JPH04501959A - 核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸プローブ 本発明は新規な核酸プローブ及びそれらを調製し使用するための方法及びキット に関する。

核酸の生化学的操作においては、特定の核酸物質を複合混合物から単離しこれに 非常に広範なプロセスを施すことが望ましいことが多い。標的（ｔａｒｇｅｔ） 核酸の十分に長い配列が知られている場合、その配列に選択的にバイブリド化し 、その核酸の同定及び／又は単離に使用することができるオリゴヌクレオチドを 設計することが特に有用であることが判明した。特に、そのようなプローブを不 動化して、標的核酸を含む複合混合物との接触の際に標的核酸が選択的に不動化 され、従って分離されるようにすることが提案されている。

以前より、オリゴヌクレオチドを磁性粒子に結合させることが提案されている［ 例えば、アドバンスト・マグネティックス（＾ｄｙｓｎｃｅｄ　Ｍｘｇｎｅｌｉ ｃｓ）の米国特許第４６７２０４０号、アモコ・コーポレーション（Ａｍｏｃ。

Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の欧州特許第２６５２４４号）。しかしながら、これ らは決して単分散ではなく、通常、適当な平均粒度まで微粉砕され、その後、オ リゴヌクレオチドを含む問題の生体分子の範囲への結合を可能にする官能基をも たらす物質で被覆された磁鉄鉱なら成っていた。さらに、このような磁性粒子は 特に自動化された反応系では信頼性がなく、実用上好ましくないことが証明され ている。

特に、微粉砕によって製造された微細磁性粒子はしばしば磁気的凝集に不適切に 感応し、かなりの割合が結合した生体分子とともにサスペンション中に残留し、 理論量よりも少ない生体分子の単離しか行われないことが判明１７ている。本発 明は、単分散超常磁性（ｓｎｎｏｄｉｓｐｅ＋５ｅｓｏｐｅ＋ｐｉｎｍａｇｎｔ ｔｉｃ）粒子が以前に提案された磁性粒子よりも大幅に信頼性が高いということ の発見に基づくものである。

本発明に従っ、て、本発明者らは、複数のオリゴヌクレオチドの分子を担持した 単分散超常磁性粒子を提供する。

本発明の粒子は、標的−重鎖核酸に対するハイブリッド形成用のプローブとして 使用でき、また前記オリゴヌクレオチドの塩基配列決定を可能にすることにも利 用できる。

オリゴヌクレオチドは一重鎖ＤＮＡであるのが好ましいが、それはこれがＲＮＡ と一重鎖ＤＮＡの両方に対してハイブリッド形成し、かつＲＮＡよりもかなり安 定だからである。このようなりＮＡには、オリゴ−ｄＴ　（これは自生真核生物 のＩＴＩ　ＲＮ　Ａ上に普遍的に存在するポリ（Ａ）「テール（ｔａｉｌ）Ｊと ハイブリッド形成する）及び標的ＲＮＡ及びｓ　ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子中の特定の 配列とハイブリッド形成する特異的Ｄ　Ｎ　Ａ配列が含まれ、又は塩基配列決定 用のＤＮＡ分子でもよい。各プローブは、オリゴ−ｄＴ又は特異的ＤＮＡ配列で よい一重鎖ＤＮＡ配列が磁性粒子に直接結合したものから成ることができるが、 Ｄ　Ｎ　Ａの二重鎖部分を介して磁性粒子に結合していてもよい。本明細書中で 使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、合成及び自生のあらゆる鎖長 のＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含する。

オリゴヌクレオチドの鎖長は１２乃至２００塩基（ｂａｓｅ）が好ましく、１５ 乃至５Ｇ塩基がさらに好ましい。オリゴ（ｄＴ）配列と、特定の用途では、制限 酵素部位（単数又は複数）とを含むプローブオリゴヌクレオチドは、市販のＤＮ Ａ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ　 Ｂｉｏｔ７ｓｊｅｍｔ、Ｉｎｃ、）　（ＣＡ　９４４０４、フォースターシティ −・リンカーンセンタードライブ・８５０−７　）製の各装置、のいずれかを利 用することによって最も好適に製造することができる。

本発明によるプローブは、一般に、標的核酸の単離とその後の化学的及び／又は 生化学的技術による操作において使用される。

磁性粒子を使用することによる幾つかの利点は明らかに際立っている。磁性粒子 は、標的核酸を含む混合物、例えば細胞エキス、に添加され、攪拌され、そして 磁気的にリセプタクル（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）の一方の側に引き寄せる。

液体はその後不要な成分とともに除去でき、そして、結合したＲＮＡを有する磁 性粒子は洗浄溶液中に再分散できる。洗浄工程はやつぎばやに数回繰り返すこと ができる。標的核酸を得る全工程を！５分以内で行うことができる。

別の利点は、磁性粒子を使用して行われるハイブリッド形成又はその他のいかな るプロセスも、間隔をおいて粒子を磁気的に凝集させ、粒子上の物質についてか 又は上澄液中の物質に結び付いたラベル（ｌａｂｅｌ）を分析をすることによっ て、連続的にモニターすることが容易にできるということである。

磁気的凝集を使用することによる粒子の分離は、核酸又は蛋白質を劣化させる可 能性のある剪断力を生（でる遠心分離のような従来的な分離技術よりもはるかに 穏やかである。

磁性粒子は単分散でありかつ超常磁性であり、これらの特性は、粒子が含まれる 反応の速度論に大きく寄与する。粒子に担持されたプローブが種々の反応におい て溶液中で実質的にまるで遊離状態であるかのように速く反応することは、本発 明の驚くべき特徴である。従−２て、。

例えば、磁性粒子を使用する細胞溶解物からのｒｎ　ＲＮ　Ａの全単離を約１５ 分以内に行うことができるが、これに対しアフィニティーカラム（ｉｌｌｉｉｉ １７　ｃｏｌｕｍｎ）を使用すると２時間である。単分散粒子、即ち、はぼ同じ サイズを有する粒子、を使用することによって、反応速度及びその他のパラメー ターは特に均一である。超常磁性粒子（即ち、永久磁性を維持するのに必要な磁 区（ｄｏｍａｉｎ）の大きさよりも小さい強磁性体のサブ粒子を含む粒子）を使 用することによって、反応中の粒子の凝集ｉ１ｇ＋ｅＨＮｑｎ　ｏｒ　ｃｌａｍ ｐｉｎｇ）を防ぐことができ、従って、これちまた均一かつ速い反応速度を確実 にする。従って、粒子は磁場をかけることによって表面上に均一な速度で容易に 凝集させることができるが、例えば物理的攪拌によって、その後の処理用に容易 に再分散させることができる。反応の挙動及び素速さの均一性は特に自動化への 道をもたらし、このことは、工業的製造及び／又は反復的プロセスにおいて必要 な多くの核酸操作の必須要件である。最小限の人間の介入しかともなわない適当 な機械によって、反応及び分離が完全な信頼性をもって行えるということは最も 重要な事である。

本発明において使用するのに好ましい磁性粒子は、欧州特許第８３９０１４０６ ．５号［シンテフ（Ｓｉｎｔｅｌ）］に従って製造される単分散超常磁性粒子で あり、この引例の開示は本明細書中に含まれる。これらの粒子中には、鉄が非常 に均一に分散しており、磁場に対する非常に均一な応答をもたらし、これによっ て全ての粒子が同じ速度で移動するので、再現性のある方法、特にオートメーシ ョン、を設計する際に重要である。さらに、鉄の再現性のある量が各粒子に組み 込まれているので、これを、以下で説明する範囲の粒子の比重を可能にする比較 的低い濃度に調節することができる。従来の、規則性の劣った生成物におい”Ｃ は、小粒子は、磁場がかけられた時にブラウン力（Ｂ＋ｏｖｎｉａｎ　ｆｏｒｃ ｅ）を打ち消すには少なすぎる鉄しか含んでいないか、或いはその物質の比重は より大きな粒子への望ましくない沈降を生じさせる。幾つかの自動化された装置 は、粒子を反応領域内に保持し、一方溶液は流れていかせるのに、磁場を使用し ている。この様な装置で使用するためには、磁性粒子の均一な磁気的及び粘弾性 的性質は必須のものである。

本明細書中において使用される「単分散」という用語は、５％未満の直径標準偏 差を有するサイズ分散を意味するものである。

１．１乃至１．８の比重を有する粒子を使用するのが好ましく、１．２乃至１． ５の比重が特に好ましい。本発明に従って使用される単分散粒子において、比重 はここでも特に均一であり、均一で予想可能な速度論的特徴をもたらす。

単分散粒子は、少なくとも１ミクロン、好ましくは少なくとも２ミクロンの直径 の球状粒子であるのが適切であり、１０ミクロン以下、好ましくは６ミクロン以 下、例えば約３ミクロンの直径であるのが好ましい。粒子が小さくなればなるほ ど沈降はゆっくりになり、沈降時間が反応時間に匹敵するほど長くなることもあ り、従って物理的攪拌の必要性を省ける。しかしながら、従来技術で使用されて いるような、ずっと小さい直径の微細粒子を含む平均直径が０．１乃至１．５ミ クロンの粒子は、磁化への応答において信頼性があるようには行動しない。

プローブの粒子への結合は、直接的化学結合並びにストレプトアビジン（ｓｌ＋ ｅｐｌ＆ｖｉｄｉｎ）　／ビオチン（ｂｉｏｌｉｎ）錯体などによる親和力結合 でよい。

プローブの結合用に、磁性粒子は、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、 又はアミノ基を担持してもよい。一般に、これらは、被覆されていない単分散超 常磁性粒子を処理して、上述の官能基のうちの一つを有するポリマーの表面被覆 を施すことによって設けられ、ポリマーの例は、ヒドロキシル基を与えるための ポリグリコールをともなうポリウレタン、ヒドロキシル基を与えるためのセルロ ース誘導体、カルボキシル基を与えるためのアクリル酸又はメタクリル酸のポリ マー又はコポリマー、アミノ基を与えるためのアミノアルキル化ポリマーなどで ある。米国特許第４６５４２６７号は、このような表面被覆をたくさん紹介して いる。

本発明において使用するのに好ましい被覆された粒子は、米国特許第４３３６１ ７３号、第４４５９３７８号、及び第４６５４２６７号に従う粒子の改質法によ って製造でき、これらの引例の開示は本明細書中に含まれる。従って、例えば、 スチレン−ジビニルベンゼンから製造され、３．１５ミクロンの直径を有するマ クロ網状（ｍａｃｒｏ−＋ｅｌｉｃｕｌａｒ）多孔質高分子粒子は、ＨＮＯ３で 処理され細孔の表面に−ＮＯ２基が導入された。その後、粒子は、Ｆｅ”の水溶 液中に分散された。Ｆｅ”は−ＮＯ２基によって酸化され、これは細孔の内部に 不溶性の鉄オキシーヒドロキシ化合物を析出させる。加熱後、鉄は、磁性酸化鉄 の微粉砕粒子として、細孔粒子全体にわたって存在する。ＮＯ２基はＦｅ″“と の反応によってＮＯ２基まで還元される。

細孔を満たし表面に所望の官能基を導入するためには１、別のモノマーを細孔中 及び表面で重合させる。好ましい種類の粒子の場合、表面は、−（ＣＨｚＣＨ２ ０）　ｓ−ｔ　ｏ結合を通してポリマー主鎖に結合している一ＯＨ基を有する。

その他の好ましい粒子は、メタクリル酸の重合によって得られたー〇〇〇Ｈ基を 有する。

従って、例えば、粒子中に初めから存在しているＮＯ２基を、米国特許第４６５ ４２６７号に記載されているようにジエボキシドと反応させ、その後メタクリル 酸と反応させて末端ビニル基を設けてもよい。メタクリル酸との溶液共重合は、 以下で言及するＲ４５２粒子のような、末端カルボキシル基を有するポリマー被 覆を生じる。同様に、Ｒ２４０、Ｒ４４２、及びＲ４６９ビーズのようなジエボ キシドとの反応の上記生成物をジアミンと反応させることによってアミノ基を導 入することができ、一方１１４５０及びＬ２５５ビーズのように、アミノグリセ ロールのようなヒドロキシルアミンとの反応はヒドロキシル基を導入する。

