JPH04501565A - Ｅｌａｍ―１に特異的な抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 泣肌ユ五艷 ＥＬＡＭ−１に特異的な抗体およびその用途発明の分野 本発明は、免疫学の分野におけるものである。

発明の背景 血管の内皮内層への白血球の付着は、炎症およびある種の血管性疾患の過程にお ける特徴的な段階である。血管壁における変化が白血球の付着を促進し得る（コ ーンハイム（Ｃｏｈｎｈｅｉｍ、Ｊ、、Ｌｅｃｔｕｒｅｓ　１ｎＧｅｎＣｒａｌ 　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　（Ｎｅｗ　Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｌ ｏｎｄｏｎ）　Ｖｏｌ、１．２ｎｄ＋：ｄ、　（１８９８）））ということは長 い間推測されてきたが、最近まで、この相互作用のメカニズムおよびモジュレー タ−は、明らかにされていなかった（バーラン（Ｈａｒｌａｎ、Ｊ、Ｍ、、　Ｂ ｌｏｏｄ、　６５：５１３−５２５（１９８５）））。

インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（Ｔ　Ｎ　Ｆ　）、およ び細菌性エンドトキシンを包含するある種の炎症／免疫サイ：・力５ｒンは、培 養されたヒト血管内皮に直接作用１７、白血球および間車セルラインについてそ の表面の付着性を増大することが示された。

ベビラクア等（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｍ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｊ、Ｃ１ １ｎ、１ｎｖｅｓｔ、　７６：２００３−２０１１（１９８５）　；ベビラクア 等（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｍ、Ｐ、　ａｔ　ａｔ、）、　Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈ 。

１．１２＋　＝３９３−４０３（１９８５）；ベビラクア等（Ｂｅｖｉｌａｃｑ ｕａ、Ｍ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ＥＩｌｌｉｇｒａｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　５ｅｑｕｅｌａｅ、　Ｍｏｖａｔ、　Ｈ，Ｚ、（ｅｄ 、）、Ｋａｒｇｅｒ。

ＮＪ、、ｐｐ、７９−９３（１９８７）；ギャンブル等（Ｇａｍｂｌｅｊ、Ｒ， ｅｔ　ａｌ、）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ｔｅｕｃ：ＵＳＡ ）　８２：８６６７−８６７！（１９８５）；シュライマー等（Ｓｃｈｌｅｉｍ ｅｒ、Ｒ，Ｐ、　ｅｔ　ａｔ、）、　Ｊ、１ｗｕｎｏ１．１３６：６４９−６５ ４（１９８６）；ダン等（Ｄｕｎｎ。

Ｃ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｔｈｅ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ、　Ｍｅｔａｂ ｏｌｉｃ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎ＋ｅ ｒｌｅｕｋｉｎ−１，Ｋｌｕｇｅｒ、Ｍ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　（ｅｄｓ、） 、Ｌｉ５ｓ、Ｎ、Ｙ。

ｐｐ、４５−５４（１９８５）；カベンダー等（Ｃａｖｅｎｄｅｒ、Ｄ、Ｅ、　 ｅｔ　ａｌ、）、　Ｊ、ｆｍｍｕｎｏｌ。

１３６：２０３−２０７（１９８６）；ユ等（Ｙｕ、Ｃ，−Ｌ、ｅｔ　ａｌ、） 、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：５７１（１９８６）、およびポールマン等（ Ｐｏｈｌｍａｎ、Ｔ、Ｈ，ｅｔ　ａｔ、）、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：４ ５４８−４５５３（１９８６）。

多数の、白血球および内皮細胞表面の蛋白が、内皮細胞−白血球の付着に関係が ある。、１例であるＩＣＡＭ−１は、血管内皮を包含する種々の造血細胞および 非造血細胞上で発現される。ＩＣＡＭ−１は、ある種のサイトカインによって内 皮細胞上に誘導される９０ｋＤの糖タンパクである。ＩＣＡ、Ｍ−１の発現は、 タンパク−およびｍＲＮＡ合成−依存性であり、その誘導は可逆的である。ダス ティン等（Ｄｕｓｔｉｎ、Ｍ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、１ｍａ＋ｕｎｏ１ ．１３７：２４５−２５４（１９８６））；ロスレイン等（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、 Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ−１３７：３２７０−１２７４（１ ９８６））；およびボーバー等（Ｐｏｂｅｒ、Ｊ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、迦：１６８０−１６８７（１９８６））。

白血球細胞表面の糖タンパク、ＬＦＡ−１は、リンパ球、顆粒球、単球、食細胞 およびＢ細胞上で発現される。ＬＦＡ−１も、白血球−内皮細胞の付着において 役割を果たしている。ＬＦＡ−１は１７７ｋＤＣアルファまｔ二は重）サブユニ ットおよび９５ｋＤ（ベータまｔ二は軽）サブユニットを有するダイマー分子で ある。Ｆ　（ａｂ’　）２　Ｍａｂは、内皮細胞に対する白血球の付着を効果的 に阻害するアルファおよびベータサブユニットに展開された。？ンツアー等（Ｍ ｅｎｔｚｅｒ、Ｓ、Ｊ、　ｅｔＳ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、１３０：４１０−４１５（１９８７））；およびポール本発明は、 ＥＬＡＭ−１またはその７ラグメントをコードしているクローンされた遺伝子ま たはその縮重変異体に関するものである。

本発明のクローンされた遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を含有している。

１　ＣＣＴＣＡＣ＾〔＾Ｇ　ＡＣＧＣＡＧＣＡＱＴ　ＱＡＴＡＣＣＣＡＣＣＴｃ ＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＴτＣＡＡａｏＩ　ＣＡＡＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣ（ τ＾’ｒｒｃｃ　Ａｃｃｃｒｃｃ＾＾ｖ　ｃｖｃｃＴｒｃＡｃｒ　ｃ’ｒｃＡｖ ｃｃ’ｒｃｖ８５１　ＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡ　Ｃ１ＣＣＡＡＴＧＧＧＴ　ＴＣＣ ＴＧＧＡＡＴＧ　ｍｃｃＡＡＡＡｃ　ＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴ９ｏ＋　１ｃｃｃＡ ｖｃｃ＾＾ＣＡＣＡＡＣＣＴＣＴ　ＡＣ＾ηゴＣ＾ＣＴ　ＣＴＣ＾＾ＱＡ、ＬＣ Ｑ＾η１Ｃ＾＾〔ＴＡ９５１　ＡＴＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＴＣＡ　Ｃ ＴＣＴＡＣＣＴＣＡ　ＴＣＴＧＣＣＡＡＩＴ　Ｃ（ｆｌ；ＡＣＡＡＣＧｉＡｌｏ ｏｌ　ＧＡＡＣＣＣＡＡＣ（：　ＴＣＴＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡ（＾ＴｃｃＡｃ　 ｃｃｃｃｃｖｃｃｃＣＣＡＣ（ＣＴ（ＡＣＡ１０５１　ＡＴＧＣＣＴＣＴＣＴ　 ＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴ”ｒｃｃｃｃＴｃ　ＣτＣＣＡＣＡＣ’口’　（Ａ ＣＣＴｒＣＡＡＡ１１０１ＴＣＡＴＣＣ丁にＣＡＡＣｎＣＡＣＣＴｆｌ；ＴＣＡ ＣＣＡＡＣＣＣｎｃＡＴｃｎｃｃＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣ！１５１　ＣＣＡＣＣ二 ＧＡＡ　ｖｃｃＡｃｃＡｃＴｃ　ｕｃｃｃｃ＾ＧＴに　Ｇ＾Ｃ＾ＣＡＧＣ＾＾＾ ＴＣＣＣ＾Ｇロゴ１２０１　にＴＧＡＡＣ（ｍ　ＣＣＡにＴＯ（ＡＣＡ　ＣＣＣ ｎＣＴＣＣＡ　Ａ（ＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＣＣＴＡＣＡＴ（１２５１ＡＡＴｒＣ ＴＣｎＣＣＴＡＣＴＩＩ；ＣｎＣＴＣＧＣＡｆｌ；ｍｃ　ＣＣｎＡＴＧＣＣＴ　 ＣＣＡＧＣＴ（：ＴＧＡ１３０１　ＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴ　ＣＡＧ（ＡＣＣＣｎ 　ＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡ　ＣＣＣＡＴＣＣＡＡＡ　ＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴ１３５ １　ＣＴＣＣＣＣＣＣＡＣ＾ｃｃｃ、ｃｋｃＴｃｃ　にＡＣＡＡＣＣＡＣＡ　Ａ にＣＣＣＡＣＡＴＣＴ（：ＡＡＣＣＴＣＴ（：１４０１　ＡＣＡＴＣＣＣＦＡＴ Ｇ　ＣＴにτ〔Ｃ＾ＣＣＡ　ｃｃｃｃｃｃｃＡＡｃ　ｃｃｍｃｃＴｃＡＧＣＴＧ ＴＧＣＴＣＡ２４５１’　ＡＴＣＴＴＣＡＡＴＣＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡ　ＡＡＴ Ｃ：、ＣＡＴＣＣＡ　Ｃ（、ＣＴＴＣ’口′＾Ａ　ＴＣＧＴＣ（ＡＡＡＴ２６０ １　ＴｒＴｒＡＣＴｒＧＣＡＴｒｆ−ＡＡＴＡＴＡ　ＴＴＡＴＡＡＴＣＴｒ　Ｃ ＣＡＴＡＣＴｒＣＴ　ＴＣＡＴＴＣＡＡＴＡ２６５１　（ＡＡにＴＣＴＧＣｉＴ 　ＡＣＣＧＡＣＴｒＡＡ　ＡＡＡＡＣＴＴＣＴＡ　ＡＡＴＣＣＴＧＴ（Ａ　ＡＣ ＴＡＴＧＡＴＡＴ２８０１　ＡＣＣＡＡ（：ＣＣＡＴ　ｃＡＴＣＴＴＡＡＣＣＡ ｌｌ；ＡＡＴＡＡＡＣＴ　ＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴ　ＴｒｒＡＣＴＡＣＡＣ３１５ １ＴＣＡＣＣＡＴＣＴ＾　＾＾＾ＧＡＣＴＣＡＴ　ＣＴＯＣ丁ＡｃＡＴｒ　ＴＴ ＴＡＡＣＣ入ＡＴ　ＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴ３父Ｌ　ＡＡＡＣＡＣ；ＡＣＡＴ　Ｃ ＴＣＡＴＡＡＣＣＡ　ＴＣ＾ＣＭＣ＾ｃｃ　ＡｃＡｃｃｎｃττＴＴ患ｃｃｃｃ ｃ３５５１　ＡＣＡんμ＾ＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴ＾＾ＣＡＣＡＣＡＡＣＡ＾（ ＴＡ（ＴＣＴにＡＴ　ＣＡＣＣＣＴＡＴＣＴ３６０１　ＡＴＣＧＡＡＴＡＣＡ　 ＣＴＧＴＴＡｎｎ　ＣＴＴＴＣＡＡＡ’口’　ＣＴＴＴＡＡＣＴｆｌ：Ｔ　ＴＣ ＴＡＡＡＴＡＴＴ３６５４　ＴＡＴにＴ人＾＾ＣＴ　ＣＣ＾■＾Ｃ＾λＡ　ＴＴ ＡＧ（ＴにＴＣ，Ｔ　ＧＡＡ＾丁ＡｃｃＡｃ　ＴｃＴｃｃｍｃｙ３７０１　ＣＴ ｎＣＡｆｌ；Ｔｎ　ＴＡＴｒＣＡＣＡＡＴ　ＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴ　ＡＪｌｉＣ ＴＴＡＡＡＡＴ　ＡＴＴＴＴＡＴＡＡＴ３７Ｓ１　丁ロゴＡＡＡＣＴＡ　ＴＡＴ ＡロゴＡ’口’　ＴＡＡＧ（’口“＾ＴＯＴＣ，ＬＣＡＣＣＴＡＴ　ＴｒＣＡＣ ＡＴＡＡＣ３ＲＯＩ　Ａ（ＴＡＴＡＡＡ（’；Ｑ　ＴＴＣＡＣＡＡＴＡＡ　ＡＴ ＣτＧＣＴＴＡＴ　ＣｍＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ３８５１　＾ＡＡ Ａ 本発明はまた、以下のＤＮＡ配列を有する、ＥＬＡＭ−１をコードしている配列 を含有しているクローンされた遺伝子に関するものである。

