JPH04501961A - ヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコード化するｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコード化 するＤＮＡ 発明の詳細な説明 本発明はヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ、 ＃ＤＮＡが挿入されている発現ベクターで形質転換された形質転換細胞により産 生きれるポリペプチド、および該ポリペプチドを前記形質転換体の使用により製 造する方法に関する。 ヒト単球走化性因子Ｃ以下、ＭＣＦと略記する）はリボ多糖（ＬＰＳ）で刺激さ れたヒト単球細胞から産生される生理学的に活性なポリペプチドであり、そして 単球を誘引するか、または腫瘍細胞増殖に対する単球の阻害効果を増大する生物 学的活性を有する。半球を誘引し、そしてさらに単球活性を増大させることによ り、ＭＣＦはある種の細菌感染症またはガンの治療のための薬剤として期待され る。 本発明者のマツシマ・コウジ博士およびヨースト・ジェ仁・オッペンハイム博士 等は、いくつかの誘導物質で刺激されたヒト単球白血病細胞の培養培地からいわ ゆる天然ヒトＭＣＦを単離し、そしてその部分アミノ酸配列を決定した。その分 子量は約１５ｋＤａであると見積もられた。 本発明者等は天然ヒトＭＣＦの範囲の決められた部分アミノ酸配列により従うこ とにヒトＭＣＦをコード化するｃＤＮＡの単離に成功した。ヒトＭＣＰポリペプ チドは約９ｋＤａの低分子量を存するポリペプチドであり、このヒトＭＣＦの前 駆体ポリペプチドの完全−次構造がクローン化ヒトＭ　ＣＦ　ｃ　Ｄ　Ｎ人のヌ クレオチド配列を分析することにより確立されたから、該前駆体のＣ末端の７６ 個のアミノ酸からなるものであることが見出された。 本発明者等は、上記クローン化ＤＮＡまたはその主要部分が挿入されている発現 ベクターで形質転換された形質転換細胞を用いて岨換えＤＮＡ技術を適用するこ とにより、ヒトＭＣＦ活性を有するポリペプチドを直接発現させることを試みた 。結果的に、上記ポリペプチドは産生され得ることが見出された。 本発明の第１の目的は、次式〔■〕　：Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ入１ａ　ＩＩｓ 　Ａｓｎ　ＪＬｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　’Ｌ’ｈｒＣｙｓ　ＣＹ＊　’！’ｙｒ 　Ａｓｎ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｇ　ｌ１ａ５ａｒ　Ｖａｌ　Ｇ ｉｎ　Ａｒｇ　Ｌ＊ｕ　Ｊｕａ　Ｓａｒ　’ｊ’ｙｒ　ｈｘｑ　Ａｒｇｌｌａ　 ’ｒｈｒ　Ｓｅｒ　５ａｒ　Ｌ７！Ｉ　Ｃ’ｆｌｌ　ｐｒｏ　Ｉ、７−Ｇｌｕ　 Ａｌａ　［１１Ｖａｌ　Ｉｌａ　Ｐｈ＠Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｉｌ＠Ｖａｌ　Ａｌａ 　ＬｙＩｓＧｌｕｌｌａ　Ｃｙｓ　Ｘ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙ ｍ　？ｒｐ　ＶａｌＧｉｎ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｍａｔ　Ａ日Ｐ　Ｈｌｓ　Ｌ４１ ｕ　Ａ１！ｐ　Ｌｙｓ　ＧｉｎＴｈｒ　Ｇｉｎ　’！’ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 Ｔｈｒ（式中、ＸはＡｌａまたはＴｈｒを意味する）により表現されるアミノ酸 配列またはその主要部分からなるヒトＭＣＦ活性を有するポリペプチドをコード 化するＤＮＡを提供することである。 本発明の第２の目的は、上記ＤＮＡが挿入されている発現ベクターで形質転換さ れた宿主細胞を用いて組換えＤＮＡ技術を適用することにより製造され得る上記 式〔■〕により表現されるアミノ酸配列またはその主要部分からなるヒトＭＣＦ 活性を有するポリペプチドを提供することである。 本発明の第３の目的は、組換えＤＮＡ技術を適用することによる上記ポリペプチ ドの製法を提供することである。 