JPH04501660A - 増強された細胞増殖、培養寿命および生産物発現のための細胞培養培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 増強された細胞増殖、培養寿命および 生産物発現のための細胞培養培地 本発明は、動物細胞培養の一般的分野に属する。より詳しくは、本発明は、動物 細胞の培養並びにそれから誘導される天然および組換え物質の生産のための改良 培地に関する。 現在まで、細胞培養増殖を最大にし、それによって得られる生成物の収量を増加 させるような培養条件を開発するための努力がなされている。動物細胞の培地の 開発における初期の研究は、迅速な細胞増殖を達成するような培地の調製に集中 した（Ｗｈｉｔｅ、　Ｐ、Ｒ，、１９４６，Ｇｒｏｗｔｈ、　１０　：　２３１ −２８９　：および−ａｙＩｌｌｏｕｔｈ、　Ｃ，、１９７４＋　Ｊ、Ｎａｔｌ 、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　５３　：　１４Ｌ）３−１４４８　）。そのよ うな培地は、特定の栄養素、特に糖、アミノ酸、ビタミン、塩を含み、そして成 る場合には微量金属イオン、プリンおよびピリミジンを含むことがある。それら の培地は、最も頻繁には動物血清が補足される。今日、哺乳動物細胞培養のため に広く使われている幾つかの基礎培地としては、Ｈａｎｄｓ　Ｆ−１２，Ｄｕｌ ｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（Ｄ？ＩＥ）　、ＲＰＭ１１６４０およびｌ５ｃ ｏｖｅ改良ＤＭＢが挙げられる。 ハイブリドーマ細胞系を使ったヒトモノクローナル抗体の生産を、細胞培養にお ける生産物発現の一例として本出願において用いることにする。 モノクローナル抗体の生産のための低血清および無血清噛乳動物細胞培養用に特 別に開発された培地が既に記載されている。そのような無血清培地の１つは、１ ９８３年４月１３日に発行されたヨーロッパ特許公告０７６．６４７号に開示さ れている。 微量元素のような補足物およびビタミンのレベルを変更し、そして精製タンパク 質ホルモン添加物を含めることにより、別の培地が開発されている。そのような 培地に対する参考文献として、例えば、Ｂａｒｎｅｓ、　Ｄ−＋ら、１９８０． 　Ｃｅ旦、　２２　：　６４９−６５５　；　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、−ル、ら、 １９８３＋　Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、＋　５６　：２２１−２３４　； 　ｌ５ｃｏｖｅ、　Ｎ、ら、１９７８．　Ｌｌｌ」仰、１４７　：　９２３−９ ３３　；　ｌ（Ｂｗａｍｏｔｏ、　Ｔ、ら、１９８３＋　Ａｎａｌ　ｔｉｃａｌ 　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒ　＋１３０　：　４４５−４５３　；　Ｋｏｖａｒ 、Ｊ、ら、１９８４．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋７　：　３３９　３ ４５　；　Ｍｕｒａｋａｍｉ、　Ｈ，ら、１９８３＋　Ａｒ　ｉｃ　Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、。 ４７（８）　：　１８３５　１８４０　ＨＭｕｒａｋａｍｉ、　Ｈ，ら、１９８ ２．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９　：　１１５８−１１６２　：　Ｍｕｚｉｋ 、　Ｈ，ら、１９８２．　Ｉｎ對１四、坦：　５１５−５２４　；およびＷｏｌ ｐｅ＋　Ｓ、Ｄ、＋“Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。 Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓ　ｉｎ　５ｅｒｕａ＋−ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ’、　Ｊ、Ｐ、Ｍａｔｈｅｒ　 ｋｌｉＡ＋、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８４　：　Ｈａｇｉｗａｒａ、　Ｈ， ら、１９８５＋　Ｈ，Ｍｕｒａｋａａ＋ｉら（＆Ｗ）　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　ＤｅｆｉｎｅｄＥ ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　；　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−νｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ 、　１９８５の第１１７−１２２頁：　Ｔｈａｒａｋａｎ＋　Ｊ、Ｐ、ら、１９ ８６．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、　９４　：２２５　２３５　：　Ｃ ｏ１ｅ、　ｓ、ｐ、ｃ、＋　１９８７＋　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、＋　 ９７　：２９−３５　；　ＭｃＨｕｇｂ＋　ｙ、Ｅ、＋　１９８３．　ＢｉｏＴ ｅｃｂ＋山阻竺、６月／７月号：　７２−７７が挙げられる。それらの培地の全 てでないにしろほとんどに共通している成分としては、４．５ｇ／Ｌまでの濃度 のグルコース、２　４ｍＭの濃度のグルタミン、通常的１−４■／Ｌのコリン、 トリプトファンおよび他のアミノ酸が挙げられる。トリプトファンは通常２０■ ／Ｌ未満の濃度で存在する。それらの培地の幾つかは、増殖因子インスリンおよ びトランスフェリンも含有する。 抗体の収量を増加させるための努力は、細胞増殖および細胞密度を最適化する方 法に主に集中している。参考文献の一般的特徴として、マウスハイブリドーマ細 胞系からの抗体価は細胞系によって非常に変動的であり、そして典型的には１０ 〜３５０■／Ｌの範囲である（Ｌａｍｂｅｒｔ、　Ｋ、Ｌ、ら、１９８７．　Ｄ ｅｖ。 Ｉｎｄｕｓｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ！、、　２７　：　１０１　１０６）。ヒト／ ヒトまたはヒト／マウス融合からのヒトモノクローナル抗体の発現は、細胞系に よって非常に変動的であり、典型的には０．１〜２５■／Ｌの範囲である（Ｈｕ ｂｂａｒｄ、　Ｒ，、Ｔｏ　ｉｃｓ　ｉｎ　」ｎｚ　ｍｅ　ａｎｄＦｅｒｍｅｎ ｔａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　、　’ｊｐ−１皇：　１９６　２６３ ．　Ｗｉｓｅａ＋ａｎｄ。 ４０編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８ ３）＠それらの数値は、細胞増殖にとって最適である培養条件の指標である。 生産物の生産を増加させる文献からの別のアプローチは、細胞再利用または封入 方法により高い細胞密度を達成するものである。それらの方法の例としては、中 空繊維型リアクター（Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ、　Ｇ、Ｌ、ら、１９８６．　Ｂｉｏ ｔｅｃｈ、Ｂｉｏｅｎ　＋ｌ　ＸＸＶＩＩ　：６４６−６５８　、セラミックマ トリックス型リアクター（Ｍａｒｃｉｐａｒ。 Ａ、ら、１９８３．　Ａｎｎａｌｓ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　４１３　 ：　４１６−４２０　；Ｎａｔｕｒｅ、　３０２　：　６２９　６３０）；潅流 リアクター（Ｆｅｄｅｒ、　Ｊ、ら、１９８５、ハ五匙工」違中田り巨隙阻圏■ 、　ＩＩＩ　：　２４−３６）等が挙げられる。 細胞培養物からの生産物の発現を増加させるための様々な方法が探索されている が、主な論点はまだ細胞増殖の最適化にある。典型的な培地においては、最大細 胞密度に達した後は細胞が迅速に死滅する。 文献からの別の例は、少なくとも幾つかの細胞系については、培養物が増殖を停 止した後でも生産物（モノクローナル抗体）の生産が進行することを証明してい る（Ｖｅｌｅｚ、　Ｄ、ら、１９８６、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、　８６　 ：　４５−５２　；　Ｒｅｕｖｅｎｙ、　Ｓ、ら、１９８６゜同文献、５３　５ ９）　、　Ａｒａｔｈｏｏｎ、　Ｗ、ら、１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２ 　：１３９０−１３９５は、１０００リツトルのハイブリドーマ培養物が増殖期 中に約８０ｇのモノクローナル抗体を生産し、そして延長した定常／減衰期中に 更に１７０ｇの抗体を生産したことを報告している。Ｊ、Ｂｉｒｃｈら（ヨーロ ッパ特許出願第８７１００１９５号、１９８７）は、ある期間に渡り培養物に栄 養素を添加しそして培養寿命を増加させる流加培養方法を記載している。こうし て培養物からの最終抗体価が増加される。 