JPH04501117A - リポソーム類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソーム類 本発明は、外部表面に共有結合的に結合しているポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）部分を有しているリポソーム類に関する。

循環中のリポソーム類の半減期を長くするための数多（の方法が探求されてきた 。方法の中には、＾１ｌｅｎ　Ｔ、Ｍ、他、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ａｃｔａ　８１８：２０５−２１０に記述されているように、脂質二重層中 へのガングリオシド類の組込み、そしてＧｏｓｈ　Ｐ、およびＢａｃｈａｗａｔ 　Ｂ、　Ｋ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　６３２：５６２−５７２に記述されているように、グリコシド類のよ うな分子でリポソームの表面を覆うこと、そして５ｅｎｉｏｒ　Ｊ、著、「治療 学的薬剤担体におけるＣＲＣ評論Ｊ　”　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅ ｗｓ　ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒｓ”　３：　１ ２３−１９３　（１９８７）に記述されているようなポロキサマー類（ｐｏｌｏ ｘａｏ＋ｅｒｓ）が含まれる。

しかしながら、ベシクル類を架橋させることなくそしてベシクルに実効電荷を与 えることなく、水系の溶質を定量的に保持しながら、リポソーム類（これらが、 小さい単一薄板のベシクル類または多層板のベシクル類、或は限定された大きさ を有する大きな単一薄板のベシクル類であろうと）の表面親水性を向上させる技 術が必要とされている。

Ｕｎｇｅｔ他、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、　１７１８１−８５　（１９８９）および Ｔｉ１ｃｏｃｋ他、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、　１７１７７−８０　（１９８９）に 記述されているＧｄ−ＤＴＰＡのような、磁気共鳴画像に関する循環寿命特性を 改質するためのリポソーム類の使用において、特殊な問題が生じている。がん流 刑としての使用に関しては、リポソームのＧｄ−ＤＴＰＡの循環寿命を伸ばすこ とが望まれている。

一度、静脈内に投与されると、リポソーム類は、血漿の蛋白質（例えば、ＨＤＬ ）および細網内皮系（ＲＥＳ）との数多くの相互作用を受け、この結果、該循環 からのベシクル類の不安定化とクリアランスをもたらす。該循環中のベシクルの 安定性を改良するために、今日まで利用されてきた方法は、コレステロールまた は糖脂質の如きステロール類をベシクル類のリビッド組織内に組み込むことであ った。この両方の方法の欠点は、該ステロールまたは他の高相転移すビッドが水 に対するベシクル膜の透過性を減少させ、そのことによって、捕捉されたＧｄ＝ ＤＴＰＡに関するリラックス性（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）が減少し、従って、コ ントラスト剤としてのそれの有効性が低下することが示されたことである。

我々は、驚くべきことに、リピッドの二重層を崩壊することなしにリポソーム類 の外部表面にＰＥＧを共有結合的に結合させると、このリポソーム類の循環寿命 が引き伸ばされ得ることを見い出した。

従って、本発明は、外部表面で共有結合的に結合しているＰＥＧ部分を有するリ ポソーム類を提供する。

好適には、このＰＥＧ部分は、リポソームを形成する少な（とも１種のリン脂買 種の頭基中のアミノ基に対して結合している。この頭基中にアミノ基を有してい る適切なリン脂質には、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ　Ｅ）およびホス ファチジルセリン（ＰＳ）が含まれる。

このリポソーム類は、リン脂質種の少なくとも１つがＰＥＧと結合するための適 切な頭基を有していることを条件として、いかなる適切なリン脂質またはリン脂 質混合物（これらの多くは文献中で既に公知である）から形成されていてもよい 。このリポソーム類内の空間はいかなる通常の水系の相を含有していてもよ（、 そしてこのリポソーム類は、水系の懸濁液として、或は他のいかなる通常の調剤 として、例えば薬学的に許容される担体または希釈剤を含んでいてもよい薬学的 調剤として、例えば静脈内投与のための調剤として、与えられてもよい。好適な 担体には、任意に補助材料、例えば緩衝液、防腐剤、抗酸化剤および等浸透圧性 の塩類を含有している注射用無菌水が含まれる。

好適には、このリポソーム類は、押し出しで製造された大きな単一薄板のベシク ル類（ＬＵＶｅｔｔｅｓ）であり、より好適にはジオレイルホスファチジルコリ ンとジオレイルホスファチジルエタノールアミンとのモル比が７：３〜５：５の りビッドニ重層であり、最も好適には、このリポソーム類は水系のＧｄ−ＤＴＰ Ａを含有している。

本発明は更に、ポリエチレングリコールの反応性を示す誘導体、好適には２．　 ２．　２−トリフルオロエタンスルホニル（トレシル）モノメトキシＰＥＧでリ ポソーム類を処理することを含む方法を提供する。トレシルモノメトキシＰＥＧ 　（ＴＭＰＥＧ）およびその製造は、我々の共出願中の英国出願番号８８２４５ ９１．５に記載されている。