グイナビーズ（Ｄｙｎｘｂｅａｄｓ）　Ｍ４５０　（直径４．５ミクロン）（こ れはノルウェー、オス口のダイナル社から得られる）は、単量体エポキシドで被 覆されており、エポキシ基とヒドロキシ基の混合物をもたらす。しかしながら、 水との接触はエポキシ基をヒドロキシ基に転換する。

グイナビーズト２８０（直径２．８ミクロン）は、ｐ〜トルエンスルホニルクロ リドとの反応によってトシロキシ基（ｔｏｓ７１ｏＢ　ｇｒｏυｐ）に転換され ているヒドロキシル基を有するポリスチレンビーズである。

上記のタイプの官能化された被覆を使用することによっｒ、ＤＮＡ及び／又はＲ ＮＡの非特異的結合が非常に低くなり、特に、カルボキシル化ビーズの場合にそ うであることを本発明者らは発見した。

ハイブリッド形成したｒｎ　Ｒ，Ｎ　Ａを次にｃＤＮＡ合成に使用する場合、プ ローブとＲＥクリンカはカルボキシル基を介して磁性粒子に結合しているのが好 ましく、このＤ　Ｎ　Ａは初めに５′−末端アミノ基が供給され、これはカルボ ジイミドカップリング剤を使用してカルボキシルとアミド結合を形成させること ができる。ＤＮＡの５′−結合は、５′−アミノＤＮＡと反応するようにＣＮＢ ＋で活性化されたヒドロキシル化磁性粒子を使用して行うこともできる。

オリゴヌクレオチドＤＮＡの３′−結合もまた化学的合成によって行うことがで きる。ここでもまた単分散粒子の非常に均一な性質は、ジーン・アセンブラ−（ Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ＾ｓｓｅｍｂｌｕ）　［フデーマシア（Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ）　 Ａ／Ｓ製］のような自動化された合成装置中での合成に特に適する均一な反応速 度をもたらす。磁性粒子は、初めにヒドロキシル基又はプロテクトされたヒドロ キシル基を供給されることを必要とする。ダイナルＡ／Ｓ製のダイナビーズト２ ８０はこの目的によく適合する。しかしながら、必要な場合には、カルボキシル のようなその他の表面官能基を使用してヒドロキシル基を有するリンカ−又は３ ′−結合ヌクレオチドを結合させることができる。

５′−結合は、５′−アミノ−オリゴヌクレオチドのトシル活性化磁性粒子への カップリングによって行ってもよい。トシル活性化磁性粒子は、ダイナル＾／Ｓ 製のグイナビーズト２８０のようなヒドロキシル化磁性粒子をトシル化すること によって製造できる。トシロキシ基の置換は、磁性粒子に直接結合した５′−ア ミノ基を残す。

しかしながら、プローブがｍＲＮＡの単離にのみ使用される場合には、プローブ の３′末端が磁性粒子に結合してもよく、これは、ＤＮＡの３′−ホスフェート 基と粒子上のアミノ基の間にホスホルアミデート結合を形成させることによって 簡便に行うことができる。

ビオチンラベルされたヌクレオチドは市販されているので、ＤＮＡ断片の３′− 末端はＤＮＡポリメラーゼを使用して容易にラベル付けでき、これらは、例えば ヒドロキシル基を介して磁性粒子に結合しているアビジン又はストレプトアビジ ンに簡便に結合できる。ビオチンラベルは、１つ以上のε−アミノカプロン酸部 分のような、スペーサーアーム（ｓｐｘｃｅｒ　ａｒｍ）によって、ヌクレオチ ドに結合させて立体障害を最小化できる。従って、例えば、二重鎖プラスミドが 制限部位で切断され、各鎖の３′−末端にビオチンを与えるように、その末端に ビオチニル化されたヌクレオチドを付けることができる。線状化された（ｌｉｎ ｅａ＋１ｓｅｄ）プラスミドが、その後、別のＲＥ部位で切断される場合、二重 鎖ＤＮＡの部分は切除され、ストレプトアビジン被覆されたビーズに結合する可 能性がある。

ビオチニル化されていない鎖を除去するとビーズに結合した、ビオチンの結合し たヌクレオチドが残る。

一般に、粒子を官能化し、その後のプローブを結合させるのが有利であり、各磁 性粒子は１０３〜１０６のプローブを有する。（１〜３００　ｐｍｏｌｓ／ｗｇ 　）。磁性粒子の均一なサイズは、プローブが粒子と反応する際均−なプローブ 密度を確実にする点で有利である。均一なプローブ密度は、全てのプローブが、 それらが使用される様々な手順において実質的に同じようにふるまうことを確実 にする点で重要である。

酵素活性が、粒子の表面に非常に近いところ、例えば７ベース（ｂｘｓｅｇ）以 内、で起こるようであることは、本発明の顕著な特徴である。従って、もしＲＥ 部位が後述するようなリンカ−配列中に存在し、かつプローブがその後プライマ ーとして使用される場合、５ｓｃＤ　Ｎ　Ａと従ってｄ＠ｃＤＮＡを、ＤＮＡポ リメラーゼによってＲＥ部位を越えて粒子表面に向かって合成でき、従って、そ れを適当なエンドヌクレアーゼによって容易に切断できることが判明した。本発 明のカルボキシル化された粒子の場合、粒子のミクロ表面が非常に不規則であり 、ハイブリッド形成とその表面近くでの酵素活性に対する立体障害を軽減できる ような非常に大きな表面積を存在させていることが判明した。一方、このような カルボキシル化された粒子への非特異的結合は増加しない。

本発明による、オリゴヌクレオチドを担持している超常磁性単分散粒子は、広範 囲の方法において使用できる。

これらのいくつかを以下に記載する。

１、ｍＲＮＡを含む混合物からのｍＲＮＡの単離真核細胞エキスからｍＲＮＡを 得る従来的方法は、ティー・マニアチス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｌｉｓ）　らによっ て教示されている［モルキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｅｕｌａ＋ＣＩｏｎ ｉｎｇ）　ニラボラトリー−ｖニュアル（ｌａｂＯｒａｔｏ＋７ｍａｎｕａｌ） 　、１８７〜１９８ページ］。簡単に述べると、ポリデオキシチミジン（オリゴ ｄＴ　）を、親和性マトリックス、典型的にはカラム、を作るのに使用されるア ガロースビーズ又はセルロースに結合させる。

細胞エキスをカラムに通し、細胞エキスがカラムを通過するにつれて、ｍＲＮＡ のポリアデニレートテール（ｌ　ａ　ｉ　ｌ）がビーズ上に不動化されたオリゴ ｄＴに結合する。カラム洗浄し、その後ｍ　Ｎ　Ｍ　Ｒをカラムから溶出させる 。しかしながら、通常少なくとも２時間というそれに必要な時間のために、この 方法は理想からはほど遠い。

ＲＮＡの全ての種は、細胞溶解物中に存在するりボヌクレアーゼによって急速に 加水分解する傾向にあるので、細胞の溶解後できるだけ速やかに単離し、ｃＤＮ Ａに逆転写することが重要である。そうしないと、ｍＲＮＡのかなりの割合が劣 化し、完全な遺伝子のＤＮＡに対応する全長のｍＲＮＡの位置を定めるのが困難 になる。細胞エキスからｍＲＮＡを分離する従来的方法を使用すると、ｍＲＮＡ がカラム上にいる間に多くの時間が費やされ、望ましくない劣化をもたらす。さ らに、アガロース又はセルロースのカラムは汚染され、或いはさらにその他の細 胞成分によって詰まり、容易に再使用できない。

本発明の目的は、ｍＲＮＡを得て精製する迅速な方法を提供することである。

本発明の別の特徴によれば、ＲＮＡをその他の成分とともに含有する液体からＲ ＮＡを単離する方法であって、 （り結合したオリゴヌクレオチドプローブを有する複数の超常磁性単分散粒子を 前記液体に添加し、それによってＲＮＡを前記プローブに対しハイブリッド形成 させて前記粒子に結合させる工程、（ｂ）前記粒子を固体表面上に磁気的に凝集 させる工程、及び （ｃ）液体とその他の成分を凝集した粒子から分離する工程、 を含む方法が提供される。

望ましくないＲＮＡのランダムなハイブリッド形成を防ぎ、ハイブリッド化溶液 の残りの成分の除去を完全にするために、磁性粒子は最初の磁気的分離の後少な くとも１回洗浄するのが好ましい。ランダムな部分相同によって結合されたＲＮ Ａを除去するために、この洗浄はストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件 下で、温度を上昇させるか又はハイブリッド化中に使用するのよりも低い塩濃度 、例えば０，５Ｍの塩化ナトリウム又は当量溶液（ｅ−ｑｉｉｗｉｌｅｍ（５ｏ ｌｕｔｉｏｎ）　、を使用することによって行ってもよい。

ストリンジエンシー（Ｂｒｉｍ＠ｅｎＢ）は通常プローブの長さとＧ：Ｃ含有率 によって計算される。プローブオリゴヌクレオチドと標的ｍＲＮＡの間の相同（ ｈｏｍｅｌｏＢ）が不正確である場合、洗浄は比較的小さいストリンジェント条 件下で行うべきである。一般に、洗浄は、２重（＋Ｉ＠ｐｌｅｘ）の融点（Ｔｓ ）より１２℃低い温度で行われる。

大体のＴａは、上述のマニアチスの文献の３８８〜３８９頁からの以下の関係に 従って簡便に計算できる。

（ａ）　Ｔｍ・６９ｊ　＋　０．４１　（Ｇ　＋　Ｃ）％−６５０／ＬＬはヌク レオチド中のプローブの平均長さに等しい。

（ｂ）　この２重ＤＮＡのＴｍは、誤って組み合わされた塩基対の数が１％増加 するごとに１℃下がる。

（Ｃ）　（Ｔａ）ｗｚ　−（１ｍ）ｍｌ　冨　１１．５　１１４ｓｏ　ｍｌ　／ ｉ＋ここで、ｕｌ及びｕ２は２つの溶液のイオン強度で小さいオリゴヌクレオチ ドに対しては、この融点は以下のように℃の単位で近似できる。

Ｔ−・２　Ｘ　（Ａ＋Ｔ残基の数）　＋　４　Ｘ　（Ｇ＋Ｃ残基の数）ハイブリ ッド化反応は、１Ｍ塩化ナトリウム溶液又は本技術分野で公知の当量溶液中で行 うのが好ましい。

［ヌクレイツク・アシッド・ハイプリダイゼイション（Ｎｎｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄ　Ｈｙｂ＋１ｄｉｓｉｔｉｏｎ）　、ビー・ディー。

ヘイムズ（Ｂ　Ｄ　）ｌｘｍｅｓ　）及びニス・ジェー・ヒギンズ（Ｓ　Ｊ　Ｈ ｉＢｉｉｇ）、アイアールエル・プレス（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）　、１９Ｒ５、を 参照のこと］。

プローブからのｍＲＮＡの除去は、適当な緩衝液、例えば、１　ｔａ　ＥＤＴＡ ％中において６５℃で熱処理することによって行うことができる。

本発明の方法は、特定のｍＲＮＡフラクション又はさらに特定のｍＲＮＡ分子の 分離の前の予備精製工程としてのように、細胞溶解液からの全てのｍＲＮＡ物質 の分離に適用することができる。この目的のために、プローブはオリゴ−ｄＴ　 、即ち、例えば１２乃至２００塩基（ｂｘｓｅ）、好ましくは１５乃至５０塩基 のような、比較的短いデオキシチミジン単位の鎖、であるのが好ましい。

このような鎖は、デオキシチミジンの酵素的重合或いは、より短い鎖に対しては 、自動化されたＤＮＡ合成又は従来的重合によって、容易にかつ安価に製造する ことができる。