従って、動物細胞の増殖を維持し且つ抗体を含む生成物および天然または組換え タンパク質の生産を現在利用可能な培地を使って実現され得るよりも高いレベル に刺激するであろう培地への重大な要望がある。 従って、ここに与えられる発明は、標準細胞培養培地に添加すると、細胞増殖、 培養寿命および生産物発現を増強する無タンパク質補足物（「主要補足物」）を 記載する。この補足物が無血清培地中でのハイブリドーマ細胞系を使った抗体の 生産において特に効果的であることを示す実施例が与えられる。ある例では、抗 体価が８０■／Ｌから２５０■／Ｌ以上に増加する。主要補足物とは、規定の組 合せにおいて添加すると有利であり、そして１）グルタミン、２）最小限コリン とエタノールアミンの両方を含むリン脂質前駆体、３）トリプトファン、および ４）特定の細胞系および生産しようとする生成物に必要とされる追加のアミノ酸 、から成る標準培地成分の未知の相乗的組合せである。それらの成分を個々に標 準培地に添加してもほとんど効果がないが、規定の組合せにおいて一緒に添加す ると非常に効果的であり、そして規定の成分のいずれかの削除は所望の効果を減 少させる。主要補足物中の幾つかの成分は、不要または禁止であると従来具なさ れていた濃度に添加される。規定の組合せにおいて一緒に添加すると、この補足 物は生産物の発現が持続する擬似定常期に細胞を維持することにより培養寿命を 増加させ、こうして最終生成物の力価の有意な増加をもたらす。 本発明の第二の観点は、個々にまたは様々な組合せにおいて主要補足物に添加す ると、細胞増殖および／または生産物発現の更なる改善をもたらす幾つかの追加 の成分（「クラス■試薬」）の記載である。このクラスの追加の成分に含まれる のは、還元剤、微量金属イオンおよび／またはビタミンである。 本発明の第三の観点は、前記補足物を含む無血清および血清補足培地、並びに脂 質が補足されておりそして溶質ストレスを誘導する試薬の添加と共に使用するこ とができる培地の調製である。 本発明の更なる観点は、培養の開始時に培地中に含めることができるか、または 流加もしくは連続方式で添加することができるような、上述の培地補足物を使っ た細胞の増殖方法である。得られた培地は、様々な培養方法、例えば限定的でな く、バッチ培養、流加培養、ヘモスタット培養および潅流培養において、そして 様々な細胞培養設備、例えば限定的でなく、静置フラスコ、撹拌フラスコ、回転 フラスコ、撹拌発酵槽、エアリフト発酵槽、メンプランリアクター（中空繊維、 平板膜プレート、外部ループ潅流を含む）、固定された固体支持体上に維持され た／微孔質ビーズ中に封入された細胞を有するリアクター、および所望の細胞系 の増殖または維持に適当な任意の他の形状を用いて使うことができる。 図１は、典型的な市販の培地Ｖｅｎｔｒｅｘ　ＨＬ−１中での増殖特性およびＤ ２３４により生産される抗体のレベルを示す。 図２は、細胞培養の文献中に記載の組成物を代表する標準無血清培地組成物中で の増殖特性およびＤ２３４により生産される抗体のレベルを示す。 図３は、主要補足物の試薬が補足された培地中での増殖特性およびＤ２３４によ り生産される抗体のレベルを示す。 図４は、主要補足物の試薬とクラスＩ試薬が補足された培地中での増殖特性およ びＤ２３４により生産される抗体のレベルを示す。 図５は、主要補足物の試薬とクラスＩ試薬が補足されそして脂質の補足と組合せ て使用される培地中での増殖特性およびＤ２３４により生産される抗体のレベル を示す。 図６は、主要補足物とクラスＩ補足物の試薬並びに脂質が補足された培地を使っ た流加培養において増殖させたハイプリドーマＤ２３４を示す。 本出願を通じて次の参照文献が引用され、そして読者の便宜上ここに与える。Ｉ ａｎ　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ　（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ −−Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、　Ａｌａｎ　 Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　ＮＹ＋　１９８７）は、広範な動物細胞の培養およびそれから の生産物の生産のための文献中に記載の典型的な血清含有基礎培地の組成（表７ 、５　：　７４−７５）および典型的な無血清培地の組成（表７．６：７６−７ ８　）を表にしている。それらの表は引用により本明細書中に組み込まれる。 本発明は、第一に、細胞増殖、培養寿命および生産物発現を増強するための標準 細胞培養培地と適合する無タンパク質補足物に関する。主要補足物が好ましく、 そして少な（とも部分的には、使用する試薬の未知の相乗作用により生じる利点 を有する。ｌ５ｃｏｖｅ　（Ｎ、Ｎ、ｌ５ｃｏｖｅ、　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　 Ｌｙ＋ａｐｈｏｃｙｔｅｓａｎｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ 　５ｅｒｕ＋ｎ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ　Ｓｅｒ ｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐ ｈｏｉｄ　Ｃｅ１ｌｓ中の第１６９−１８５頁）は、「各成分の濃度を個々に２ 倍および４倍にすることの効果を調べた・・・」という箇所に、細胞培養培地を 最適化する標準法を記載している。このアプローチは、細胞培養技術において広 く使われているが、成分が相乗的に作用し得る可能性や、所望の効果を生ぜしめ るのに幾つかの成分の補足物を組み合わせることが必要となり得る可能性を認識 することはできない。 第ニゲループの細胞培養試薬（クラスＩ試薬）から選択された成分は、主要補足 物と組み合わせると相乗作用して高密度への細胞増殖において特に有利な効果を 有する、より好ましい細胞培養補足物を生成することができる。 試薬のクラスおよびそれから調製できる培地補足物の詳細な記載を与える前に、 本明細書中で使用する幾つかの技術用語の簡単な定義が本発明の本質の理解を容 易にするであろう。 定−ｌ 「基礎培地」とは、本明細書では無機塩類、糖、アミノ酸、並びに所望により、 ビタミン、有機酸および／または緩衝剤の栄養素混合物または他の公知の細胞培 養栄養素を含むものと定義される。それらの試薬は、細胞増殖および再生産を維 持するのに必要である。本発明の細胞増殖培地組成物の成分である好ましい基礎 培地は、血清もタンパク質も含まない。 種々様々な市販の基礎培地が当業者に公知であり、そのようなものとしてＤｕｌ ｂｅｃｃｏｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＤＭＥＭ） 、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｍｅｄ ｉｕｍ　（ＲＰＭＩ）、ＩｓｃｏｖｅＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ 　Ｍｅｄｉｕｎ＋およびＨａｍｓ培地が挙げられる。 「ハイブリドーマ」なる用語は、免疫原の不死化細胞系と抗体産生細胞との融合 により作製されたハイブリッド細胞系について言う。その用語は、ヒト細胞とマ ウスミエローマ細胞系との融合に次いで形質細胞との融合の結果得られ、当業界 ではトリオーマ細胞系と呼称されるペテロハイブリッドミエローマ融合体の子孫 を含む意味である。従って、事実上この用語は、抗体を産生ずる任意の不死化ハ イブリッド細胞系、例えばクアドローマを包含する意味である。Ｍｉｌｓｔｅｔ ｎ、　Ｃ，ら、１９８３、　Ｎａｔｕｒｅ、　５３７　：　３０５３゜更に、バ イブリアＦ細胞系は、事実上ヒトおよびマウスを含む任意の種のものであること ができる。 ｒマイクロエマルション」なる用語は、事実上タンパク質様物質、例えば血清中 に見つかるもの、特に血清アルブミンの助けをかりることなく乳化された脂質混 合物について言及する。通常は、１９８９年１月９日に公開されたＰＣＴ出［Ｗ Ｏ３９１０１０２７中に記載の乳化剤が、マイクロエマルションを形成せしめる ために使用されるだろう。この特許出願は、そのまま引用することにより本明細 書中に組み込まれる。 本明細書中で使用する「溶質ストレス」なる用語は、増殖阻害効果または最終細 胞密度の減少、即ち最適増殖について測定されたものよりも小さい増殖速度また は最大細胞密度、をもたらすような濃度における溶質の添加について言う。しか しながら、この減少した増殖レベルにおいて発現された生成物のレベルは、（細 胞ごとの）特定の生産物の発現速度の増加または培養寿命の増加のため、最適増 殖速度において達成される発現のレベルよりも比較的大きい。通常、１９８９年 ６月１日に公開されたＰＣＴ出願ｗｏ８９１０４８６７に記載の溶質および方法 が使用されるだろう。この出願は、そのまま引用することにより本明細書中に組 み込まれる。 「擬似定常期」とは、指数増殖期の後にくる培養物増殖期間を言い、そして時間 と共に比較的遅く（指数増殖期または減衰期中と比較して）にのみ生存細胞濃度 が変化するように、細胞の増殖速度と死滅速度が同じ位である期間のことを言う 。 