ｐ２４　ＥＬＩＳＡ Ｎ−ブチルＤＮＪおよびＡＺＴを、ウィルス複製の阻害剤としてＩ）２４ＥＬＩ ＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）において試験し、た。ＨＩＶｐ２４抗原の検 出は、ＡＩＤＳへの進行と関連し、抗レトロウィルス剤の候補の評価において重 要な終点として提案されている。

特定的には、ｐ　２４抗原として以下のように無細胞培養上澄液を試料にした。

アッセイキット（ＨＩＶｐ２４コア抗原ＥＬＩＳＡ、カタログ番号ＮＥＫ−０４ ５，ＮＨＫ−０４６およびＮＥＫ−０４７、ＤｕＰｏｎ　ｔ　−ＮＥＮＲｅｓｅ ａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂ１１１ｅｒｉｃａ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ ｔｔｓ　）を入手し、これはキットに含まねたプロトコールによれば、試験試料 から溶離される任意のｐ２４抗原を捕捉するためにマイクロプレートウェルに固 定されたｐ２４抗原に対するウサギポリクローナル抗体を含んでいる。捕捉され たｐ２４抗原は、ｐ２４抗原に対するビオチニル化ポリクローナル抗体と複合化 し、ストレプトアビジン−西洋ワザビペルオキシダーゼ接合体によりプローブと される。次いて、オルトフェニルジアミン−ＨＣｌとの複合体を熟成し、これは 捕捉されたｐ２４抗原の量に比例する黄色を生した。次いて、マイクロプレート 読取装置を用いて各ウェルの吸光度を測定し、ｐ２４抗原標準曲線の吸光度に対 して較正した。

薬剤相互作用の数学的分析 薬剤相互作用を、中央値効果およびイソボログラム技術により、ＩＢＭ−ＰＣを 用いてコンピュータソフトウェアによって評価した（Ｃｈｏｕら“マイクロコン ピュータによる投与効果分析：　ＥＤ、。、ＬＤ、。、相乗性および拮抗性、低 投与量リスク、受容体結合および酵素動力学の定量化。Ａｐｐｌｅ　ＩＩまたは ＴＢＭＰＣ用コンピュータソフトウェア（［ＥＩｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｓｏｆｔ 、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ。

１９８６））、多重薬剤効果分析［Ｔ、　Ｃ，ＣｈｏｕおよびＰ。

Ｔａ１ａｌａｙ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇｕｌ、、　２２．２７−５ ５頁（１９８４））を組合せ薬剤効果を計算するために使用した。この方法は、 各薬剤および薬剤の倍々希釈固定比組合せについての投与効果曲線を中央値効果 方程式（ｍｅｄｉａｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用いてプロットす ることを含む。この方法に基づいて、本発明による種々の組合せについて組合せ 指標（ＣＩ）を決定した。ＣＩ値は、各薬剤およびそれらの組合せの中央値効果 プロットのパラメータｍ（傾斜）およびり、（ＥＤ＆。）からイソボログラム方 程式に基づいて決定した。

組合せ指標が１未満である場合には相乗的であることを示し、一方、値か１に等 しい場合には相加的効果を示し、また１より大きい値は、先に定義したように拮 抗的であることを示す。また、該データをイソホログラム法により分析し、これ は投与量指向幾何的方法による薬剤相互作用を評価する。

以下の代表的データは、ｎｇ蛋蛋白質−またはｎｇ蛋白質／バイアル細胞数ＸＩ Ｏ’　（試験薬剤の抗増殖効果による抗−ＨＩＶ−１効果を除くため）のいずれ かとして表されている。