１００１　ＣＡＡＣＣＣ＾＾（ＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＣＴＣＡＣ＾τｃｃＡｃ　 ｃｃｃｃｃｖｃｃｃｃ　ｃＡｃｃｃｖｃＡｃ＾１０５１　ＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴ 　ＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴｒＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＣＴＴ　ＣＡＣＣ ＴｒＣＡＡＡｌｌｏｌ　τｃＡＴｃｃ’ｒｃｃ＾＾ＣＴｒＣＡＣＣＴ’ＣＴＣＡ ＣＣＡＡＣＣＣＴｒＣＡＴＣＴＴＣＣ＾ＣＣＣＡ（ＣＡＣＣ１１５１ｃｃＡｃｃ ｎｃＡＡＴにＣＡＣＣ＾ＣＴＣ＾＾ｃｃｃｃ＾ＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡ　Ａ ＴＣＣＣ＾ｃｍ１２０１　ＣＴＣＡＡＣ（Ｔｒｒ　ＣＣＡＣＴＣＣＡＣＡ　ＣＣ ＣＴＴＣＴＣＣ＾＾ＣＣＣＣＣＡＩＩ：ＣＯＡＣＣＣＴＡＣＡＴＣ１４０１ＡＣ ＡＴＣ（ＣＡＴＣ（ＴＣＴＣ（Ａ（（＾ｃ〔ｃｃｃＣｃ＆Ａｃ　ｃｃｍｃｃ’ｒ ｃＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＡ１９０１　ＡＡＣＣＣＴＴＧＡＡ　ＴＣＡにＡＣＣＣ ＡＡ　ＧＣＴＡ（ＣＡＡＡ＾ｃｃｃｒｒｃｒｒ＾ｃ　＾Ｔｃｃｍ４本発明は更に 、以下のアミノ酸配列を含有している、本発明のクローンされた遺伝子を発現さ せることによって得られるＥＬＡＭ−１に関するものである。

Ｉ ＾ＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＩＩＫＥＳＣＡＷＳＹＮＴＳＴＥＡＭＴＹＤＥＡＳＡ ＹＣＱＱＲＹＴＨＬＶＡＩＱＮＫＥＥＩＥＹＬＮＳＩＬＳＹＳＰＳＹＹＷＩＣＩ ＲＫＶＮＮＶＷＶ１１ＶＧＴＱＫＰＬ　τ　ＥＥＡＫＮＷＡＰＣＥＰＮＮＲＱＫ ＤＥＤＣＶＥＩＹＩＫＲＥＫＤＶＣ＆１ＷＮＤＥＲＣ５ＫＫＫＬＡＬＣＹＴＡＡ ＣＴＮＴＳＣ５ＣＨＣＥＣＶＥＴＩＮＮＹＴＣＫＣＤＰＩＩ；ＦＳＣＬＫＣＥＱ ＩＶＮ（ＴＡＬＥＳＰＥＨＣＳＬＶＣＳ　ＨＰＬ（：ＮＦＳＹＮＳＳＣ５ＩＳＣ ＤＲＣＹＬＰＳＳ　μ　ＥＴＭＤＡＶ　τ　ＮＰＡＮＧＦＶＥＣＦＱＮＰＣＳＦ ＰＩＮＴ　τ　（ＴＦＤＣＥＥＣＦＥＬ＆ｌにＡＩＩＪＳ　Ｌ　Ｑ　ＣＴ　Ｓ　 Ｓ　ＣＮ　Ｗ　’Ｄ　Ｎ　Ｅ　Ｋ　Ｐ　Ｔ　（Ｋ　Ａ　ＶＴＣＲＡＶＲＱＰＱＮ Ｃ５ＶＲＣＳ）ＩｓＰＡＣＥＦ　τ　ＦＫＳＳＣＮＦＴＣＥＥＣＦＭＬＱＣＰＡ ＱＶＥＣＴＴＱＣＱＷ　τ　ＱＱＩＰＶＣＥＡＦＱＣＴＡＬＳＮＰＥＲＣＹ＆Ｉ ＮＣＬＰＳＡＳＣ５ＦＲＹＣ５ＳＣＥＦＳＣＥＱＧＦＶＬＫＣ５ＫＲＬＱＣＣＰ ＴＣＥＷＤＮ［ＫＰＴＣＥＡＶＲＣＤＡＶＨＱＰＰＫＧＬＶＲＣＡＨ５Ｐ　Ｉ　 ＣＥＦＴＹＫＳＳＣ＾　ＦＳＣＥＥＣＦＥＬＹＣ５ＴＱＬＥＣＴＳＱＣＱｖＴＥ ＥＶＰＳＣＱＶＶＫＣ９ＳＬＡＶＰＣＫＩＮＩＪＳＣ５ＣＥＰＶＦＣＴＶＣＫＦ ＡＣＰＥＣＶＴＬＮＣ５＾　＾　ＲＴＣＣ＾　τ　に　Ｈ＊’　ｓ　ｃＬＬＰＴ ＣＥＡＰＴＥＳＮＩＰＬＶＡＣＬＳＡＡＣＬＳＬＬＴＬＡＰＦＬＬＷＬＲＫＣＬ ＲＫＡＫＫＦＶＰＡＳＳＣＱＳＬＥＳＣＣ５７２Ｋ　Ｐ　Ｓ　Ｙ　Ｔ　＋一 本発明は更に、ＥＬＡＭ−１またはその７ラグメント、およびジフテリアトキシ ン、リシン、またはその他の細胞毒性蛋白であってよい第２の蛋白からなる融合 蛋白をコードしている、クローンされた遺伝子またはその縮重変異体に関するも のである。

本発明はまた、本発明のクローンされた遺伝子を含有しているプラスミド、本発 明のプラスミドで形質転換された宿主、および本発明の形質転換宿主によって発 現されたＥＬＡＭ−１またはそのフラグメントに関するものである。

本発明は更に、ＥＬＡＭ−１またはその７ラグメント、およびジフテリアトキシ ン、リシンまたはその他の細胞毒性蛋白であってよい第２の蛋白からなる融合蛋 白に関するものである。