「細胞成長ホルモン」または「増殖因子」とは、定義される培地中での細胞の増 殖を刺激するかまたは細胞の存続を維持するような、天然に存在するかまたは遺 伝子操作された多数の分子、断片、誘導体もしくは変形体を包含する意味である 。前者の例としては、特に、トランスフェリンおよびインスリンが挙げられる。 増殖因子の例としては、特に、神経増殖因子、表皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因 子および内皮細胞増殖因子が挙げられる。動物細胞系が異なると１または複数の それらの分子に対する要求が異なること、および標準的な細胞培養技術を使って 最適なホルモンもしくは増殖因子またはそれらの混合物が容易に決定されること 、に注目することが重要である。 本発明は、試験管内における動物細胞（特に哺乳動物細胞）の一般的増殖および 維持の必要条件と両立でき、そして特に特定の細胞タイプに関係する分化した性 質の発現（例えばハイブリドーマ細胞系による増大したモノクローナル抗体の産 生）を増強するかまたは支持する。従って、本発明の補足物は、広範な用途を有 すると思われ、日常的な細胞培養に通常有用であり、その上多量の天然または組 換え細胞生産物が培養中の細胞により生産されることを所望する場合に使用され るであろう。 注」」補」層成 本発明の主要補足物（Ｐｒｉｓ＋ａｒｙ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）は、組合せに おいて１）グルタミン、２）好ましくはコリンとエタノールアミンを含むリン脂 質前駆体、３）トリプトファン、および４）特定の細胞系に要求される追加のア ミノ酸、を含む１クラスの試薬から成る。 ａ）グルタミン： 主要補足物中には、グルタミンは５ｍＭより多く、好ましくは８　２０＋ｗＭに おいて含まれる。それらの濃度が細胞培養培地中に典型的に認められるものより も有意に高いことに注目することが大切である。 グルタミンは、タンパク質合成のためのアミノ酸成分としておよび細胞培養にお ける一次エネルギー源として認識されている（−ル、ＭｃＫｅｅｈａｎ、　”Ｇ ｌｙｃｏｌｙｓｉｓ、　Ｇｌｕｔａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄＣｅｌｌ　Ｐｒ ｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ”、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏ　Ｉｎｔｒｏ、Ｒｅ　０ｒ ｊＳ＋　１９８２＋６（７）　：　６３５−６５０　；　Ｌ、Ｊ、Ｒｅ１ｔｚｅ ｒら、”Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｔｈａｔ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ。 Ｎｏｔ　Ｓｕｇａｒ、　Ｉｓ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ｅｎｅｒｇｙ　５ｏｕｒｃ ｅ　ｆｏｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　ＨｅＬａＣｅ１ｌｓ’、　Ｊ、Ｂｉｏｌｏ　１ ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　ｒ　１９７９＋　２５４（Ｂ）　：　２６６９−２ ６７６　；　Ｈ，Ｒ，Ｚｉｅｌｋｅら、”Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　Ｒｅｇｕｌａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｃｏｓｅａｎｄ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　Ｕｔｉｌｉｚａ ｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　ＤｉｐｌｏｉｄＦｉｂｒｏｂ ｌａｓｔｓ”、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏ１．、１９７Ｂ、　９５　：　４ ｌ−４８）　。 Ｆｒｅｓｈｎｅｙにより表にされた典型的培地組成の要約への参照は、標準血清 補足培地および無血清培地中にグルタミンが典型的には２または４ｍＭにおいて 含まれることを示す。対照的に、上述のように本発明の組成物は、５ｍＭより多 い、好ましくは約８−２０ｍＭに高められた量のグルタミンを含有する。 グルタミン代謝並びにグルタミンの自然分解（Ｇ、Ｌ、Ｔｒｉｓｃｈら、”５ｐ ｏｎｔａｎｅｏｕｓ　Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ 　ｉｎ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉａ″＋　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｒ＋ｔａ ｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　１９６２＋　２８　：３６０−３６４）は 共に、細胞増殖またはタンパク質生産に対して毒性であると文献中に広く記載さ れているアンモニウムイオンの放出をもたらしくＳ、Ｒｅｕｖｅｎｙら、“Ｆａ ｃｔｏｒｓ　Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　５ｔｉｒｒｅｄ Ｒｅａｃｔｏｒｓ”、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ＋　１９８６＋　 ８６　：　５３５９）　、そしてグルタミンを高濃度で添加すると毒性効果を有 するであろう（間接的にはアンモニウムイオンの生成の増加により）ことを焼入 かの研究者が論じている。焼入かの研究者は、グルタミンの欠損下で且つ代わり の基質としてグルタミン酸を用いて増殖するように培養物を改変せしめることに より（Ｊ、Ｂ。 Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、　”Ｔｈｅ　Ｕｐｔａｋｅ　ｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ ｄｓ　ｂｙ　Ｍｏｕｓｅ　Ｃｅ１ｌｓ（Ｓｔｒｎ　ＬＳ）　Ｄｕｒｉｎｇ　Ｇｒ ｏｗｔｈ　ｉｎ　Ｂａｔｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　ＨｅｍｏｓｔａｔＣｕ ｌｔｕｒｅ、　Ｔｈｅ　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｌｌｌｔ ｈ　Ｒａｔｅ”＋紅匹」Ｈ５ｏｃ、Ｌｏｎｄｏｒ、　１９６’Ｌ　１６８　：　 ４２１　４３８）、またはグルタミンの比較的一定低濃度を維持するために培養 期間を通じてグルタミンをゆっくり添加することにより（Ｍ、Ｗ、Ｇｌａｃｋｅ ｎら、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｓｔｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｅｘｃｒｅｔ ｉｏｎ　ｖｉａ　ＮｕｔｒｉｅｎｔＣｏｎｔｒｏｌ　：　Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ　Ｓ ｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔａｎｄ　 Ｃｅ１ｌ　Ｙｉｅｌｄｓ　ｏｎ　Ｓｅｒｕｍ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｏｆ　 Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ。 肛配匹画虱」旦並ｌ、　１９８６．述：　１３７６−１３８９）　、培養物中の グルタミンの濃度を最小にすることが論じられている。 上記の議論に基づいて、グルタミンの代わりにグルタミン酸または別の代替物を 用いて増殖するように順応されている細胞系には、高レベルのグルタミン酸また は他の代替物がグルタミンの代わりに補足物中に含まれるだろうことを除いて本 発明の方法がまだ適用できることが理解されるだろう。培養中のグルタミン酸の 添加によりグルタミンの低濃度が維持された状態で増殖するように順応されてい る細胞系には、培養期間に渡り増加量のグルタミンを徐々に添加することを除い て、本発明の方法を適用することができる。 最近、焼入かの研究者は培養の後期における補足的グルタミンの添加が幾つかの 細胞系の培養寿命を増加させ得ることを発見した（Ｓ、Ｒｅｕｖｅｎｙら、”Ｆ ａｃｔｏｒｓ　Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈａｎｄ　Ｍｏｎｏ ｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　５ｔｔｒｒｅ ｄ　Ｒｅａｃｔｏｒｓ”。 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９８６．８６　：　５３　５９０） 。 