Ｎ−ブチルＤＮＪ　（μＭ） 非感染対照＝０ Ｈ９細胞内におけるＮ−ブチルＤＮＪ／ＡＺＴ−７日（ｎｇ／細胞ＸＩＯ’） Ｎ−ブチルＤＮＪ　（μＭ） 非感染対照＝Ｏ Ｎ−ブチルＤＮＪ　（μＭ） 非感染対照＝０ Ｎ−ブチルＤＮＪ／ＡＺＴ　Ｈ９細胞−１１日（ｎｇ／細胞ＸＩＯ’） Ｎ−ブチルＤＮＪ　（μＭ） 非感染対照＝Ｏ Ｎ−ブチルＤＮＪ　（μＭ） 非感染対照＝Ｏ Ｎ−ブチルＤＮＪ／ＡＺＴ　Ｈ９細胞−１４日（ｎｇ／細胞ＸＩＯ＠） Ｎ−ブチルＤＮＪ　（μＭ） 非感染対照＝Ｏ Ｎ−ブチルＤＮＪ　（μＭ） 非感染対照＝Ｏ Ｎ−ブチルＤＮＪ／ＡＺＴ　Ｈ９細胞−１１日アッセイ：逆転写酵素活性／生存 細胞 （ｌ　Ｏ’　ＣＰＭ／細胞×１０［株］）Ｎ−ブチルＤＮＪ　（μＭ） 急に感染されたＨ９細胞において、Ｎ−ブチルＤＮＪ（２４５，６４Ｍ）とＡＺ Ｔ　（≧０，６４μＭ）との組合せは、インビトロにて相加的青性なしにＨＩＶ −１を相乗的に阻害した。

Ａ　Ｚ　Ｔ　トＮ　−フｆ　ルＤＮ　Ｊ　トｔ７）組合セｒ＃標（ＣＪ）値を決 定するための中央値効果原理およびイソポログラム技術による前述のすべてのデ ータの数学的評価は、以下の値を与えた。

ＡＺＴおよびＮ−ブチルＤＮＪの組合せ指標（ＣＩ）値Ｔ　ＥＬＩＳＡ　、３９ ９８　．４＋、３３１１　ＥＬＩＳＡ　、２３８０　．２２７０Ｔ　ＥＬＩＳＡ ／１０°細胞　、３８８９　．４０３５１１　ＥＬ［ＳＡ／１０’細胞　、２９ ２１　．３２６５１１　逆転写酵素　、２７９９　．２５７１１１　逆転写酵素 ／　、４６５１　．５１５４１０＠細胞 これらの結果の数学的分析は、インビトロで急性の感染Ｈ９細胞において、Ｎ− ブチルＤＮＪ　（２４５，６４Ｍ）およびＡＺＴ（≧０．６４Ｍ）が相乗的１： ＨＩＶ−１を阻害することを示した。更に特定的には、組合せ指標値は異なる採 取口におけるウィルス？Ｉ！；！阻害の９０−９５％について１未満てあっで相 乗性を示している。

これらの薬剤の細胞毒性は、単独または組合せのいずれの場合にも非感染薬剤処 理並行対照フラスコにおいて何ら示されなかった。

上述の実験は、同じ細胞型、アッセイ、薬剤、および薬剤濃度を用いて反復され 、結果は再現可能であることが見出された。

現在、ＨＩ　Ｖに対する治療的有効性を示す方法には議論の余地かあるが、ｐ２ ４抗原水準の下降および感染個体からＨＴＶを単離する能力の減少により示され る抗ウイルス効果は、生存率の上昇および日和見感染発症の低減を導くものと認 識されている。従って、上述のインビトロ試験に基づき、本発明の組合せ薬剤お よび方法は、ＨＩＶ感染に起因するであろうＡＩ’ＤＳまたはＡＲＣについてヒ トの治療に有効であろうことが期待される。

医薬組成物 ＡＺＴおよびＮ−ブチルＤＮＪ活性成分は、直接投与か可能であるが、それらを 医薬的剤型の部分として存在させることか好ましい。本発明の剤型は、少なくと もＡＺＴとＮ−ブチルＤ　Ｎ　Ｊの相乗的組合せを、抗ウイルス効果を達成する 量をもって１種以上の許容できる担体と共に含み、場合により他の治療的成分を 含む。