好適には、反応性を示すＰＥＧ誘導体とリポソーム類との反応は、周囲温度また は生理学的温度の水溶液中で行われる。この反応は、中性に近いｐＨ１例えば生 理学的緩衝液中で生じるが、ｐＨ９〜１０でより速くそしてより広範である。リ ポソーム類に対する反応性ＰＥＧ誘導体の比率を調節することによって、該リポ ソーム類と結合するＰＥＧ部分の数が調節できる。

ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、エチレンオキサイド繰り返し単位か ら成る２つの末端ヒドロキシル基を有する水溶性のポリマＨＯ（ＣＨ＊　ＣＨ２ ０）　ｎ　ＣＨｔ　ＣＨｔ　ＯＨである。ＰＥＧ類はそれらの分子量で種類分け され、従って、例えばＰＥＧ６０００は約６０００の分子量を有しており、そし てｎは約１３５である。

ＰＥＧ類を、種々の化学的方法により蛋白質に共有結合的に結合させることがで きる。我々は、モノメトキシＰＥＧ５０００　（ＭＰＥＧ）の単一の遊離ヒドロ キシル基を活性化させるためにトレシルクロライド（２，２，２−トリフルオロ エタンスルホニルクロライド）を用いたが、他のトレシルハライド類およびＭ　 Ｐ　Ｅ　Ｇの他の反応性を示す誘導体も使用できる。達成段階で架橋したリピツ ド類を作り出すところの、両末端が活性化されたＰＥＧを生じさせる可能性は、 ＰＥＧのその他のヒドロキシル基を反応性を示さないメチルエーテルとして「ブ ロックする」ことによって避けられる。

リン脂質類ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルセリ ン（Ｐ　Ｓ）は、極性の頭基中に遊離アミノ基を有している。

水溶液中、リン脂質は離液メソモオルフイズム（ｍｅｓｏｍｏｒｐｈｉｓｍ）を 示し：大部分のリン脂質は、リピッドの二重層（リポソーム類）を含む閉鎖され たベシクル構造を有している。ＰＥは、独立しているときＨ＋＋相を有している が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）との混合物中では二重層構成を有している。

我々は、外側と内側の表面の両方が暴露されているＰＥのアミノ基を有するリピ ッドベシクルを得るため、ＰＥ／ＰＣ混合物からリポソームを調製した。外側の ＰＥ分子のみがトレシル−ＰＥＧに近づくことができ、それゆえ、修飾は非対称 である。

リポソーム表面に結合しているＰＥＧの量は、リビッドの組成、ポリエチレング リコールの反応性誘導体とアミノ基含有頭基を有するリン脂質との比率、反応時 間、およびｐＨを変化させることによって調節できる。例えばリビッド二重層の 統合性の崩壊のためのマーカーとして、捕捉されている色素の放出を用いた体系 的な研究、並びに、例えば静脈内投与した後のマウスの血流中の処理されたリポ ソームの半減期を監視することによって、最適な製造方法が得られる。

循環中に注入された未処理リポソームの主な運命は、大きさに拘らず、肝臓のク ツパー細胞による取り込みおよび膵臓中の固定された大食細胞による取り込みで ある。細胞内皮系（ＲＥＳ）によるこのような取り込みは、生物学的活性分子の ゆっくりとした徐放のためおよびＲＥＳ組織以外の処理のための貯蔵場所の形成 の如き用途におけるリポソーム類の適用性を制限している。ＰＥＧ部分を外部表 面上に導入するため、本発明に従ってリポソーム類を処理すると、驚くべきこと に、血清とリポソームとの相互作用が減少し、そして驚くべきことに、静脈内投 与した後の循環寿命が向上する。

本発明の、ＰＥＧを有するリポソーム類の特に好適な使用は、Ｇｄ：ジエチレン トリアミンペンタセディックアシッド（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ ｐｅｎｔａｃｅｄｉｃ　ａｃｉｄ）のキレートの如きＭＲ画像剤の放出に関する ものである。

本発明は更に、例えば薬のための、そして磁気共鳴画像（ＭＲ）用のコントラス ト剤のための放出手段として、ヒトまたは動物体に対して行われる治療学的およ び診断上の方法において、リポソームの外部表面に結合しているＰＥＧ部分を有 するリポソーム類の使用を提供する。本発明は、ヒトまたはヒト以外の動物に必 要な診断上もしくは治療上の薬剤を含む、有効で無毒量の、上記ＰＥＧ含有リポ ソーム類の静脈内投与から成る治療または診断方法を提供する。

本発明を、付随する図面から成る図によってここに説明するが、ここで、図１は マウス中の循環からのＰＥＧ化した５ＵＶｓおよび未ＰＥＧ化５ＵＶｓに関する クリアランスの比較を示す。

