PT94247B

PT94247B - Processo para a preparacao de uma composicao farmaceutica contendo 3'-azido-3'-desoxitimidina e n-butil-desoxinojirimicina e metodo para inibir hiv utilizando-a

Info

Publication number: PT94247B
Application number: PT94247A
Authority: PT
Inventors: Martin Stanley Hirsch; Victoria Anne Johnson
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1989-06-02
Filing date: 1990-06-01
Publication date: 1997-05-28
Also published as: CA2030803A1; DE69000434T2; EP0401194A1; JPH04500220A; EP0437554B1; EP0437554A1; PT94247A; ATE81979T1; IE64352B1; US5011829A; IE901973L; DK0437554T3; DE69000434D1; WO1990014830A1

Description

O presente invento diz respeito a um process para de uma composição farmacêútica e um método de vírus da imunodsficiência humana <HIV), o qual compreende a administração a um doente infectado por HIV de uma / l composiçSo sinergístxca de 3 -azido-3 -desoxi t i m i d ina (AET) e N-buti1-desoxinojirimicina (N-buti I-DM-J) numa quantidade que atinja eficácia antiviral.

consiste em obter-se um -DM-J varia, processo para a preparação da referida se inclui r neIa os referi dos componentes, composição cuja proporção molar de AZT para de preferência entre cerca de iíSO e cerca composi ção de modo N-butii ‘ás? 1 ί 1OV.

Este invento relaciona-se com uma composição farmacêutica e com um método de inibição do virus da imunodeficiéncia humana (HIV) e, mais particularmente, com uma composição sinérgica do derivado N-buf£ 1ico de 1,5-didesoxi-i,S-imino„D-glucitol t t (desoxinojirimicina) e 3 -azido-3 -desoxitimidina (AZT) numa quantidade que atinja eficácia antivirai, sendo de potencial utilização no tratamento do síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA) e o complexo afim da SIDA CARO.

FUNDAMENTOS PO INVENTO síndroma de deficiência imunitária adquirida, que há apenas alguns anos era uma curiosidade médica, constitui actualmente uma doença grave. Consequentemente, tem sido feito um grande esforço para desenvolver drogas e vacinas para combater a SIDA. 0 virus da SIDA, identificado pela primeira vez em 1933, tem sido descrito com vários nomes e tem a capacidade de réplica no interior das células do sistema imunitário levando desse modo a uma profunda destruição das cêlulas-T Γ4' (ou células CD4 ). Ver, por exemplo, Gallo et al., Science 224, 500-03 (1934), e Popovic et al., Ibid., 497-500 (1934). Este virus, que se estabeleceu ser um retrovírus, tinha sido conhecido como virus associado a 1infadenopatia (LAV) ou virus relacionado com SIDA (ARV). Foram descritos dois virus distintos da SIDA, H1V-Í e H1V-2. HIV-1 é o virus originalmente identificado em 1983 por Flontagnier e colaboradores no Instituto Pasteur em Paris EAnn. Vi rol. Inst, Pasteur 135 E, 119-134)1, enquanto quo o H1V-2- foi isolado mais recentemente por Nontagnier e seus colaboradores em 1386 CNature 326», 662 (1987)3. Tal como é aqui usado, HIV pretende referir-se a estes virus num sentido genérico.

Embora a biologia molecular da SIDA comece a ser decifrada e definida, muito mais fica ainda para, ser aprendi do e compreendido àcerca desta doença. Entretanto, estão sendo investigadas várias abordagens do problema na procura de potenciais drogas e vacinas contra a SIDA. 0 desenvolvimento de uma vacina para SIDA é dificultada pela falta de compreensão dos mecanismos de imunidade protectora contra o HIV, pela importância da variação genética do vírus, e pela falta de modelos animais eficazes para a infecção pelo HIV. Ver, por exemplo, Koff and Hoth, Science 241, 426-432 (1988).

Uma abordagem para planear drogas ou vacinas para o tratamento de seres humanos infectados com HIV depende do conhecimento gue os biólogos moleculares tenham adquirido sobre o ciclo de vida replicativo do virus guando penetra e infecta uma célula hospedeira, sofre replicação, e progride infectando outras células. No ciclo de replicação do HIV existem certos passos específicos dos virus gue constituem potenciais alvos da terapêual., Ant i m i crob. Agants Chemother. 31, a ser aprovada pela U.S. Food and Drug o tratamento da SIDA foi zidovudine, nome anterior azidothymidina (A2T).

t t

Quimicamente, esta droga é 3 -azido-3 -desoxitimidina, e tem a estrutura gue se segue:

tica anti-viral. Hirsch et 339-43 (1387).

A primeira droga Administration (FDA) para melhor conhecido pelo seu

Α2Τ é convertida pela trifosfato gue é um forte inibidor reversa do HIV, interferindo desse replicação do HIV.

quinase celular numa forma competitivo da transcriptase modo com um estádio precoce na

Esta droga foi originalmente seleccionada como uma potencial arma contra a SIDA por ter revelado capacidade para inibir a replicação do virus in vitro. Esses testes constituem virtualmente o único método prático para avaliação e teste iniciais das drogas potencialmente anti-SIDA.

Embora a A2T seja actualmente usada na clinica, uma grave desvantagem da AZÍ consiste nos seus efeitos secundários tóxicos. Na verdade, a bula requerida pelo EDA para o Retrovir', a composição farmacêutica comercializada contendo A2T como o ingrediente activo, faz advertências em relação à toxicidade hematológica, incluindo granulocitopenia e anemia grave requerendo transfusões. Assim, continua a procura de melhores drogas anti-SIDA.

g1ucosida

Porque as

Mais recentemente, foram testados cer is quanto à sua actividade contra glicoproteinas que envolvem o HIV tos inibi do r es da o vírus da SIDA, são i n tensamen te ί

glicosiladas, os compostos que interferem com o processamento coe põstranslac ional da gl icoproteina gpí20 e da glicoproteina da. tra.nsmembra.na gp41 podem evitar a entrada do vírus para o interior de uma célula. Karpas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 9229-3233 (1933). Estes compostos intereferem, ou interrompem um estádio do processo replicativo do HIV diferente do estádio atingido por A2T.