本発明はまた、ＥＬＡＭ−１またはその７ラグメント、および薬学的に許容し得 る担体を含有してなる医薬組成物に関するものである。

本発明は更に、ＥＬＡＭ−１またはその７ラグメント、およびジフテリアトキシ ンまたはりシンであってよい第２の蛋白からなる融合蛋白を含有する医薬組成物 に関するものである。

本発明はまた、ＥＬＡＭ−１またはその７ラグメントを含有する医薬組成物を患 者に投与することからなる炎症の治療法に関するものである。

本発明はまた、ＥＬＡＭ−１またはそのフラグメントを含有する医薬組成物を患 者に投与することからなる再潅流後の損傷の予防または治療の方法に関するもの である。

本発明はまた、ＥＬＡＭ−１またはそのフラグメントを含有する医薬組成物を患 者に投与することからなる白血病またはリンパ腫の治療のための方法に関するも のである。

本発明はまた、ＥＬＡＭ−１またはそのフラグメントを含有する医薬組成物を患 者に投与することからなる感染症（例えば、細菌性、ウィルス性または寄生生物 性）の治療法に関するものである。

本発明はまた、ＥＬＡＭ−］またはそのフラグメントを含有する医薬組成物を患 者に投与することからなる脈管炎の治療法に関するものである。

本発明はまｆ＝、ＥＬＡＭ−１またはそのフラグメント、および薬学的に許容し 得る担体を含有してなる医薬組成物を患者に投与することからなる、腫瘍細胞の 転移的伝播を阻害するための方法に関するものである。

本発明はまた、治療的有効量のＥＬＡＭ−１特異抗体またはその抗体フラグメン ト、および薬学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与すること による炎症の治療法に関するものである。

本発明はまた、治療的有効量のＥＬＡＭ−１特異抗体またはその抗体フラグメン ト、および薬学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与すること からなる感染症（例えば、細菌性、ウィルス性または寄生生物性）の治療法に関 するものである。

本発明はまた、検出可能な量のラベルされたＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体 フラグメント、および薬学的に許容し得る担体を含有してなる医薬組成物を投与 し、ラベルを検出することからなる、患者におけるＥＬＡＭ−１の発現を検出す るだめの方法に関するものである。

本発明は更に、生物学的試料をＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメント と接触さセ、複合体が生成されたか否かを検出することからなる、試料中のＥＬ ＡＭ−１の発現を検出するための方法に関するものである。

図面の説明 第１図は、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡの酵素制限地図を示す。

第２図は、ＩＬ−１で処理後の種々の時間について、ＨＥＣ単層に対するＨ　１ ８／７の特異的結合を示すグラフである。

好ましい態様の説明 ＥＬＡＭ−１は、内皮−白血球の付着に関与する内皮細胞表面糖蛋白である。こ の付着蛋白は、ある種のサイトカインによって誘導される。ＥＬＡＭ−１は、刺 激された内皮細胞に対するネズミＭａｂ（Ｈ４／１８およびＨ１８／７）の特異 的結合によって確認される。

Ｈ４／１８およびＨｌ　８／７の抗原結合によって認識される、抗原の誘導の時 間的順序および代謝阻害剤に対するその発現の感受性は、白血球の付着について 観察されｊ；それと同様てあっｔ；。ベビラクア等（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｍ 、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　４ｔｈ　Ｉｎｔ’ｌ　Ｓｙｍｐ、Ｂｉｏｌ、Ｖａｓ ｃ、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１１：１３（ＡｂｓｔｒＸ１９８６））；ボ ーバー等（Ｐｏｂｅｒ、Ｊ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

ア等（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｍ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ：Ｌｅｕｋｏ ｃｙｔｅ　Ｉｍｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｔｓ　５ｅｑｕｅｌａｅ、　５ ａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｓｙｍｐ、　（Ｈｅｎｒｙ　Ｚ、　Ｍｏｖａｔ、　ｅｄ、） 、ｐｐ、７９−９３゜ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｓ、Ｋａｒｇｅｒ、　Ｂａ５ ｉｌ、　Ｓｗｅｔｚｅｒｌａｎｄ　（１９８７））。これらの内皮細胞表面構成 物と推定される物質は、“内皮−白血球付着分子”（ＥＬＡＭｓ）と命名された 。刺激された内皮細胞によるＥＬＡＭ−１の発現は、蛋白およびＲＮＡ合成阻害 剤によってブロックされたが、シクロオキシゲナーゼ阻害剤によってはブロック されなかっｌ；。

Ｈ４／　１８　Ｍａｂは、１００ｋＤおよび１２０ｋＤの分子量を有する２種類 の生合成的にラベルされたポリペプチドを免疫沈降させた。

Ｈ４／１８およびＦ　（ａｂ’　）２７ラグメントは、活性化されたＨＥＣに対 するＨＬ−６０細胞（前骨髄球セルライン）の付着を一部分阻害したが、正常血 球の付着には影響しなかったことがわかった。対照的に、ＭａｂＨ１８／７は正 常な血液ＰＭＨの付着をブロックし、それによってＥＬＡＭ−１の指定を可能に した（ベビラクア等（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８４：９２３８−９２４２（１９８７）） 。

炎症の部位の内皮細胞におけるＥＬＡＭ−１の発現の誘導は、ヒトの皮膚の微小 血管内皮においてＭａｂ　Ｈ４／１８を使用し、炎症の部位で検出された。コト ラン等（Ｃｏｔｒａｎ、Ｒ，Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、１６４：６６１−６６６（１９８６））。

本発明は、クローンされｔ：ＥＬＡＭ−１遺伝子に関するものである。ＥＬＡＭ −１をコードしているｃＤＮＡは、培養されたヒト内皮細胞を刺激し、ｍＲＮＡ を単離し、次いで、例えば当該技術分野既知の方法に従って逆転写酵素を使用し てｃＤＮＡを製造することによって得ることができる。また、エビソームＤＮＡ を回収してもよい。次に、ｃＤＮＡまたはエピソームＤＮＡをショットガンクロ ーニングし、得られたクローンを、ＥＬＡＭ−１を認識する抗体でスクリーニン グする。別法として、相補的な、ラベルされたプローブでクローンをスクリーニ ングしてもよい。

ＥＬＡＭ−１を認識する抗体は、例えばモノカインであるインターロイキン１（ ＩＬ　１）によって活性化された、培養されたヒト内皮細胞（ＨＥＣ）でマウス を免疫することによって製造することができる。牌細胞と骨髄腫細胞を融合させ 、次にＩＬＩ−処理した対照ＨＥＣでこのハイプリドーマをスクリーニングする と、ＥＬＡＭ−１に特異的なモノクローナル抗体を選別することができる。ベビ ラクア等（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｍ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　４ｔｈ　Ｉｎ ｔ’ｌ　Ｓｙｍｐ、Ｂｉｏｌ、Ｖａｓｃ、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１１： １３（ＡｂｓｔｒＸ１９８６））；ポーバー等（Ｐｏｂｅｒ、Ｊ、Ｓ、、　ａｔ 　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：１６８０−１６８７（１９８６）） ；ベビラクア等（Ｂｅｖｉ　Ｉａｃｑｕａ、Ｍ。

Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｉｍｍｉｇｒａｔｉｏｎ 　ａｎｄ　Ｉｔｓ　５ｅｑｕｅｌａｅ、　５ａｔｅ１１ｉｔｅ　Ｓｙｍｐ、　（ Ｈｅｎｒｙ　Ｚ、　Ｍｏｖａｔ、　ｅｄ、）、　ｐｐ、７９−９３．　ｐｕｂｌ ｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｓ、Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａ５ｉ１．５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ（ １９８７））；ベビラクア等（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８４：９２３８−９２４２（１ ９８７））参照。この目的のためにとりわけ有用なモノクローナル抗体には、Ｈ ４／１８およびＨ１８／７がある。

ＥＬＡＭ−１に対する抗体は、組換ＥＬＡＭ−１またはＥＬＡＭ−１７ラグメン トでマウスを免疫することによっても製造することができる。″ＥＬＡＭ−１７ ラグメント”とは、分子のポリペプチドサブセントを意味する。とりわけ好まし いＥＬＡＭ−１７ラグメントは、白血球−結合フラグメントおよび補体−結合フ ラグメントを包含する。白血球−結合または補体−結合フラグメントは、種々の 制限酵素またはエキソヌクレアーゼでＥＬＡ、Ｍ−１遺伝子を切断し、得られＩ ；フラグメントをクローニングし、当該技術分野既知の方法によって白血球まｔ ；は補体結合活性についてスクリーニングすることによって入手することができ る。別法として、適当なコンピュータープログラムによってＥＬＡＭ−１の構造 を分析し、抗原性領域を確認し、当業者既知の蛋白合成法によってＥＬＡＭ−１ ７ラグメントを製造することも可能である。従って、本発明は更に、ＥＬＡＭ− １７ラグメントによる動物の免疫によって得た規定された特異性を有する抗体に 関するものである。

ライゲーションのための平滑末端または付着末端を使用し、適当な末端を得るｔ ；めに制限酵素消化し、望ましくない結合を回避するために適当なアルカリおよ びホスファターゼ処理のようにして付着末端を充填し、適当なりガーゼでライゲ ートする常法に従って、種々のＤＮＡ７ラグメントを結合させる。遺伝子構築物 は、組換蛋白の効率よい発現を可能にするｊ−めのリーダー配列をコードしてい てもよい。