本発明者らは、合計で１リツトルあたり５−４０ミリモル、好ましくは約８−２ ０ミリモルの補足的グルタミンを、培養の開始時または培養期間中に添加できる ことを発見した。培養の後期、指数増殖期後の擬似定常期において、グルタミン が細胞にとっての主要なエネルギー源となり得る（即ち、グルコース消費が減衰 し得るがグルタミン消費は持続する）と思われる。本発明者らは、グルタミンの 補足は必要であるが、培養寿命の所望の増加を達成するには十分でないことを発 見した。最適な性能を得るためには、グルタミンは一次補足物の他の試薬と組み 合わせて添加しなければならない。 ｂ）リン脂質前駆体： 主要補足物は、限定的ではないがセリン、イノシトール、コリン、エタノールア ミンおよびグリセロールを含む群から選択されたリン脂質前駆体も含有する。そ れらの成分は全てリン脂質前駆体である一方で別の生化学的役割も有するので、 本発明は、提唱されるいずれかの作用機構の仮説により限定されると解釈しては ならない。 セリンは必須アミノ酸であり、そしてイノシトールは必須ビタミンであると考え られる。はとんどの細胞培養培地は、リン脂質前駆体としての役割および他の生 化学的役割に適したレベルにおいてセリンとイノシトールを含有する。 コリンは、はとんどの培地では１−４■／Ｌにおいてビタミンとして含まれる。 しかしながら、時折、コリンはより高濃度で使われている。例えば、非リンパ系 起源の細胞を増殖させるためのＨａｍ培地（Ｒ，Ｇ、Ｈａｍ、　”Ｃ１ｏｎａｌ 　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎズハムスター卵巣細胞のクローン増 殖のため、無血清培地中に１５ｍｇ／Ｌのコリンを含む。Ｂｉｒｃｈ培地（Ｊ、 Ｂｉｒｃｈら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ一連日ユ、　１９６９．　５　：　１３５−１４２ ）は、マウス繊維芽細胞の増殖のため血清培地中に２０■／Ｌのコリンを含む。 マウスＬ９２９繊維芽細胞結合組繊細胞系の培養のための−ａｙｍｏｕｔｈ　（ Ｃ，讐ａｙｍｏｕｔｈ＋″Ｒａｐｔｄ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ ｕｂｌｉｎｅｓ　ｏｆ　ＮＣＴＣＣ１ｏｎｅ９２９　ＭｏｕｓｅＣｅｌｌｓ　ｉ ｎ　ａ　Ｓｉｍｐｌｅ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉｕ ｍ″、　Ｊ、Ｎａｔｌ。 Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　１９５９．２２　：　１００３−１０１７）　Ｍ Ｂ　７５２／　１培地は、２５０■／Ｌのコリンを含む点で例外である。Ｈａｍ 、　Ｂｉｒｃｈおよび−ａｙｍｏｕｔｈは細胞増殖を支持する培地を開発したけ れども、彼らは培地中での細胞増殖により生産される生物学的生産物の生産を研 究しなかった。本発明者らは、細胞、好ましくは抗体産生細胞が、主要補足物の 他の試薬との組合せにおいて約４■／Ｌより高レベル、好ましくは約４−４０■ ／Ｌのレベルに補足されたコリンを含有する培地中で増殖しそして最大量の抗体 を分泌することを発見した。それらの濃度では、コリンは制限にならず、且つ顕 著な毒性を持たない。 エタノールアミンは、典型的には血清補足培地中に含まれない。Ｍｕｒａｋａｍ ｉ　（Ｈ，Ｍｕｒａｋａａ＋ｉら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ＋１９８２、互：　１１５８−１１６２）は、２０団のエタノールアミンが マウスハイブリドーマ細胞系の増殖を刺激することを証明している。Ｔｈａｒａ ｋａｎら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ＋　１９８６＋　９４　：　２ ２５−２３５　；　Ｃｏ１ｅら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９ ８７．９７　＝　２９　３５　；およびＫｏｖａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ＋　１９８Ｃ工：　３３９−３４５もまた、幾つかのマウスハイブリド ーマ細胞系の増殖に対して刺激性であることを見い出している。上記研究者のい ずれも、本発明者らが最適な生産物発現に必要であることを発見したような、高 レベルのグルタミン、コリン、トリプトファンおよび他のアミノ酸と高レベルの エタノールアミンとを組み合わせていない。幾つかの別の無血清培地はエタノー ルアミンを含有せず（Ｔ、Ｃｈａｎｇら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ 、　１９８（Ｌ　３９　：３６９−３７５）、そしてｌ５ｃｏｖｅによる概説（ Ｎ、Ｎ、　ｌ５ｃｏｖｅ、Ｃｕ１ｔｕｒｅｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎ ｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅ ｄｉｕｍ″。 ル江恒＋ｄｓ　ｆ虹−社工堕ニヒ甜＝　Ｃｕｌお匡ｅ　ｏｆ　Ｎ烟工東立り立Ｉ 」ｊμ虫劇ｊＣｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、、　 ＮＹ　１９８４中の第１６９−１８５頁）は必須なものとしてコリンとイノシト ールを挙げているが、エタノールアミンについては言及していない。本発明者ら は、約１−１０■／Ｌのレベルにおいてエタノールアミンを補足すると効果的で あり、そして顕著な毒性を有することなく少なくとも１０■／Ｌまでエタノール アミンを含めることができることを発見した。 コリンとエタノールアミンは、ホスホコリンとホスホエタノールアミンまたはホ スファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンを含む様々な形態で提供 することができると理解すべきである。それらの様々な形態の相対的有効性は、 そのような複合体形を取り込み（輸送し）そして代謝する特定の細胞系の能力に 依存するだろう。 リン脂質前駆体のみによる標準培地の補足は、培養寿命および生産物の生産の所 望の最大拡大を達成するのに十分でない。むしろ、リン脂質前駆体は記載の他の 成分と相乗作用する。 ｃ））リプトファン： トリプトファンは必須アミノ酸と考えられ、そして典型的な血清補足培地および 無血清培地中には２−２０■／Ｌにおいて含まれる。ただし、Ｌ−９２９細胞用 のＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ７５２／　１培地中には４０■／して存在する。焼入 かの研究者は、別々に添加される増加したレベルの各アミノ酸による補足によっ て培地を最適化しようと試みている。それらの典型として、Ｂａｒｎおよびｌ５ ｃｏｖｅ（Ｎ、Ｎ、　ｌ５ｃｏｖｅ、“Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃ ｙｔｅｓａｎｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆ ｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ”、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ伽ｎ倶ゴ逆狙」叫１肛灸且り 軸μｍ匣上旦Ｉ」立駐担状（層上ｖ中の第１６９−１８５頁）は、各々の標準ア ミノ酸による培地の補足をテストしたが、２人とも標準レベルより高いトリプト ファンの添加が刺激性となることに気づかなかった。本発明者らは、培養寿命お よび生産物力価の所望の増加を達成するのにトリプトファンの補足が不可欠であ ることを発見した。最適効果のために、トリプトファンは、文献中に典型的に教 示されているものよりも高いレベル、または２０■／Ｌより高いレベルにおいて 補足され、そして毒性効果を有することなく少なくとも１００■／Ｌまで添加で きる。 トリプトファンのみによる標準培地の補足は、所望の効果を達成するのに十分で ない。むしろ、高められた濃度のトリプトファンは主要補足物の他の成分と相乗 作用して、細胞増殖、培養寿命および生産物生産の所望の最大拡大を達成する。 ｄ）他のアミノ酸： 提案される主要補足物は、特定の細胞系からの生産物の発現にとって望ましいと 決定されたアミノ酸の配合物も含有する。 アミノ酸はタンパク質合成にとっての必須成分である。はぼ特定された成分によ る培地の補足は、増加された培養寿命、および有意に増加された期間における生 産物生産の基礎を提供する。最終生産物力価を最大にするために、それらのアミ ノ酸レベルは制限とならないように増加しなければならない。 分析化学者に既知である技術を使った消耗培地のアミノ酸分析（Ｄ、Ｈ，Ｓｐｅ ｃｋｍａｎら、”Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ　Ａｐｐａｒａｔｕ ｓ　ｆｏｒＵｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆ　Ａｍ １ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ”、ハｌ■江虹助μ山１■、　１９５８．