I rés desses compostos suger xd*_*s como potenc iais oroqas anti-3IDA são castanospermine, 1-desoxinojirimicína <DNJ) e 2,5-dihidroximetil-3,4-dihidroxi~pirrolidina <BMDP?. Ver, por exemplo, Sunkara et al., Biochem. Siophys. Res. Commun, 148< í ?, 2O6-210 <1387?,' fyms et al . , Lancet, Qct. 31, 1987, pp. 1025-1026; Walker et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. 08A 84, 8120-8124 <1387?,’ e Gruters et al. , Nature 330, 74-77 <1987?.

Assim, castanospermine, que ê um alcaloide isolado a partir de sementes do castanheiro Australiano, revelou a capacidade de interferir na glicosilacSo normal dos virions do HIV, alterando desse modo o invólucro de glicoproteinas e evitando a entrada do HIV no interior das células alvo. Contudo, porque o fornecimento de castanospermine é limitado devido â sua fonte natural, ele torna-se extremamente dispendioso, nSo sendo desse modo um candidato prático para uma droga urgentemsnte requerida em grande escala. Adicionalmente, a castanospermine revelou citotoxicidade nos níveis de dosagem de O,70 mg/ml. Karpas et f

al., Proc. Nat 1. Acad. Sei. USA 85, 3229-3233 (1888).

Em PCT Inter. Appln. WO 87/03303, publicado em 2 de Julho, 1387, o derivado M-metílico de desoxinojirimicina <DMJ? foi também apresentado como possuindo actividade contr baseada aparentemente na sua actividade inibidora d/ o HIV glucosidase

Ϊ. Contudo, foi subsequentemente revelado por Fleet et al., ΡΈΒ8

Lefcfc 237, 128-132 <1988), que nem todos os inibidores da glucosidas® I são inibidores eficazes do HXV. Assim, podem ser responsáveis pela actividade inibidora do HIV alguns outros mecanismos.

Verificou-se que o derivado N-butilico da desoxinojirimicina (N-buti 1 DN-J) apresenta um-a melhor actividade inibidora contra o virus da imunodeficiência humana (HIV) em concentrações não tóxicas em comparação com as apresentadas pelos correspondentes de r i vados N-me t £1i co e N-ε t £ 1i c o.

N-buti 1 DN-J tem a seguinte estrutura química:

(CH₂)₃CH₃

A fim de indicar esteroisomerismo linhas contínuas ou tracejadas indicam ligações dirigidas para cima ou para baixo, r espec ti vamen te, do ρ1ano do pape1.

a titulação do não c i to tôxicas esox i no jirimicina a quatro logs na vado N—but £ 1i c o

N-buti1 DNJ reduz de um modo ónico virus para cima de cinco logs em concentrações enquanto que os derivados N-meti1- e N-etil-d levam apenas a uma redução da ordem dos dois produção de HIV infeccioso. Assim, o deri

apresenta uma significativa potencial utilização para o tratamento do síndroma de deficiência imunitária adquirida (SIDA), e foram recentemente anunciados ensaios clínicos deste agente na fase I.

Apesar dos progressos anteriormente referidos na terapêutica farmacêutica para indivíduos infectados com HIV, pensa-se que uma terapêutica não tóxica eficaz dirigida contra o HIV pode requerer uma técnica quimioterapêutica que envolva a utilização de terapêuticas combinadas. Uma tal técnica não tem sido amplamente utilizada na terapêutica anti-HIV, mas tem tido êxito no tratamento de uma série de infecçfíes bacterianas e , por fungos, assim como na quimioterapia do csncro. Combinações de terapêuticas anti-HIV que incluem agentes que atacam o cicio de replicação do HIV em vários sítios oferecem várias vantagens, particularmente se ocorrerem interseções favoráveis das drogas.

Quando dois agentes são combinados, eles podem ter um dos três tipos de actividade contra a replicação do HIV in vitro, tal como é estabelecido pelo Combination Index <C1> discutido aqui a seguir.

1. Efeito aditivo.' Diz-se que duas drogas são aditivas quando a actividade das drogas em combinação ê igual à soma (ou um soma parcial) das suas actividades independentes quando es tudadas sepa r adamen te.

2. Sinergismo: 0 efeito combinado de um par de agentes sinérgicos é superior à soma das suas actividades independentes quando medidas separadamente.

3. Antagonismo; Se duas drogas forem antagonistas, a actividade da combinação é inferior ã soma d O& S T Ès? X Íl*OS independentes guando medidos isoladamente.

Us objectivos da terapêutica de combinaçãc evem incluir a capacidade de atingir sítios diferentes no ciclo de replicação do HIV, e a de afectar a replicação virai numa ampla série de tipos celulares, fambém, os agentes não devem apresentar toxicidade aditiva em combinação. Os benefícios da terapêutica em combinação incluem interacçôes in vitro aditivas ou sinérgicas, as quais podem permitir a utilização de drogas individuais abaixo das suas concentrações tóxicas ção pode evitar a emergência

Também, a terapêutica, de combi nade mutantes de HIV resistentes à

Foram ja realizados estudos combinando vários agentes anti-HIV conhecidos. Por exemplo, combinações de ou ΑΖΓ ou de

I i ,3 -didesoxicitidina e interferon alfa-A recombinante revelaram a capacidade de inibir sinérgicamente o HIV in vitro. Hartshorn et al., Antimicrob. Ag. Chemother. 31, 168-72 al · , 3 Inf ec i. Pis. 158, 378—85 (1988). Outras (1987),· Vogt et combinações, tais como AZT mais aciclovir revelaram sinergismo. Mitsuys et al., em

8. 8roder (ed.)	AIOS,	Modern Concepts and	íher apeut i c Cha11enges,
Mareei	Dekker,	Inc . ,	Neu> York.	Contudo,	outras combinações de
drogas	testadas	tais	como ΑΖΓ é	í ribavirin	( ί,β-0-r ibo f uranos i1-
11-1,2-	-tr iazole-	-3-c ar	boxami da)	revelaram	ser antagonistas in

vitro. Vogt et al. , Science 235, 1376-79 <1987).