その他の目的は以下の記載から理解されるであろう。 本発明に従って、式（１）により表現されるアミノ酸配列またはその主要部分か らなるヒトＭＣＦ活性を有するポリペプチド（以下、［本発明のポリペプチドＪ と記載する）は、式（１）により表現されるアミノ酸配列またはその主要部分か らなるヒトＭＣＦ活性を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ　（以下、［ 本発明のＤＮＡと記載する）を用いて組換えＤＮＡ技術を適用することにより製 造され得る。 本発明のＤＮＡの中で、式（Ｉ）により表現されるアミノ酸配列からなるポリペ プチドをコード化するＤＮＡのヌクレオチド配列として、下式（Ａ）により表現 されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ　（ｒヒトＭＣＦコード化ＤＮＡＪと略 記されることもある）が例示される。 Ｃ入Ｇに入Ｑ入丁ＧＣ入入ＴＣ入入ＴＧＣＣＣＣＡＧＴこ五ＣＣ’！’ＧＣＴＧ ＹＴにひ五ｃｒｒｃ入Ｃご入入ＴλＧαυ心λＴＣ？ＣＡＧ’Ｊ’ＧＣＡＧＡＧ ＧＣ’ｔ’ＣＧＣＣＡＧＣ’ｌ’ＡＴ入ＧλＡＧλ入ＴＣ入Ｃ０ＡａＣ入Ｇｃ人 入ＧＴＧＴＣＣＣλ入ＡＧ入入ＧＣＴ　［λ］ＧＴＧＡＴＣＴＴＣＡＡ　ＧＡＣ ＣＦＬ！？ＧＴＧＧＣＣ入入ＧＧ入ＧＡ’ｔ’ＣＴＧＴＲＣＴＧＡＣＣＣＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧ？ｒＣλＧＧ入丁？ＣＣＫＴＧＧ入ＣＣＡＣＣＴＧＧ入 ＣＡＡＧＣ入入入ＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＧ入入ＧＡＣＴ（式中、ＹはＣまたはＴ を意味し、そしてＲはＧまたはＡを意味する） ヒトＭＣＦポリペプチドをコード化するＤＮＡは、例えば、実施例１に記載され るような方法またはその変法に従って単離され得る。また、上記ＤＮＡの全合成 を化学的に行うこともできる。ヒトＭＣＦの主要部分をコード化するＤＮＡはヒ トＭＣＦコード化ＤＮＡの切断および／またはその余分な領域または不足領域の 修復の方法、例えば、適当な制限酵素により消化し、そして化学的に合成された オリゴデオキシリボヌク、レオチドとの連結により、および特定部位の突然変異 誘発の技術により製造され得る（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、　Ａ、等、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＢｎｚｙｍｏｌ、、　１５４　、３６７−３８２．１９８７ 　）。 本発明のポリペプチドを製造するための発現ベクターは、遺伝子工学の技術およ び遺伝子発現の原理（例えば、Ｍａｎｉａ’ｓ、　Ｔ、等、モレキュラークロー ニング：実験マニュアル、コールド・スプリング・）１−ノ＜＋、１９８２）に 従って、本発明のＤＮＡの５°末端（上流）に翻訳開始コトンＡＴＧを付加し、 終結コドン含有ＤＮＡ断片を上記Ｄｊ始コドン含有ＤＮＡの３′末端（下流）に 連結し、生成するＤＮＡを適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐ、　Ｌａｃ、Ｄ ｈｏ　Ｓ、　ＰＬ、　ＳＶ４０初期プロモーター）およびＳＤ配列に結合し、次 いで生成するＤＮＡを適当なベクター（例えば、プラスミドｐＢＲ３２２）内に 挿入することにより構築される。 ＳＤ配列から翻訳開始コドンまでのヌクレオチド配列は好ましくは式（Ｉ３）に より表現されるものが好ましい。 ５′−Ｘ’　ＧＧＡＧＧＴＴＴＹ’　ＡＴＴ−３’　式（Ｂ）〔式中、Ｘｏは（ Ａ）、（Ｘｌｉｌないし５である）を意味し、そしてＹ′は（八）、（Ｔ）、（ ７は口ないし８であり、２は０または１である）を意味する〕。 本発明の形質転換体は上記のように構築された発現ベクターを適当な宿主細胞、 例えば大腸菌内に導入することにより、コーエン等の方法（Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、 Ｎ、等、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　６９ 　、２１１０．