オリゴ−ｄＴは共有又は親和結合によって粒子に直接的に結合できる。この場合 、ハイブリッド化されたｍＲＮＡはその後加熱によって溶液中に遊離し、所望の 緩衝液中所望の濃度の精製ｍＲＮＡの混合物を与えを介して粒子に結合する場合 、ＤＮＡプローブの３゛−末端はまた逆転写用のプライマーとして作用して一重 鎖相補的（ｃｏｍｐｌｔｍｅｉｔａｒＹ）　ＤＮＡ　（ｓ　ｓ　ｃ　ＤＮＡ）を 形成することが可能であり、５ｓｃＤＮＡはその後、所望により、本願出願人の 英国特許出願第８８２７１５８．０号及び第１１１１２７１５９．８号に対応す る本願と同日付けの国際出願（その内容は参考として本明細書中に組み入れられ る）に従って、単離したｍＲＮＡに相補的な二重鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓｃＤＮＡ） を製造するのに使用できる。

１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位をを有するリンカ−を介してのＤＮＡプ ローブの５′−末端の結合によって、このプローブ、合成されたｄｓｃＤＮＡは 、制限酵素的切断によって粒子から遊離させることができ、粒子は磁気的に分離 される。

しかしながら、本発明の別の実施態様によれば、プローブは標的ｍＲＮＡ分子に 対して特異的である。

磁性粒子にカップリングされた特異的ＤＮＡプローブの使用は、プローブとハイ プツト形成する共通の配列を有するｍＲＮＡ分子の族（Ｆａｍｉｌｙ）を単離す る際に特に価値がある。従って、例えば、免疫グロブリンに対するｍＲＮＡのコ ーディングは、重い鎖と軽い鎖の一定の範囲からのＤＮＡプローブを使用して関 連する細胞エキスから単離できる。遺伝的に伝染する疾病の研究において、遺伝 子の保留された配列（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ＄ξｑｕｅｏｃｅ）に対応するプロー ブを使用して一連の改質された遺伝子から転写されたｍＲＮＡを単離することが できる。

２、−重鎖ＤＮＡの単離 本発明による磁性オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの場合と実質的に同じ方法で 、５ｓＤＮＡを単離するのに使用できる。細胞溶解液のように、ＤＮＡがサンプ ル中に二重鎖の形態で存在する場合、鎖分離工程が初めに必要である。これにつ いては、後述のポリメラーゼ鎖反応の説明中で説明する。

ポリ　ｄＴＴａ−ブを担持する本発明の磁性粒子は、特定の標的核酸配列（ｔｐ ｗｃｉｌｉｃ　ｊａｔｇｅｌ　ｎｕｃｌｅｉｃ　１ｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ）の 分離に有利に使用することができる。標的核酸及びさらに、例えば、１Ｇ−２５ ｄＡユニットのポリｄＡテールの公知の配列に相補的なりＮＡ配列を含む一プロ ーブを合成できる。プローブは標的核酸とハイブリッド形成し、そしてラベル付 けされたプローブは核酸の別の配列とハイブリッド形成する。その後、この三重 複合体を捕獲するためにポリ　ｄＴを担持している磁性粒子を使用でき、捕獲条 件は、ポリ　ｄＴとポリｄＡの間の水素結合のみが生じるようなものである。

ポリ　ｄＴとポリ　ｄＡの間の比較的弱い結合は、例えば、加熱又はグアニジン チオシアネート緩衝剤による洗浄によって、容易に可逆的になる。従って、ハイ ブリッド化溶液からの磁性粒子の除去及び洗浄の後、三重複合体を粒子から溶出 させることができ、さらに選択的に精製するために、１回以上のサイクルの捕獲 処理を行うことができる。この技術は、過剰のラベルでラベル付けされた標的核 酸の汚染、従来的分析システムにおける「ノイズ（ｎｏｉｓｅ）　Ｊの共通の源 、を防ぐ点で特に有効である。

３、−重鎮のＲＮＡ又はＤＮＡの塩基配列決定法ＤＮＡの塩基配列決定には２つ の主要な方法、即ち、Ｍａｘａｍ−Ｇ：Ｉｂｅｒ！法とＳａＤｇｅｒジデオキシ 法がある。

Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂａｒｆ法は、１本の鎖の５′末端でラベル付けされている ＤＮＡを用いて出発する。ラベル付けされたＤＮＡは、その後、４つのヌクレオ チドの１つで優先的に切断される。条件は、平均して鎖１本当たり１つの切断が 起こるように選択される。与えられた塩基での切断用の反応混合物中において、 各々の切断された鎖は、５′末端からその塩基用の位置の１つまで伸びる放射性 断片を生成し、そのような断片は塩基の全ての位置に対して生じる。これらの断 片は、例えば、ＰＡＧＥ及びゲルから成るオートラジオグラムによって分離され る。切断された各塩基までの鎖長を測定することによって、全体の配列を決定で きる。ＭＩＸＩＩＩＩ−Ｇｉｌｂｅ＋１法は２５Ｇ塩基以上の配列を決定するの に使用できる。

ＤＮＡ塩基配列決定用のＳａｎｇｅ＋ジデオキシ法は、酵素的複製の制御された 妨害に依存する。ＤＮＡポリメラーゼは一重鎖ＤＮＡの特定配列のコピーに使用 される。この合成は、相補的断片によってプライムされる（Ｐｒｉｍｅｄ）。４ 種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートに加えて、浸漬（ｉｎｃｕｂａ ｌｉｏｎ）混合物は、それらのうちの１つの２’、３’−ジデオキシ相似物（ｘ ｎｘｌｏｇｕｅ）を含む。このジデオキシ相似物又はデオキシリボヌクレオシド トリホスフェートのうちのいずれか１つがラベル付けされる。この相似物は次の ホスホジエステル結合を形成するのに必要な３′−ヒドロキシ末端を欠いている ので、この相似物の組み込みは新しい鎖がさらに成長するのを妨害する。従って 、ジデオキシ相似物が３′末端にある様々な長さの断片が形成される。このよう な連鎖形成−停止（ｃｈａｉｎｅｄ−１ｅｒｍｉｎａｔｅｄ）断片群の４つの組 （各々のジデオキシ相似物に対して１つずつ）をゲル上で電気泳動させて、４つ のレーンのオートラジオグラムからＤＮＡの塩基配列を読む。最近、ジデオキシ 法の変種が考案され、これは蛍光性標識物のオリゴヌクレオチドプライマー、即 ち、４つの連鎖停止反応混合物の各々の中で別々に着色されたもの、への結合を 含む。これらの混合物はまとめて、−緒に電気泳動させる。それらが検出器を通 過するとき、それらの蛍光によって、ＤＮＡの分離したバンドが検出される。こ の方法では５００塩基までの配列を決定することができるが、一般に、約２５０ 塩基のようなより短い配列が好ましい。

ＤＮＡのかなり長い配列は、この方法によって塩基配列の決定をする前に、より 小さい断片（２５０〜５５０塩基）に切断しなければならない。通常、配列デー タを正確に集めるためには、部分的に重なり合う断片が必要である。部分的に重 なり合う断片の形成はＤＮＡ配列の決定におけるもう一つの工程を作り出す。

通常使用される塩基配列決定法の１つは、ＤＮＡ配列クローンを１３フアージ中 で形成するが、これは−重ＤＮＡ鎖を与える。配列が５Ｈ塩基対よりも長い場合 、通常の方法は、初めの部分の塩基配列を決定し、このようにして得られた情報 を使用して、次の５００塩基部分用のプライマーを合成し、そしてこの手順をＤ ＮＡ鎖全体の塩基配列が決定されるまで繰り返す。

しかしながら、テンプレートＤＮＡを含む全てのＤＮＡ物質がゲル上に投入され なければならないので、各回毎にクローン化Ｍ＋３ファージの新しいサンプルを 使用する必要がある。核酸の大きな片のサブ断片を形成する必要のない、核酸の 塩基配列決定法に対する要望がある。また、簡単、迅速、かつ自動化につながる ような方法に対する要望もある。

本発明のさらに別の面によれば、−重鎖核酸の配列決定方法であって、 （ａ）配列決定すべきオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を担持する超常 磁性単分散粒子を製造する工程、 （ｂｌ　（ｉ）　粒子を４つのアリコートに分割し、各々のアリコートに、ポリ メラーゼ、混合ヌクレオシドトリホスフェート、及び１つのジデオキシヌクレオ シドトリホスフェートを添加する工程であって、ここでジデオキシヌクレオシド トリホスフェートは各アリコート毎に異なり、プライマーが必要であれば、プラ イマー又はヌクレオシド又はジデオキシヌクレオシドの少なくとも１がラベル付 けされている工程か又は、 ■　全粒子に、ポリメラーゼ、混合ヌクレオシドトリホスフェート、それぞれ異 なったラベルを有する４つの異なったジデオキシヌクレオシドトリホスフェート 、及び、必要であればプライアー、を添加する工程、 を行うことによって、それぞれ異なった鎖長と特定のジデオキシ塩基をともなっ た末端を有する、一連のラベル付けされたＤＮＡ鎖を合成する工程、（ｃｌ　ラ ベル付けされたＤＮＡ鎖を遊離させ、大きさ毎にそれらを分別する工程、及び （ｄ）配列を決定する工程、 を含む方法が提供される。

配列決定される一重鎖核酸はオリゴヌクレオチドであること、及び工程（ａ）が 本発明による結合されたオリゴヌクレオチドを有する磁性粒子の形成を含んでい ることに注目すべきである。配列決定される一重鎖核酸がＤＮＡである場合は、 ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼでよく、ＲＮＡである場合は、ポリメラーゼ はＤＮＡポリメラーゼか又は逆転写酵素であることは認められるであろう。

サイズ分別時に断片の同定を確実にするために、プライマー配列は、それに結合 したラベルを有してもよく、或いはヌクレオシドトリホスフェート又はジデオキ シ塩基は、例えば、放射性燐でラベル付けされてもよい。磁性粒子に結合したテ ンプレート核酸とｃＤＮＡ断片の両方′を磁性粒子とともに溶液から磁気的に分 離し、ｃＤＮＡ断片を配列決定用緩衝剤中に遊離させることによって、過剰のラ ベルを系から除去できることは、本発明の配列決定法の特徴の１つである。従来 的配列決定方法においては、過剰なラベルが配列決定ゲルからの像（ｉｍｓｇｅ ）を妨害していた。

本発明による特に有効な方法の１つは、初めに、配列決定するＤＮＡのクローン をクローニングベクター中で形成させて配列決定用のＤＮＡを十分な量準備する 。あらゆる種類のクローニングベクターを使用できる。その後、ＤＮＡはベクタ ー中の適当なＲＥ部位で切断され、簡便にベクターの結合部分（これらは既に配 列決定されている）を残して磁性粒子への結合に適する点を提供する。

二重鎖ＤＮＡ配列が３′−ビオチニル化配列を介して粒子に結合している場合、 それを変性させて、配列決定するＤＮＡを含み、隣接プライマ一部位を介して磁 性粒子に結合している一重鎖を残すことができる。

上記のものに対して相補的なプライマーはアニール（＊ｎｎｅａｌ）でき、例え ば、放射性ヌクレオチド及びポリメラーゼプライマ一部分を加えアニーリングす ることによフてラベル付けできる。その後、上で概略を述べたような、サイズ分 別を含む配列決定が行われる。

配列決定は、通常、わずか約２５０の塩基に対して続けられ、正確なサイズ分別 を可能にする。これは、ジデオキシヌクレオチドのノーマルヌクレオチドに対す る比率を調節することによって達成される。合成されたｃＤＮＡ断片は、粒子上 のＤＮＡに害を与えること無く変性によって除去できる。その後、配列情報は、 配列決定されるべき次の一連の塩基用の短鎖プライマーを設計するために利用で きる。このようにして、非常に長いＤＮＡ鎖（例えば、Ｂｏｏ塩基）が、部分毎 に、従来的方法に見られる重複の問題に遭遇すること無く、塩基配列決定できる 。

クローニングベクターに組み入れられているプライマー配列は、簡便には、従来 約１３塩基配列決定において使用されている、いわゆる、「ユニバーサルブライ ｖ−（ｕｎｕｖｅｒｓ！ｌ　ｐｔｉａｅｒ）Ｊである。ＩＩｃ　ｌ”遺伝子を有 する全てのベクターはこのプライマーを有しており、これは、５’　ＧＴＡＡＡ ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’の配列を有している。