図ＩＡ：　ＰＥＧ化したか（）、或は未処理（）の、組成がＤＳＰＣ：ＰＥ：コ レステロール（モル比０．４：０．１：０．５）＋７）ＳＵＶＳをマウスに静脈 注射した（０．４ｍｇ／２５ｇマウス）。ＣＦ（投薬量±ｓｅ、５匹）の血液レ ベルを示す；ｓＨリン脂質のクリアランスは同じであった（示していない）。

図ＩＢおよびＩＣ：　ＳＵＶの製造に関して、大きなベシクルを除去するため１ ００．０００ｇで１時間遠心分離を行い、そして注射の量が０゜８ｍｇ／２５ｇ マウスである以外は図ＩＡの条件と同じ。ＣＦ（図ＩＢ）クリアランスと３Ｈリ ン脂質クリアランス（図１ｃ）の両方は、ＰＥＧ化（）および未ＰＥＧ化（）ベ シクルに関して示した。

本発明を下記の実施例でここに説明する。

実施例１〜１０ ＰＥＧ化リビすドベシクルの製造 Ａ、活性化トレシル−ＭＰＥＧの製造 塩基性触媒としてピリジンを用いて、室温で、ジクロロメタン中の乾燥モノメト キシＰＥＧ５０００　（これはＵｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅから入手可能）をト レシルクロライド（２，２，２−）リフルオロエタン−スルホニルクロライド） （これはＦｌｕｋａから入手可能）で処理することによってトレシル化モノメト キシＰＥＧ　（ＴＭＰＨＧ）が得られた。ジクロロメタンを減圧上除去した後、 得られる固体をメタノール−ＭＣＩ混合物（１０００ｍＬ当たり０．３ｍＬのＩ ＩＨＣＩ）に溶解し、そして−２０〜０℃で再沈澱させた。固体を遠心分離で単 離し、サンプル中にピリジンがなくなるまで（２５５ｎｍで検出）この操作を繰 り返した後、酸がなくなるまでこの固体をメタノールから再沈澱させた。

Ｂ、リピッドのベシクル表面のＰＥＧ化得られるＴＭＰＥＧとリピッドのベシク ルとを、緩衝液中室温で反応させた（以下を参照）。該ベシクルの外部表面への ＭＰＥＧのＭＰＥＧ共有結合付着は、Ｔｉ１ｃｏｃｋ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９７９：２０８−２１４　（１９８９）の方法と同 様の方法による、ＰＥＧとデキストランとの水系の二相系中のベシクルの分配挙 動における変化で明らかに示される。この相系の組成は、該ベシクルが上部のＰ ＥＧ豊富相中への低い分配度を示し：ベシクルが接触面に存在しているか、或は ＭＰＥＧの底部のデキストラン豊富相中に存在するように調整した。ベシクルの 表面へのＭＰ’Ｇの付着は、それらをよりｒＰＥＧらしく」（該ＰＥＧ豊富豊富 上って、それらの湿潤化が増大する）し、そしてそれらは上部相に分配される。

実施例Ｉ ＭＬＶｓ　（多層板ベシクル類）のＰＥＧ化２０％（Ｗ／Ｗ）の卵ホスファチジ ルエタノールアミン（ＥＰＥ）と８０％（ｗ／ｗ）の卵ホスファチジルコリン（ Ｅ　Ｐ　Ｅ）と１４ＣＥＰＣとを含有している多層板ベシクルを、０．０５Ｍの 燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，５（ＰＢＳ）を含有している０、１２５ＭのＮ ａＣ１中、１０ｍｇの全すピッド／ｍＬに調製した。ベシクルの０．１ｍＬのサ ンプルを、ＰＢＳ中で調製したＴＭＰＥＧの溶液（最終濃度０＝１７０ｍｇ　／ 　ｍ　Ｌ　）と−緒に、室温で２時間保温した。０、ＯＩＭの燐酸ナトリウム、 ｐＨ６，８を含有している０、１５ＭのＮａＣ１中、５％（ｗ／Ｗ）のＰＥＧ６ ０００と５％（Ｗ／Ｗ）のＤｅｘｔｒａｎ　Ｔ５００から成る相系の二相系（１ ｍＬの上部相と１ｍＬの底部相）にサンプル（０，０５ｍＬ）を加え、この系を 混合し、そして混合（全体）後直ぐの混合物から採取したサンプル、そして相分 離が完了した後（２０分）の上部Ｐおよび底部相から採取したサンプルの放射能 を測定することで、サンプルを分配させた。

表１の結果は、リポソームをＴＭＰＨＧに暴露することで、ＰＥＧが豊富な上部 相へのそれらの分配が増大することを示している。このことは、おそら（は、Ｅ ＰＥのアミノ基への共有結合的付着により、ＰＥＧがリポソームに付着してきた ことを示している。