１９７２）に従って得ることができる。 本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を適当な培養条件下で培養するこ とにより製造され得る。上記ポリペプチドを含むＪｉｂ出物は細胞を破壊した後 に培養液から得ることができ、例えばリゾチーム消化および凍結−融解、和音ｉ １１＆またはフレンチプレス、次に遠心分離またはろ過による抽出物の収集によ り行われ得る。 本発明のポリペプチド（」、塩析、陽イオン交換クロマトグラフィー、限外ろ過 、ゲルろ過、必要ならば透析、電気泳動、特異的抗体を用いるアフィニティーク ロマトグラフィーおよびその他の核酸除去の処理方法の組合せを特徴とする精製 方法により抽出物から精製され得る。 次いで、使用された宿主細胞およびその他の条件によっては、Ｎ末端にある翻訳 開始コドンに基づ＜Ｍｅ　を残基を有するポリペプチドが製造され得る。そのよ うなポリペプチドは、それがヒトＭＣＦ活性を有する限り本発明のポリペプチド の中に包含されると理解されるべきである。 本発明のポリペプチドはまた、上記発現ベクターを用いて無細胞転写−翻訳系を 適用することにより製造され得る。 本発明のポリペプチドは、いくつかのＭＣＦ活性の中のある種の活性、例えば１ １１球を誘引するか、または腫瘍細胞増殖に対する７１１＃：の阻害効果を増大 する生物学的活性を有する、上記式「Ｉ〕により表現されるアミノ酸配列または その主要部分からなるポリペプチドを意味する。 式〔１）により表現されるアミノ酸配列の主要部分からなるポリペプチドは、例 えば、」−記アミノ酸配列中、Ｎ末端の１ないし１０個のアミノ酸またはＣ末端 の６個のアミノ酸が欠失されているアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含す る。 ヒトＭＣＦをコード化する突然変異対立ＤＮＡにおいてコード化されたポリペプ チドおよび該ポリペプチドの主要部分は本発明のポリペプチド中に包含されると 理解されるべきである。 さらに、式（１）により表現されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端 を、アミノ酸またはペプチド例えばヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドにおけるプレ ペプチド領域のＣ＊趨アミノ酸配列の一部に相当する部分に付加することから生 じるポリペプチドは本発明のポリペプチド中に包含されると理解されるべきであ る。 本発明のポリペプチドは、以下の方法に従うことを特徴とする組換えＤＮＡ技術 を適用することにより製造される。 分子量は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により分子量マーカータ ンパク質（標準タンパク質キット：ファルマシア、スウェ・−デン）の分子量と 対比して測定された。 単球走化性の活性は走化性ボイデンチャンバーにューロ・プローブ社、米国）内 で測定された。詳しくは、本発明のポリペプチドを王室に添加し、そしてヒト半 球を上室に添加した。王室および上室は孔の大きさが８マイクロメートルのポリ カーボネートフィルター（ヌクレオボア、米国）により分離されている。該チャ ンバーを３７℃で保温した後、フィルターの下面に付着し、メタノールで固定し 、モしてギムザ液で染色した移動細胞は顕微鏡分析により４潤された。０．５　 ％ウシ血清アルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地が本発明のポリペプチ ドの希釈および培養のために使用された。 本発明のポリペプチドを配合するために、１Ｍ用のビヒクルおよび安定剤を添加 することは好ましい。安定剤の例はアルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタ ミン、プロタミン塩、グルコース、ガラクトース、キシロース、マンニトール、 グルクロン酸、トレハロース、デキスラン、ヒドロキシエチルデンプン、非イオ ン性表面活性剤等である。 