組換ＥＬＡＭ−１を発現させるために、適当な宿主エレメントによって認識され る転写および翻訳シグナルが必要である。哺乳動物細胞は組換蛋白分子に正しい ホールディングおよび適当な部位でのグリフシル化という翻訳後修飾を与える。

本発明の方法で使用し得る哺乳動物細胞は、ＣＯ５細胞、チャイニーズハムスタ ー卵巣（ＣＨＯ）細胞、白血球、骨髄種細胞、または例えばＥＢＶ−形質転換細 胞の様なその他の形質転換されたかまたは腫瘍形成性の白血球、ＶＥＲＯの様な 線維芽細胞起源の細胞またはハイブリドーマ５Ｐ２１０−ＡＧ１４またはミエロ ーマＰ３ｘ６３Ｓｇｈのような類リンパ球起源の細胞、およびその誘導体を包含 する。その他の宿主には、ＢＨＫ細胞およびヘパドーム（肝癌）細胞がある。

通常、宿主細胞と適合し得る種由来のレプリコンおよびコントロール配列を含有 しているベクターを、宿主について使用する。ベクターは通常、レプリフン部位 、および形質転換細胞において表現型の選択を提供し得る特定の遺伝子を担持し ている。ＥＬＡＭ−１をフードしている遺伝子の発現は、その形質転換されてい ない状態のセルラインにホモローガスである得るその他の調節配列によるコント ロール下に位置させることもできる。例えば、ラクトース依存性Ｅ、ｃｏｌｉ染 色体ＤＮＡは、酵素、ベーターガラクトシダーゼを合成することによってラクト ースの利用を媒介するラクトースオペロン、即ち１ａｃオペロンを含有している 。ｌａｃコントロールエレメントは、Ｅ、ｃｏｌｉに感染性のバクテリオファー ジ、ラムダｐｌａｃ５から入手することができる。Ｉａｃプロモーター−オペレ ーター系は、ＩＰＴＧによって誘導することができる。

他のプロモーター／オペレーター系またはその一部分も、同様に使用することが できる。例えば、コリシンＥｌ、ガラクトース、アルカリホスファターゼ、トリ プトファン、キシロース等を使用することができる。

哺乳動物宿主のためには、幾つかの可能なベクター系を発現のために利用し得る 。ある種のベクターは、ウシパピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノ ウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス、レトロウィルス（Ｒ３Ｖ、 ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウィルスの様な動物のウィルス由来 のＤＮＡエレメントを利用する。ＤＮＡがその染色体に安定に組み込まれた細胞 は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にするｌまたはそれ以上のマ ーカーを導入することによって選択し得る。マーカーは膿栄養菌に代わる栄養素 要求株宿主に、例えば抗生物質、銅等の重金属のような生物致死物質に対する耐 性を付与し得る。選択可能なマーカー遺伝子を、発現させようとするＤＮＡ配列 に直接結合させてもよいし、同時形質転換によって同一細胞に導入してもよい。

ｍＲＮＡの最適合成のために、更にエレメントが必要であるかもしれない。これ らのエレメントは、スプライスングナル、および転写プロモーター、エンハンサ −１および終止シグナルを包含し得る。この様なエレメントを組み込んでいるｃ ＤＮＡ発現ベクターは、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，、Ｍｏ１．Ｃｅ１．Ｂ ｉｏｌ、、　３：２８０（１９８３））およびその他によって記載されたベクタ ーを包含する。

構築物を含有しているベクターまたはＤＮＡ配列を発現のために製造したら、Ｄ ＮＡ構築物を適当な宿主に導入することができる。

プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈澱、電気穿孔法またはその他の常法の 様な、種々の方法を使用することができる。トランスフェクション後、細胞を培 地で増殖させ、例えば前記の抗体を使用して、適当な活性についてスクリーニン グする。遺伝子が発現すると、ＥＬＡＭ−１が産生される。

形質転換された細胞を、培１１７ラスコ中、適当な栄養培地で増殖させるか、ま たは同系宿主、例えばマウスまたはラット、または免疫欠損宿主または宿主部位 、例えばヌードマウスまたはハムスターの体腔に注射することができる。具体的 には、動物の腹腔に細胞を導入し、ＥＬＡＭ−１またはそのフラグメン：・を含 有している腹水を産生させることができる。まｔ；、細胞を皮下注射し、宿主の 血液からＥＬＡＭ−１を集めることができる。ハイブリドーマ細胞と同様にして 、細胞を使用することができる。

発現されたＥＬＡＭ−１またはその７ラグメントを、発酵培地または細胞培養か ら分離し、抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフイニティクロマトグラフィー 、電気泳動等のような通常の条件によって精製することができる。

例えば、表面蛋白を含有している溶液を、ＥＬＡＭ−１に特異的な固定化抗体、 例えば前記抗体Ｈ１８／７およびＨ４／１８を含有しているカラムに通すことに よって、ＥＬＡＭ−１を精製することができる。次いで、溶離剤のｐＨを上昇さ せることによって、所望の蛋白を溶離させることができる。

ＥＬＡＭ−１またはそのフラグメントを患者に投与し、炎症を治療することがで きる。可溶性形態のＥＬＡＭ−１は、炎症の部位で、内皮に対する白血球の付着 をブロックすることができる。また、アミノ酸配列分析から誘導されたＥＬＡＭ −１の１次構造は、ＥＬＡＭ−１が補体系の蛋白に結合することを示唆している 。従って、ＥＬＡＭ−１、またはその補体まｔ；は白血球−結合フラグメントを 投与すると、補体の活性化を調節し、その病態生理学的結果を阻害する。

ＥＬＡＭ−１に対するモノクローナル抗体を患者に投与することによって、炎症 をブロックすることもできる。この様なモノクローナル抗体は、前記抗体Ｈｌ　 ８／７およびＨ４／１８を包含する。モノクローナル抗体は、例えば、免疫グロ ブリンのＦｃ部分によって免疫学的反応を最小にするＦ　（ａｂ’　）２７ラグ メントのような抗体フラグメントをも包含することができる。

潅流後の損傷の予防のためにも、ＥＬＡＭ−１またはそのフラグメントの投与を 使用することができる。動脈血栓症を治療する時、組織プラスミノーゲン活性化 因子（ｔ−ＰＡ）の様な血餅溶解剤によって再潅流を誘導するとしばしば、組織 の損傷を随伴する。この様な組織の損傷は、少なくとも１部分、多形核白血球（ ＰＭＮ）によって媒介されると教示されている。従って、ＥＬＡＭ−１，または そのフラグメント、好ましくは白血球−結合７ラグメントを投与すると、ＰＭＮ −内皮相互作用をブロックし、それによって再潅流後の損傷を低減するか、また は予防する。

また、ＥＬＡＭ−１に対する抗体を患者に投与して、ＰＭＮ−内皮相互作用をブ ロックし、それによって炎症を予防または治療することもできる。この目的に好 適な抗体は、Ｈ１８／７およびＨ４／１８またはその抗体フラグメントを包含す る。

本発明はまた、検出可能な量のラベルされたＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体 ７ラグメント、および薬学的に許容し得る担体を含有してなる医薬組成物を患者 に投与し；ラベルを検出することからなる、患者におけるＥＬＡＭ−１の発現の 検出方法に関するものである。

患者の体内で検出し得るラベルは放射線不透過のラベル、放射ラベルまたは常磁 性アイソトープを包含するが、これに限定されない。

この方法によって、患者において、種々の疾患状態と関連しているＥＬＡＭ−１ の発現の検出および位置決定が可能となる。

ＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメントを投与し、抗体がＥＬＡＭ−１ 発現の部位を決定するのに十分な時間が経過し、結合しなかった抗体が患者の１ １！慶な組織から除去されｌ；後、ラベルを検出することができる。ラベルが放 射性同位元素である場合、与えられた型の機器で検出し得る種類の放射性元素崩 壊でなければならない。更に、イン・ビポでの診断のためには放射性同位元素は 、最大の取り込みの時点でなお検出可能な程度に長いが、診断後に望ましくない 放射線量が患者に残留しない程度に短い半減期を有するべきである。抗体または 抗体７ラグメントへの放射性同位元素のカップリングは当該技術分野で既知であ り、しばしば、直接的にまたは中間官能基を使用して間接的に行われる。イン・ ビポの診断に使用し得る放射性同位元素の例は、”Ｔ　ｃ　ｓ　１２３Ｉ　ｓ目 Ｊ、１口Ｉｎ、”Ｒｕ、”Ｃｕｘ　５７Ｇａ、”Ｇａ、、”ＡｓＳ”Ｚｒおよび ２０１７１である。

イン・ビポの診断の目的のために、本発明の方法に従い、常磁性アイソトープを 使用することもできる。磁気共鳴エネルギー法での使用にとりわけ有用な元素の 例には、１　′？　Ｑ　ａ％”Ｍｎ、　””［）ｙ。

５２（、ｒ、　Ｓａｐ、がある。

血液、血清、脳背髄液等のような生物学的試料中のＥＬＡＭ−１の存在を検出す るために、種々の過程の疾患に関連するＥ　Ｌ　Ａ　Ｍ−１の発現の指標として 、ＥＬＡＭ−１に対する抗体を使用することも可能である。