ここにおいて使用される“抗ウイルス効果を達成する量”とは、）（ＩＶ感染患 者に対して医学的に有益であり、この使用の利益より重い毒性的副作用を与えな い量である。

現在、Ａ　Ｚ　Ｔは経口および静脈内投与用に製剤化され、またＮ−ブチルＤＮ Ｊは経口投与用に製剤化されているか、それらの投与経路および剤型には制限が ないことが知られている。

従って、適用可能な剤型は、経口的、直腸的、経鼻的、局所的（口腔的および舌 下的を含む）、膣内的および非経口的（皮下的、筋肉内的、静脈内的および皮肉 的を含む）投与に適したものを含んでいる。該剤型は、例えば錠剤および徐放性 カプセル等の単位投与形態において都合良く提供されてもよく、また医薬分野で 周知のいずれの方法により調製されてもよい。

このような方法は、ＡＺＴおよびＮ−ブチルＤＮＪを、１種以上のけ加的成分を 構成する担体と組合わせる工程を含む。一般的には、該剤型は、活性成分を液体 担体または微細化固体担体あるいは両者と均一かつ密接に組合せ、また必要に応 じて生成物を成形することにより調製される。

経口投与に適した本発明の剤型は、カプセル、カシュ剤もしくは錠剤等の所定量 の活性成分をそれぞれ含む離散的単位として；粒末もしくは顆粒として；水性液 体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁物として；または水中油液体エマル ジョンもしくは油中水液体エマルジョンとして、および巨丸剤等として提供され てもよい。

錠剤は、圧縮または成形により、場合により１種以上の付加的成分と共に調製さ れてよい。圧縮錠剤は、適当な装置により粉末または顆粒等の流動形態の活性成 分を、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性もしくは分 散剤と混合して圧縮することにより調製されてよい。成型錠剤は、不活性液体希 釈剤で湿潤化した粉末化合物混合物を適当な装置でモールド成型することにより 調製される。該錠剤は、場合により被覆されるか、もしくは刻み目を付されても よく、また活性成分の遅い、もしくは調節された放出を与えるように製剤されて もよい。

局所投与に適した剤型は、成分を通常ショ糖とアラビアゴムまたはトラガカント である好ましい基剤中に含むロ腔錠：活性成分をゼラチンおよびグリセリン、ま たはシ：Ｉ糖とアラビアゴム等の不活性基剤中に含む香錠；および成分を適当な 液体担体中にて投与されるように含む口腔洗浄剤等を含む。

皮膚に対する局所投与に適した剤型は、投与されるべき成分と医薬的に許容され る担体とを含む軟膏、クリーム、シェル、ペースト、および経皮的バッチとして 提供されてもよい。

直腸的投与のための剤型は、例えばコツアバターまたはづリチレート等を含む適 当な基剤と共に座薬として提供されてもよい。

担体か固体である場合の経鼻投与用の適当な剤型は、例えば２０　５００ミクロ ンの範囲の粒径を有する粗粉末を含み、：ｔｌは鼻に近接して支持した粉末の容 器から鼻腔経路を通して急速な吸入を行なうことによる、かぐ方法にて投与され る。担体か液体である場合の適当な剤型は、活性成分の水性または油性溶液を含 む例えば経鼻用スプレーまたは経鼻用滴剤である。

吟内的投与に適した剤型は、活性成分に加えてこの分野で適当であるものとして 知られている担体を含む、ベッサリ、タシボン、クリーム、シェル、ペースト、 発泡剤またはスプレー剤として提供されてよい。

非経口投与のために適した剤型は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および該剤型を所 望の受容者の血液と等張にするための溶質を含存する水性または非水性滅菌注射 溶液：ならびに懸濁剤および濃厚化剤を含んでもよい水性または非水性滅菌懸濁 液を含む。該剤型は、例えば密封アンプルおよびバイアル等の単位投与または複 数投与用容器中にて提供されてよく、また使用直前に例えば注射用水等の滅菌液 体担体の添加のみを必要とするような凍結乾燥条件にて保存されてよい。まに合 せの注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤等の前述したものから 調製されてもよい。