表１ ＥＰＥ／ＥＰＣ（２：　８）の多層板ベシクルの分配挙動に対するＴＭＰＥＧの 効果 ０．０　９．１±４．７　８４．５±４．１　６．４±２．４　９２．０　１４ ．５±５．４　８０．２±４．２　５．３±１゜６３８．０　４４．９±６．３ 　５０．８±６．５　４．３±０．４　３１２．５　７４．７±９．５　２０． １±１０．５　５．２±１．４３２５．０　９６．３±７．８　３．１±３．６ 　４．６±０．８４５０．０　８９．３　６．５　４．５　１１００．０　８８ ．８　５．１　６．１　１１７０．００　８９Ｊ　６．５　４．２　１ＴＭＰＥ Ｇがなんらかの効果を有するためには、ベシクル中にＰＥが存在していることが 必要とされる。１００％のＥＰＣから成るＭＬＶ　ｓをＴＭＰＥＧで２時間処理 した後、０．０１．Ｍの燐酸ナトリウム、ｐＨ６，８で緩衝させた０、１５Ｍの ＮａＣｌ中の５％１５％ＰＥＧ６００Ｑ　−Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｔ５００系中で分 配させたとき、緩衝液で処理したＭＬＶｓに比べていかなる差異も見られなかっ た（表２）。

表２ 卵ＰＣ多層板ベシクルに対するＴＭＰＨＧの効果最終ＴＭＰＥＧ　分配（％）　 ｎ ｏ　２２．５±１３．０　７１．６±１２．０　５．９±１．０５２５　２５． ８±１３．０　６７．８±１４．０　６．４±１．０　５ＴＭＰＥＧの活性は保 存中に減少する。蛋白質をＰＥＧ化する能ノコを失ったサンプルは、ＥＰＥを含 有しているリポソームの分配に対していかなる効果も有していないことを見い出 した。この観察は、ベシクル類を含有している非ＰＥを生じさせるＴＭＰＥＧの この無能力と共に、ＴＭＰＥＧが特にＰＥに対して付着しておりそして変化した 分配化は、ベシクル表面に対するＴＭＰＥＧの吸着から生じたものでないことを 支持している。

実施例２ ＳＵＶｓ　（小さい単一薄板ベシクル類）のＰＥＧ化モル比が０．ｓ：ｏ、２： １のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスフ ァチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）およびコレステロールから成る５ＵＶｓ を、トレーサー３Ｈ−ＤＰＰＣ（３０ｍｇのリン脂質当たり６　ｘ　１０’ｄ　 ｐｍ）を用いて、Ｓｅｔ＋ｊ。

ｒＪ、他、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｔｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ　８３９：１−８　（ １９８５）の方法で調製した：ここで、２ｍＬのＰＢＳ　（０，０５Ｍの燐酸ナ トリウム緩衝液、ｐＨ８゜５で緩衝させた０、１２５ＭのＮａＣ１）中で、２５ ｍｇのＤＳＰＣ１５，５ｍｇのＤＰＰＥおよび１５ｍｇのコレステロールを水和 させた。

達成反応および次の操作中、水溶性分子のリポソーム保持率を測定する−ため、 ５ｅｎｉｏｒ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　８３９：１− ８　（１９８５）に記述されているように、カルボキシフルオレセン（Ｃａｒｂ ｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｅｃｅｉｎ）を部分的に精製し、そして０．１５Ｍで捕捉 させた。１２５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ　（０，０５Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液、ｐ Ｈ８，５で緩衝させた０、１２５ＭのＮａＣＩ）中で調製した等容積のＴＭＰＥ Ｇと一緒に、Ｑ、５ｍＬのＳＵＶを保温した（全ＤＰＰＥに対するＴＭＰＥＧの 比率は６．２５である）。次に、このベシクルを５ｅｐｈａｒｎｓｅ　４Ｂ−Ｃ ｌ上のゲル濾過で未反応のＴＭＰＥＧから分離した後、０．０１．Ｍの燐酸ナト リウム、ｐＨ６，８を含有している０、１５ＭのＮａＣｌ中の５％のＰＥＧ３　 Ｑ　Ｑ　Ｑ　（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ）および５％のＤｅｘｔｒａｎ　Ｔ ５００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から成る相系中、実施例１と同様にして分配さ せた。表３中の結果は、リポソームをＴＭＰＥＧに暴露すると、緩衝液のみで処 理したベシクル（対照区）に比較して、ＰＥＧの豊富な上部相へのそれらの分配 が増大することを示している。このことは、ＰＥＧがＤＰＰＥのアミノ基に共有 結合的に結合していることを示唆している。捕捉されているＣＦを失うことなし にＰＥＧ化が進行した。

表３ ＰＥＧ化および未ＰＥＧ化５ＵＶｓの相分配未処理　１．４±０．２　３６．叶 ５，０　６２．５±５１ＴＭＰＥＧ処理　９６．５±ｉ、ｏ　１．４±１．１　 ２．１±０．４実施例３ 実施例２で用いたのと同様な５ＵＶｓをＴＭＰＥＧ　（１２５ｍｇ／ｍＬ）で処 理した後、それらの分配化を、ＭＰＥＧ　（１２５ｍｇ／ｍＬ）または緩衝液で 処理した５ＵＶｓと比較した；ここで、ＴＭＰＥＧで処理したベシクルは完全（ ］０００％に上部相中に分配されたが、一方、ＭＰＥＧ処理ベシクルおよび緩衝 液処理ベンクルは上部相への分配化を示さず、そして接触面相と底部相との間に 同様な等しい分布を示した。