Descrição Breve do Invento

De acordo com o presente invento, descobrimos actualmente gue a combinação de N-butil DN-J e ΑΖΓ inibe o HXV sinêrgícamente sem toxicidade aditiva in vitro. Assim, podem ser usadas doses mais baixas tanto de AZ‘T como de N-butil DN-J, minimizando desse modo os efeitos secundários tóxicos de cada um deles, particularmente os associados ao AZT.

As doses apropriadas para o tratamento de seres humanos sof rendo de oIDA ou de ARu para o componente Ad Γ oa. combinação do presente invento variam entre cerca de 50 mg/dia a cerca de 1,2 g/dia.

As doses apropriadas para o tratamento de seres humanos sofrendo de Sida ou de ARC para o componente N-butil DN-J da combinação do presente invento variam entre cerca de 1 mg/kg/dia e cerca de 500 mg/kg/dia. Os estudos de toxicidade em animais de laboratório estabeleceram gue o N-butil DN-J apresenta uma baixa tox i c i dade.

As drogas devem ser combinadas em quantidades suficientes para conseguir as vantagens aditivas ou sinérgicas da sua combinac-So.

Descrição Detalhada do Invento ja c om re x v x nd x c a ç ões distintamente o assunto i nd i c ando

Embora a especificação conclt particularmente e reivindicando

considerado como constituindo o invento, pensa-se gue o invente será melhor compreendido a partir da descrição gue se segue.

Fonte da AZT e do N-butil DNJ

A A2T foi obtida sob uma forma em pó a partir de Dr. P. A. Furman, Burroughs-Wellcome Co., Research Friangle Park, NortiCarolina. Foi dissolvida em solução salina estéril tamponada con fosfato e foi armazenada numa concentração de i mr em porções aliguotas de 0,5 mi/frasco a -2Q°C antes da utilização.

N-butil DÍMJ foi obtido sob a forma em pó a partir de Dr. R. Nueller, S.D. Searle & Co. Foi armazenado sob a forma em pó a 4°C até à sua utilização, sendo preparadas soluções recentes da droga para cada mudança de meio. 0 N-but.il DNJ foi dissolvido em ãgua duplamente destilada filtrada em condições estéreis, sendo em seguida, filtrado em condições estéreis antes da prsparaç So das dilui ç ões da d r oga.

Ensaios Sobre a Actividade Anti-Virai

Nestes exemplos, avaliámos as actividade® antivirais das várias combinações deste invento usando modificações de usados para estudar agentes anti-virais PP. 602—04 (1385),’ Hartshorn et al . , vários ensaios in vitro CHo st al., Laneet, 1,

Antimicrob. Ag. Chemother, 30, 183-31 (1985)3.

Para cada um destes ensaios, cultivámos células H9 não infectadas, uma doação do Dr. Robert Gallo, National Câncer

Instituis, Bethesda, Maryisnd, EPopovic st al., Science, 224, pp.

457-500 (158433 numa concentração iniciai de 0,4 x 10^b células/ml em 6 mi de volume final de meio de cultura R-20 compreendendo

- íí meio de RPMI-1640, 20% de soro de c a1or (8i gma Chem i c a 1, St. Lou i s, antibióticos (penicilina, 260 U/ml num frasco T-2S (Falcon, Secton Dickinson Laboratory, Lincoln Park, New -Jersey).

ν í te1o fetal i na eti vado pe1o Mo.3, L-glutamina (2mM3, e e estreptomicina, 250 ug/ml3

Nas experiências, células HS não infectadas (2 _J .. i-r io células) foram suspen* em ml de meio R-20 em frascos T-2S. A multiplicidade da infecção foram 250 doses infecciosas da cultura de tecidos (TCODj.^3 de HlV-i sem células (HTLV-I11B) (obtidas a partir de Or. Robert C. Sallo) por 1 x 10* células. Ver Hartshorn et al., An timicrob. Ag. Chemother. 31, 168-72 /15873. 0 meio ds cultura foi mudado nos dias 4, 7 e 11, com 2 mi de suspensão celular sendo resuspenso em 5 ml de meio de substituição contendo as concentrações originais do(s) agente(s) antiretroviral(ais). Várias concentrações graduadas de N-butil DNJ ou de ALi, quer isoladamente quer em combinação, foram adicionadas às culturas de células simultâneamente com o isolado de H1V-Í. 0 meio de cultura foi mudado nos dias 4, 7 e 11 e de novo N-butil DNJ, ALT, ou ambos, foram adicionados com as mudanças de meio a fim de manter a concentração de cada um dos agentes originaimente presentes.

Nestes ensaios, os produtos flutuantes sem células das culturas foram armazenados em um ou mais dos dias 7, 11 e 14 para determinação da produção de antigénio p24 em relação ao núcleo do H1V-1, da actividade da transeriptase reversa virai (RT) ou da produção de vírus infecciosos a fim de avaliar os efeitos dos agentes isoladamente, ou em combinação, sobre a replicação do H1V in vitro.

Para cada ensaio de replicação dos virus, células não infectadas foram expostas ao inóculo de HlV-1 sem subsequente lavagem. Simultâneamenta, combinações de agentes de taxa fixa com múltiplas diluições, ou agentes simples, foram adicionados a cada frasco. Avaliámos a proliferação celular e a viabilidade pelo método de exclusão pelo corante azul tripan. Em todos os ensaios, as culturas não infectadas e infectadas foram mantidas em paralelo. Os controlos de toxicidade tratados com droga foram mantidos com a mais elevada concentração de cada agente testado (quer isoladamente quer em combinação), para excluir um efeito antiHIV-1 devido a um efeito anti~proliferativo de qualquer agente testado.