本発明の塩基配列決定方法は種々の形態を取ることができる。

Ａ、配列決定されるＤＮＡ鎖は、３′ビオチニル化され、ストレプトアビジンを 有する磁性粒子に結合してもよい。所望により、二重鎖ＤＮＡをこのようにして 結合させ、その後、変性して配列決定に必要な一重鎖を与えてもよい。これは、 上澄液から単離されるべき分離した鎖が不動化された鎖で汚染されないようにで き、このもう一つの鎖は別個に配列決定して配列情報の確認を与えることができ ることは注目すべきである。プライマーはＤＮＡの３′領域、続いて、上述のデ オキシ及びジデオキシ塩基に約５００塩基まで、ハイブリッド形成し、次の部分 を配列決定するために上述したようにさらにプライマーが必要とされる。

Ｂ、配列決定されるべきＤＮＡ鎖は、磁性粒子に担持されているリンカ−にハイ ブリッド形成でき、このリンカ−は−重鎮ＤＮＡのループの形態であり、ここで 、５′末端が３′−末端に近い領域でハイブリッド形成し、ＤＮＡ鎖の３′末端 領域に対応する粘着性（ｓｌｉｃｋｙｌ末端を残す。このようなループは、アミ ン又はビオチン基を介して磁性粒子に結合することができ、これらの基は粒子に 担持されたカルボキシル又はストレプトアビジン基とそれぞれ反応することがで きる。ＤＮＡ鎖は、３′〜末端で脱ホスホリル化され、その後、ループの５′− 末端に配位して共有結合を与えてもよい。ループによって与えられたものに対応 する粘着性末端を有する二重鎖ＤＮＡは、このようにして結合することができ、 ２つめの鎖はその後変性によって除去でき、５１１０塩基までの第１の部分を配 列決定するためのプライマーとしてのループの３゛−末端を残すことができる。

Ｃ０磁性粒子は、ＤＮＡのある部分に対しハイブリッド形成するプローブを担持 することができ、このプローブは第１の部分の配列決定をするためのプライマー として役立つ。プローブに対してハイブリッド形成するＤＮＡ配列は、配列決定 されるＤＮＡに対し３′−であるのが好ましい。これは、後者のＤＮＡが追加の 末端ＤＮＡ配列とともにベクターから切断される場合、共通に起こり得ることで ある。核酸がｍＲＮＡの場合、プローブは、自生真核ｍＲＮＡのポリメラーゼ（ ｊ　＊　ｉ　Ｉ）に対しハイブリッド形成する５′−結合オリゴーｄＴ配列でよ い。或いは、例えば、ｍＲＮＡの３１−末端配列が既に知られている場合、プロ ーブは、ｍＲＮＡ中のある配列に対しハイブリッド形成する特異的ＤＮＡ配列で もよい。

配列決定法がプライマーにラベルを担持することを要求する場合、プライマーと しても機能するプローブは、合成されたＤＮＡ鎖をラベルとともに粒子から切り 離せるように、適当なＲＥ部位を有していなければ成らない。この要件は方法２ ）及び３）の両方に適用される。しかしながら、プローブに共有結合せず従って 合成されたＤＮＡ鎖とともに容易に分離する、分離ラベル化プライマーを単に使 用することもできる。

４、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的核酸の増幅標的ＤＮＡ分子は、 細胞溶解液又はその他の原料中に極めて少量でしか存在しないことが多く、配列 決定の前にそのようなりＮＡを選択的に増幅（ａｍｐｌｉ１７）するために、ポ リマー連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用してもよい。標的ＤＮＡを増幅させるために はクローニング工程を使用するよりもむしろＰＣＩＩ法が使用される。ＰＣＩＩ 技術においては、標的Ｄ　’Ｎ　Ａの公知の配列に特異的な一対の重合プライマ ーが選択され、ポリメラーゼの存在下に、各プライマーが標的ＤＮＡテンプレー トの全長まで伸びるＤＮＡ配列を生成するように、−力はコーディング鎖の５′ 末端又はその付近でハイブリッド形成し、他方は非コーディング鎖の５′末端又 はその付近でハイブリッド形成する。このようにして製造されたＤＮＡがその後 、典型的には約９０℃での溶融による、鎖分離処理にさらされる場合、新たに形 成した一重鎖ＤＮＡ配列は混合物中に存在する過剰のプライマーに対しハイブリ ッド形成し、通常アニ・−リングに適する範囲まで温度を下げた後、ポリメラー ゼの存在下にさらにＤＮＡ鎖が合成されるが、今度は２つのプライマーの末端間 しか伸びない。ポリメラーゼは、鎖分離工程で使用される高温中で生き延びるこ とができるのが好ましく、適する好熱性ポリメラーゼ、すなわち、Ｔａｑ　！が 最近利用できるようになった。過剰の２つのプライマー及びＤＮＡ合成に必要な 過剰のヌクレオチドが媒体中で維持される場合、別々の鎖が合成され、分離され 、プライマーまでアニールされ、新しい鎖が合成され、これらがただ単に上記の 各工程に対する最適温度の間で温度を上下させることによって行われる、反復循 環プロセスを行うことができる。この方法においては、オリジナル標的ＤＮＡの 増幅が指数関数的であり、濃度の数百万倍の増加が比較的短い時間で行うことが できることが判明した。

しかしながら、プライマーのその他のＤＮＡへの非特異的結合と、それにより標 的ＤＮＡに加えてその他のＤＮＡが増幅されることによって、この方法は必ずし も十分に選択的ではない。プライマーの非特異的結合による、このサンプルＤＮ Ａのランダムな部位の増幅は、標的ＤＮＡからのシグナルに比較してバックグラ ウンドのノイズを増加させる。多くの場合、このバックグラウンドノイズのレベ ルの増加は、この方法の有用性に太き（影響を与える。

分子クローニングに関連して、このプライマーの非特異的結合の問題が、第１の 対のプライマー中に入れ子になっている第２の対のプライマーを使用することに よって解決できると提案されている。

４つの別個のプライマー化を要求することによって非特異的結合の大幅な低減化 が達成できる［ムリスケー・ビー（ＭＩｌｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、）、ケー−７７ ０−ナ　エフ・ニー’　（Ｋ’　Ｆａｌ’ｏｏｎａ、　’Ｆ、　Ａ、　）　、メ ソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｌｌｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎＢｍｏｌｏｇｙ） 　（１９８７）ユｕ３３５〜３５０頁、及び゛ライシュニク　エル・ニー（Ｗ＋ １ｔｃｈｎｉｋ。

Ｌ、＾、）らのＮｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９ｇ？）　１５５２９〜５ ４２頁、を参照）。エンゲルケ　ディーφアール（Ｅｎｇｅｌｋｅ、　Ｄ。

Ｒ，）　らは、オリジナルのプライマーの一方に入れ子になっている、１つの新 しいプライマーのみが、標的ＤＮＡのより大きくかつより一致した増幅をもたら すことができることを示唆している（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１１１ｇ８）’　８５５４４〜５４ｇ頁）。

本発明者らは、本発明の結合したオリゴヌクレオチドを有する磁性粒子がＰＣＲ 増幅法におけるプライマーの１つとして使用できることを発見した。この反応の 速度論は溶液中で見られるものに近い。入れ子になった第２のプライマーが使用 される場合、本発明の粒子は第２のＰＣＲ相において使用することのみが要求さ れる。各々の場合、増幅された全てのＤＮＡは磁性粒子上に不動化され、過剰の 反応体を除去するために容易に洗浄できる。増幅されたＤＮＡが最後に除去でき るように、粒子とオリゴヌクレオチドプローブ／プライマーの間にＲＥ部位又は その他の可逆的結合を設けるのが好ましい。

ビオチニル化プローブ／プライマーを使用するＰＣＲを行うこともでき、また増 幅ＤＮＡを単離するためにアビジン又はストレプトアビジンで被覆された本発明 の磁性粒子を使用することもできる。

４、標的ＤＮＡのラベル付けとその分析英国特許出願筒８８２７１６０．６号に 対応する本願と同日付けの本願出願人による国際特許出願であって、その内容が 参考として本明細書中に組み入れられているもの、には、標的核酸にラベル付け する方法であって、標的核酸の公知の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプロー ブを担持した磁性粒子を標的核酸を含む混合物に添加し、プローブをプライマー としてポリメラーゼ及び適当な塩基とともに使用して多数のラベル付けされたヌ クレオチド塩基を組み入れたｃＤＮＡを合成する方法が記載されている。この方 法は特に簡単で迅速であり、標的核酸を定量的又は定性的に分析するのに使用で きる。

５、ｃＤＮＡの合成 英国特許出願第８８２７１５８．０号及び第８８２７１５９．８号に対応する本 願と同日付けの本願出願人による国際特許出願であって、その内容が参考として 本明細書中に組み入れられているもの、には、オリゴヌクレオチドプローブを担 持した磁性粒子を標的核酸に対してハイブリッド化させ、プローブをプライマー としてポリメラーゼ及び適当なヌクレオチド塩基とともに使用して、ｃＤＮＡ鎖 を合成させることによる、ｃＤＮＡの合成が記載されている。この方法は、個々 のｃＤＮＡ分子を合成するために、又は存在する特定種の核酸の全て、例えばＲ ＮＡ中の全て、に対応するｃＤＮＡを製造するために使用できる。

６、本発明の磁性粒子を使用する方法のためのキット本発明はまた本発明の方法 を実施するためのキットを提供する。

Ａ、サンプル中の全てのｍＲＮＡを単離するためのキット （ｉ）オリゴ−ｄＴを担持した本発明による磁性粒子及び１つ以上の （ｈ）ハイブリッド化緩衝液 （ｃ）洗浄用緩衝液 Ｂ、サンプルから特異的ｍＲＮＡ又は５ｓＤＮＡを単離するためのキット （り特異的オリゴヌクレオチドを担持した本発明による磁性粒子及び１つ以上の （ｂ）ハイブリッド化緩衝液 （ｃ）洗浄用緩衝液 Ｃ，ＤＮＡ又はＲＮＡ塩基配列決定用のキット（１）オリゴ−ｄＴ又は特異的オ リゴヌクレオチドを担持した本発明による磁性粒子 （ｂ）ポリメラーゼ及び１つ以上の （Ｃ）適当な緩衝液 （ｄ）　ジデオキシヌクレオチドｄｄＴ、、ｄｄＡ、ｄｄＣ，及びｄｄＧ （ｅ）デオキシヌクレオチドｄＴ　、　ｄＡ、　ｄＣ，及びｄＧ（ｆ）　ジデオ キシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドであって、 各々ラベルを担持しているか又は担持するように適合されているもの。

Ｄ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＲＣ）用キット（ａ）標的核酸の３′末端用の標 準的特異的ＤＮＡプローブ／プライマーを担持した本発明による磁性粒子； （ｂ）所望によりラベル付けされた標準的ＰＣＲ５’−プライマー； （Ｃｌ熱安定性ポリメラーゼ；及び１つ以上の（ｄ）適当な緩衝液；及び （ｅ）制限エンドヌクレアーゼ。

以下の実施例は説明のためのみに与えられている。

（１）プローブのカルボキシル粒子への結合に使用される反応は以下の通りであ る。チュウ（Ｃｈｕ）　らによって記載された［Ｃｈｏ、　Ｂ、　Ｃ，Ｆ、及び オーゲル（０＋ｇｅｌ、　Ｌ、Ｅ、）、（１９８５）　ＤＮＡ　４．３２７〜３ ３１コ、１工程反応法を使用してプローブの５′−末端に導入されたアミノ基は 、塩基のアミノ官能性と比較して、アルキルリンカ−の末端第１７ミノ基のより 大きな核性をもたらす。従って、粒子上のカルボキシル基はこれらの第１７ミノ 基と優先的に反応することが予想された。

Ｒ４５２カルボキシル粒子１＋Ｂ当たり、１１．１Ｍイミダゾール緩衝液ｐＨ７ ，０，ＩＭＥＤＣの６００μｍ中の１００μｇ　５’−ＮＨ２改質プローブを添 加した。反応混合物を穏やかに振盪しながら室温で２０時間保った。