抗原性物質および生物学的試料の検出および定量はしばしば、免疫検定法を利用 する。これらの方法は、検定しようとする抗原性物質、例えばＥＬＡＭ−１と、 ■またはその他のメンバーの複合体を検出可能にラベルし得る抗体または抗体群 の間の複合体の生成に基づく。本発明では、ＥＬＡＭ−１特異的抗体を通常のラ ベルで標識することができる。

即ち、本発明のこの態様では、生物学的試料を、細胞、細胞粒子または可溶性蛋 白を固定化し得るニトロセルロースまたはその他の固形支持体で地理することが できる。次いで、この支持体を適当な緩衝液で洗浄し、次に検出可能にラベルさ れたＥＬＡＭ−１特異的抗体で地理することができる。次いで、固相支持体を緩 衝液で２回洗浄し、結合しなかった抗体を除去することができる。結合した抗体 上のラベルの量を、常法によって検出することができる。

ＥＬＡＭ−１、またはその表面にＥＬＡＭ−１を発現している細胞を含有してい る試料に対して本発明の検定を行う場合、本方法は＝（ａ）ＥＬＡＭ−１または その表面にＥＬＡＭ−１を発現している細胞を含有していると予想される試料と 固体支持体を接触させて、ＥＬＡＭ−１またはその表面にＥＬＡＭ−１を発現す る細胞を固定化し： （ｂ）該固体支持体と、検出可能にラベルされたＥＬＡＭ−１特異的抗体を接触 させ； （ｃ）該検出可能にラベルされたＥＬＡＭ−１特異的抗体と該支持体を、固定化 されたＥＬＡＭ−１またはその表面にＥＬＡＭ−１を発現する細胞にＥＬＡＭ− １特異的抗体を結合させるのに十分な時間、インキュベートシ： （ｄ）工程（ｃ）で得たインキュベーション混合物から固相支持体を分離し； （ｅ）結合したラベルを検出し、それによって、ＥＬＡＭ−１またはその表面に ＥＬＡＭ−１を発現する細胞を検出および定量することからなる。

別法として、試料中のラベルされたＥＬＡＭ−１特異的抗体／ＥＬＡＭ−１複合 体を、複合体を、免疫グロブリン、例えばプロティンＡ１プロティンＧ１抗−１ ｇＭまたは抗−１ｇＧ抗体に特異的な固定化されＩ；抗体または蛋白と接触させ ることによって反応混合物から分離することができる。この様な抗−免疫グロブ リン抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルとすることができる。次いで 、固体支持体を適当な緩衝液で洗浄し、固定化ＥＬＡＭ−１／ラベルされたＥＬ ＡＭ−１特異的抗体の複合体を得ることができる。次に、融合蛋白上のラベルを 検出して、内在しているＥＬＡＭ−１の測定値を得、それによって、刺激された 内皮細胞の程度を得る。

本発明のこの態様は、 （ａ）ＥＬＡＭ−１を含有していると予測される試料と、ＥＬＡＭ−１に結合す るＥＬＡＭ−１特異的抗体またはそのフラグメントを接触させ； （ｂ）複合体が生成されるが否かを検出することからなる、試料中のＥＬＡＭ− １またはその白血球−結合フラグメントを検出するための方法に関するものであ る。

本発明は更に、 （ｃ）工程（ａ）で得Ｉ；混合物と、固相支持体に固定化され、ＥＬＡＭ−１特 異的抗体に特異的な抗体、プロティンＡまたはプロティンＧの様なＦｃ結合分子 を接触させて、ＥＬＡＭ−１／ＥＬＡＭ−１特異的抗体である固定化抗体複合体 を得：（ｄ）工程（ｃ）で得た固相支持体を洗浄して、結合しなかったＥＬＡＭ −１／ＥＬＡＭ−１特異的抗体複合体を除去し；（ｅ）ＥＬＡＭ−１特異的抗体 上のラベルを検出することを含む、試料中のＥＬＡＭ−１またはその白血球−結 合フラグメントの検出法に関するものである。

もちろん、検出可能にラベルされた抗体およびＥＬＡＭ−１の比濃度、イン等ユ ベーンクンの温度８よび時間、およびその池の検定条件は、試料中のＥＬＡＭ− １の濃度、試料の性質等を包含する種々の因子によって、異なり得る。当業者な ら、通常の実験法による各試験のＩ；めの効果的かつ最適の検定条件を決定し得 るであろう。

個々の状況に通例であるように、または必要に応じ、洗浄、撹拌、搬とう、濾過 等のようなその他の工程をこの検定に加えてもよい。

ＥＬＡＭ−１特異的抗体を検出可能にラベルし得る方法の１つは、これを酵素に 結合させることである。この酵素は、後にその基質に接触させると基質と反応し て、例えば分光測光法、蛍光測定法、または視覚的方法によって検出し得る化学 的部分を形成するであろう。

ＥＬＡＭ−１特異的抗体を検出可能にラベルするために使用し得る酵素は、マレ イン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイド イソメラーゼ、イーストアルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロホス フェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラデ ィツシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グル コースオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアー ゼ、カタラーゼ、グルコース−■−ポス７エートデヒドロゲナーゼ、グルコアミ ラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを包含するがこれに限定されない。

ＥＬＡＭ−１特異的抗体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンタ ーまたはオーディオラジオグラフィーの使用の様な手段によって調べ得る放射活 性なアイソトープでもラベルすることができる。本発明の目的にとりわけ有用な アイソトープは、１Ｈ１＋２Ｊ、　＋３１■、３２Ｐ１０ｓｓ　”Ｃ％”Ｃｒ　 Ｓコ＠Ｃ１％”Ｃｏ。

５ｍｃｏ、ｓａｐ　ｅおよび７１　Ｓ　ｅである。

ＥＬＡＭ−１特異的抗体を蛍光性化合物でラベルすることもできる。蛍光的にラ ベルされた抗体を適当な波長の光にさらすと、染料の蛍光によってその存在を検 出することができる。最も一般に使用される蛍光ラベル化合物には、イソチオシ アン酸フルオレセイン、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロ フィコシアニン、０−７タルデヒドおよびフルオレスカミンがある。

１′２Ｅｕ又はその他のランタニド系列のような蛍光放射金属を使用して、ＥＬ ＡＭ−１特異的抗体を検出可能にラベルすることもできる。ジエチレントリアミ ン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属 キレート基を使用し、これらの金属をＥＬＡＭ−１特異的抗体に結合させること ができる。

ＥＬＡＭ−１特異的抗体は、これを化学発光化合物にカップリングさせることに よっても検出可能にラベルすることができる。次いで、化学反応の間に生じる発 光の存在を検出することによって、化学発光で標識されたＥＬＡＭ−１特異的抗 体の存在を調べる。とりわけ有用な化学発光ラベル用化合物の例は、ルミノール 、イソルミノール、セロマチイックアクリジニウムエステル、イミダゾ−ｊｌｚ 。

アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。

同様に、本発明のＥＬＡＭ−１特異的抗体をラベルするために、生物発光化合物 を使用することができる。生物発光は、触媒性蛋白が化学発光反応の効率を上昇 させる生物学的系で見いだされる化学発光のタイプである。発光の存在を検出す ることによって、生物発光蛋白の存在を調べる。ラベルの目的に重要な生物発光 化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。

例えば、検出可能なラベルが放射活性なガンマ線（ｅｍｉｔｔｅｒ）である場合 はシンチレーションカウンターによって、例えば、ラベルが蛍光物質である場合 は蛍光計によって、ＥＬＡＭ−１特異的抗体を検出することができる。酵素ラベ ルの場合、酵素のための基質を使用し、比色分析法によって、検出することがで きる。基質の酵素的反応の程度を同様に調製した対照に比較し、視覚的に比較す ることによっても、検出を行うことができる。

ＥＬＡＭ−１またはその白血球−結合フラクションを患者に投与し、内皮組織に 対する白血球腫瘍細胞または非白血球腫瘍細胞の付着を予防することもできる。

即ち、ＥＬＡＭ−１またはその白血球−結合フラグメントの投与は、腫瘍細胞の 転移的伝播を予防するであろう。また、ＥＬＡＭ−１に対する抗体、または抗体 フラグメントを投与し、内皮組織に対する腫瘍細胞の付着をブロックし、それに よって、転移的伝播を阻害することができる。

また、ＥＬＡＭ−１またはその白血球−結合フラグメントを、ＥＬＡＭ−１のた めのレセプターを発現している腫瘍細胞に結合して腫瘍細胞を殺生し得る化学療 法薬物とカップリングさせることができる。従って、本発明はまた、例えば、抗 −腫瘍剤とカップリングされたＥＬＡＭ−１またはその白血球−結合フラグメン トを患者に投与することからなる白血病の治療法に関するものである。この様な 抗腫瘍剤は、例えばジフテリアトキシンまたはりシン、毒性レクチンの様な細菌 毒素を包含することができる。

従って、本発明は更に、ジフテリアトキシンまたはりシンからなる第２の蛋白に カップリングされたＥＬＡＭ−１またはその白血球−結合フラグメントを含有し てなる融合蛋白に関するものである。

組換手段によって、ジフテリアトキシンの７ラグメントＡを含をスる融合蛋白を 製造するための方法は、米国特許第４，６７５．３８２号（１９８７）に教示さ れている。ジフテリアトキシンは、２本のポリペプチド鎖を含有している。Ｂ鎖 は細胞表面のレセプターに毒素を結合させる。Ａ鎖は事実上、細胞質に入り、Ａ 　′ｒ　Ｐの加水分解を伴ないながらリポソームをｍ　ＲＮ　Ａに沿って転位さ せる因子である伸長因子２、を不活化することによって蛋白合成を阻害する。ダ ーネル等（Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｂｏｏｋｓ、　Ｉｎｃ、、　ｐａｇｅ、６６２（１９８６））を参照されたい。