Ensaio da Γranscpigx.ase Reversa

Medimos a actividade da transcriptase reversa como um indicador dos efeitos das combinações de A4f e de N-butil DN-J de acordo com este invento sobre a replicação virai do H1V ctal como foi descrito por Popovic et al., Science, 224, 497-500 <1984)1 Sallo et ai., Science, 224, 500-03 <1984)1 ou Ho et al., Proc.

, 7588-90 <1984)1 Ho >c ience,

Nati. Acad. Sei. USA,

225, 451-53 <1984)3.

Mais especificamente, no ensaio de transcriptase reversa, utilizamos os reagentes indicados a seguir. 0 ditiotreito 1 <BTT) foi fornecido por Boehringsr Mannheim Bio-Chemicals, Indianapolis, Indiana. 0 PEG 8000 <poIetilene glicol) foi fornecido por Fisher Scientífic, Medford, Massachusetts. 0 t-RNA foi do tipo X-S, fornecido por Sigma Chemical, St.

Missouri. 0 3K-TTP <trifosfsto de timidina tritiada) foi fornecido por OuPont, New England Nuclear Research Products, Soston,

Massa chuse11s.

usaoo

L.ou is,

Tampão Α $Tris 1,0 Η <ρΗ 7,8) $Ácido tetraacético etilensdiamina 0, ί M $10% Triton X-100 $81i cerol Água

DTT (cristal)

KCi (cristal)

12,5 ml 1,25 ml 1,25 ml 250,00 mi 235,IO ml

0,77 g

3,72 g

500,00 ml

Solução $ í 0%

Triton X-100

45,00 mi

Agua duplamente destilada

455,00 ml

KC

Λ.

(cristal) _

500,00 ml

P£8 (30%), NaCl O,4 N

PeG 800O NaCl

Água

150,00 g I1,70 g até 500,00 mi

Ãcido Tricloroacético (TCA) <10%?

TCA

F* i r o f os f a fo de Sôd i o

Água •50 > 0<

4,45 g a fcê 500,00 οι 1 $ Soluções feitas em água destilada.

TCA

Pirofosfato de Sódio

1.000,00 178,00

Água

».té > OO

Tampão Uni ver sa 1

Tris 0,01 M <pT ,0) s solução de NaCl 0,015 li

Pitiotreitol 0,2 Μ

0,303 s.OTT

0,0 m 1 de tampão un i ve rsa 1

Esta solução foi armazenada congelai gelada apena uma vez antes da utilização.

-20^eC e descon20 mg/ml tfiNA tRNA foi levado a 20 mg/ml em tampão universa;

armazenado a 20 °C, unidades/mí de padrão dA ou rA

Prímeros de padrão oligo d'f (# 27-7878 e # 27-7858, Pharmacia/P-L Biochemicals, Piscataway, New -Jersey) foram dissolvidos em 2,-5 ml de tampão universal para dar origem a 20 unidades/ml de solução. A solução foi armazenada em porções alíquotas de 0,5* ml a — 20®v- e ciescongelaoa antes oa utilização.

Realizámos precipitação em ΡΕΘ de partículas de vírus a partir de produtos flutuantes sem células pela adição de 2 ou 3 ml de fluido flutuante de cultura clarificada, tanto como metade da solução de precipitação em pE8, fizemos redemoinhar bem e colocámos a mistura em gelo durante a noite a 4°C. Foi então que centrifugãmos a 800 vezes a gravidade <~22QO rpm) durante 4-5 minutos até se precipitar uma pílula. Subsequentemente, separámos por aspiração todo o fluido flutuante, deixámos o precipitado repousar, aspirámos então de novo para proporcionar a pílula seca. Tornámos então a fazer suspensão do precipitado num tampão compreendendo 100/jl de tampão A e SOwl de solução 2, onde o produto flutuante original usado tinha o volume ds 2 ml, com volumes proporcionais de tampão de rsssuspensão a serem usados para diferentes volumes de fluido flutuante. Tornámos a suspender a pílula colocando uma pipeta de pasteur no tubo s submetendo-o a redemoinho. Congelámos a amostra a ™2'0°C no caso desta não ser ensaiada imediatamente. Fodos os passos de precipitação com r£€i foram realizados usando tubos de centrifugação com tampa. Qualquer passo requerendo exposição ao ar foi realizado numa cobertura ao acaso biológico até após a adição ds tampão A que i na c t i varam o v í rus.

Ensaiamos amostras usanoo segu i n te c o c kta i1 de transeriptase reversa <RT>:

cocktail RF $ amostras cocktail rA X (”1/tubo) # amostras cocktail dA X (j-tj/tubo)

Fr is 1 M CpH 7,3)

DTT 0,2 Μ

HgCl.., 0,2 Μ água dup1amente destilada

Γsmpâo un i versa I

3H-T ΓΡ

2,S

Oligo dT, poli rA (ou dA)

Preparámos o cocktail F?T multiplicando o volume de reagentes pelo número de amostras mais 2 para controlos (o cocktail dA foi um controlo negativo interno) mais 2 para perdas ao pipetar. Subsequentemente, adicionámos 30 jul de cocktail rA ou dA a tubos eppendorf mantidos num banho de água gelada Cí tubo rA e 1 tubo dA para cada amostra). Adicionámos então 10/jI de cada amostra a um tubo rA e a um tubo dA, submetemo-los a redemoinho incubandoos então num banho de água a 37°C durante í hora.

Para terminar

- a actividade da transeriptase reversa, removemos amostras do banho de água e colocámo-las num banho de água gelada. Adicionámos então 10 pi de solução fria de tRNA a cada tubo, seguindo-se 1 ml de solução fria de 10% de TCA. Deixámos os tubos repousar no banho de água gelada durante 20-30 minutos.