（ｂ）　Ｎ）１．改質プローブをアプライド・バイオシステム・シンセサイザー （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ＊７ｇｌｅｍ　５ｙｎｌｂｅｓｉ！ｅｒ）とアミノリ ンク（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ）　ＩＩを使用して製造した。

カップリング反応は以下の通りであった。

Ｒ４５２カルボキシル粒子ｌｒＡｇ当たり、０．１Ｍイミダゾール緩衝液ｐ）１ ７ａ１００μｍ中の１０μｇ　５’−Ｎｈ改質プローブ、０．　Ｉ　Ｍ　ＥＤＣ を添加した。反応混合物をローラーミキサー［コールタ−（ｃｏｕＮｅｒ）　］ 上、室温で２０時間保ち、その後０．１　Ｍ　ＮａＣｌ　（４ｘ）を含むＴＥ緩 衝液中で洗浄した。

ハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション）効率：種々の量の結合したプロー ブを有するある範囲の粒子を相補的２５　ｍｅ＋ポリポリプローブを用いてハイ ブリッド形成実験において試験した。

粒子は、粒子１ｍｇ当たり１〜２５０　ｐｍｏｌの結合したプローブをカバーし ていた。

２５　ｍｅｒポリポリオリゴヌクレオチドの量を徐々に増加させながら、徐々に 増加する量の結合したプローブとハイブリッド形成させた。１９３　ｐｍｏｌが 、結合した２５０ｐｍｏ　ｌを有する粒子に対してハイブリッド形成した。しか しながら、標的分子が１０００　ｂｐの範囲にあった場合［対照　ｍＲＮＡ１プ ロメガ・コーポレーション（Ｐ＋ｏｍｅｇａＣｏ＋−ｐｏｒｌｏｏｎ）］、結合 したプローブを１００　ｐｍｏｌ有する粒子とより密度が高くカップリングした 粒子とを比較してもハイブリッド形成効率に相違はなかった。

実施例２ カルボジイミド（ＥＤＣ）で仲介された５′−ホスフェート−プローブのアミノ 粒子への結合 ゴーシュらによって記載された方法［ゴーシュ、ニス・ニス（Ｇｈｏｓｈ、Ｓ、 　Ｓ、　）及びムッソ、ジー・エフ（Ｍｕｓｓｏ。

Ｇ、Ｆ、）　、（１９８７）　ｈｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５．５３５ ３〜５３７２］によって、プローブをホスホルアミデート結合を介して３種の異 なるアミノ粒子に結合させた。これらの異なる粒子に結合したＤＮＡの量は、ｌ 、４〜１１．３マイクログラム／ｍｇであった。

ポリエチレングリコールリンカ−（８原子）の末端にアミノ基を担持するＲ４６ ９粒子は、より短いリンカ−（３原子）上にアミノ基を担持するＲ２４０粒子よ りも多量のプローブと結合する。Ｒ４４２粒子のようにリンカ−をもっと長くす ると（原子の数　２０）、粒子に結合するプローブの量の減少が観察される。こ れはおそらくリンカ−の二次構造によるものであり、これが末端アミノ基をカッ プリングに利用できなくするのであろう。

非特異的に結合したＤＮＡの量は、おそらく単位面積当たりのアミノ基の数によ って、粒子間で異なる（７〜３Ｇ％）。Ｒ４６９粒子は最も多くのプローブと共 有的に結合するが（１１ｇｇ／ｍｇ）　、これは最も低い非特異的結合しか示さ ない。

ホスホルアミデート結合の酸不安定性［チュー　ビー・シー・エフ（Ｃｂｕ、Ｂ 、　Ｃ，Ｆ、　）　、バール　ジー・エム（Ｌｈｌ　Ｇ、Ｌ）　、及びオーゲル 　エル・イー（Ｏｒｇｅｌ　Ｌ、ε、）、Ｎｏｔｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｕ、ＩＩ 　、６５１３〜６５２９］は、酸加水分解によって末端結合の程度を測定するの に使用される。末端結合プローブの量は、異なる粒子間で２０〜６５％まで変化 し、また、Ｒ４６９粒子が６５％の末端結合したプローブを有しており好ましい ようである。

本発明者らは、ｐＨ６、室温で２４時間の代わりに、１ｌＨ７の緩衝液中５０℃ で３時間反応を行うことによって、Ｒ４６９粒子に２倍のプローブ物質を結合さ せることができた。

ＥＤＣのモル数を０．１Ｍから０．２Ｍまで増加させると、Ｒ４６９粒子上のプ ローブの量が２０％減少した（データは示されていない）。

一般的方法 ６００　ｐｍｏｌ　（６μｇ　）のオリゴＡ　（３６ｒｎｔｒ）を、１ｍ１（７ ）０．１Ｍイミダゾール、ｐ）１７．０．　Ｉ　Ｍ　ＥＤＣ＋、：溶解サセす５ ｍｇのアミノ粒子と混合し、５０℃で３時間保った。

５’−ＮＨ２プローブのトシル活性化粒子へのカップリングアプライド・バイオ システム・ＤＮＡシンセザイザ−３８１Ａとアミノリンク■を使用して、ＮＯ２ 基をオリゴヌクレオチドの５′末端に導入し、５′末端に第１　Ｎ）［２基を導 入した。アミノリンク■はアプライド・バイオシステム社から供給される。合成 後これらのアミノ改質オリゴヌクレオチドは直接カップリング実験に使用された 。

トシル活性化１２８０粒子は、オス口のダイナル（ＤＴＩＩＩＩ）ＡＳから市販 されている。

カップリング手順： １０　ｍｇのトシル活性化粒子を、１００．ＩＺＩの０．５ＭＮ１２ＨＰＯＪ中 ５０μｇ　ＮＨ２改質オリゴヌクレオチドと混合し、ローラーミキサー（コール タ−）上３７℃で２０時間保ち、その後Ｇ、ｌ　Ｍ　ＮｌＣｌ　（４ｘ）を含む 丁Ｅ緩衝液中で洗浄した。

ダイナビーズＲ４８８粒子を使用した。これらは、直径が２．８　ミクロンでは なく３．１５ミクロンであることを除いてｌｌ−２８１１粒子を同じであり、Ｒ −２８０粒子と同様に表面上に第１−ＯＨ基を含んでいる。

合成器［フデーマシア・ジーン・アセンブラ−（Ｐｂｘｒｍｘｃｉｓ　Ｇｅｎｅ 　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ）を使用して、ＤＮＡの３′末端を表面に結合させた。

３．１５ミクロンの粒子に適合させるために極小さい改良が必要であった。アプ ライド・バイオシステム社からの標準約手スケールカラム中、３．８ミクロンで カットオフするテフロンフィルターを設け、粒子を投入し、モしてカラムを組み 立てた。

この担持体はジメチルトリチル（ＤＭＴ＋）基を含んでおらず、最初のサイクル の最初の工程でこのような化学物質が遊離しない場合装置が停止するので、開始 手順に小さい改良を導入した。ＤＭＴ　ｒ基が遊離するまで標準的ＡＢＩ小スケ スケールカラム用して合成を出発した。その後、ジーン・アセンブラ−を手動で 停止し、磁性粒子を含む改良カラムをジーン・アセンブラ−に入れた。その後は 装置の製造業者によって推奨されている標準的合成プログラムに従った。デプロ テクション（ｄｅｐｒｏｔｅｃｌｉｏｎ）がフデーマシアから推奨された。直接 合成をオリゴ（ｄＴ）２ｓ及びカッパ軽鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）遺伝子の Ｃ領域からの以下の配列を製造するために使用した。

５’−ＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴ ＧＣＡ−３’。

ダイナビーズト２８０ストレプトアビジン（ダイナルＡ、Ｓ　、　Ｂｏｘ　１５ ｇ　、Ｎ−０２１２オス口）を固体相として使用した。これらは、２，８　μｍ の直径を有しており、ストレプトアビジンと共有結合している単分散超常磁性ポ リマー粒子である。これらは４．３　ｍ２／ｇの表面積を有していた。

ビオチン結合能力 １　＋＋ｍｏｌの１４ｃｍビオチン［アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を含 む１００　μｌ　６　１５ＳＰＥ　（ホスフェートとＥＤＴＡを有する標準的塩 類二マニアチス）を０．５ｍｇの粒子（６ｘＳＳＰＥで予め洗浄したもの）に添 加し、室温で１５分間ローラーミキサー（コールタ−）に入れた。

６　ｘ　５ＳＰＥで２回洗浄した後、シンチレーション計測によって結合したＩ ’Ｃ−ビオチンの割合を測定した。

デオキシオリゴヌクレオチド アプライド・バイオシステム・　３ｇ１ＡＤＮＡシンセサイザー上でデオキシオ リゴヌクレオチドを合成した。

化学薬品はアプライド・バイオシステム社から購入した。アミノリンク■を使用 して、５′アミノ改質デオキシオリゴヌクレオチドを製造した。

使用した免疫グロブリンカッパ軽鎖プローブは、５′−丁ＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧ ＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ＾−３１提供者によって推 奨されたように、ビオチンＸＮＨＳエステル［Ｎ−ビオチニルε−カプロン酸の クロンチック（ＣＩｏｎｔｅｃｌ　Ｎ−スクシンイミジル］を使用した。

９０μｍの水中の０．１　ｐｍｏｌ　ＮＯ３−改質オリゴ（ｄＴ）２．を１０μ ｍラベル付は緩衝液（］　Ｍナトリウム炭酸水素塩／炭酸塩、ｐＨ９，０）に添 加し、攪拌した。

最後に、ジメチルホルムアミド中２５μｍのビオチンＸＮＨ３エステル（１００ ｍｇ／ｍｌ　）を添加して室温で一晩保った。

過剰のラベル付は剤と緩衝液を、セファデックスＧ５０スピンカラム（Ｓｅｐｈ ｘｄｅｒ　Ｇ５０５ｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ）中で除去した。

Ｋｌｅｎｏｖのポリメラーゼ、ａ　−［”Ｐ］　−ｄＴＴＰ　、及びテンプレー トとしてオリゴ（ｄＡ）２．による反応中のフィル（ｆｉｌｌ）を使用して、５ ′ビオチンオリゴ（ｄＴ）２．を末端ラベル付け（ｅｎｄｌａｂｅｌｌｅｄ）　 Ｌ、、た。過剰のラベルをセファデックスＧ５０スピンカラムを使用して除去し た。

オリゴ（ｄＴ）ダイナビーズ（Ｔ−ビーズ）の製造２．５　ｍｌ　６　ｘ　５Ｓ ＰＥ中の　２００ｕ、ビオチニル化オリゴ（ｄＴ）ｚｑ　（２４ｎ　ｍｏｌ）を 、５０　＋Ｈの予め洗浄したダイナビーズト２８０ストレプトアビジンと混合し 、室温で１５分間ローラーミキサー上で保った。

６　！　５ＳＰＥ中で２回洗浄した後、ビーズを６１ＴＥ。

０．１％ＳＤＳ中４℃で保存した。

オリゴヌクレオチドハイブリッド形成分析Ｔ−ビーズの種々のバッチのハイブリ ッド形成能力を測定するための標準的分析において、エッペンドルフ（ｅｐｐｅ ｎｄｏｌｌ）管中の０．］ｍｇのビーズを６１ＳＳＰＥ　、　０．１％ＳＤＳで １回洗浄した。マグネットラック（ＭＰＣ−Ｅ　、ダイナル＾、Ｓ９、オス口） を各工程間に粒子を凝集させるのに使用した。

洗浄用緩衝液の除去後、５０　ｐｍｏｌのオリゴ（６人）２．と微量（１〜２ｘ ｌＧ’　ｃｐｍ）のａ　−（３２Ｆ］−ｄＡＴＰ−ラベル付はオリゴ（ｄＡ）２ ．を含むハイブリッド形成溶液（６ｘ　５ＳＰＥ　。

０．１％５ＯＳ）を添加した。

穏やかに攪拌した後、管を室温で２分間放置してハイブリッド形成させた。

ハイブリッド形成した粒子を室温で２　ｘ　５ＳＰＥ　、　０．１％ＳＯ５を用 いて２回洗浄し、オリゴ（ｄＴ）ｚｓに対してハイブリッド形成したオリゴ（ｄ Ａ）２５のパーセントをシンチレーション計測器中で測定した。