このことは、ＴＭＰＥＧがベシクル表面に対して共有結合付着で作用しているの であって、吸着によるのではないとする示唆に対して、追加的支持を与えている 。

実施例４ 限定された大きさの１．１ｆｆｅｔｔｅｓ　（押し出しで製造した大きな単一薄 板ベシクル類）のＰＥＧ化 Ｔｉ１ｃｏｃｋ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　９７９：２ ０８−２１４　（１９８９）に記述されているのと同様にしてＬＵＶｅｔｔｅｓ を調製した。

直径が１１００ｎのＬＵＶｅｔｔｅｓを、最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるよう に調製した。種々のモル比（全部で２０ミリモル）のクロロホルム中のジオレイ ルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）とジオレイルホスファチジルエタノールア ミン（ＤＯＰＥ）とから成る混合物を２ｕＣの３３ＨＤＰＰＣと一緒にした後、 減圧（＜０．１ｍｍＨｇ）下、２時間蒸発させることで溶媒を除去した。このリ ビッドを１．５５ｍＬの５ＱｍＭの■ｅｐｅｓ１１００　ｍＭのＮａＣＩ、ｐＨ ７〜９中に、室温で、渦巻き状に混合することで分散させ、１．０ｍｇ／ｍＬの 最終的リビツド濃度を得た。次に、Ｈｏｐｅ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、＾ｃｔａ　８１２：５５−６５　（１９８５）の方法により、押し出し装置 （Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、　Ｃａｎａｄａ）を用い、２枚重ね のｉｏｏｎｍのポリカーボネート製フィルターを通して、該リビツド分散液のＭ ＬＶｓを繰り返しく１０回）押し出すことで大きい単一薄板のベシクルを製造し た。直径を、Ｎｉｃｏｍｐモデル２７０の粒子分析機を用いてＱＥＬで測定した 。

このベシクルを、４０ｕ１のＴＭＰＥＧ含有緩衝液を用いて、室温で保温するこ とによってＰＥＧ化した。間隔をおいて、２０ｕｌのサンプルを取り出し、そし て燐酸ナトリウムを用いて室温でｐＨ５，８に緩衝させた０、１５ＭのＮａＣＩ で調製したところの、５％のＰＥＧ３０００　（Ｌｔｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ ）と５％Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｔ５００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）系の、１．５ｍＬ の上部相および１．５ｍＬの底部相から成る相系中で分配させた。この相を混合 し、分離させた後２０分後の上部相と底部相のサンプルを取り出した。未処理の ベシクルの上部相への分配化が著しく低く（〉５％）；即ち、該ベシクルの大部 分が底部相とかさ高い接触面相との間にほぼ等しく分画されるように、この相系 を選択した。

実施例５ 実施例４では、ＬＵＶｅｔｔｅｓの外側の表面に存在しているＤＯＰＥに対して ２倍過剰量のＴＭＰＥＧを用いたＰＥＧ化反応の時間的過程およびｐＨ依存性を 用いた。ｐＨが８〜９のとき、ＴＭＰＥＧを用いた保温では、経時的にベシクル が上部相に移動した。ｐＨが７．５のとき、反応はかなり遅く、そしてｐＨが７ ．０のときは、実際上、上部相への移行は生じなかった。底部相と接触面相との 分配化も測定した別の実験で、ｐＨが７．２のとき、上部相の分配化は変化しな かったが、接触面相の分配化が上昇すると、底部相の分配化が低下することが分 かり、このことは、より高いｐＨのときに比べてゆっくりではあるが、ｐＨが７ ．２のときでもＰＥＧ化が進行することを示している。ｐＨが８のとき、分配化 は、底部相から接触面相に、そして次に上部相へ移動し、そしてｐＨが９および １０のとき、ベシクルは接触面相および底部相から即座に上部相へ移動する。こ のように、ＰＥＧ化反応はｐＨに対して非常に敏感であり、そして時間およびｐ Ｈ条件を適切に選択することで、ＰＥＧ化の度合を一決定することができる。Ｐ ＥＧ化の度合はまた、使用するＴＭＰ、ＥＧの量で調節され得る。ＴＭＰＥＧの モル比を変化させながら、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ（０，２：　０．　８）から成る １１００ｎのＬｌｆｆｅｔｔｅｓをｐＨ９゜０で処理すると、ＰＥＧ化が上昇す るに従って上部相への分配が上昇した。１．０〜１．３のモル比の上部相中の分 配化において、２０％から９０％への著しい上昇が生じた。底部相および接触面 相における分配化も測定したが（表４）　、ＴＭＰＥＧ：外部ＤＯＰＥのモル比 がより低い比率のときのＰＥＧ化は、底部相から接触面相へ、そして次に上部相 への段階的な分配の変化を生じ、ＰＥＧ化の度合の段階的変化を明らかに示して いた。