Embebemos então filtros de fibra de vidro de 2,4 cm (Miilipore Corporation, Sedford, Massachusetts) em 5% de solução de TCA. Colocámos os filtros num tubo de distribuição de amostras (Miilipore, Model 1225) ligado a uma fonte de vácuo. Subsequente— mente, aplicámos uma amostra ao filtro e lavámos cada tubo de amostra quatro vezes para, o tubo de distribuição com a solução de •5% de TCA usando uma seringa de parede dura (cornwsll regulada filtros duas vezes com 5% de TCA tubo de distribuição rápidamente enquanto sob vácuo. Secámos os filtros desligando o vácuo e enchendo cada recipiente do tubo de distribuição com 70% de etanol, deixando os filtros repousar durante cerca de IS segundos antes de tornar a aplicar o vácuo.

para 1 ml . Cavamos enc*âo os enchendo os recipientes do

Subsequentemente, colocámos os filtros sob uma lampada de aquecimento durante 10-20 minutos para secagem. Os filtros secos foram colocados em frascos de cintilação de 18 ml (Seckman Instruments, Wakefield, Massachusetts). Adicionámos então 10-12 ml de fluido de cintilação de Setafluor para, contagem (ÍMational jersey) a caoa frasco e fechamos os

Diagnostics, Manvxile, New frascos. Também testámos cada amostra usando um padrão não específico poli (dA)-oIigo(dT)

12-18'

Calculámos os resultados do ensaio subtraind»;

contagens/'minuto de dA das contagens/minuto de rA e mui tipi içando então o resultado por 7,5 para conversão em contagens/minuto/ml

liquidas da amostra flutuante da cultura original. Amostras tendo

O valores de IO' contagens/minuto/ml ou superiores foram consideradas pos i t i vas em relação ao ΗIV-1.

ELISA p24

Testámos N-buti1 DNJ e AZT como inibidores da replicação virai num ELISA p24 (ensaio de imunoabsorção ligada a enzima). A detecção do antigénio HIV p24 foi associada com a progressão da SIDA e foi proposta como um ponto final importante para a avaliação das drogas antiretrovirais candidatas. Spector et al., J. Infect. Dis. 1-59, 822-28 (1983).

Espe c if i camen te, f i zemos amos t ras do f1u i do f1utuan te da cultura sem células para antigénio p24 como se segue. Obtivemos um estojo para ensaio Cp24 Core Antigen ELISA, Catalogue Nos. NEK-045, NEK-046 e NEK-047, DuPonf-NEN Research Products, Billerica, Massachusettsl, de acordo com o protocolo incluído no estojo, que contem anticorpos policlonais de coelho para ant-igénio p24 imobilizado nos recipientes da microplaca a fim de capturar qualquer antigénio p24 lisado a partir de uma amostra do teste. 0 antigénio p24 capturado foi transformado num complexo com anticorpos policlonais biotinilados para antigénio p24 e investigado cuidadosamente com um conjugado de peroxidase streptavidin—rábano. Incubámos então o complexo com ortofenildi— amina-HCl, o gue produz côr amarela proporcional â quantidade de antigénio p24 capturado. Medimos então a absorvência de cada recipiente usando um leitor de microplaca e calibrado em relação á absorvência de uma curvs padrão de antigénio p24.

Análise Ma temática das Interseções das Drogas

Avaliámos as interseções dos agentes pelo princípio do efeito mediano e pela técnica do isobolograma com software de computador usando um I8M-PC <Armonk, New YorK) Cchou et al .

Dose-Effect Analysis With Microcomputers; Quantitation of ED-,,, òv

LDj»_f, Synergism And Antagonism, Low-Dose Risk, Receptor Binding And Enzyme Kinetics. A Computer Software For Apple II Or IBM PC CElsevier Biosoft, Cambridge, England, 198833. Uma análise do efeito de múltiplas drogas ET.C. Chou and P. Talalay, Adv. Enzyme Regul., 22, pp. 27-55 <198433 foi usada para calcular os efeitos de agentes combinados. Este método envolve o registo de curvas dose-efeito para cada agente e para combinações de taxa fixa com múltiplas diluições dos agentes usando a equação do efeito mediano. iendo como base este método, determinámos o índice de combinação <CI3 para várias combinações de acordo com este invento. Cs valores CI foram determinados a partir dos parâmetros m(slope) & D CEDj.^3 de cada agente registados para efeito mediano e suas combinações tendo como base a. equação de isobolograma.

Um valor de índice de combinação inferior a 1 indica sinergia, enquanto que um valor igual a 1 indica efeitos aditivos e um valor superior a 1 indica antagonismo tal como foi aqui anteriormente definido. Também analisámos os dados pela técnica de isobolograma, que avalia as interseções das drogas por meio de um método geométrico orientado para a dose.

Cs dados representativos que se seguem são expressos ou como ng de proteina/ml ou como ng de proteina/número x 10'“* de células viáveis Ca fim de excluir um efeito anti-HIV-ί devido a um efeito anti-proliferativo do agente testado).

N-butil DN3/A2T em Células H9 - Dia /

Ensaio; ELISA antigénio p24 (ng/ml)

N-butil DNJ (;jM)

	0	,71	5« oc	11,4	45,6	•s ο··;« a c
0	88₁6	56.6	204,0	20,6	15,1	2, 1
,01	74,5	30,6
t 04	5? Λ •«/.ti. í M		14,3
AZT
(,υΝ), 16	16,0			11,2
,64	3,5				0, &
2,65	0,2					0,08

CONTROLO NÃO INFECTADO « O i±^utn_aNJ/AZT em Cél ulas H3 - Dia 7

Ensaio; ELISA Antigênio p24/Células Viáveis
	C ng/c é1ulas x 10) N~but.il DNJ OjM)
	0 ,71	2,85	11,4	45,6 182,45
	—„ -----	—	—	-------- --------
0	31,3 21,3	82,3	7,0	6,2 0,7
,01	25,4 8,9
ΑΖΪ ,04	15,3	411
O_íM> , ÍS	5,7		3,4
, 64	1,1			0,2
2,56	0,05			0,0

CONTROLO NÃO

INFEC fADO

O

N-butil ONJ/AZT em Células H9 - Dia 11

Ensaio:

ELISA antigénio p24 <ng/ml>

N-bu til DM J < uii)