３０　：　１１９ ０−１２０６）は、培養中に消耗されそして補足を必要とするアミノ酸を同定す る手段として使用することができる。 ｌ５ｃｏｖｅ　（Ｎ、Ｎ、ｌ５ｃｏｖｅ、　”Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐ ｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ第１６９−１８５頁）等は、各々の標準アミノ酸による 培地の補足をテストしている。典型として、ｌ５ｃｏｖｅは、テストした全アミ ノ酸（シスチンを除く）の標準レベルより高レベルでの添加が刺激性でないこと を認めている。 Ｌｕａｎ　（Ｙ、Ｔ、Ｌｕａｎら、”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｔｏ　Ｅｘｔｅｎ ｄ　Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ　ｏｆＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 ａｎｄ　Ｐｒｏｍｏｔｅ　Ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ”）は、グルタミン、必須アミノ酸（トリプトファンを含む）、ビタ ミン（コリンを含む）および血清を含有する補足物を、マウスハイブリドーマ細 胞系の培養中の様々な時点において添加することから成るバッチ培養法を記載し ている。添加を行った培地は、ウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭから成った。 この方法は、培養寿命の増加および最終抗体価の増加をもたらした。同様に、Ｂ ｉｒｃｈ（Ｊ、Ｒ，Ｂｉｒｃｈら、”Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ ’、　ＥＰＡ　ＰＣＴ／ＧＢ６１００３Ｂ３．１９８６）は、グルコース、グル タミン、必須および非必須アミノ酸（トリプトファンを含む）を含む補足物を別 のマウスハイプリドーマ細胞系の培養中に添加する流加培養法を記載している。 添加を行った培地は、同じくウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭであった。 培地中にエタノールアミンを含まないＬｕａｎおよび旧ｒｃｈに関して、本発明 者らが最適細胞増殖および生産物生産効果にとってリン脂質前駆体が非常に好ま しいと発見したことに注目することが重要である。更に、本発明者らは本発明の 補足物を流加培養および連続培養において効果的に使用できることを発見し、本 発明者らは（ＬｕａｎおよびＢ　ｉ　ｒｃｈと異なり）培養の開始時点における 補足物の含有もまた効果的である（即ち、ＬｕａｎおよびＢ　ｉ　ｒｃｈと対照 的に、培養中の栄養素の添加は本発明の補足物を用いる必要はない）ことを発見 した。従って、本発明の補足物は無血清培地で有利に使用することができる。　 ＬｕａｎおよびＢｉｒｃｈのいずれとも異なる本研究は、限定された還元剤、例 えば後述するように、細胞の生産物発現の更なる増加をもたらし得る好ましい態 様として証明したＭＴＧを含んだ。 文旦ス土拭東 主要補足物の試薬は、より好ましい細胞増殖および生産物発現特性を有する培地 を作製するために追加の試薬と組み合わせることができる。それらのクラスＩ試 薬としては、限定的でないが、還元剤、微量金属イオンおよび／またはビタミン が挙げられる。クラス■試薬の成分は、個々にまたは主要補足物の試薬の全セッ トと組み合わせて添加することができる。それらのクラスＩ試薬の使用法は、細 胞系や基礎培地組成に依存して異なるであろう。 ａ）還元剤： グルタチオンおよび関連するスルフヒドリル種の代謝はＭｅｉｓｔｅｒにより概 説されている（Ａ、Ｍｅｉｓｔｅｒ＋“ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＭｏｄｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、　５ｃｉｅｎ ｃｅ、　１９８３＋２２０　：　４７２−４７７）。Ｙａｍａｎｅ　（１，Ｙａ ｍａｎｅら、“Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆＳｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　Ｇｒｏｕｐｓ　ａ ｎｄ　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｔｅｎ５ｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅ ｒａｔｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　ＡＩｂｕ ｎ＋ｉｎ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ″。 Ｃｅ１ｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ＋　１９８２＋ユニ 　１３３−１４３）は、還元剤の添加が高酸素張力に関係する損傷から培養物を 保護することができることを示している。 幾つかの血清補足培地（例えばＲＰＭＩ　１６４０）は、１−１５■／Ｌに添加 されたグルタチオン（ＧＨ）を含有する。他の還元剤は、血清補足培地に通常台 まれない。例えば、β−メルカプトエタノール（Ｂ−ＭＥ）やモノチオグリセロ ール（ＭＴＧ）は典型的には細胞培養培地中に含まれず、そして上記のＦｒｅｓ ｈｅｙにより表にされた培地のいずれにも含まれていない。対照的に、ＭＣＤＢ 　ｉｌｏ無血清培地にはグルタチオンまたはジチオトレイトール（ＤＴＴ）が含 まれるが、幾つかの他の無血清培地（ＣＤＢ　１７０゜ＭＣＤＢ　１５３．　Ｗ ＡＪＣ，）ＩＩＴＥＳ等）では欠いている。ｌ５ｃｏｖｅの無血清培地はＧＨま たはＤＴＴを含有しない。 還元剤を含有する培地の報告はあるけれども、どの培地も主要補足物の試薬の全 部は含んでいないことに注目することが大切である。例えば、ｌ５ｃｏｖｅ　（ Ｎ、Ｎ、ｌ５ｃｏｖｅ、　”Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆＬｙａ＋ｐｈｏｃｙｔｅｓ　 ａｎｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　 Ｍｅｄｉｕｍ’＋Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｎｄ　ＬｙｍｐｈｏｉｄＣｅｌｌｓ中の第１ ６９−１８５頁）は、Ｂ−ＭＥ　（５ＸＩＯ−５Ｍ）またはＭＴＧ　（７，５Ｘ ｌ０−’Ｍ）のいずれかによるＩＭＤＭ培地の補足を勧めている。しかしながら 、ｌ５ｃｏｖｅの培地は、主要補足物の試薬に起因する細胞増殖および生産物発 現について観察される相乗効果に必要とされるエタノールアミンまたは高レベル のグルタミン、トリプトファンおよび他のアミノ酸を含有しない。更にＫａｗａ ｍｏｔｏ　（Ｔ＋Ｋａｗａｍｏｔｏ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　１９８ ３＋１３０　：　４４５−４５３）は、エタノールアミン（１０禮）およびＢ− ＭＥ（１０ｍ＞を含む幾つかの成分により基礎培地を補足している。 しかしながら、Ｋａｈａｍｏｔｏの培地は、相乗効果に必要とされる高レベルの グルタミン、トリプトファンおよび他のアミノ酸を含有しない。同様に、Ｋｏｖ ａｒ（Ｊ、Ｋｏｖａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ。 １９８４、　７　：　３３９−３４５）は、エタノールアミン（２０オ）を含有 する無血清培地を開発しているが、この培地もまた低レベルのグルタミン、トリ プトファンおよび他のアミノ酸を含み、本発明者らが見い出した相乗効果を得て いない。Ｋｏｖａｒ（Ｊ、　Ｋｏｖａｒら、”Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉ ｕｍ　ｆｏｒ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ａｎｄ　ＰａｒｅｎｔａｌＭｙｅｌｏｍａ 　Ｃｅ１ｌｓ　Ｃｕ１ｔｉｖａｔｉｏｎ　：　Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｃｏｍｐｏｓｉ ｔｉｏｎ　ｏｆＧｒｏｗｔｈ　Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ” ）は、エタノールアミンが補足されたＲＰＭＩ−１６４０ベースの無血清培地中 の可能な成分としてβ−メルカプトエタノールをテストした。この培地は、本発 明者らが最適な相乗効果に好ましいと発見した高レベルのグルタミン、トリプト ファン、他のアミノ酸またはコリンを含有しなかった。ＫｏｖａｒおよびＦｒａ ｎｋはＢ−ＭＥが有用でないと判断し、それを最終組成物から削除した。 本発明者らは、還元剤／スルフヒドリル化合物による培地の補足が培養寿命およ び生産物力価の増加をもたらすことができることを見い出した。