記載の簡略化のために、以下の略号が本明細書および請求の範囲において使用さ れている。 ＲＮＡ　：　リボ核酸 ｍＲＮＡ　：　メツセンジャーＲＮΔ ＤＮＡ：　デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：　相補的ＤＮＡ ５ｓｃＤＮＡ二一本膜ＤＮＡ ｄｓｅＤＮＡ：二本鎖ＤＮＡ ＡＴＰ：　アデノシン三リン酸 ｄＡＴＰ　：　デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ：　デオキシシチジン三リ ン酸ｄＧＴＰ　：　デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ　：　デオキシチミジ ン三リン酸ＳＤ配列：　シャインーダルガルノ配列ｋｂ：　キロ塩基 ｋｂｐ：　キロ塩基対 ｂｐ＝　塩基対 しＰＳ　：　リボ多糖 ＢＤＴＡ：　エチレンジアミン四酢酸 ＤＴＴ　：　ジチオトレイトール ｋＤａ：　キロダルトン ＳＤＳ　：　ラウリル硫酸ナトリウム ＭＯＰＳ：　５−Ｎ−（モルホリノ）プロパンスルホン酸 以下の実施例および参考実施例は本発明をより詳細に説明するが、しかし本発明 がそれらの実施例になんら限定されないと理解されるべきである。 ４＆鱈シルＡ４１＋　ｎ　１　ｋＩｔｎ　Ｒｎ　Ｔ　Ａ　Ｉ；−今ｔ？Ｆ、７Ｍ の憔実施例１ ヒトＭＣＦをコード化するＤＮＡのクローニングヒト前骨髄性白血病の細胞列、 ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４０）は１ｍｌあたり１ｘｌＯ’の細 胞濃度でペトリ皿（９０ｘｌＢｍｍ）に接種される。 １０％のウシ胎児血清を含むＰＲＭＩ−１６４０媒体は培養媒体として使用され る。 それぞれ５００ｎｇ／ｍｌ及び１マイクログラム／ｍｌの最終濃度までホルボー ル−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）とレチノール酸を補った 培養媒体中で、細胞は３７℃で５％二酸化炭素、および９０ないし１００％の湿 気を含む空気中で、２日間培養される。 前培養の後、調節された媒体および付着されていない細胞は吸引によって除去さ れる。分化された付着細胞はさらに、それぞれ１０マイクログラム／ｍｌ及び１ マイクログラム／ｍｌの最終濃度のＬＰＳ及びシクロヘキサイミドで１０％のウ シ胎児血清を含むＰＲＭＩ−１６４０媒体、中、上記と同じ条件下で６時間培養 される。 培養後、調節された媒体は吸引によって除去され、皿に付着した細胞は、０．５ ％のナトリウム　Ｎ−ラウロイルサルコシネー）、６ｍＭのナトリウム　シトレ ート及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノールを含む６Ｍのグアニジルチオシア ネート溶液に溶解され、および均質化される。 Ｗｉｔ　ａｌｌ　＋ｎ１　１’ｌ　１５−　罷工／ＩＮ　出　出　１−　Ｌ　Ｊ −全龜　ａａｔ　ン診　１−　愈ｂ　Ｑ　ｎ　１１１　＃シηＩＪＲ（乙ｖ　） ！　、υ、１ＪＶｌｔ／Ｊｎυ１　八”ａ：　ｊＪ＋　ＬＬ’　Ｄ　、Ｉ　ＩＶ Ｌ　ＵＪ　ｈｌｋ化セシウム溶液に適用され、全ＲＮＡ留分をペレットとして得 るため、超遠心１１（ｐＨ２７−２０−ター、日立工種、日本）を使用して２６ ５００ｒｐｍで２０時間遠心機にかける。 ペレットは０．３５ＭのＮａＣ１，２０ｍＭのトリスおよび２０ｍＭのＥＤＴＡ を含む少量の７Ｍ尿素溶液に溶解され、全ＲＮＡはエタノールから沈澱によって 回収される。 全ＲＮＡはｆｍＭのＢＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７， ４）に溶解され、溶液は６５℃で５分間加熱される。ＮａＣ１溶液を０．５Ｍの 最終濃度まで添加し、溶液は１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５ＭのＮａＣｌを含む１ ０ｍＭのトリフ、−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，４）で前もって平衡化されたオリゴ （ｄＴ）−セルロースのカラムに適用される。 