	0	,71	··> _t Ç;E	11,4	45,6	182,45
0	4125,	0	4300,0	3850,0	33-50, 0	3650,0	'3&& -, 0
AZT .01	4200,	0	3850,0
<,uN>,04	4050,	o		3750,0
, 16	3850,	0			3S00,0
, 64	3505,	0				154,5
2,-56	OO •nf nS }	0					1,4

CONTROLO NÃO INFECTADO = 0

N-butil DiMJ/AZT em Células H9

Dia 11

	Ensaio,* 0	ELISA antigénio p24/Células Viáveis
C ng/c é1u1as x 10 ~) N-butil DNJ CpM) ,71 2,66 11,4 46,6	182,46
0	6422,9	6231,9 7264,2 4817,1 4011,0	176,3
AZT ,01	6461,5	5202,7
<: ijM ) , 04	7600,0	3671,4
,16	6416,7	3913,0
,64	3074,6	72,6
2,66	16,6		0,8

CONTROLO NSO INFECTADO = O

N-butil DNJ/AZT em Células H9 - Dia Í4

Ensaio; ELISA Antigénio p24 Cng/ml)

N-bu til DN3 < ijM ) ,71

182,45 :> _t ρε 11.4

0	2797,	& 2940,0	2*460,0	3000,0
ΑΞΤ ,01	3065,	0 2635,0
CjuM) ,04	254.5 _t	0	2660,0
, 16	2530,	0		2*765,0
, 64	CjC.C,.·»	o
’7^! CC	•~*C»yí C	0

'545 - 0

4450,0

4170,0

CONTROLO NSO INFECTADO = 0

N-butil 0NJ/A2T em Células H3 - Dia 14

Ensaio i ELISA Antigénio ρ'24/Células Viáveis (ng/céluias x 10“)

N-butil DNJ C,uM>

0	,71	2,85	11,4	45,6	i tíz! >	45
0	C7CO £ •uJ t O O f L*	6000,	O S02O,4	5660,4	47í3,o	4088	^: ϊ 4
ΑΞΤ ,01	6385, 4	4705,	4
C pN),04	6207,3		3746,5
, 16	5060,O			2
,6-4	4363,0				4*^44 j 4
£, 56	241ί,O	CON	JROLO NÁ'0	1'NFECΓΑΟΟ	= 0	Ί A	i,·

.» J

X. /

N-buti1 DNJ/AZT em Células H9 - Dia il

Ensaio; Actividade Transcriptase Reversa (lOCPH/ml

N-buti1 DNJ QjM?

	0	,71	•1_} Ç;C	11,4	45,6	182,45
0	510	680	680	6»^«0	610	130
ΑΕΓ ,01	500	650
( /jM ) , 04	510		640
, 16	660			600
,6-4	560				pq
2,56	15					0,47

CONTROLO NÃO INFECTADO = 0

;»ο

N-butil DNJ/AZT sm Células H9 - Dia li

Ensaio.' Actividade transcr iptase Reversa/Células Viáveis <10⁴CPN/células x 10'')

N-butil DNJ OjM>

	o	, 71	O CjC	lí ,4	45,6	182,45
0	1	685,2	985,5	1283,0	804,3	670,3	62,8
AZT ,	01	769,2	332,4
OjM),	04	944,4		603,5
>	16	1100,0			652,2
t	64	491,2				32,4
Λ. }	56	9,1					0,3

CONTROLO NãO INFECTADO = O

Em células H9 infectadas agudamente, N-butil DNJ (> 45,6 jjM) e AZT (> 0,64 /jM) inibiu mente sem toxicidade aditiva in vit ro.

a combinação de HVI-l sinérgicaA avaliação matemática de todos os dados anteriores peio princioio de efeito mediano e pela técnica do isoboiograma a fim de determinar os valores do índice de combinação (CD para AZT e N-butil DNJ proporcionou os valores gue se seguem;

5‘Q

4Ϊ» —'

VALORES ÍNDICE DE COMBINAÇÃO (CI> RARA AZF E N-butil DNJ

CI NA PERCENTAGEM

DE INIBIÇÃO

Dia	Ensaio	30	95
7	ELISA	, 3338	,4133
11	ELISA	ΟΟΟΛ	,2270
7	ELISA.-⁷10células	, 3883	, 4035
11	EL1SA/10⁶ Células		,3265
11	Γ r ans c r i ptase Reve rsa	, 2739	,2571

Transcriptase Reversa/ ,4651 ,5154

10“ Células

A análise matemática destes resultados demonstrou que N-butil DNJ <> 45,5 pM) e AZT <2 0,6-4 ,uM> inibiram HIV-1 sinérgicamente em células H9 agudamente infectadas in vitro. Mais específicamente, a combinação dos valores dos índices era inferior a 1 para 30-35% de inibição da replicacSo virai em diferentes dias de colheita, indicando sinergismo. Não se verificou

qua1que r toxi cidade quer em combinação, com droga não infectados.

celular destes agentes, quer isoladamente nos frascos de controlo paralelos tratados usando o ds drogai

As experiência mesmo tipo de ; § verificou-se s anteriormente referidas fo células, ensaios, drogas e que os resultados eram repr r am r epe t idas c on c en t r a ç ões odutιve i s.

Embora presentemente, os métodos de demonstração da eficácia terapêutica contra o HIV sejam controversos, é habitualmente reconhecido que a eficácia anti-viral tal como é indicada, pelo declínio nos níveis do antigénio p24 e peia capacidade diminuída para isolar HIV a partir dos indivíduos infectados pode levar a um aumento de sobrevivência e a uma diminuição na incidência de infecções oportunistas. Assim, tendo como base os testes in vi tro anteriormente mencionados, espera-se que a droga de combinação e método do presente invento sejam eficazes no tratamento de seres humanos com SIDA ou ARC atribuível a infecçâo pelo HIV. .