分配化の時間的経過からして、ｐＨが９のときの反応は実際上１時間で完了する ことは明らかである。このように、ＰＥＧ化の限定された度合は、ＴＭＰＥＧ： ＤＯＰＥの比を調節することによって得られる。

表４ ０．２　５６　４１　３ １．０　２８　５８　１３ １．３　１　９　８９ ｐＨが８．５のホウ酸緩衝液中の０．０５ＭのＴＮＢＳ中、Ｈｏｐｅ　Ｍ、　Ｊ 。

およびＣｕ１ｌｉｓ　Ｐ、Ｒ，、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、　２６２：４３ ６０−４３６６　（１９８７）の方法で製造したＬＵＶｅｔｔｅｓの外部表面を 暴露したアミノ基の画分（ＰＥからの）を測定した結果、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥの ベシクル（８：　２）に関する４７％の値を与え、この値は、内部表面と外部表 面とのＰＥの等しい分布に関する５０％の理論値に近い。ＰＥＧ化は、この定量 法で検出できるＰＥ含有量の減少を生じさせ、ＰＥの遊離ＮＨ，基へのＭＰＥＧ の共有結合付着を示唆していた。例えば、外部ＰＥに対して３倍モル過剰のＴＭ ＰＥＧを、７：３のモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＥベシクルに１時間加えたとき、 ＰＥＧ化された外部ＰＥのパーセントは３６％であり；そして、６倍モル過剰を 加えたとき、このＰＥＧ化のパーセントは４５％に上昇した。

実施例６ ＰＥＧ化に対するリビッドベシクルの安定性５ｅｎｉｏｒおよびＧｒｅｇｏｒｉ ａｄｉｓ著「リポソーム技術」”Ｌｉｐｏｓｏａ＋ｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” 　（Ｇ　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編集）３巻、２６３頁（１９８４）　ＣＲＣＰ ｒｅｓｓ、に記述されているように、リピッドベシクルの安定性は、６ＣＦ　（ ６−カルボキシルフルオレセン）の発散の度合で測定された。ＤＯＰＣ：ＤＯＰ Ｅから成る１１００ｎのＬｌｆｆｅｔｔｅｓを、ｐＨが８．５の１００ｍＭのＮ ａＣｌ中、捕捉されている５ＱｍＭの６ＣＦ（６−カルボキシルフルオレセン） を用いて合成し、外部の６ＣＦは、溶離剤として５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、　１０ ０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８，５を用いた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５上のカラム クロマトグラフィーで除去した。潜在性期間測定のためのサンプルを４ｍＬの緩 衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ９）　１．：加え た後、蛍光を測定しく放出された色素）、そして２５ｍＭのオクチル−グルコシ ドの入っている４ｍＬの緩衝液に加え、該ベシクルの完全な崩壊を確実にするた め３７℃で３０力月保温した後、蛍光を測定した（全色素）。蛍光は、４９０ｎ ｍで励起させ、そして５２０ｎｍの発光を測定した。

１１００ｎのＬＵＶｅｔｔｅｓは、いかなる潜在性期間の損失もなしにＴＭＰＥ ＧでＴＭＰＥＧ化された。一層のＰＥＧ化（相分配で示される）を確実にするた め、ベシクルの外側の表面に存在しているＤＯＰＥに対して３倍モル比のＴＭＰ ＥＧを用いて、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥが８：２のベシクルを、ｐＨ８，５で処理し た。２時間に渡って、該ベシクルからの６ＣＦの漏出はな（、これは、リビッド の二重層の崩壊なしにＰＥＧ化が生じることを明らかに示している。

実施例７ ＳＵＶｓと血清との相互作用 連成させたＰＥＧ　（上を参照）を有するか或は有していない、組成が−ＤＳＰ Ｃ：　ＰＥ：コレステロール（モル比０．　４：０．　１：０．　５）の５ＵＶ ｓＯ，１ｍＬを、０．５ｍＬの新鮮な血漿（マウス）または緩衝液と一緒に、３ ７℃で培養した。このサンプルを間隔をおいて取り出し、そして上の実施例と同 様にして分配化させた。５ＵＶｓは、約２０％が上部相、６０％が接触面相、そ して２０％が底部相に分配された。血清で処理すると、直ちに（１分以内）、そ れらの分配（０％が上部相、４０％が接触面相、そして６０％が底部相）で示さ れるところの、ベシクル表面特性の変化が生じた。血漿の蛋白質単独では、主に 、底部相へ分配された（６８％が底部相、３２％が上部相：分配係数＝０．４７ ±０゜０２、ｎ＝４）。このように、５ＵＶｓは直ちに血清の蛋白質で被覆され 、これが次に、該蛋白質と同様の特性でもってベシクルの分配化を生じさせると 考えられる。５ＵＶｓのＰＥＧ化は、上部相へのそれらの分配を増大させ（はと んど１００％）；血清に暴露すると、それらの分配は接触面相および底部相へと 変化したが、しかし重要なことは、未ＰＥＧ化５ＵＶｓに対する血清の実際上の 瞬間的な効果に比べて、この課程は非常に遅かったことである。分配挙動は、Ｐ ＥＧ化および血清の結合によって与えられる力の合計に関係しており、そして前 者は１次関数でないため、分配に対する血清の効果がＰＥＧ化および未ＰＥＧ化 リポソームに対して同じであるか否かを測定するのは簡単ではない。しかしなが ら、これは、分配係数に対するＰＥＧ化の効果に関する詳細な用量応答の分析を 行うことで測定され、その結果、血清の影響が、ｒＰＥＧ当量」として用量応答 曲線の種々の部分で測定され得る。これによって、ているか否かが分かる。分配 挙動に関する大きさの変化の度合は、ＰＥＧ化がベシクル上への血清成分の吸着 を低下させることを示唆している。