しかしながら、 そのような補足は、完全な主要補足物と組み合わせた時に最大に効果的である。 使用される還元剤／スルフヒドリル化合物としては、β−メルカプトエタノール 、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）　、ジチオトレイトール、グルタチオン、チ オグリコレートおよびシスチンが挙げられる。より好ましいのは、ヒドロキシル 基を有するチオール分子、例えばＢ−ＭＥ　（β−メルカプトエタノール）、Ｍ ＴＣ；　（モノチオグリセロール）およびＤＴＴ　（ジチオトレイトール）であ る。最も好ましいのは、このクラスのモノチオール化合物、例えばＢ−ＭＥおよ びＭＴＧである。それらは、０．１■／Ｌより高い濃度において効果的であり、 そして少なくとも１０■／Ｌまでは毒性でない。好ましい濃度は０．５−５■／ Ｌである。 ｂ）金属イオン： 金属イオンは動物細胞培養にとって必須であり、典型的な培地中には塩および微 量元素混合物として、または血清のような不特定補足物の成分として含まれる（ Ｋ、Ｈｉｇｕｃｈｉ、”Ｃｕ１ｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ ｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ　−Ａ　Ｒｅｖ ｉｅ−”。 担ＷｙＬ七阻１．Ｍお江可状すエ、　１６　：　１１１−１３６）。主要補足物 の試薬が補足された培地においては、低い細胞密度を維持するために考案された 標準培地中に含まれているレベルにおいてのみ金属イオンを含む場合、成る種の 金属イオンの利用可能性が制限になり得るような、高い細胞密度に達し得る。従 って、本発明の好ましい態様では、特定の細胞系にとって必要であることが判明 した補足物中に金属イオンも含まれる。要求され得る高濃度では、幾つかの金属 イオンの溶解性限度が、有利な効果で添加できる最大濃度を制限することがある 。従って、より好ましい態様は、適当なキレート化剤と一緒に金属イオンを供給 することである。キレート化剤は、添加される濃度において毒性であってはなら ず、そしてそれらは十分な濃度で溶液中に保持されるが活性形において細胞に配 送されるような可逆方式において、要求される金属イオンを結合しなければなら ない。 分析化学者に周知である技術（”Ｆｌａｍｅ　Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ’、第１１ 章、　Ｈ，Ｗｉ　Ｉ　１ａｒｄら、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｏｆ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　ＶａｎＮｏｓｔｒａｎｄ　Ｃｏ、＋　１９６５中 ）を使った消耗培地の分析は、使用され補足を必要とする金属イオンを同定する ための手段として用いることができる。補足を必要とする幾つかの金属イオンと しては、限定的ではないが、カルシウム、マグネシウム、モリブデン、コバルト 、銅、マンガン、亜鉛、セレンおよび鉄が挙げられる。より広範なリストはＨａ ｍｉｌｔｏｎおよびＨａｍにより与えられている（Ｗ、Ｈａｍｆｌｔｏｎら、“ Ｃ１ｏｎａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｃｅ１ｌ 　Ｌｉｎｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉａ”。 Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１９７７、１３（９）　：　５３７−５４７）。 様々な金属キレート化剤が細胞培養において使われている。 この機能を果たし得る天然タンパク質としては、特に鉄をキレート化するトラン スフェリンおよびフェリチン、並びに様々な多価金属イオンをキレート化するア ルブミンが挙げられる。特に鉄をキレート化するために使われている別のキレー ト化剤としては、ピリドキシルイソニコチノイルヒドラゾン、クエン酸コリン、 クエン酸塩（Ｃ，ＩＩＬ　Ｔ、Ｂｒｅｈｍら、“５ｐｅｃｉｅｓＳｐｅｃｉｆｉ ｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｒｏｎ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｉｎ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ″ 、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。 Ｃｅ１１．Ｄｅｖｅｌｏ　、Ｂｉｏｌ、、　１９８８．２４（５）　：　４１３ −４１９）およびアセチルアセトネー）　（Ｌ、Ｒａ５ｎ＋ｕｓｓｅｎら、”Ｕ ｔｉｌｉｚａＸｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩｒｏｎＣｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　Ａｎｉｍ ａｌ　Ｃｅ１ｌ’、　Ｊ、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｐｈ１ｓｉｏ１．＋　１９８５＋ １２２　：　１５５−１５８）が挙げられる。本発明者らは、約１　１０ｍＭの クエン酸塩が幾つかの多価金属イオンを供給できる効果的なキレート化剤である ことを見い出した。加えて、様々な有機酸、例えばリンゴ酸、コハク酸、フマル 酸およびα−ケトグルタル酸が効果的なキレート化剤である。 。）ビタミン： ビタミンは動物細胞培養にとって必須であり、通常−胞婚壽←栴培養培地中に含 まれている（Ｋ、Ｈｉｇｕｃｈｉ、“Ｃｕｌ　ｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ　Ａｎｉｍ ａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ 　−Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ″。 Ａｄｖａｎ、Ａ　１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９７７、１６　：　１１１　 １３６）。主要補足物のみにより補足された培地においては、低い細胞密度を維 持するために考案された標準培地中に組み込まれているレベルにおいてのみビタ ミンを含む場合、成る種のビタミンの利用可能性が限定となり得るような、高い 細胞密度になり得る。 限定となり得るビタミンとしては、限定的でないが、Ｐ−アミノ安息香酸、ビオ チン、葉酸、フォリン酸、ニコチンアミド、パントテン酸塩、ピリドキシン、リ ボフラビン、フラビンアデニンジヌクレオチド、アスコルビン酸、チアミンおよ びビタミンＢ１２が挙げられる。 本発明の培地補足物を一般的に記載してきたが、ここでそれらの使用法に関係す る制限、並びに該制限を回避するための方法について議論する。 第１に、細胞を再供給しなければならない培養期間中の後期ではなく細胞に供給 される培地と容易に組み合わせることができる試薬のクラスを限定することが好 都合であるけれども、補足物により提供されるレベルに試薬の濃度を維持するよ うに培養期間中に培地に個々の試薬を添加することにより、同様な好ましい効果 が得られることは当業者により認識されるだろう。このことはグルタミンに関し て最も明白であり、グルタミンは主要補足物のその他の試薬と組み合わせて添加 することができ、またはそれから削除して個別的に添加し、所望のレベルで維持 することもできる。 第二に、様々な補足物で使用される試薬の濃度は、言及される範囲を超えて異な ることができ、そして補足物が添加される細胞培養培地並びに培養される特定の 細胞タイプの両方の関数である。 第三に、最大細胞培養効果のために補足物中に全部が存在しなければならない主 要補足物の試薬を除いて、有利な結果のためにクラスＩ試薬のうちの１つのみが 存在する必要がある。 第四に、最適な結果のためには、補足物が添加される基礎培地が目的の細胞系に 適当でなければならず、細胞増殖または生産物発現を増強するのに適切なレベル において必須栄養素が利用可能でなければならないことは理解されよう。従って 、例えば、基礎培地中のグルコース（または別のエネルギー源）のレベルを高め るか、または必須エネルギー源が消耗し、細胞増殖もしくは生産物発現を制限す ることが認められるならば、培養中にグルコース（または別のエネルギー源）を 添加することが必要となり得る。 次の実施例は本発明を説明するが、決して限定するものではない。例えば、ハイ ブリドーマと抗体は、本発明の組成物が補足された培地中で好結果に増殖できる 細胞系と収得できる生産物のそれぞれ一例である。しかしながら、そのような培 地は、ハイブリドーマの増殖または抗体の収得に限定されるのではなく、むしろ 広範な生産物を生産する種々様々な細胞の増殖に利用することができる。 災幕医上 ・　、な　の立土言。す Ｖｅｎｔｒｅｘ　ＨＬ−１は、細胞培養用の技術の現状の市販培地を代表する培 地である。商品に関する文献は、この培地は「ハイブリドーマおよびリンパ系細 胞の培養用に考案された」ことを指摘している。