好ましい態様では、本発明の融合蛋白は、ＥＬＡＭ−１またはその白血球−結合 ７ラグメント、およびジフテリアトキシンのＡＩ！［ヲ含有する。

ＥＬＡＭ−１は、微生物感染症の治療にも有用である。種々の微生物（細菌、リ ケッチア、ボレリア、種々の寄生生物、およびウィルス）ハ、おそら＜ＥＬＡＭ −１依存性のメカニズムによっテ血管内皮に結合することがある。従って、ＥＬ ＡＭ−１またはその白血球−結合フラグメントを患者に投与し、結合標的分子と してＥＬＡＭ−１を認識する微生物の結合を予防し、それによって、微生物感染 症を治療することができる。

また、ＥＬＡＭ−１に対する抗体または抗体フラグメントを投与し、内皮組織の 微生物レセプターをブロックすることもできる。従って、本発明は更に、ＥＬＡ Ｍ−１に対する抗体まｌ；は抗体７ラグメントを患者に投与することからなる微 生物感染症の治療法に関するものである。

本発明は更に、抗菌薬にカップリングさせたＥＬＡＭ−１またはそのフラグメン トを含有する医薬組成物を投与することからなる微生物感染症の治療法に関する ものである。このようなコンジュゲートは、抗菌薬を血管感染の部位に特異的に 輸送し、局在させる。

このような抗菌薬は前記のようなりシンまたはジフテリアトキシンを包含し、自 滅酵素阻害剤としてはだら（ハロゲン化アミノ酸を含有することができる。ソー パー等（Ｓｏｐｅｒ、Ｔ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５２：３１７０−３１７５（１９７７Ｘβ−クロロアラニン））： コロニツチュ等：１３１３−１３２１（１９７８Ｘβ、β−ジフルオロアラニン およびβ、β、β−トリフルオロアラニン））参照。

本発明はまた。ＥＬＡＭ−１またはその７ラグメントを患者に投与することによ る脈管炎の治療法に関するものである。最近の証拠は、ある槍の形態の脈管炎に おける組織の損傷は、誘導された内皮表面蛋白に関連していることを示唆してい る。従って、ＥＬＡＭ−１は、血管壁の抗体−媒介性まＩ；は細胞−媒介性損傷 のための標的となり得る。

ＥＬＡＭ−１またはそれに構造的にホモローガスな分子は、胚形宏／器官発達− 新形成（腫瘍細胞による発現があり得る場合）；創傷／組織再生；および関連す る過程における、細胞−細胞相互作用の媒介に関与しているかもしれない。従っ て、ＥＬＡＭ−１またはそのフラグメントの投与は、これらの過程の研究のため の治療用介入物および／または診断用手段として有用である。

ＥＬＡＭ−１分子またはその７ラグメント、またはＥＬＡＭ−１に対する抗体お よび抗体フラグメントを、薬学的に許容し得る担体ビヒクルと混合する様な既知 の方法によって、医薬的に有用な組成物に製剤化することかでさる。好適なビヒ クルおよびその製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１６ｔｈ　ｅｄ、）、　０ｓｏｌ。

Ａ、（ｅｄ、）、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｅａｓｔｏｎ　（１９３ Ｑ）に記載されている。有効な投与のために好適な薬学的に許容し得る組成物を 製造するためには、このような組成物に治療的有効量のＥＬＡＭ−１，ＥＬＡＭ −１の７ラグメント、またはＥＬＡ、Ｍ−１に対する抗体または抗体７ラグメン トを単独でまたは好適量の担体ビヒクルと一緒に含有さゼる。

炎症、再潅流後の損傷、白血病、リンパ腫、微生物／寄生生物感染、脈管炎の治 療、または腫瘍細胞の転移的伝播の阻害のために使用する場合、医薬組成物は、 ｌｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ患者の本発明のＥＬＡＭ−１％ＥＬＡＭ−１の７ ラグメント、または融合蛋白を含有することができるが、より高いかまたはより 低い投与量も可能である。炎症、微生物／寄生生物感染、再潅流後の損傷、白血 病、リンパ腫、脈管炎の治療、または腫瘍細胞の転移的伝播の阻害のために使用 する場合、医薬組成物は、ｌｐｇ／ｋｇ〜１．　Ｏｍｇ／　ｋｇのＥＬＡＭ−特 異的抗体またはその抗体フラグメントを含有し得るが、より高いかまたはより低 い投与量も可能である。

更に、作用の持続時間をコントロールするＩ；めに、薬学的方法を使用すること ができる。放出制御製剤は、本発明のＥＬＡＭ−１゜ＥＬＡＭ−１７ラグメント またはＥＬＡＭ−１に対する抗体または抗体フラグメントとコンプレックス形成 するか、または吸着させるためにポリマーを使用することによって、得ることが できる。コントロールされた輸送は、適当な高分子（例えば、ポリエステル、ポ リアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロ ース、カルボキシメチルセルロース、プロタミンサルフェート、まＩ；はラクタ イド／グリフライドコポリマー）を選択することによって達成することができる 。薬物放出の速度は、このような高分子の濃度を変えることによってもコントロ ールすることができる。作用の持続時間をコントロールするための他の可能な方 法は、ポリエステノ呟ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクタイド／グリフライ ドコポリマーまたはエチレンビニルアセテートコポリマーのようなポリマー物質 の粒子に治療薬を含有させることである。

または、例えばコアセルベーション法、または界面内ポリマー化、例えばそれぞ れ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルまｔ二はポ リ（メチルメタクロレート）マイクロカプセルの使用によって製造されｔ；マイ クロカプセルへまたはコロイド薬物輸送系、例えばリポソーム、アルブミンマイ クロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、ナノカプセル、また はマクロエマルジョンに治療薬を封入することが可能である。このような方法は 、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ 　（１９８０）に開示されている。

ＥＬＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１の７ラグメント、またはＥＬＡＭ−１に対する抗体 まｔ；は抗体７ラグメントを、当該技術分野周知の手段によって患者に提供する ことができる。導入のためのこのような手段は、経口手段、鼻腔的手段、皮下手 段、筋肉的手段、静脈内手段、動脈内手段、または非経口的手段を包含する。

これまで本発明を一般的に記載しｔ；ので、本明細書に含まれるある種の具体例 を参照するとよりよく理解されるであろう。これらの具体例は、特に断らない限 り、本発明の例示のみを目的とし、本発明の限定を意図するものではない。

実施例 ｒｌＬ　１β（５Ｕ／ｍｌ）で２時間処理した、培養されたＨＥＣから得たＲＮ Ａを使用し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーをＣＯＳ細胞 にトランスフェクトし、Ｍａｂｓ　Ｈｌ　８　／　７およびＨ４／１８を使用し て、ＥＬＡＭ−１エピトープを発現している細胞を単離した。エピソームＤＮＡ を回収し、細菌（ｍｃ　１０６１ｐ３）中で増幅し、更に２回、発現−選択（ｅ ｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ−ｐａｎｎ　ｉｎｇＸシードおよびアル）才（Ｓｅｅｄ、 Ｂ、、　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ、Ａ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、（ＵＳＡ）８４：３３６５−３３６９（１９８７）；アルフオおよびシード （Ａｒｕｆｆｏ、Ａ、、　ａｎｄ　５ｅｅｄ、Ｂ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８４：８５７３−８５７７（１９８７）を行い、ｐ ＥＬＡＭ−１と呼称されるｃＤＮＡクローンを得た。間接免疫蛍光オヨび免疫ペ ルオキシダーゼによって検出した時、ｐＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた ＣＯ５細胞はＭａｂ　Ｈｌ　８　／　７およびＨ４／１８の両者と反応するが、 対照のＭａｂと反応しない分子を発現する。

ＭａｂＨ１８／７は、生合成的にラベルされた、ｒＩＬ　１で刺激されたＨＥＣ からＭｒ　１１５．０００および９７．０００の２種のポリペプチドを免疫沈降 させたが、対照ＨＥＣからは沈降させなかった。生合成的にラベルされｔ＝、ｐ ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＯ５細胞から、同様の質量の２種の蛋 白（Ｍｒ１０７゜０００および９７，０００）を得た。低い方の分子量のＣｏＳ 細胞産物は、前記の観察（シードおよびアル７　才（Ｓｅｅｄ、Ｂ、、　ａｎｄ 　Ａｒｕｆｆｏ、Ａ、。

Ｐｒｏｃ　、Ｎａ　ｔ　ｌ　、Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ　、　（ＵＳＡ）８４　： 　３３６５−３３６９（１９８７）　；アル７オおよびシード（Ａｒｕｆｆｏ、 Ａ、、　ａｎｄ　５ｅｅｄ、Ｂ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ ＵＳＡ）８４：８５７３−８５７７（１９８７））と一致しており、これはグリ コジル化の変化を反映しているのかもしれない。ＣＯ５細胞およびＨＥＣ由来の 免疫沈降物の両者をＮ−グリコシダーゼＦ（Ｎ−グリカナーゼ）（Ｎ−Ｇ）ｙｃ ａｎａｓｅ。

Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｃ、、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ））で処理し、Ｎ一連結し た炭水化物を採取すると、電気泳動によってＭｒ７７．０００のポリペプチドに 対応する１つのバンドが得られた。これらのデータは、組換ＣＯ５細胞由来のＥ ＬＡＭ−１のポリペプチドのバックボーンが天然の内皮細胞由来のＥＬＡＭ−１ のそれと同等であることを示唆している。

更に、これは、生合成的にラベルされた細胞から免疫沈降された２種は同一のポ リペプチドバックボーンを有し、翻訳後修飾が異なるという仮説と一致する。こ の仮説は更に、ｒＩＬ−１βで刺激されたＨＥＣおよびｐＥＬＡＭ−１でトラン スフェクトされたＣＯ５細胞を使用する、パルス−チェイス生合成的ラベル実験 によって支持される。両者の場合、ラベルは最初、より低い分子量の蛋白（Ｍｒ ９７．０００）に関連して見られ、次いで、より高い分子量形態へのこのラベル の明らかな”チェイシング（追跡）”が見られる。要約すると、これらのデータ は、抗−ＥＬＡＭ−Ｉ　Ｍａｂで免疫沈降された２種が、前駆体および産物とし て関係していることを強く示唆している。

第１図に示されるように、ｐＥＬＡＭ−１は３．８５ｋｂであって短い５″非翻 訳領域、１．８３０塩基の読み取り枠、および比較的長い（１，９ｋｂ）３’非 翻訳領域を有することがわかった。ＥＬＡＭ−１および３′非翻訳領域をコード しているｃＤＮＡのヌクレオチド配列を以下に示す。

１００１　ＣＡＡＣＣＣＡＡＣＧ　ＴＣＴ人＾ＡＣＣ丁ＣＴＣ＾〔＾ｙｃｃＡｃ 　ｃｃｃｃｃｒｃｃｃｃ　ＣＡＣＣＣＴ（＾Ｃ＾１０５１　ＡＴＣｆｌ；ＣＴＣ ＴＣＴ　ＣＡＧｆｌ；ＴＧＣＡＱＣＣＡＴＴＣＣＣＣＴＧ　ＣＴＣＣＡＧＡＣＴ ｒ　ＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡｌｌｏｌ　ＴＣＡＴＣ（ＴＧＣＡ　Ａ（ＴＴＣＡＣＣ ＴＧ　ＴＧＡｆｌ；ＣＡＡＧＣＣＴｒＣＡＴＣＴｒｌｌ；ＣＡｌｌ；ＣＣＡＣＣ ＡＣＣ１１５１ＣＣＡＣＧｎＣＡＡ　ＴＣ（ＡＣＣＡＣＴ（ＡＡＣＯＧＣＡＣＴ ＣＧＡＣＡＣＡＧＣ＾＾　＾ｖｃｃｃＡｃｍ１４５１　ＴＴＣＣＣＣＴＡＴｒ　 Ｃ１ＧＡＧＡＡＴｒＣＡ　ＣＣＡＣＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧ ＣＴＯＴＣ１６０１ＡＣＣＡｃＣＧＡＴＴ　Ｔ（２ＡＡＴＴＡＴＡＴ　ＣＣＡτ （ＡＡＣＴＣＡＡＣ’口’＋２ＡＣＴ（ｉ　ＣＡＣＡＴＣＴＣＡＣ１８５１ＣＣ ＣＡＡＡＴＣＣＴ　ＴＡＣＣＩ：ＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＴｒＴ　ＣＴｒＣＣ ＴＣＣＣＡ　ＣＣＡＧ；ＣＴＧ（ＣＡ２００１　ＡＡ（ｉｎＡＡｃＡｃ　ＡＣＡ ＣＡＧＡＴＡＡ　ＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＣｎＣＣＣ Ｔ２１５１　ＣＴＣＴＴＣＣＣＴｒ　ＴＣＣＴＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣ Ａ　ＡＡＧＴＣＴｒＣＧＣＴＡＡＴＣＡＡＣＣＣ２３０１ＣＡＡＡＣＡＣＡＡＴ 　ＡＴτＴＴＣＴＣＣＣ丁口’ｃｍｃｎ　ｒｒｃｃｃｃｒｒｃＡｃＡｃｖｃｍｃ ｃ２３５１　ＡＣＡＣ（ＴＣＡ’口’　ＡＣＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＴ（ＡＴＡＡ ＣＡ　ＡＴＧＡＡＴＡＡＴＡ　ＡＴｒＡＴＣＣＡＣＡ２４０１　ＣＴＴｒＡＣＡ ＣＧＡ　ＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡｎ　ＡＴＡＡＣＴＴＡＡＡ　Ａ ＡＡＡτＣＡＣＡＧ２４５１　ＡＴＣｎＣＡＡＴｆｌ；　（ＣＣＡ（ＡＣ２ＣＣ Ａ　ＡＪσＣＣＡＴＣＣＡ　ｃｃｃｒｒｃｍＡＡ　Ｔ（２０ＴＣＣＡＡＡＴ２９ ０１　ＴＴτＣτ＾Ｔ＾′口’　ＣＴＣＡＧＡＴ＾“ロ′丁ロ了ＣＡＣＡＡＡ　 Ｔ＾■ＣＴＧＣＩＴＴ　ＣＣ＾ＣＣＡＴＣ＾＾３１６１　ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡ 　ＡＡＡｃＡＣＴＣＡＴ　ＣＴＱＣＴＡＣＡＴｒτＴＴＡＡＣＣＡＡＴ　ＣＡ＾ ＣＡＴＣＴＣＴ３８５１　＾＾＾＾ ＥＬＡＭ−１をコードしているｃＤＮＡのヌクレオチド配列を以下に示す。

８０１　ＣＡＡＡＡＧＡＣＴＣＣＴ（ＣＴＡＴｒ（ＣＡＣ（ＣＴＣＣ＾＾Ｔ　に ＴＣＣＴｒＣＡＧＴ　ＣＴＣＡＴＣＣＴＣＴｇｓＩＣＡＣＡＪ、ＡＴＣＣＡ　ｃ ｃｃ＋ｕＴｃｃｔＴ　ＴＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴｒｒＣＣＡＡＡＡＣＣσＣＣＡＡ ＣＣＴ１００１　ＣＡＡＣ（ＣＡＡＣＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＣＴＣＡＣ＾丁ＣＣ ＡＣＣＣＣＣＧＴＣＣＣＣ（ＡＣＣＣＴ（ＡＣＡｌｏｓｌ　＾ｙｃｃｃＴｃｖｃ ｙ　ｃＡｃｃＴｃｃＡｃｃ　ｃＡｎｃｃｃａｃ　ｃ丁ＣＣＡＣＡＩＩ：Ｔｒ　Ｃ ＡＣＣＴｒＣＡ＾＾１１０１　ＴＣＡＴ（ＣＴＧＣＡ　ＡＣｎＣＡＣＣＴＣＴＣ ＡＣにＡＡＣＣＣＴｒＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣ（ｉＣＡ（ＣＡＣＣ１！５１　（Ｃ ＡＣＣＴＴＣＡＡ　ＴＣＣＡＣＣＡＣＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＣＡＣ ＣＡＡ　ＡＴＣＣＣ＾Ｃ■＋”０１　ＣＴＣ；ＡＡＧ（ＴｒＴＣＣＡＣＴＣＣ＾ 〔＾ｃＣｃｒｒｃＴｃｃ＾＾ｃｃｃｃｃＡｃｃｃ　ＡｃｃＣｒＡｃＡｖｃ１２５ １　ＡＡＴＴＣＴＣＴｒＣＣＴＡＣＴＣ（ＴＴＣＴＣＣＣＡＣｍＣＣＣＴＴＡＴ ＣＣＣＴ　ＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡ１４０１　ＡＣｉＡＴＣ（ＣＡＴＣ（ＴｃＴＣ （Ａ（（Ａ　Ｃ（Ｃ（（ＣＣ＆ＡＧ　ＣＣｍＣＣＴＣＡ　Ｃ１ｌ；ＴＣＴＣＣＴ ＣＡＥＬＡＭ−１の翻訳されたアミノ酸配列を以下に示す。