血清に暴露させた５ＵＶｓのクロマトグラフィーによる分離によって、暴露前の ベシクルの分配挙動に近い分配挙動を示すベシクルが得られた。

従って、ベシクルと血清との間の相互作用は、ベシクルを再び単離することによ って逆戻りする。

これらの実験はまた、ＰＥＧ化によって与えられた５ＵＶｓの変化した表面特性 は、血清蛋白質の吸着によっては本質的に逆戻りしないことも示している。

実施例８ 血清に対するＬＵｖｅｔｔｅｓの安定性はＰＥＧ化によって上昇する。

血清に対するＬＵＶｅｔｔｅｓの安定性を測定するため、捕捉された６ＣＦ　（ ５０ｕ１）を含有しているベシクルを、０．５ｍＬの血清（新しく水和させた凍 結乾燥のヒトの血清、Ｍｏｎｔｔｒｏｌ−ＥＳＳＤａｄｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃｓ）と−緒に３７℃で培責し、約１ｍｇ／ｍＬの最終リピッド濃度とし、この 濃度は、Ｕｎｇｅｒ他Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　１７１：　８１−８５の画像実験を 基にした、期待される最大インビボ血清濃度に相当している。間隔をおいてサン プルを取り出し、放出された６ＣＦを蛍光定量法で測定した。外側の表面のＤＯ ＰＥに対して３倍過剰のＴＭＰＥＧを用いて、ベシクルを室温で一晩ＰＥＧ化し 、その後、潜在性の損失があった。

８：２のモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＨの５Ｑｎｍのベシクルが、血清の存在下、 かなりの潜在性の損失を示しく例えば、２時間後１０％のみの潜在性が存在して いた）、これは、ＰＥＧ化によって低下しなかった、即ち、１１００ｎのベシク ルは２時間後３５％の潜在性を示し、これはＰＥＧ化の影響を受けず、２００１ ｍのベシクルはより小さい潜在性の損失を示しく例えば、６５％の潜在性が２時 間後残存してＬまた）、これはまた、ＰＥＧ化によって阻害されなかった。しか しながら、７：３のモル比のＤＯＰＣ：　ＤＯＰＨの１１００ｎのベシクルに関 して、ＰＥＧ化は、潜在性の血清誘発損失を、率に関して２だけ減少させた。Ｄ ＯＰＥの含有量を４０モル％および５０モル％に上昇させると、血清に対するベ シクルの安定性が上昇したが、それにも拘らず、ＰＥＧ化によって追加的安定性 が得られた。表５にこれらのデータを要約する。

表５ 血清に対する１１００ｎのＬＵＶｅｔｔｅの潜在性に関するＰＥＧ化による安定 化（２時間、３７℃） ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ　潜在性（％） モル比 未ＰＥＧ化　ＰＥＧ化 ８・２　３５　３５ ７　：３　５５　８３ ６　：４　９０　９５ ５：５　９２　９９ 実施例９ ＰＥＧ化は、包含されているＧｄ−ＤＴＰＡのリラ・ソクス性を変化させない。

Ｔｉ１ｃｏｃｋ他、Ｒｒａｄｉｏｌｏｇｙ１７１：　７７−８０　（１９８９） の方法によって、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥが７：３のＬＵＶｅｔｔｅｓ中に、Ｇｄ− ＤＴＰＡを包含させた。

サンプルの半分がＴＭＰＥＧでＰＥＧ化された（外側の表面上、３：１のモル比 のＴＭＰＥＧ：　ＰＥ）。対照区およびＰＥＧ化サンプルの両方を、食塩緩衝液 （１３９ｍＭのＮａＣ］、１０ｍのＨｅｐｅｓ、　６ｍＭのＫＣｌ５ｐ）（８， ５）中に希釈して、２．１．０．５および０．２５ｍＭの有効Ｇｄ濃度（該ベシ クルの公知捕捉容積およびリピ・ソド濃度を与え、そして捕捉されたＧｄ−ＤＴ ＰＡの濃度が０．６７Ｍであると仮定して、Ｔｉ１ｃｏｃｋ他、Ｒａｄｉｏｌｏ ｇ＞＋　１７１：　７７−８０　（１９８９）に記述されてＬＮるのと同様にし て計算した）を有する４つのサンプルを得た。１０〜１２ｍＬのサンプルを、Ｔ ｏｓｈｉｂａ　Ｏ，５Ｔ　ＭＲＴ−５０＾全体スキャナーを用いて像を撮った。