ポリ　Ａ　ｍＲＮＡ）レーサーのラベリング３′ポリＡ３（１テールを有する１ ４ｇの１２００　ｈｐ　ｍ　ＲＮ　Ａ（プロメガ）を、１０７ｚｌ　５　！Ｋｌ ｅｎｏｖ緩衝液、１ｕＲＮアシン（ＲＮｉｓｉｎ）、１０　ｍＭ　ＤＤＴ中の２ ，５ｐｍｏｌオリゴ（ｄＴ）２ｓと混合した。室温で２分後、ｌＯμＣ１α−［ ”Ｐ］　−ｄＡＴＰ　。

１　ｕ　Ｋｌｅｎｏｖポリメラーゼ（アマ−ジャム）及び５０μｍまでの水を添 加し、１５℃で６０分間保持を続けた。過剰のα−［”Ｐ］−ｄＡＴＰをセファ デックススピンカラムを使用して除去した。

オリゴ（ｄＴＬ、と結合したダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジンに対す るポリ（Ａ）ｍＲＮＡハイブリッド形成用緩衝液 ポリ（Ａ）結合緩衝液： ０．５Ｍ　ＬｉＣｌ　、１０ｍＭ）リス−Ｃ１、ｐＨ７，５、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴ Ａ。

０．１％ドデシル硫酸ナトリウム。

中間洗浄緩衝液： ０、１５Ｍ　ＬｉＣｌ、ＩＯＩＩＩＭ）リス−Ｃ１、ｐＨ７，５，１ｒｎＭ　Ｅ ＤＴＡ。

［１，１％ドデシル硫酸ナトリウム。

溶出緩衝液：　２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．　Ｉ％５ＤＳ０精製ｍＲＮＡのその後 の用途に応じて、最後の洗浄工程と溶出緩衝液中のＳＯ３を省略できる。

全ＲＮＡの抽出 細胞培養液からの全ＲＮＡの抽出は、オーフレイ（Ａｕｆｌｒｅｙ）とローショ ン（Ｒａａｇｅｏｎ）のプロトコル（１９８０，ＥＩＮ、Ｊ、Ｂｉｏｃｂｅｍ　 、　１０７．３０３〜３１４）に従って、サルコシル（ｓａｒｃｏｓ７１−）法 、ＬｉＣｌ法、尿素法を使用本願の実験において使用したダイナビーズＭ−２８ ０−ストレプトアビジンは、粒子１ｍｇ当たり　３９０　ｐｍｏｌの１４０−ビ オチンに結合したことが判明した。

結合した５′ビオチニル化オリゴ（ｄＴＬ５の量は、カップリング反応中にラベ ル付けしたトレーサーを使用して測定し、粒子１ｍｇ当たり　２５０　ｐｍｏｌ のビオチンオリゴ（ｄＴ）２ｓであることが判明した。

これらの磁性オリゴ（ｄＴ）ｚ７粒子の最大ハイブリッド形成能力を決定するた めに、材料と方法において記載したような（ｄＡ）　２５オリゴヌクレオチドを 使用して分析を計画した。

本願の研究において製造し使用したＴ−ビーズのバッチは、１９３　ｐｍｏｌオ リゴ（６人１ｚ、／ｎｇのハイブリッド形成能力を有していることが判明した。

非特異的結合を測定するための対照実験において、非相補的プローブ（４２ｍｅ ＋　Ｔｎ９１７プローブ）とカップリングした粒子は、粒子１ｍｇ当たり１０　 ａＨｏｍｏｌオリゴ（ｄＡ）２゜未満しか結合しなかった。

オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成速度論磁気的にｍＲＮＡ単離実験を開 始する前に、この系のハイブリッド形成速度論を研究することが必要であった。

相補的オリゴ（ｄＡ）２．標的ヌクレオチドに対して２倍過剰未満のＴ−ビーズ ハイブリッド形成能力を使用して、ハイブリッド形成実験を組み立てた。

第１図が示すように、ハイブリッド形成は１分以内に完了した。

オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成効率どの程度効率的に標的核酸が混合 物から分離できるかを試験するために、本発明者らは２つの異なる実験を組み立 てた。

第１の実験においては、徐々に量を増やしながら幾つかの量の標的オリゴヌクレ オチド（オリゴ（ｄＡ）２５）を、公知の最大ハイブリッド形成能力１９　ｐｍ ｏｌを有する固定量（１００μｇ）のＴ−ビーズに添加した。第２八図中の結果 は、標的対ビーズ能力のモル比が１＝１に近づいた場合でも、Ｔ−ビーズは少な くとも９９％の標的オリゴヌクレオチドと結合できることを示している。

第２の実験において、ｌ　ｐｍｏｌから　１００　ａｍｏｌまでの５つの異なっ た濃度のオリゴ［ｄＡ）　２５をＩＮμｇの粒子のアリコートに添加した。各混 合物中に存在する核酸の全量を、無関係のオリゴヌクレオチドを含むプローブで １０ｐｍｏ　ｌまで調節した。標的オリゴヌクレオチドを含まない否定的対照実 験においては、非特異的結合を検知できるように、非相補的プローブをラベル付 けした。２分間のハイブリッド形成後、２段階の洗浄工程を行い、ハイブリッド 形成したオリゴ（ｄＡ）２ｓの量を測定した。第２Ｂ図中の結果は、１００　ｘ ｍｏｌのような低い標的オリゴヌクレオチド量（存在する全核酸の０．００１％ ）でも、磁性オリゴ（ｄＴ）２６粒子は９５％以上を引き出すことを示した。

ポリＡ　ｍＲＮＡの磁気的単離 （ｄＴり、ダイナビーズ結合ポリＡ　ｍＲＮＡの能力、効率、および速度論を、 オリゴヌクレオチドハイブリッド形成に関して記載したような類似の１組の実験 を組み立てることによって研究した。

丁−ビーズの最大ポリＡｍＲＮＡ結合能力を決定するために、３′末端に３ＯＡ ’ｓを有する１２００ヌクレオチドカナマイシン転写（プロメガ）である公知の 濃度の３２ｐ−ラベル付けされた対照ＲＮＡを使用した。結合能力を決定するた めの方法は、オリゴヌクレオチド結合分析に関して記載したのと同様であるが、 上述のハイブリッド形成緩衝液を使用した。

この特定のポリＡ、。ｍＲＮＡの結合能力は、Ｔ−ビーズ１ｍｇ当たり３３　ｐ ｍａｌ１３μｇ）のｍＲＮＡであることが判明した。

■−ビーズに対するポリＡ　ｍＲＮＡのハイブリッド形成オーフレーらの上述の 方法を使用して、ハイブリドーマ細胞系（ｌｉｎｅ）八Ｂ１１）のｌＸｌ０”細 胞から全ＲＮＡを抽出した。オリゴ（ｄＴ）粒子に対するｍ　ＲＮ　Ａハイプツ ト形成の速度論を、１０Ｍｇの全ＲＮＡを微量の３２ｐ−ラベル付けされたマウ スの膵臓ポリＡ　ｍＲＮＡとともに、そして１５０μｍのハイプツト形成緩衝液 中の約５倍過剰のＴ−ビーズ能力を使用して、決定した。第３図中の結果は、サ ンプル中のポリＡｍＲ，ＮＡの９０％近くが２分以内にビーズに対してハイプツ ト形成し、また３０秒後には７８％が既にハイプツト形成していることを示して いる。

細胞質（ｃ７１ｏｐｌａｓｍ）からのポリＡ　ｍＲＮＡの直接磁気的単離 ハイブリドーマ細胞系ＡＢＩの培養液からの１０６細胞を１度洗浄し、５０μＩ 　ＰＢＳ　［ドゥルベ−／　−１（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）、０４１−０４１９０　 ］中に再分散させ、トリトン（Ｔ＋Ｎｏｎ）’　！−１００を０．５％の最終濃 度まで添加した。１分間のリシス（１７ｓｉｓ）の後、核酸を含む細胞デブリス を、エッペンドーブ（Ｅρｐｅｎｄｏｒｐ　）遠心分離中で１０秒間スピンさせ てペレット化した。上澄液を、２倍濃度の１００ハイブリツド形成緩衝液中のＴ −ビーズに添加し、２分間放置してハイブリッド形成させ、その後粒子を磁気的 に凝集させた。

ハイブリッド形成したｍＲＮＡを２　ｍＷ　ＥＤＴＡ中６５℃で粒子から切り離 し、粒子を磁石を使用して除去した。この実験においては、１０’ハイブリドー マ細胞のアリコートを、可変量、２ｆｌ（ｌμｇ、１００μｇ、５１１ｇｇ１２ ０μｇ１のＴ−ビーズと、プローブなしの２００　μｇのダイナビーズＭ２８０ −ストレプトアビジンに添加した。Ｔ−ビーズから切り離した後、ポリｍＲＮＡ のノーザンブロッッ（Ｎｏ【ｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ）からのＸ線フィルムをデ ンシトメーターでスキャンし、免疫グロブリンカッパ軽鎖プローブで調査した。

これらの結果は、ｍＲＮＡの収量がビーズの量が増加するとともに増加し、一方 上澄液中の残留ｍＲＮＡがそれに対応して減少することを示している。第４図中 に提示されている結果は、約１２０μｇのＴ−ビーズが１０６細胞からの細胞質 ポリＡ　ｍＲＮＡの９０％より多くを単離するのに十分であることを示している 。図中の記号−へ一は粒子に対するハイブリッド形成を表し、記号−〇−は上澄 液中に残留しているｍＲＮＡを表す。プローブを有していないストレプトアビジ ン粒子は検知可能なｍＲＮＡ結合を与えなかった。

実施例６ 真核Ｂ−細胞系「ラジ（Ｒａｉｉ）Ｊ　（スウェーデン、ストックホルムのジー ・フレイン教授（Ｄｒ、　Ｇ　Ｋｌｅｉｎ）から供給された）からのｍＲＮＡの 精製 オーフレーらによってＥｖｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０７．３０３〜３１４　 （１９８０）に記載されている方法によって、１・Ｉ０８細胞から全ＲＮＡを抽 出した。この方法に従って、０．５ｍｌの細胞ペレットを、５　ｍｌ水冷分解（ ｌｙｔ口）緩衝液（３ＭＬｉＣＩ、６Ｍ　尿素、０．１％サルコシル（ｇａｒｋ ｏＢｌ）、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール、　５０Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ７，４，５ｍＭ　ＥＤＴＡ）に添加した。その後、混合物を超音波処理し、氷 上で一晩保持した。

翌日、分解液を１７．０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを速やかにＴ Ｅ−３ＤＳ（Ｉｎ　ｍＭ　ＮａＣ！　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０１５％５ＤＳ） に溶解させ、同体積のフェノール−クロロホルム（１：　１）で１回抽出し、そ の後クロロホルムのみでもう１回抽出した。分解液を３倍体積のエタノールと１ ０００体積の３　Ｍ　ＮａＡｃと混合し、１０のバッチに分割し、そして使用す るまで一２０℃で保存した。

１・１０７細胞に相当する全ＲＮＡのバッチの１つに、マニアチスによって１９ ８２に１９７〜１９８頁に記載された方法に従って、オリゴｄＴ−セルロールを 使用する従来的ｍＲＮＡ精製法を施した。

全ＲＮＡのもう１つのバッチを以下のｍＲＮＡ精製方法において使用した。

ＤＮＡ合成器（アプライド・バイオシステムズ製）によって製造された、構造５ ’　（ＮＨ２）　（ＣＨ２）＋２−ＧＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧ ＣＴＧＣＡＧＴ−（Ｔ）　２４を有するＲＥＴと命名されているＤＮＡプローブ を、２０　ｍｇのＲ５０２粒子、５０Ｍｇの前記ＤＮＡプローブ、２．５ｍｌの ０，１Ｍイミダゾール緩衝液ｐＨ７，０中の４８目のＥＤＣ（シグマ製）と混合 することによって、（前述の）カルボジイミド法によって磁性粒子Ｒ５０２に結 合させた。−晩保温し、ＴＥ（上述のもの）で２回粒子を洗浄し、０．２１　Ｎ ｌＯＨ，０，５Ｍ　ＮｌＣｌ中で１回洗浄して８μｍｏｌのオリゴＡ１７プロー ブをハイブリッド形成させる能力を与えた。０．５ｍｇの粒子を１００　ｐｍｏ ｌのＡ１７ブローブ（キナーゼ（ｋｉｎｇｓｅ）反応によって３２ｐでラベル付 けされている）と６　ｘ　５ＳＰＥ中で１０分間保持することによって、ハイブ リッド形成能力を測定した。２２℃（融点よりも１２℃低い）において６　ｘ　 ５ＳＰＥで２回粒子を洗浄した後、全添加量に対するハイブリッド形成したＡ　 、７の割合をシンチレーション計測機で測定した。