好適な単位投与剤型は、前述したように１日投与量もしくは単位、１日の準投与 量を含むもの、または投与される成分の適当な分画を含むものである。

上記に特に述べた成分に加え、この発明の剤型は所望の剤ヤを考慮して当分野で 慣用の他の薬剤、例えば経口投与に適したものとして着香料等を含んでもよいも のと理解されるべきである。

ＡＩＤＳまたはＡＲＣの治療における本発明の組合せのＡＺＴ成分に関する適当 な投与量は、約５０■／日−約１．２ｇ／日の範囲である。より好ましい範囲は 、約２００■／日−約１０００■／日である。更に好ましい範囲は、約３００■ ／′日−約８００■／日である。

ＡＩＤＳまたはＡＲＣの治療における本発明の組合せのＮ−ブチルＤＮＪ成分に 関する適当な投与量は、約１■／　ｋｇ　／日−約５００■／　ｋｇ　／日の範 囲であり得る。好ましい範囲は、約８■／　ｋｇ　／日−約１６５■／　ｋｇ　 ／日である。より好ましい範囲は、約２０■／　ｋｇ　／日−１３０■／ｋｇ／ 日である。更に好ましい範囲は、約２５■／ｋｇ／日−約１００■／ｋｇ／日で ある。

本発明による利益を得るためには、ＡＺＴおよびＮ−ブチルＤＮＪを含む好適な 医薬的剤型は、これら２成分の比の範囲が、ＡＺＴ　：　Ｎ−ブチルＤＮＪで約 ｌ：５０−約１　：　１００モル比となるように調製すべきであると考えられる 。より好ましくは、約１・６〇−約１：８０の比である。最も好ましくは、Ｎ− ブチルＤＮＪに対してＡＺＴか、約１＝７０の比である。

単独の薬剤または組合せとして、ＨＩＶ−１複製を完全に阻害するために必要な Ｎ−ブチルＤＮＪおよびＡＺＴの濃度は、生物学的アッセイにおいて期待される ように、ウィルス接種量、試験される細胞壓、使用されるＨＩＶ−１複製アツセ イの感度等に依存して実験毎に変化する。しかしながら、Ｎ−ブチルＤＮＪ　（ ≧４５．６μＮ４）およびＡＺＴ　（≧０．６４μＮ４）の間の相乗効果は容易 に示される。

例において示したデータはＡＺＴおよびＮ−ブチルＤＮＪの２種類の特定の形態 に基づくものであるが、ＡＺＴのいずれの医薬的に許容される塩、またはＮ−ブ チルＤＮＪの遊離のアミンもしくはいずれの医薬的に許容される塩も本発明の組 合せ（合剤）の調製もしくは投与に使用してよいものと理解されるべきである。

本発明の医薬組成物は、ＡＺＴとＮ−ブチルＤＮＪの両者を同じ投与形態に含む か、開示された発明の方法の実施においては、ＡＺＴおよびＮ−ブチルＤＮＪは 、別別に、分離された異なる投与形態において、または分離された異なる投与形 態であるが基本的に同時に、あるいは同じ医薬組成物中で同時に投与されてもよ いものと理解されるべきである。