Composi ções Farmacêuticas

Embora seja possível administrar directamente os ingredientes activos ΑΖΓ e N-butil DN-J, é preferível que eles façam parte de uma formulação farmacêutica. As formulações do presente invento compreendem pelo menos uma combinação de A2T e N-butil DN-J numa quantidade que atinja eficácia ral juntamente com um ou mais seus veículos aceitáveis e sinérgica an11vi — facultativamente outros ingredientes terapêuticos.

fai como ê aqui usada, a expressão uma quantidade atinja eficácia antiviral é uma quantidade que seja do ponto vista médico benéfica para os doentes infectados com HIV mas não apresente efeitos secundários tóxicos que ultrapassem benef í c i os da sua utί1ização.

que ds que

OS

Enquanto que AZT é nistração oral e intravenosa, formulado para administração quaisquer restrições nas suas habitualmente formulada para admie o N-buti1 DNJ seja habitualmente oral, não temos conhecimento de vias de administração ou formulaAssim, formulações aplicáveis incluem as apropriadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). As formulações podem convenientemente ser apresentadas sob uma forma de unidade de dosagem, por exemplo, comprimidos prolongada., e podem ser preparados e cápsulas de libertação por quaisquer métodos bem conhecidos na. técnica farmacêutica.

Esses métodos incluem o passo de levar AZT e N-buti1 DNJ a associarem-se com o veiculo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas associando uniformemente e íntimamente os ingredientes activos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então se necessário moldando o produto.

As formulações do presente invento apropriadas para administração oral podem encontra-se presentes como unidades descontínuas tais como cápsulas, pílulas ou comprimidos contendo cada um deles uma quantidade prédeterminada do ingrediente activo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão

num líquido aquoso ou num liquido não aquoso; ou como uma emulsão liquida óleo-em-água ou uma emulsão liquida âgua-em-óleo tal como um bolus, etc.

Um comprimido pode ser feito por prensagem ou moldagem, facultativamente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos prensados podem ser preparados por prensagem numa máquina apropriada dos ingredientes activos sob uma forma fluindo livremente tal como um pó ou grânulos, facultativamente misturados com um agente de ligação, lubrificante, diluente inerte, preservativo, agente tensio activo ou agente de dispersão. Os comprimidos moldados podem ser feitos por moldagem numa máquina apropriada de uma mistura do composto em pó humidificado com um diluente liquido inerte. Os comprimidos podem facultativamente ser revestidos ou marcados com riscos e podem ser formulados de modo a proporcionarem libertação lenta ou controlada dos ingredientes activos neles contidos.

Formulações apropriadas para administração tópica incluem pastilhas compreendendo os ingredientes numa base aromatizada, usualmente sucrose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo os ingredientes activos numa base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sucrose e acácia,’ e loções para a boca compreendendo os ingredientes a ser administrados num veículo 1i qu i do ap rop r i ado.

Formulações apropriadas para administração tópica á pele podem ser apresentadas sob a forma de unguentos, cremes, geles, pastas, e pensos transdérmicos compreendendo os ingredientes a ser administrados e um veículo farmacêuticamente aceitável.

Formulações para administração rectal podem ser apresentadas sob a forma de um supositório com uma base apropriada compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau ou um salicilato.

Formulações apropriadas para administração oral em que o veículo é um sólido incluem um pó grosseiro tendo um tamanho particular, por exemplo, variando entre 20 e 500 microns o qual é administrado do modo pelo qual a aspiração pelo nariz é feita, isto é, por rápida inalação tarvés da passagem nasal a partir de um recipiente do pô mantido muito perto do nariz. Formulações apropriadas em que o veículo é um líquido, para administração , como por exemplo, um spray nasal ou como gotas nasais, incluem soluções aquosas ou oleosas dos ingredientes activos.

Formulações apropriadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, geles, pastas, espumas ou formulações para spray contendo para além dos ingredientes activos veículos que sejam considerados apropriados nesta técnica.

Formulações apropriadas para administração parentérica incluem soluções para injecção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter anti-oxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos e solutos que tornem a formulação isotónica com o sangue do recipiente planeado,' e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessamento. As formulações podem ser apresentadas em recipientes com uma dose ou com múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas numa condição seca por congelação Cliofiiizaoas? requerendo apenas a adição de veiculo líquido estéril, por exemplo água para injeccões, imediatamente antes da utilização. Soluções e suspensões para injecção extemporânea podem ser preparadas a partir de pôs estéreis, tipo préviamente descrito.

grânulos e comprimidos do

Formulações de unidade de dosagem preferidas são as que contêm uma dose ou unidade diária, uma sub-dose diária, tal como foi aqui anteriormente referido, ou uma sua fraccSo apropriada, dos i ng r ed i en tes adm i nistr ados.

Deve ser tomado em consideração que para além dos ingredientes particularmente mencionados anteriormente as formulações deste invento podem incluir outros agentes convencionais na técnica tomando em consideração o tipo de formulação em questão, por exemplo, as apropriadas para administração oral podem inclui r agen tes de a r orna t ização.

Dosagens apropriadas para o componente AZT da combinação deste invento no tratamento da SIDA ou ARC podem variar entre cerca de 50 mg/dia e cerca de 1,2 g/dia. Uma variação mais preferida vai de cerca de 200 mg/dia a cerca de i.000 mg/dia. Uma variação ainda mais preferida vai de cerca de 300 mg/dia a cerca de 800 mg/dia.

Dosagens apropriadas para o componente N-buti 1 DN-J da combinação deste invento no tratamento da SIDA ou de ARC podem variar entre cerca de 1 mg/kg/dia e cerca de 500 mg/kg/dia. Uma variação preferida vai de cerca de 8 mg/kg/dia a cerca de 155 mg/kg/dia. Uma variação mais preferida vai de cerca de 20 mg/kg/dia a cerca de 130 mg/kg/dia. Uma variação ainda mais preferida vai de cerca de 25 mg/kg/dia a cerca de 100 mg/kg/dia.

Para se obter os benefícios do presente invento, pensa-se que formulações farmacêuticas apropriadas contendo AZT e

N-buti 1 DN-J devem ser preparadas de modo a que a relação entre

estes	dois ingredientes varie	entre	cerca de	1:	: so	e cerca	de
1: íOO	moles de AZT:N-butil DNJ.	Ma i s	preferida	é		relação
cerca	de l:60 a cerca de 1:80.	A ma i s	preferida	é	uma	relação	de

cerca de 1:70 moles entre AZT e N-butil DNJ.