Ｉ ＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＣＡＷＳＹＮＴＳＴＥＡＭＴＹＤＥＡＳＡ Ｙ（ＱＱＲＹＴＨＬＶＡＩ（ＩＪＫＥＥＩＥＹＬＮｓＩＬＳＹＳＰＳＹＹＷＩＧ ＩＲＫＶＮＮＶＷＶＷＶＣＴＱＫＰＬＴＥＥＡＫＮＷＡＰＧＥＰＮＮＲＱＫＤＥ ＤＣＶＥＩＹＩＫＲＥＫＤＶにＭＷＮＤＥＲＣ５ＫＫＫＬＡＬＣＹＴ　＾　＾Ｃ ＴＮＴＳＣ５ＣＨＣＥＣＶＥＴＩＮＮＹＴＣＫＣＤＰＣＦＳＣＬＫＣＥＱＩＶＮ ＣＴＡＬＥＳＰＥＨＣ５ＬＶＣ５ＨＰＬＣＮＦＳＹＮＳＳＣ５ＩＳＣＤＲＧＹＬ ＰＳＳＭＥＴＩＪＱＣＭＳＳＣＥＩＳＡＰＩＰＡＣＮＶＶＥＣＤＡＶＴＮＰＡＮ ＣＦＶＥ（ＦＱＮＰＣ５ＦＰＷＮＴＴＣＴＦＤＣＥＥ（：ｆ”ＥＬＭｃＡＱＳ　 Ｌ　Ｑ　ＣＴ　Ｓ　Ｓ　ＣＮ　Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ｅ　Ｋ、Ｐ　Ｔ　ＣＫ　Ａ　ＶＴＣ ＲＡＶＲＱＰＱＮＣ５ＶＲＣ５Ｈ５ＰＡＣＥＦＴＦＫＳＳＣＮＦＴＣＥＥＣＦＭ ＬＱＣＰＡＱＶＥＣＴＴＱＣＱＷＴＱＱＩＰＶＣＥＡＦＱＣＴＡＬＳＮＰＥＲＣ ＹＭＮＣＬＰＳＡＳＣ５ＦＲＹＣ５ＳＣＥＦＳＣＥＱＣＦＶＬＫＧＳＫＲＬＱＣ ＧＰＴＣＥＶＤＮＥＫＰＴＣＥＡＶＲＣＤＡＶＨＱＰＰＫＧＬＶＲＣＡＨ５ＰＩ ＣＥＦＴＹＫＳＳ（ＡＦＳＣＥＥＣＦＥＬＹＣ５ＴＱＬＥＣＴＳＱＣＱＶＴＥＥ ＶＰＳＣＱＶＶＫＣ５ＳＬＡＶＰＣＫＩＮＭＳＣ５ＣＥＰ’１ＦＧＴＶＣＫＦＡ ＣＰＥＣＷＴＬＮＧＳＡＡＲＴＣＧＡＴＣＨＶＳＣＬ　Ｌ　Ｐ　Ｔ　ＣＥ　Ａ　 Ｐ　Ｔ　Ｅ　Ｓ　Ｎ　Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　Ａ　ＣＬ　Ｓ＾　＾　ＧＬＳＬＬＴＬＡ ＰＦＬＬＷ　Ｌ　ＲＫＣＬＲＫＡＫＫＦＶＰＡＳＳＣＱＳＬＥＳＤＣ５ＹＱＫＰ ＳＹＩＬ ｐＥＬＡＭ−１の翻訳されたアミノ酸配列は、トランスメンブラン蛋白の典型的 特徴を示唆している。例えば、細胞外ドメインは、１１個のＮ一連結可能なグリ コジル化部位を有している。

Ｍａｂ　ｌ　８　／　７は、活性化されたＨＥＣ単層に対するＰＭＮ（＞５０％ ）およびＨＬ−６０細胞（〉６０％）の付着を阻害する。ペビラクア等（Ｂｅｖ ｉｌａｃｑｕａ、Ｍ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８４：　９２３８−９２４２（１９８７）。これらの 研究から、ＥＬＡＭ−１は、白血球表面レセプターのためのリガンドとして作用 することによって白血球の付着を促進し得ると思われる。この仮説は更に、クロ ーンされたＥＬＡＭ−１を使用するこの研究によって支持される。ｐＥＬＡＭ− １でＣＯ８細胞をトランスフェクトすると、ＨＬ−６０細胞の付着を促進する。

免疫ペルオキシダーゼ染色から、ＥＬＡＭ−１のＣｏＳ細胞発現とＨＬ−６０細 胞の付着の直接的相互関係がわかった。

Ｍａｂ　ＨＬ　８　／　７は、ｐＥＬＡＭでトランスフェクトされたＣｏＳ細胞 に対して、増加された付着を低減（１００±３％阻害、平均値±ＳＥＭ、３回の 実験）することがわかった。

実施例４ 天然のＥＬＡＭ−１の発現 これまでの研究は、非刺激ＨＥＣはＥＬＡＭ−１をわずかしが、または全く発現 しないことを証明しＩ；。ベビラクア等（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ。

Ｍ、Ｐ、、　ａｔ　ａｔ、）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　 ＵＳＡ　８４：９２３８−９２４２（１９８７）。

ＨＥＣ単層をｒ　Ｉ　Ｌ　１　（５Ｕ／ｍｌ）またはｒ　ＴＮＦ（２００Ｕ／ｍ ｌ）で４時間処理すると、抗−ＥＬＡＭ−１沈降可能な種を産生じた。

リンフォトキシン（２００Ｕ／ｍｌ）および細菌性エンドトキシン（ｌＯｕｇ／ ｍｌ）で、同様の結果が得られた。ＨＥＣをＩ　Ｆ　Ｎ（２００Ｕ／ｍｌ）で処 理した後には、ＥＬＡＭ−１の誘導は観察されなかった。

ＲＮＡブロー／　ｔ・分析は、ｒｌＬ−１まｊ；はｒＴＮＦで２時間処理したＨ ＥＣにおいて３　、９　ｋｂの主要な種を示し、これは、非刺激およびＩＦＮ− 刺激されたＨＥＣには存在しなかった。ＨＥＣ単層をｒＩＬ−１に連続的に接触 させると、ＥＬＡＭ−１の発現は１−２時間で開始し、４−６時間でピークを有 して急速に増加し、次に、２４時間までに基準レベルに低下する。第２図に示さ れるように、免疫結合検定で検出した時、ＥＬＡＭ−１の内皮細胞表面の発現は 、ＥＬＡＭ−１ｍＨＭＡの発現と時間的に相関する。即ち、ＥＬＡＭ−１の内皮 細胞発現は、ｒｌＬ−１およびｒＴＮＦを包含する幾つかのメディエータ−によ って誘導することができる。これらの効果は時間依存性であり、少なくとも一部 分、転写レベルで現れる・胎盤由来のゲノムＤＮＡのプロットハイブリダイゼー ションは、シングル−コピーの遺伝子と一致するパターンを示した。

結論 ＥＬＡＭ−１は、補体レセプター１（ＣＲＩ）、補体レセプター２（ＣＲ２）、 補体因子ＨおよびＣ４結合蛋白、およびβ２−グリコプロティンＩのような幾つ かの補体−結合蛋白を包含する種々の補体結合蛋白に配列相同性を有する新規な 細胞表面糖蛋白である。これらの相同性は、類似した蛋白の７アミリーの存在を 示唆している。

ＥＬＡＭ−１の翻訳されたアミノ酸配列は、リーダー配列を包含するトランスメ ンプラン蛋白の典型的特徴を示す。細胞外ドメインは１１個のＮ一連結可能なグ リコジル化部位を有し、エンドグリコシダーゼＨを用いる研究は、Ｎ一連結しｊ ；炭水化物が成熟内皮性ＥＬＡＭ−１の全分子量（Ｍｒ　１１５．０００）の約 ４０％の原因であることを示唆している。更に、これらの研究は、パルス−チェ イスラベル法と共に、抗−ＥＬＡＭ−ＩＭａｂによって、活性化されたＨＥＣか ら免疫沈降された２種のポリペプチドは、同じポリペプチドバックボーンを構成 成分とし；２種間の分子量の相違はおそらく炭水化物製造のレベルにおける翻訳 後修飾に関係するらしいという強い証拠を提供する。

ＥＬＡＭ−１の誘導可能な発現は、白血球−血管壁相互作用でのその役割におい て非常に重要であるかもしれない。データは、ＩＬ−１およびＴＮＦを包含する がＩＦＮ−を包含しないある種の炎症／免疫サイトカインが内皮細胞に作用し、 ＥＬＡＭ−１の生合成および発現を誘導することを示している。ＲＮＡプロット 分析は、Ｅｌ−ＡＭ−１の誘導は大部分、転写レベルで起こることを示唆してい る。Ｍａｂ　Ｈ４／　１８についてのこれまでの研究は、種々の病態生理学的環 境におけるＥＬＡＭ−１の病巣内皮発現を証明しＩ；。

本発明を十分説明したので、当業者には、本発明またはそのいずれかの態様の範 囲に影響することなく、広範かつ等価な範囲の条件、処方、およびその他のパラ メーターで本発明を行い得ることが理解されるであろう。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．治療的有効量のＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメント、および薬 学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与することからなる炎症 の治療法。 ２．治療的有効量のＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメント、および薬 学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与する二とからなる微生 物感染の治療法。 ３．該微生物感染が細菌性、ウイルス性、または寄生生物性感染である請求の範 囲２に記載の方法。 ４．治療的有効量のＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメント、および薬 学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与することからなる再灌 流後の損傷の治療法。 ５．治療的有効量のＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメント、および薬 学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与することからなる白血 病またはリンパ腫の治療法。 療的有効量のＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメント、および薬学的に 許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与することからなる、腫瘍細胞 の転移的伝播を阻害するための方法。 ７．治療的有効量のＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメント、および秦 学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与することからなる脈管 炎の治療法。 ８．検出可能な量のラベルされたＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメン ト、および薬学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を患者に投与し；ラベ ルを検出することからなる、患者におけるＥＬＡＭ−１の発現を検出するための 方法。 ９．ＥＬＡＭ−１特異的抗体または抗体フラグメントと試料を接触させ、複合体 が生成されたか否かを検出することからなる生物学的試料中のＥＬＡＭ−１の発 現を検出するための方法。 １０．該抗体がＨ１８／７またはＨ４／１８である請求の範囲１−９のいずれか に記載の方法。