ｍＲＮＡ精製の負の対照物として、配列ＮＨ２−（ＣＨ２）　ｌ　２−５’　Ｎ ｌ２−　（ＣＨＩ　２）　−ＴＴＡＡＴＴＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧＣＴＴＣＣＴ ＧＴＴＧＣＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣ−３’　を有しＴ ｎと命名されている無関係のプローブを上述の方法によって粒子と結合させた。

ラジ（Ｒｓｊｉ）ｍＲＮＡ　）レーサーを０．１μ、を用いて放射性ラベル付け することによって調製し、ｍＲＮＡを上述の従来法によって精製した。ラベル付 けは、１０μｍ５Ｉ　ｋｌｅｎｏｖポリメラーゼ緩衝液（０，２５Ｍ　ＮｌＣｌ 　、０．２５　ＭＴｎ４ＨＣＩ、ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴ＾）中１５℃で１ ０分間、１μｍｏ　ｌのＲＥＴ−プローブをｍＲＮＡに対してハイブリッド形成 させることによって行った。１０　ｕ　Ｃｉ　α−［３２Ｐ］　ｄＡＴＰ（アマ −ジャム）、２単位のｋｌｅｎｏｖポリメラーゼを（ＢＲＬ）をこの混合物に添 加し、これを５０μｍまで水で希釈した。２時間保持した後、混合物をセファデ ックスＧ５０（フデーマシア）に通して組み込まれなかったヌクレオチドを除去 した。

ｍ　ＲＮ　Ａ精製実験は以下のように行った。

ＲＥＴプローブを有する粒子１　ｍｇを、！００μ１６ｘＳＳＰＥ中１００．　 ＯＨｃｐｍのトレーサーｍ　ＲＮ　Ａとともに、Ｂ細胞系ラジからの全ＲＮＡの ２０ｐｇに添加した。

同じ実験を行ったが、粒子はＴｎ−プローブを有していた。

ハイブリッド形成は室温でローラーマシーン（ｒｏｌｌｅｒｍｇｃｈｉｎｅ）上 で行った。ハイブリッド形成反応の後、短い間隔で、磁石によって粒子を凝集さ せ、上澄液中の残留放射能を測定した。各測定の後、粒子をすぐに再分散させた 。

１０分後、ｍＲＮＡの６０％がＲＥＴプローブを有する粒子に結合した。対照粒 子は検知可能な量のｍＲＮＡに結合しなかった。

３０分間の保持後、粒子を室温で５００μｌ　２！ＳＳＣで２回洗浄し、１００ μｌ　ＴＥ−緩衝液中で再分散させ、粒子を凝集させ、上澄液を回収し、−７０ ℃で保存した。

実施例７ 本発明の方法を、本発明者らの研究所でクローン化したりシン（ｒｉｃｉｎ）　 Ａ遺伝子の５′末端の塩基配列決定を行うために使用した。

ＢｓｍＨＩ断片上のりシンＡをｐｕｔ　ｇ中でクローン化した。この遺伝子の３ ′末端は以前に配列決定されている。

プラスミドｐＡＬ４００をＳｍ１ｌ及びＥ、ｃｏＲＩを用いて切断し、ｋｌｅｎ ｏｗポリメラーゼを使用して、存在する唯一のヌクレオチドとしてのビオチン− ｄＵＴＰでビオチニル化した（マニアチス、１１３〜１１１６を参照のこと）。

ビオチンは５μｌ１部位においてのみ組み入れられる。第１のプライマーは公知 の配列データに基づくものであり、５’　−ＴＧＡ−ＡＴＴ−ＧＧＡ−ＣＴ−Ｇ ＣＡ−ＡＡＧ−３’であった。

組み入れられなかったビオ−ｄＵＴＰを除去するために、Ｇ−５０セフアデツク ススピンカラムを使用して材料を精製しくマニアナス４６６頁）、エタノールで 析出させた（エタノールによる析出はおそらく省略できる）。ビオチニル化され た二重鎖ＤＮＡを含む混合物を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　）リスＨＣＩ及び１　 ｍＥＤＴ＾、１１８８．Ｑ）中のストレプトアビジン／アビジン被覆磁性粒子と 、室温で３０分分間中かに反転（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）させて、混合した。１０ μｍの粒子（２５ｍｇ粒子／１）当たり２μｇのビオチニル化ＤＮＡを使用した 。

結合したビオチニル化二重鎖ＤＮＡを０．１５　Ｍ　Ｎａ０Ｗ中室温で５分間変 性させた。−重鎖ＤＮＡを有する粒子を磁石を使用して回収し、ＴＥ緩衝液中で １回洗浄した。

配列決定反応 配列決定用プライマーのアニーリング：２μｍの１０！　反応／ハイブリッド形 成（１００ｍＭ、トリスｐ）ｌ　８．Ｇ　、　５（ｌ　ｍＭ　ＭｇＣｌ　ＭｇＣ ｈ　）１μｍの１７　ｍｅ＋プライマー（１，２μｇ／ｍ１）７．０μｍ蒸留水 を含む混合物を粒子に添加し、５５℃で５分間保持し、その後ゆっくりと室温ま で冷′却した。

アニールした粒子テンプレート−プライマーに以下のものを添加した。

［１”Ｓ］　ｄＡＴＰｘｓ　１．５　μｍ　（ｓｐ、ａｃｌ、６００　Ｃｉ／ｍ 　ｍｏｌ）ＫＩｅｎｏｖ　１．０　μｍ　（４Ｕ＃ｚｌ）ＢＳＡ　１．０μｌ　 （ＩｏＯμｌ　（１００μｇ／１）３２ｐを代わりに使用できる。

全混合物を、Ａ、Ｇ、Ｃ，及びＴとラベル付けされた、４つのミクロ遠心分離チ ューブ又はミクロ滴定プレート中の液体溜め（ウェル（ｙｅｌｌ））に分割した 。即ち、（粒子の体積ために）各々４μｍずつに分けた。

４μｍの適当なヌクレオチドを各チューブ／ウェル混合物、即ち、Ａミックス（ ｍｉｒ）　、Ｃミックス、Ｃミックス、及びＴミックスに添加した。

Ａミックス：１００μＭ　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰ及び１００μＭ　 ｄｄＡＴＦ Ｃミックス：　５μＭ　ｄＧＴＰ；　１００μＭ　ｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰ及び１ ２ｐＭ　ｄｄＧＴＰ Ｃミックス・　１００μＭ　ｄＧＴＰＳｄＴＴＰ　、　１０ｐＭ　ｄｃＴＰ及び １００μＭ　ｄｄｅＴＰ Ｔミックス＝１００μＭ　ｄＧＴＰ、５μＭ　ｄＴＴＰ、　１００μＭｄＣＴＰ 及び５００μＭ　ｄｄＴＴＰ 混合物を室温で１５分間放置して保った。

ジデオキシヌクレオチドで停止されていない全ての鎖の完全な合成を、１２５Ｍ Ｍの各ヌクレオチドを含む２μｍのデオキシヌクレオチド溶液、ｐＨ７，５、を 添加し、１５分間さらに保持することによって行った。

５　Ｂ　ｌのホルムアミド色素を添加し、沸騰水中で３分間加熱して、粒子から のラベル付けされたＤＮＡを変性させることよって、反応を停止させた。その後 １、粒子テンプレートを磁気的に分離し、ラベル付けされた１）　Ｎ　Ａを含む ３μ！のＥ澄液を緩衝液勾配配列決定用ゲル（ｂｕｆ［ｅ＋　ｇ＋１ｄｉｅｎｌ 　ｓｅ−ｑＩｌｅｎｃｉｎｇ　ｇｅｌｌ）　ニアマージャム（八ａ＋ｅｒｓｈｉ ｍ）からのプロトコール（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に入れた。

テンプレートを有する粒子は洗浄後再使用でき、前の配列決定からの配列決定結 果に基づく新しいプライマー用にされる。

最初のプライマーは公知の配列データ、即ち、５’　−ＴＧＡ−ＡＴＴ−ＧＧＡ −ＣＴ−ＧＧＡ−ＡＡＧ−３’　＋こ基づいた。

２つの次のプライマー・は、この実験からの以下の配列データに基づいたパ プライマー２　５’−Ｇ〜人Ｇ　Ａ　−Ｔ　Ａ　Ｇ　−ＣＣＴ　−ＣＣＴべＴＡ −Ｇ−３’゛プライマー３　５’−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＴ−ＧＡＴ−ＴＴＧ− ＡＧ−３’、これら３−）のプライマーを（灸用すること１こ↓−っで、リシン Ａ遺伝子中の最初の７５０の塩基の配列決定が可能であ　）　ｔこ。

対照として、Ｍ１３を使用Ｉ、７て同じ遺伝子の配列決定を行った。同じ結果が 得られた。

実施例８ 磁性粒子上のストレプトアビジンへのビオチンによる不動化の前に標的配列をＰ ＣＲ法によって増幅したことを除いて、固体相塩基配列決定を前に概略を説明し た技術に従って行った。合成ヒトプロインシュリン遺伝子断片を含むプラスミド ｐＲＮ２７をＥ、　ｃｏｌｉ　ＲＲＩ　Ｍ２Ｓ株に変形させ、寒天媒体上に広げ た。殺菌されたパスツールピペット（Ｐａｓｌｅｕｒ　ｐｉｐｅｔｔｅ）で単一 　コロニーを取り、６７肥Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ１０，ＯＯｌ　１６．６１ １１Ｍ　Ｎ）Ｉ４ＳＯ４，６，７”　’ｇＣｈ　、１０　ｍＭβ−メルカプトエ タノール、及び１７０　ｕ　ｇ／ｍｌ　ＢＳＡから成るＰ　ＣＢ緩衝液１０μｍ 中に懸燭させた。す〉・プルを９５°Ｃまで５分間加熱し、室温まで冷却Ｉ。

た後、１μｌの１０　！　ＰＣＲ緩衝液、ｐＨ７，０、を添加して中和した。

マルチ−リンカ−＝領域の上流領域（ビオチン−ＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴ ＴＴＡＡＴＡＣ−３’　）及び下流領域（５’　−ＴＴＣＧＡＴ／、ＴＣＧＧＴ ＡＡＣＣ／、ＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧ　３’）のそれぞれに相補的な ２つのオリゴヌクレオチドブライマーを使用１．てＩ’ＣＲを行った。

製造者（スウエ・−デ′／のフデーマシア（Ｐｈｘ＋ｆｆ１ａｃｉａ）　）が記 載しているように上流プライマーを５′末端においてビオチニル化した。。

反応混合物（］、００１１１）は、に述のＰＣＩ！緩衝液、ｐＩｉ８．８、ＩＩ ＩＭの各プライマー、２００ＭＭ毎の昌ＴＰＳｄＣＴＰ、及びｄＴＴ？、及び− ト述の１０μｍの分解物サンプルから成っていた４、２単位のＴａｑｌ−ポリメ ラーゼ（英国のアマ−ジャム（八ｊｎｅ＋ｓｈｒｍ）：ｌを冷力Ｌｌ　＋、、千 ′７＋・プログラマブル・トリーブＤ　ツク（Ｔｅ１：）＋ａｅ　ｐ＋ｏｇ＋ａ ｍｉａｂ！ｅ　Ｄ＋１−Ｂｌｏｃｋ）　ＰＨＣ−１［テクネ、英国］を使用し− ？−１温度号−ｒウル反１と・を（１つだ、１名サイクルは、９２℃での１分間 の変性上程、その後の５０’Ｃでの２分間のＩ）　Ｎ　Ａに対するｊう１７　の アニーリング、及び７２℃で１分間のＴａｑｌ　ボリノラ〜ゼ（ＸよるＤ　Ｎ　 Ａ鎖の伸長を含／；、だ３反応計４合物を１滴のバーツノ１ン、惰でカバ〜し） °−１２０（トイクル後、混合物を！００Ｉｌｉｔつスｌ−Ｌヅトアビジン被覆 磁性粒子Ｉこ添加１−戸、。上澄液を除去し、不ＷｊＪ化された二重鎖ＩＩ　Ｎ へヲ３７°（゛Ｃ−ロｉ　５　ｙ　ｒｒ　ａ　ＯＨで１５分間保ド１夛乙−とに 、−１、うて−亀鉗月′態（、小・、換ｊ、　ｒ：：、　。