この培地は、多数の形質転換細 胞系および樹立細胞系の増殖、特にマウスおよびヒトハイプリドーマからのモノ クローナル抗体の生産に効果的であると主張されている。この培地中で好結果に 増殖する５５種の細胞系のリストは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｎｃｅ　ｔｓ＋　１ （１）　：５＋　Ｖｅｎｔｒｅｘ出版、２１７　ＲｅａｄＳｔ、、　Ｐｏｒｔｌ ａｎｄ、　Ｍａｉｎｅ中に与えられている。 図１は、ＨＬ−１培地におけるヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 系Ｄ−２３４の増殖および生産物発現を示す。 １２０時間目に１．３　ＸＩＯ’細胞／細胞量大生存細胞密度に達し、そしてそ の後培養物は迅速に死滅する。最大全細胞密度は２×１０６細胞／ｄである。最 終抗体価は７０■／してある。 ハイブリドーマＤ−２３４は、登録番号ＨＢ　８５９８のもとにアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（Ａｓ＋ｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。 このハイブリドーマはＩｇＭ抗体を生産し、標準的なＥｌ、ＩＳＡ技術を使って 該抗体をアッセイした。 表■の第１列は、典型的な無血清培地配合物を示す（５０％ＲＰＭＩ、　５０％ ＤＭＥ　、ウシインスリン（５■／Ｌ）、ヒトトランスフェリン（５■／Ｌ）、 セレン（５躍／Ｌ）、ｏ、ｔ％プルローｙり（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール（ Ｆｅ２））、この培地は、文献中に報告された幾つかの組成物と類似している。 図２は、表Ｉの第１列の培地中でのＤ２３４ハイブリドーマの増殖および生産物 発現を示す。増殖および生産物発現は市販のＨＬ−１培地のものと同様である。 最大生存細胞密度は１．３×１０６細胞／ｄである。最終抗体価は８０■／して ある。 １ｍ ・　をＡも・立■ 培養具間の前および最中でのグルタミンの添加表１の第４列は、主要補足物の試 薬（８ｍＭのグルタミン、１４０■／Ｌのトリプトファン、２０■／Ｌのコリン 、１０■／Ｌのエタノールアミンおよび典型的には基礎培地中の濃度のほぼ３倍 に濃度が増加された他のアミノ酸）により標準培地を補足した組成物を示す。最 初の研究において、基礎培地中のグルコースレベルが消耗され、培養物の増殖お よび寿命を制限し得ることが決定された。従って、基礎培地中に含めることに加 えて、追加のグルコースを培養期間中に添加した。更に、グルタミンを、培養の 開始時の培地への主要補足物中に含めることに加えて、供給される全グルタミン が培養物１　＋Ｊットルあたり２０ミリモルに等しくなるように４．８および１ ２日目に添加した。 図３は、この補足培地中でのＤ２３４の増殖および生産物発現を示す。１２０時 間目に１．２Ｘ１０’細胞／戒の最大生存細胞密度に達し、その後培養物は、生 存細胞密度が１００時間に渡りゆっくりとのみ減少するような細胞増殖と細胞死 滅とがほぼ平衡となる擬似定常期に維持される。全細胞密度は２．５Ｘ１０’細 胞／ｄまで上昇し続ける。細胞は擬似定常期に渡り生産物を発現し続け、そして １リツトルあたり２９０■の最終ヒト抗体価に達する。 実ＪＪＬ先 グルタミンの濃度が培養開始時に２０ｍＭになるようにグルタミンを主要補足物 中に含め、その後グルタミンを添加しないこと以外は、実施例３と同じ培地およ び条件においてＤ２３４を増殖させた。増殖および生産物発現は実施例３のもの と同等表■の第２列は、標準培地が主要補足物の試薬と１０■／Ｌのチオグリセ ロール（クラスＩ試薬）とにより補足されている組成物を示す。グルコースとグ ルタミンは実施例３と同様にして供給した。 図４は、この補足培地中でのＤ２３４の増殖および生産物発現を示す。１２０時 間目に１．９　Ｘｌ０６細胞／ｄの最大生存細胞密度に達し、その後培養物は、 生存細胞密度が１５０時間に渡りゆっくりとのみ減少するような細胞増殖と細胞 死滅とがほぼ平衡となる擬似定常期に維持される。全細胞密度は３．８Ｘ１０’ 細胞／−まで上昇し続ける。細胞は擬似定常期に渡り生産物を発現し続け、そし て１リツトルあたり２３０■の最終ヒト抗体価に達する。 表１の第３列は、典型的な細胞培養培地が主要補足物の試薬（８ｍＭグルタミン 、２８■／Ｌのトリプトファン、２２．８■／Ｌのコリン、０．８■／Ｌのエタ ノールアミン、および典型的には基礎培地のほぼ３倍に補足される他のアミノ酸 ）およびクラスＩ試薬（１■／Ｌのモノチオグルセロール、ビタミンＢ−１２、 並びにモリブデン、コバルト、銅、亜鉛および鉄を含む微量元素）により補足さ れている組成物を示す。更に、この培地は脂質（リルン酸、Ｔｗｅｅｎ　８０、 レシチン、コレステロールおよびビタミンＥ）を含有する。更に、実施例３に記 載のようにして、グルコースとグルタミンを培養期間中に添加した。 図５は、この補足培地中でのＤ２３４の増殖および生産物発現を示す。８０時間 目に１．７Ｘ１０’細胞／ｄの最大生存細胞密度に達する。その後、培養物は、 その間の増殖が最大指数増殖期増殖の約５０％で持続し、更に１５０時間に渡り ゆっくりのみ生存細胞密度が減少するような、増殖速度と死減速度とがほぼ平衡 になる擬似定常期に維持される。全細胞密度は３．５×１０６細胞／ｄまで上昇 し続ける。細胞は擬似定常期に渡り生産物を発現し続け、そしてＩＬあたり２７ ５■の最終ヒト抗体価に達する。 １指皿Ｉ ＩＤｆＬ　における　の１ 本発明の補足物は、流加培養および単純なバッチ培養において有利に利用するこ とができる。表■の第５列は、主要補足物の試薬およびクラスＩ試薬並びに脂質 により補足された標準培地を示す。この培地は実施例６のもの（表１の第３列） に類似している。 この培地を流加培養法においてＤ２３４の増殖に使用した。 １２０時間後、表■に示されるような追加の補足物を添加した。 ２２０時間後、更に５ミリモル／Ｌ培地のグルタミンを更に補足した。 図６は、補足流加培養物におけるＤ２３４の増殖および生産物発現を示す。１３ ０時間目に１．８　ＸＩＯ’細胞／細胞量大生存細胞密度に達する。その後、培 養物は、その間の増殖が最大指数増殖期増殖の約２０％で持続し、更に１５０時 間に渡りゆっくりのみ生存細胞密度が減少するような、増殖速度と死減速度とが ほぼ平衡になる擬似定常期に維持される。全細胞密度は３．７Ｘ１０’細胞／− まで上昇し続ける。細胞は擬似定常期に渡り生産物を発現し続け、そしてＩＬあ たり４７０■の最終ヒト抗体価に達する。 栄養素を上記試料と同じ全最終濃度に添加し、ただし異なるスケジュールで添加 する別の供給方法もテストした。１９０時間後に始まるほとんど等しい毎日の添 加に補足物添加を分割すると、上述したものと同様な結果を与える。ゆっくりし た連続供給も同様な結果を与える。 今まで本発明について記載してきたが、本発明が添付の請求の範囲による範囲に よる以外の何ものによっても限定されると解釈してはならないことが理解される であろう。 堰 １、アルギニン　１４２ ２、アスパラギン　２５ ３、アスパラギン酸　１０ ４、シスチン　４９ ５、グルタミン酸　１０ ６、グリシン　２０ ７、ヒスチジン　２８ ８、イソロイシン　７８ ９、ロイシン　７８ １０、リジン・Ｉ（Ｃｆｆｉ　９３ １１、メチオニン　２２ １２、フェニルアラニン　４０ １３、プロリン　１０ １４、セリン　３６ １５、スレオニン　５８ １６、トリプトファン　１０ １７、チロシン　４６ １８、バリン　５７ 表１（ｍｇ／ｌ）続き ５４２　２４６．２　７９４　１９４．１１２５　２８０．０　１２５　１５２ ．５５０　２７４．０　５０　１４２．０ ４９　５９．２　１９５　５４．１ ５０　３０８．０　５０　１５９．０ ４０　５６．０　４０　３Ｂ。 ５８　６２．４　１２０　４５．２ １７８　２１２．４　２８２　１４５．２１７８　１１２．４　２８２　９５． ２１？３　２１４．４　３１７　１５３．７５２　２１７．６　８２　１１９． ８ ７０　２３２．０　１３６　１３６．０５０　１０８．０　５０　５９．０ １３６　６８．８　９６　５２．４ 表１　（■／１）続き ９８　Ｂ６．４　１９４　７２．２ １２０　２８．０　１４０　１９．０ １４６　８６．８　１５８　６６．４ ９７　１４５．６　１９１　１０１．３表■ １、　ＣａＣ１’ｚ　４００．００００２、　Ｃａ（ＮＯｚ）ｚ　・４Ｈｚ０　 ０．００００３、　Ｆｅ（ＮＯ３）３’　９Ｈ２００，００００４、ＫＣｆｆｉ 　２４０．００００ ５、　Ｍｇ５Ｏａ　１８４．００００ ６、　ＮａＣ１！、５００．００００ ７、　ＮａＨｔＰＯａ　・Ｈｚｏ　２３２．００００８、　ＮａｚＨＰＯｍ　ｏ 、ｏｏｏ。 ９゜ １０、グルコース　５００．００００ １１、グルタチオン　ｏ、ｏｏｏ。 １２、　）ＩＥＰＥｓ　Ｏ，００００ １３、ピルビン酸Ｎａ　Ｏ，００００ １４、ＮａＨＣＯ３０，００００ １５、フェノールレッド　ｏ、ｏｏｏ。 １６゜ １７、ｐ−アミノ安息香酸　０．０６４０１８、ビオチン　０．３２００ １９、パントテン酸Ｃａ　Ｏ，００１６２０、葉酸　０．０１６０ ２１、ニコチンアミド　ｏ、ｏｏｏ。 ２２、ピリドキシンＩＣｆ　Ｏ，００００２３、ピリドキシンｌ（Ｃｆ　Ｏ，０ ８００２４、リボフラビン　０．０１６０ 表　■　続き ２５、チアミンＨＣｉ！、０．０１６０２６、ビタミンＢ１２０．０４８０ ２７゜ ２８、塩化コリン　４．