有効Ｇｄ−ＤＴＰＡａ度に対する１／ＴＩ（スピン格子緩和時間定数）の線形回 帰から、１巧ツクス度を得た。これは、ベシクルのＰＥＧ化の影響を受けなかっ た。

実施例１０ ＳＵＶｓのＰＥＧ化はそれらのインビボクリアランスを減少させる。

組成がＤＳＰＣ：　ＰＥ　：コレステロール（モル比０．　４＋０．　１ｏｏ。

４）の５ＵＶｓ　（０，４ｍｇのリン脂質を含有している０、２ｍＬ）を、オス のＴＯマウス（各グループ中５匹）の尾の静脈中に静脈注射した。

ＰＥＧ化および未ＰＥＧ化ベシクルのクリアランスを、「リポソーム技術Ｊ　” 　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　ＴＥｃｈｎｏｌｏｇｙ”３巻、２６３−２８２頁（１９８ ４）　、ＣＲＣＰｒｅｓｓ中の５ｅｎｉｏｒ　ａｎｄ　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ の方法を用いて、間隔をおいて取り出した血液のサンプル（２５ｕｌ）中で測定 した、捕捉されているＣＦおよび３Ｈ−放射能標識リン脂質から定量した。５ｅ ｎｉｏｒ他Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　８３９：　１−８　（ １９８５）に記述されているのと同様のもう１つの実験で、１００．０００ｇで １時間超遠心分離したときの上澄み液として、２０〜１０１００ｎ平均５０ｎｍ ）の小さいベシクルを含有している０、８ｍｇ容量のリン脂質が得られた。

図ＩＡは、音波処理した未遠心分離調剤を静脈投与した後の５ＵＶｓのクリアラ ンスを示している。この調剤は、ＰＥＧ化および未ＰＥＧ化の両方のサンプル中 に、迅速に排出されるいくつかの大きなベシクルを、おそらくは、含有している 。しかしながら、より遅いクリアランス相は、該リピッド容量の約５０〜６０％ に相当しており、未ＰＥＧ化調剤（７時間）に比較して、ＰＥＧ化サンプルの半 減期（１０時間）に関しては著しい差を示した。より大きなベシクルを除去した 調剤においては（図ＩＢおよび図ＩＣ）、ＰＥＧ化ベシクルは、未処理のベシク ルの１２時間に比較して、１４時間の半減期を有していた。

ｈ Ｉ３８問ｃ時） 国際調査報告 ””１％”−６”ｍ−ｔ”−ＮＩＩＰＣＴ／ＧＢ８９１０１２６２国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．外部表面上に共有結合的に結合したＰＥＧ部分を有するリボソーム類。
2. ２．該リビッドニ重層がジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびジ オレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の混合物から成る請求の 範囲１に従うリボソーム類。
3. ３．該リビッド二重層が７：３〜５：５のモル比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＥから成る 請求の範囲２に従うリボソーム類。
4. ４．Ｇｄ：ジエチレントリアミツペンタアセティックアシッド（Ｇｄ−ＤＴＰＡ ）を含有する水相を含む請求の範囲１〜３のいずれか１項に従うリボソーム類。
5. ５．請求の範囲１〜４のいずれか１項に従うリボソーム類および薬学的に許容さ れる担体または希釈剤から成る水系懸濁液を含む薬学的組成物。
6. ６．ヒトまたは動物体の治療方法或けヒトまたほ動物体に対して行う診断上の方 法における使用のための請求の範囲１〜４のいずれか１項に従うリボソーム類。
7. ７．ヒトまたは動物体の治療方法或はヒトまたは動物体に対して行う診断上の方 法における使用のための薬剤の製造における請求の範囲１〜４のいずれか１項に 従うリボソーム類の使用。
8. ８．ヒトまたは動物体の磁気共鳴画像を含む診断上の方法におけるコントラスト 剤を含有する水相を含むリボソーム類の請求の範囲７に従う使用。
9. ９．ポリエチレングリコールの反応性を示す誘導体でリボソーム類を処理するこ とを含む請求の範囲１〜４のいずれか１項に従うリボソームの製造方法。
10. １０．該反応性を示す誘導体が２，２，２−リフルオロエタンスルホニル−モノ メトキシ−ポリエチレングリコールである請求の範囲９に従う方法。
11. １１．それらが必要としているヒトまたはヒト以外の動物に対する診断上のまた は治療学的薬剤を含有している水相を含む請求の範囲１に従う有効で無毒量のリ ボソーム類の静脈投与を含む治療学的または診断上の方法。