国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．３′−アジド−３′−デオキシチミジンおよびＮ−ブチルデオキシノジリマ イシン、またはそれらの医薬的に許容される塩の組合せを、抗ウイルス効果を達 成し、かつ組合せ指標が１以下となる投与水準を与える量をもって投与すること を含む、ＨＩＶ感染患者の治療方法。
2. ２．３′−アジド−３′−デオキシチミジンが、約５０ｍｇ／日−約１．２ｇ／ 日の量をもって投与される請求項１に記載の方法。
3. ３．３′−アジド−３′−デオキシチミジンが、約２００ｍｇ／日−約１０００ ｍｇ／日の量をもって投与される請求項１に記載の方法。
4. ４．３′−アジド−３′−デオキシチミジンが、約３００ｍｇ／日−約８００ｍ ｇ／日の量をもって投与される請求項１に記載の方法。
5. ５．Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンが、約１ｍｇ／ｋｇ／日−約５００ｍｇ ／ｋｇ／日の量をもって投与される請求項１に記載の方法。
6. ６．Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンが、約８ｍｇ／ｋｇ／日−約１６５ｍｇ ／ｋｇ／日の量をもって投与される請求項１に記載の方法。
7. ７．Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンが、約２０ｍｇ／ｋｇ／日−約１３０ｍ ｇ／ｋｇ／日の量をもって投与される請求項１に記載の方法。
8. ８．Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンが、約２５ｍｇ／ｋｇ／日−約１００ｍ ｇ／ｋｇ／日の量をもって投与される請求項１に記載の方法。
9. ９．該組合せが経口的に投与される請求項１に記載の方法。
10. １０．該組合せが静脈内的に投与される請求項１に記載の方法。
11. １１．投与されるＮ−ブチルデオキシノジリマイシンに対する３′−アジド−３ ′−デオキシチミジンのモル比が、約１：５０−約１：１００の範囲である請求 項１に記載の方法。
12. １２．投与されるＮ−ブチルチオキシノジリマイシンに対する３′−アジド−３ ′−デオキシチミジンのモル比が、約１：６０−約１：８０の範囲である請求項 １に記載の方法。
13. １３．投与されるＮ−ブチルデオキシノジリマイシンに対する３′−アジド−３ ′−デオキシチミジンのモル比が、約１：７０である請求項１に記載の方法。
14. １４．３′−アジド−３′−デオキシチミジンおよびＮ−ブチルデオキシノジリ マイシンが、分離された異なる投与において投与される請求項１に記載の方法。
15. １５．３′−アジド−３′−デオキシチミジンおよびＮ−ブチルデオキシノジリ マイシンが、単−の投与形態に組合されてなる請求項１に記載の方法。
16. １６．約５０ｍｇ／日−約１．２ｇ／日の３′−アジド−３′−デオキシチミジ ンおよび約１ｍｇ／ｋｇ／日−約５００ｍｇ／ｋｇ／日のＮ−ブチルデオキシノ ジリマイシン、または各々の医薬的に許容される塩を患者が受け、かつＮ−ブチ ルデオキシノジリマイシンに対する３′−アジド−３′−デオキシチミジンのモ ル比が約１．５０−１：１００である、３′−アジド−３′−デオキシチミジン とＮ−ブチルデオキシノジリマイシンとの組合せによるＨＩＶ感染患者の治療方 法。
17. １７．組合せが経口的に投与される請求項１６に記載の方法。
18. １８．組合せが静脈内的に投与される請求項１６に記載の方法。
19. １９．３′−アジド−３′−デオキシチミジンおよびＮ−ブチルデオキシノジリ マイシンが、分離された異なる投与において投与される請求項１６に記載の方法 。
20. ２０．３′−アジド−３′−デオキシチミジンおよびＮ−ブチルデオキシノジリ マイシンが、単−の投与形態に組合されてなる請求項１６に記載の方法。
21. ２１．３′−アジド−３′−デオキシチミジンおよびＮ−ブチルデオキシノジリ マイシン、またはそれらの医薬的に許容される塩の組合せを、抗ウイルス効果を 達成し、かつ組合せ指標が１以下となる投与水準を与える量をもって含む医薬組 成物。
22. ２２．前記組成物中のＮ−ブチルデオキシノジリマイシンに対する３′−アジド −３′−デオキシチミジンのモル比が、約１：５０−約１：１００である請求項 ２１に記載の医薬組成物。
23. ２３．該モル比が、約１：６０−約１：８０である請求項２２に記載の医薬組成 物。
24. ２４．該モル比が、約１：７０である請求項２２に記載の医薬組成物。
25. ２５．経口投与用に製剤化された請求項２１に記載の医薬組成物。
26. ２６．静脈内投与用に製剤化された請求項２１に記載の医薬組成物。