００００ ２９、イノシトール　０．０８００ ３０゜ ３１、エタノールアミン　ｏ、ｏｏｏ。 ３２、グリセロール　０゜ｏｏｏ。 ３３゜ ３４、グルタミン　１６６０．００００３５、ブルロニックポリオールＦ６８　 ２００．００００３６゜ ３７、インスリン　ｏ、　ｏｏｏ。 ３８、トランスフェリン　ｏ、ｏｏｏ。 ３９゜ ４０、　ＮａｚＳｅ０３ｏ、ｏｏｏ。 ４１、　ＦｅＣｌ　３　０．００００ ４２、　ＮＨ４Ｈｏ、Ｏｚａ　・４Ｈ，００，００８０４３、ＣａＣｌ２　ｚ　 ・６Ｈ２００，０１００４４、ＣｕＣｆ　ｚ　’　２Ｈｚ０　０．０４００４５ 、　ＭｎＣｌ２　ｚ　・４ＨｚＯＯ，００４０４６、ＺｎＣｌ！、ｚ　Ｏ，００ ８０ ４７゜ ４Ｂ、　ＦｅＳＯ４・ＩＨｚｏ　０．１１００表　■　続き ４９゜ ５０、ナイアシン　０．０３２０ ５１、ヒドロキシプロリン１６０．００００５２、β−アラニン　６０．０００ ０ ５３、リンゴ酸　１０．７２００ ５４、α−ケトグルタル酸　５．９２００５５、コハク酸　０．９６００ ５６、フマル酸　０．８８００ ５７、　Ｄ　−セ＋Ｊ　７　４０．００００５８゜ ５９゜ ６０゜ ６１、ショ糖　３３０．００００ ６２、マルトース　２００．００００ ６３゜ ６４、エタノール　ｏ、ｏｏｏ。 ６５、　Ｔｗｅｅｎ　８０　０．００００６６、レシチン　ｏ、ｏｏｏ。 ６７、リルン酸　ｏ、ｏｏｏ。 Ｇ８．コレステロール　ｏ、ｏｏｏ。 ６９、酢酸α−トコフェロール　ｏ、ｏｏｏ。 ７０゜ ７１、モノチオグリセロール　２０．００００７２、グ／Ｉ／　−ｔ　−ス５０ ０．００００表　■　続き １、アルギニン　１３２．６ ２、アスパラギン　２６０．０ ３、アスパラギン酸　２６６．０ ４、シスチン　２０．０ ５、グルタミン酸　３００．０ ６、グリシン　４０゜ ７、ヒスチジン　４０．０ ８、イソロイシン　１５０．０ ９、ロイシン　５０．０ １０、リジン・ＨＣｆｆｉ　１４０．０１１、メチオニン　２００．０ １２、フェニルアラニン　２００．０ １３、プロリン　１００．０ １４、セリン　４０．０ １５、スレオニン　４０．０ １６、トリプトファン　２０．０ １７、チロシン　５０．０ １８、バリン　ｉｏｏ、。 浄書（内容に変更なし） 時間（時間） 時間（時間） 経過時間（時間） 手続補正書（方式）６゜ 平成４年１月　９日　７゜ 特許庁長官　深　沢　亘　殿　８゜ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３９８６ 平成１年特許願第５０９８９５号 ２、発明の名称 増強された細胞増殖、培養寿命および生産物発現のための細胞培養培地 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 補正の対象 図面の翻訳文 補正の内容 図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）添付書類の目録 図面の翻訳文　１通 国際調査報告 １＋＋１＠＋ｙ−電＋ｅｌＩａｌ＾帥石Ｉ曇””ＩＩＰ（、Ｔ／ＵＳ８９１０３ ９８６国際調査報告

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．培養中の細胞を長期間擬似定常増殖期に効果的に維持する量において、グル タミンまたはグルタミン酸塩、アミノ酸およびリン脂質前駆体を含んで成る、細 胞培養培地主要補足物。
2. ２．前記リン脂質前駆体が、セリン、イノシトール、コリン、エタノールアミン およびグリセロールから成る群から選択される、請求項１に記載の細胞培養培地 主要補足物。
3. ３．前記リン脂質前駆体がエタノールアミンとコリンの両方を含んで成る、請求 項２に記載の細胞培養培地主要補足物。
4. ４．前記リン脂質前駆体が複合体形において供給される、請求項１に記載の細胞 培養培地主要補足物。
5. ５．複合体形において供給される前記リン脂質前駆体が、ホスホエタノールアミ ン、ホスホコリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミ ンから成る群から選択される、請求項１に記載の細胞培養培地主要補足物。
6. ６．前記アミノ酸が、培地に添加した特約２０ｍｇ／Ｌより高く且つ約２００ｍ ｇ／Ｌより低い濃度のトリプトファンを含んで成る、請求項５に記載の細胞培養 培地主要補足物。
7. ７．グルタミンまたはグルタミン酸塩が、培地に添加した時約５ｍＭより高く且 つ約４０ｍＭより低い、請求項６に記載の細胞培養培地主要補足物。
8. ８．培地に添加した時に約４ｍｇ／Ｌより高く且つ約５０ｍｇ／Ｌより低い濃度 においてコリンが存在する、請求項７に記載の細胞培養培地主要補足物。
9. ９．約１ｍｇ／Ｌより高く且つ約１００ｍｇ／Ｌより低い濃度においてエタノー ルアミンが存在する、請求項８に記載の細胞培養培地主要補足物。
10. １０．請求項９の主要補足物を含んで成る細胞培養培地。
11. １１．成長ホルモン、増殖因子または血清を更に含んで成る、請求項１０に記載 の細胞培養培地。
12. １２．請求項１の主要補足物およびクラスＩ試薬を含んで成る細胞培養培地補足 物であって、前記クラスＩ試薬は前記主要補足物と共同作用して細胞を擬似定常 期に維持する有効量において存在し、そして還元剤、微量金属イオンおよびビタ ミンから成る群から選択される、細胞培養培地補足物。
13. １３．前記還元剤が、β−メルカプトエタノール、モノチオグリセロールおよび ジチオトレイトールから成る群から選択される、請求項１２に記載の細胞培養培 地補足物。
14. １４．前記還元剤が約０．１ｍｇ／Ｌより高く且つ約１００ｍｇ／Ｌより低い濃 度において含まれる、請求項１３に記載の細胞培養培地補足物。
15. １５．請求項１２の補足物を含んで成る細胞培養培地。
16. １６．成長ホルモン、増殖因子または血清を更に含んで成る、請求項１３に記載 の細胞培養培地。
17. １７．前記微量金属イオンが、鉄、カルシウム、マンガン、マグネシウム、モリ ブデン、コバルト、銅、亜鉛およびセレンから成る群から選択される、請求項１ ２に記載の細胞培養培地補足物。
18. １８．キレート化剤を更に含んで成る、請求項１７に記載の細胞培養培地補足物 。
19. １９．前記キレート化剤が、トランスフェリン、フェリチン、アルブミン、ピリ ドキシルイソニコチノイルヒドラゾン、クエン酸コリンおよびクエン酸塩から成 る群から選択される、請求項１８に記載の細胞培養培地補足物。
20. ２０．前記キレート化剤がクエン酸塩であり、そして約１−１０ｍＭの濃度にお いて培地中に含まれる、請求項１９に記載の細胞培養培地補足物。
21. ２１．請求項２０の補足物を含んで成る細胞培養培地。
22. ２２．成長ホルモン、増殖因子または血清を更に含んで成る、請求項２１に記載 の細胞培養培地。
23. ２３．前記ビタミンが、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、葉酸、フォリン酸、ニ コチンアミド、パントテン酸塩、ピリドキシン、リボフラビン、フラビンアデニ ンジヌクレオチド、アスコルビン酸、チアミンおよびビタミンＢ−１２から成る 群から選択される、請求項１２に記載の細胞培養培地補足物。
24. ２４．請求項２１の補足物を含んで成る細胞培養培地。
25. ２５．成長ホルモン、増殖因子または血清を更に含んで成る、請求項２４に記載 の細胞培養培地。
26. ２６．細胞を請求項１０の細胞培養培地と接触せしめることを含んで成る細胞増 殖方法。
27. ２７．細胞を請求項１１の細胞培養培地と接触せしめることを含んで成る細胞増 殖方法。
28. ２８．前記細胞が抗体産生細胞である、請求項２６の方法。
29. ２９．細胞増殖方法であって、前記細胞を細胞培養培地と接触せしめることを含 んで成り、ここで前記細胞を擬似定常増殖期に維持するために、細胞培養期間に 渡り請求項１の主要補足物の成分が個々にまたは組み合わせて前記細胞培養培地 に添加される方法。
30. ３０．細胞増殖方法であって、前記細胞を細胞培養培地と接触せしめることを含 んで成り、ここで前記細胞を擬似定常増殖期に維持するために、細胞培養期間に 渡り主要補足物およびクラスＩ試薬の成分が個々にまたは組み合わせて前記細胞 培養培地に添加される方法。
31. ３１．請求項１０の培地中で増殖させた細胞により生産された生化学物質。
32. ３２．請求項１５の培地中で増殖させた細胞により生産された生化学物質。
33. ３３．請求項２６の培地中で増殖させた細胞により生産された生化学物質。
34. ３４．請求項９の主要補足物と脂質エマルションとを含んで成る細胞培養培地。
35. ３５．前記脂質エマルションが、脂肪酸、非イオン性洗剤、リン脂質、酸化防止 剤およびコレステロールを含んで成る、請求項３４に記載の主要補足物含有細胞 培養培地。
36. ３６．請求項１４の主要補足物と脂質エマルションとを含んで成る細胞培養培地 。
37. ３７．前記脂質エマルションが、脂肪酸、非イオン性洗剤、リン脂質、酸化防止 剤およびコレステロールを含んで成る、請求項３６に記載の主要補足物含有細胞 培養培地。
38. ３８．請求項２５の主要補足物と脂質エマルションとを含んで成る細胞培養培地 。
39. ３９．前記脂質エマルションが、脂肪酸、非イオン性洗剤、リン脂質、酸化防止 剤およびコレステロールを含んで成る、請求項３８に記載の主要補足物含有細胞 培養培地。