不動化ａ　し・ニー、　テ”、２□　−、’　Ｉ−□−ｊ□　Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲ１ ゛１”ａ−６７ビジ’　ｋ　５に−、１′−Ｇ　ｒｅ　ｌハＣＱ、　ｉ５　ｌｌ 　ＮａＱｆｌ　とＴＥ−ｆｉ　Ｎ液−、こ洗ｅし５六、。

マノトヂーリ゛ノゾ、・−領域から丈ぐ下流の領域（、−相補的２゛、（、ル、 尭末翻−テくル付１．）され／、配′９１１決定プラー１゛マー　（１）′ＣＧ ＴＴＧ：已へＡ　Ａ　ＣＧ　Ｇ　ＣＣＡ　Ｇ　’！　１１量を使用Ｌ−（、Ｗ　 列ｉＱ　’；’；　ｒ＜　（Ｃ，−ｉ　、ｊツタ４、／３　ｐ　ｍ　Ｏｌ　’Ｑ 　ｈＬ列決ｓｑ　用ブ５　イア　’ｊ　ｊＪ、　”ｌ’　ｂ−、不動ｉｔ、；、 〕５れ？：ｔ、％：、・“＝ノし−＋、Ｉ）Ｎへ２−１１０・１ｉａ）トｉ）− べ−−ｉｔＣＩ（ｐＨ７，５）　Ｉ　ＯＩＩＩＭ　Ｌ！ｇｃｈ＋　、２００　７ ｚＨｍｌ　’１ｓＡＺ＋ｉＪ］Ｏｔｌ　（、、ｙＨの）ｈｃｌを１１］μｌの全 体積まで含む緩衝１夜中て゛）見合ｊ７、た。

、に−リング混合物４６５″Ｃて加熱し、ｈて温オーＣ玲加さ〒ｌた。ｌｌ１１ のＤＴＴ／ＮａＣｌ混合物（０，８Ｍ　Ｎ２Ｃｉｙ’Ｏ，ｌ　Ａｔ　ＤＴＴ）及 び７１量位のＴ７−ボ１ノメシーゼ（ファ＝　７シ了、；４ウエーデソ）を添加 Ｉ７、体積を１５μｍに調整した１、その後、この混合物の３５μＩのアリコー トを２．５μｌの各ツク１．・オヂド混＆物、社混合し、３７℃で１０分間保持 （７た。

以下のヌクレオチド混合物を使用した；８０μＵ毎のｄＡＴＰ。

ｄｃＴＰ、、ｄＧ’ｆ’Ｐ、　ｄ’ｆｉ’Ｐ、　６．３７１Ｍの各ｄｄＮＴＩ’ 　Ｓ５０　ｍＭの）ｆａｃｔ、及び４１１　ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５ 、伸長、（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）反応の完了後、各反応のトで液を除去し、スト し・・ブト１ビシンアガ「」−六をノと？洗浄し＊、、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、 　ｐＨ７，５０３％（１，／’Ｖ）キシ！・ンンアノ・−ル（ｃｙａｎｏｌ）　 ＦＦ及びｔ１３％（ｗ７”ｖ）　”；Ｉ’　Ｄノ）；７５−ノールブルー　（Ｂ ＋Ｏｍｐｌ＋ｅｎｏｉ　Ｂｌｕｅ）を含む脱イメン化ポ刀ムア、−、ドから・成 るホルム“アミド７／′配列決定用色素の：Ｉ　Ｉｆ　ｌを使用しＣ′、新１． ＜合成されたオリゴツク１．・−（す：：゛を溶出、−′５刊・た、、３７℃で １５分間保持１謬こ後、Ｌ澄液を除去［７、：（μｊの水でる釈１．た。電ヌ泳 動（１２）中の刈：光バンド検知する。ｊ″、うに設定１〜だ自動化塩〃；配列 決定Ｈｔｆｉ、　（Ｊｌ約２μ：を、入れり、、２０　ｃｍ　）分１１　Ｒ；” 、ツヒ□ン９６ボリアシリ柱、アミ、トメ・”ルによる配列決定実験ｌ；（明確 ｊｌ：　ｆ’ｌ’ｉ　Ｗ　’ａ’　４　Ｋ　’ｈＬ　＋、Ｓ、の例（、湿５、Ｐ ＣＲ増幅さ才またＤＮＡが磁性粒子上に不動化でき、１１１ｆ）Ｎへボリメラー ・ビと蛍光；イウイ７−を使用し、て配列決定〔きる、〕とを示（−５Ｔいる。

。 バイブ゛す、、圧イし　分 Ａ弓屹イの槽、ｔ／’）　ｐｍｏｌ ｌ、イブ゛ＩＦ・ギイしＪ今ｈｉ　ダト戸ｇ　Ｂｅ　ｄｓ 国際調査報告 −へ一一＾８−１’＝　ＰＣＴ／ＥＰ　８９１０１４１９客−峯１１＋シリーー り一υ−・１−□Ｅ身−℃１”ｒ’（’ＩＩ”ｌ讐／ｈ：ＰＲず゛コ１７Ｑ１４ １ｑ１＝、、ｌＡ＠輪ｒｌｌ＾ｅ、：、、＝ｔｉ＝豊ｃ−ｐ（１’ｆ／Ｅ？８９ ，１０：ｌ−４１９１，２オ＾、−、ユ嚇　ＰＣＴ／ＥＰ　８９１０１４１９− −＾□−ＰＣＴ／ＥＰ　８９１０１４１９国際調査報告 ＥＰ８９０１４１９ Ｓ＾　３２９２１ 国際調査報告 ＥＰ　８９０１４１９ Ｓ＾　３２９２１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　オリゴヌクレオチド分子を複数担持した、単分散、超常磁性粒子。 ２　オリゴヌクレオチドが５′−アミノ基を介して粒子に共有結合している、請 求の範囲第１項に記載の粒子。 ３　粒子がポリアクリル酸又はポリメタクリル酸のコーティングを有し、オリゴ ヌクレオチド上の５′−アミノ基との反応によって５′−アミド基を形成するカ ルボキシル基を与える、請求の範囲第２項に記載の粒子。 ４　オリゴヌクレオチドが５′−アミノ基を介して粒子の表面に直接共有結合し ている、請求の範囲第１項に記載の粒子。 ５　オリゴヌクレオチドが、粒子上のアビジン又はストレプトアビジンに結合す る５′−ビオチニル基によって粒子の表面に結合している、請求の範囲第１項に 記載の粒子。 ６　オリゴヌクレオチドが、粒子表面上のヒドロキシル基に結合する３′−ヒド ロキシル基によって粒子に共有結合している、請求の範囲第１項に記載の粒子。 ７　比重が１．１乃至１．８の範囲内である、請求の範囲第１項乃至第６項のい ずれか１項に記載の粒子。 ８　サイズ範囲が１乃至１０ミクロンである、請求の範囲第１項乃至第７項のい ずれか１項に記載の粒子。 ９　オリゴヌクレオチドが１２乃至２００塩基の範囲の鎖長を有している、請求 の範囲第１項乃至第８項のいずれか１項に記載の粒子。 １０　オリゴヌクレオチドがポリｄＴである、請求の範囲第１項乃至第９項のい ずれか１項に記載の粒子。 １１　オリゴヌクレオチドが、標的核酸のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に特異的に結合 する、請求の範囲第１項乃至第８項のいずれか１項に記載の粒子。 １２　オリゴヌクレオチドが、標的核酸の族の保留領域に結合する、請求の範囲 第１１項に記載の粒子。 １３　オリゴヌクレオチドが標的核酸に対しハイブリッド形成する配列及び、粒 子に結合した、制限エンドヌクレアーゼ制限部位を含むリンカー配列を含む、請 求の範囲第１項乃至第１２項のいずれか１項に記載の粒子。 １４　標的核酸を不動化し、前記核酸を溶液中で請求の範囲第１項乃至第１３項 のいずれか１項に記載の粒子と接触させ、粒子上のオリゴヌクレオチドを前記標 的核酸上のヌクレオチドに対してハイブリッド形成させる方法。 １５　標的核酸がｍＲＮＡであり、粒子をその後磁気的に表面に凝集させ前記溶 液から分離する、請求の範囲第１２項に記載の方法。 １６　前記粒子上に不動化した標的核酸に、２つのプライマーのうちの１つとし てオリゴヌクレオチドプローブを使用するポリメラーゼ連鎖反応による増幅処理 を施し、ここで前記オリゴヌクレオチドプローブを担持した粒子がさらに存在し ているか又はその後添加して、増幅を可能にするのに十分な量の前記プライマー を与える、請求の範囲第１２項に記載の方法。 １７　一重鎖核酸の配列決定方法であって、（ａ）配列決定するオリゴヌクレオ チド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を担持した超常磁性単分散粒子を製造する工程、 （ｂ）（ｉ）粒子を４つのアリコートに分割し、各々のアリコートに、ポリメラ ーゼ、混合ヌクレオシドトリホスフェート、及び１つのジデオキシヌクレオシド トリホスフェートを添加する工程であって、ここでジデオキシヌクレオシドトリ ホスフェートは各アリコート毎に異なり、プライマーが必要であれば、プライマ ー又はヌクレオシド又はジデオキシヌクレオシドの少なくとも１がラベル付けさ れている工程か又は、 （ｉｉ）全粒子に、ポリメラーゼ、混合ヌクレオシドトリホスフェート、それぞ れ異なうたラベルを有する４つの異なったジデオキシヌクレオシドトリホスフェ ート、及び、必要であればプライマー、を添加する工程、 を行うことによって、それぞれ異なった鎖長と特定のジデオキシ塩基をともなっ た末端を有する、一連のラベル付けされたＤＮＡ鎖を合成する工程、（ｃ）ラベ ル付けされたＤＮＡ鎖を遊離させ、大きさ毎にそれらを分別する工程、及び （ｄ）配列を決定する工程、 を含む方法。 １８　標的核酸を単離及び／又は処理するためのキットであって、 （ａ）請求の範囲第１項に記載の磁性粒子、及び以下に記載の： （ｂ）ポリメラーゼ （ｃ）逆転写酵素 （ｅ）制限エンドヌクレアーゼ （ｆ）適当な緩衝液 （ｇ）ジデオキシヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持し ているか又は担持するように適合されているもの （ｈ）デオキシヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持して いるか又は担持するように適合されているもの （ｉ）オリゴヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持してい るか又は担持するように連合されているもの （ｉ）標準的ＰＲＣ５′−プライマー及び／又は３′−プライマーであって、ラ ベル付けされていてもよいもののうちの少なくとも１つを含む、キット。 １９　請求の範囲第１項に記載の磁性粒子の製造方法であって、所望により追加 の官能基を有するオリゴヌクレオチドを、粒子の表面上の官能基又は分子に共有 又は親和結合させる、方法。 ２０　オリゴヌクレオチドを、 （ａ）オリゴヌクレオチド上のピオチンと粒子上のアビジン又はストレプトアビ ジンとの反応 （ｂ）オリゴヌクレオチド上の５′−アミノ基と粒子上のカルボキシル又はトシ ロキシ基との反応（ｃ）ヒドロキシル又はプロテクトされたヒドロキシル基を有 する粒子上でのオリゴヌクレオチドの直接化学的合成 によって結合させる、請求の範囲第１９項に記載の方法。