As concentrações de N-butil DNJ e AZT requeridas para uma inibição completa da replicação do H1V-1, como agentes simples e em combinação, variam em cada experiência dependendo do input- do inóculo de vírus, do tipo de célula testada, e da sensibilidade do ensaio replicativo de NXV-1 usado, tal como é de esperar em ensaios biológicos. Contudo, foram demonstrados fácilmente efeitos sinérgicos entre N-butil DNJ (> 4-5,6 ,uM> e AZf i. '4 0,64 ,uM).

Embora os dados indicados nos exemplos tenham como base as duas formas especificas de AZi e N-butil DNJ, deve ser tomado em consideração gue qualquer sal de AZT farmacêuticamente aceitável ou a amina livre ou sal farmacêuticamente aceitável de N-butil DNJ podem ser utilizados na preparação ou administração da combinação do presente invento.

presente

Além disso, embora as invento compreendam ambos composições farmacêuticas do os AZT e N-butil DNJ na mesma forma de dosagem, deve ser tomado em consideração qus ao pr icar

AZF e o N-butil DNJ podem ser distintas separadas em difegem distintas separadas, mas em conjunto na mesma composio método do invento apresentado, s. administrados em formas de dosagem rentes tempos, em formas de dosa essencialmente simultâneamente, ou ção farmacêutica..

Claims

Reivindicações lã. - Método de tratamento de um doente infectado por

HIV, caracterizado por compreender a administração, de preferên/ cia oralmente ou intravenosamente, de uma combinação de 3 -azidoí

-3 -desoxitimidina e N-butil-desoxinojirimicina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, numa quantidade que atinja eficácia antivirai e que proporcione um nivel de dosagem que produz um índice de combinação inferior a ou igual a 1, em que a 3'-azido3'-desox i t i m i dina

N-bu t i 1 -desox i no j i r i m i c i na. podem ser administradas quer em dosagens distintas, separadas, quer combinadas sob uma forma de dosagem única.
2á.

Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a 3 -azido-3 -desoxitimidina ser administrada numa quantidade variando entre cerca de SO mg/dia e cerca de 1,2 g/dia.

Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a

-asido-3 -desoxi t i m i d ina ser administrada numa quantidade variando entre cerca de 200 mg/dia mg/dia.

c e r c a de 1.000

4â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caractei rizado por a 3'-azido-3 -desoxitimidina ser administrada numa quantidade variando entre cerca de 300 mg/dia e cerca de SOO mg/dia.

Sã. - Método de acordo com a reivindicação í, caracterizado por a N-butil-desoxinojirimicina ser administrada numa quantidade variando entre cerca de 1 mg/kg/dia e cerca de SOO mg/kg/dia.

6ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a N-buti1-desox.i nojirimicina ser administrada numa quantidade variando entre cerca de 8 mg/kg/dia e cerca de 165 mg/kg/dia.

7 Λ

Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a N-butil-desoxinojirimicina ser administrada numa quantidade variando entre cerca de 20 mg/kg/dia e cerca de 130 mg/κg/d ia.

Método de a.cordo com a reivindi c a ç ão 1, carac t erizado por a N-buti1-desoxinojirimicina ser administrada numa quantidade variando entre cerca mg/kg/dia.

de 25 mg/kg/dia e cerca de 100 _ Método de acordo rizado por a relação molar de com a reivínoicação í, caracte^- i i
3 -azido-3 -desoxitimidina pare

N-butil-desoxinojirimicina administradas variar entre cerca de 1:50 e cerca de 1:100.

ÍOíS. - Método de acordo com a rei vindicacão 1, caracte! i rizado por a relação molar de 3 -azido-3 -desoxitimidina para N-butil-desoxinojirimicina administradas variar entre cerca de i;eo e 1;so.

líã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caractei í rizado por a relação molar de 3 -azido-3 -desoxitimidina para N-butil-desoxi no j i r i m i c i na ser de cerca de 1ί70.

12ã. - Método de tratamento de um doente infectado com HIV, caracterizado por compreender a administração, de preferêni cia oralmente ou intravenosamente, de uma combinação de 3 -azidot “3 -desoxitimidina e N-butil-desoxinojirimicina de taI modo que o fc ϊ doente receba cerca de 50 mg/dia a cerca de 1,2 g/dia de 3 -azif do-3 -desoxitimidina s cerca de .1 mg/kg/dia a cerca de 500 mg/kg/dia de N-butil-desoxinojirimicina, ou de um sal farmaceuti/ camente aceitável de cada, e em gue a relação molar de 3 -azidoí

-3 “desoxitimidina para N-buti1-desoxinojirimicina varia entre cerca de 1,’SO e cerca de í=^:100, em gue a 3'-azido-3·'-desoxitimidina e a N-butil-desoxinojirimicina podem ser administradas quer em dosagens distintas, separadas, quer combinadas sob uma forma de dosagem única.

13®. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, de preferência para administração oral ou intravenosa, caracterizado por se incluir na referida composição uma i t combinação de 3 -azido-3 -desoxitimidina e N-butil-desoxinojirimicina, ou seus sais farmacêuticamente aceitáveis, numa quantidade que atinja eficácia antiviral e gue proporcione um nível de dosagem gue produz um índice de combinação inferior a ou igual a

1.

14ã.

farmacêutica de a relação molar xinojirimicina

Processo para a preparação acordo com i

de 3 -azido na referida uma

C OfíiPOS f» âf.M.

a reivindicação 13, caracterizado por

-3 -desoxitimidina para N-butil-desocomposição varia entre cerca de l,'6O e cerca de líiOO.

Í5â. farmacêutica de a r e 1 a ç S o m o 1 a r

Proc para a preparação de uma composição acordo com a variar entre reivindicação 14, caracterizado cerca de ί;69 e cerca de l;8Q.

por tk

Í6&. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a relação molar ser de cerca de í!70.