ｍＲＮＡは１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス−ＨＣ］緩衝液（ｐＨ７， ４）で溶離することによってカラムから単離される。 得られたｍＲＮＡは、グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）及びホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ ）（Ｇｅｎｅ、　２５．２６３．１９８３）の方法に従って、ｃＤＮＡ合成の鋳 型として使用される。６マイクログラムのｍＲＮＡは蒸留水（６マイクログラム ／６マイクロリツトル）に溶解され、次いで１００ｍＭの水酸化メチル水銀の０ ．６マイクロリツトルを添加する。 のＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮアシン：プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国）を含む ０．５Ｍの２−メルカプトエタノールの１゜８マイクロリツトルを添加する。 室温で５分間そのままにした後、１０ｍＭの塩化マグＴＰ、０．０４ｍＭｃＤｄ ＡＴＰ、０．０４ｍＭのｄＴＴｐ、０．０４ｍＭのｄＣＴＰ、　５マイクログラ ムのウシ血清アルブミン、１．２５単位の大腸菌リボヌクレアーゼＨおよび２４ 単位の大１１［［ＤＮＡポリポリーゼＩを含む２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液 （ｐＨ７，５））に溶解される。 反応混合物は１２℃で６０分間培養され、２．５単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを 添加し、さらに２２℃で６０分間培養される。反応はＥＤＴＡの添加によって停 止する。反応生成物（−ｄｓｃＤＮＡ）はフェノール／クロロホルム（１：　Ｉ ）で抽出され、エタノールからの沈澱によって回収される。 生成物（ｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡ）は１００マイクロリツターのオリゴ（ｄＣ）ティ リング緩衝液（ｔａｉｌｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）〔組成物：　２ｍＭの塩化コバ ルト・、０．０２ｒｎＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのｄＣＴＰおよび１０単位の末端 デオキシヌクレオチジル転写酵素を含む１００ｍＭのナトリウム力コジラート緩 衝液（ｐＨ７，２））に溶解され、ｄＳＣＤＮΔの３°末端にオリゴ（ｄＣ）末 尾を添加させるため、３７℃で３０分間培養される。 反応生成物〔オリゴ（ｄＣ）末尾ｄｓｃＤＮＡ〕はフェノール／クロロホルム（ １：　１）で抽出され、エタノールからの沈澱によって回収される。 上記のように得られたオリゴ（ｄ　Ｃ）末尾ｄｓｃＤＮＡ、及びオリゴ（ｄＧ） 末尾ｐＢＲ８２２、Ｐｓｔｌ切断（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂｓ。、 米国）は、組み換え二本鎖をもつプラスミドを合成するため、オリゴ（ｄ　Ｃ） 末尾からオリゴ（ｄＧ）末尾にアニール化を行うため、・アニール化緩衝液〔組 成物：　１ｍＭのＥＤＴＡおよび１００ｍＭのＮａＣ１を含む１０ｍＭのトリス −ＨＣｌ緩衝液（ｐ１４７．４））に溶解され、混合され、そして６５℃で１０ 分間、５７℃で２時間および４５℃で２時間培養される。 」−記のように得られた組み換えプラスミドは、ヒトＣＤＮＡライブラリーを構 成するため以下の方法にしたがって大腸菌ＨＢＩＯＩに導入される。すなわち、 大腸菌）１Ｂ１０１はＬブイヨン〔組成物：１％トリプトン、０゜５％酵母抽出 物、０．５％ＮａＣ１，０，１％グルコース（ｐＨ７，２））に接種され、６０ ０ｎｍの濁度が０゜５に到達するまで３０℃で培養される。 培養液は氷水で３０分間そのままにされ、次いで細胞は遠心分離によって集めら れる。細胞は５０ｍＭの塩化カルシウムに再懸濁され、氷水で６０分間そのまま にされ、次いで細胞は遠心分離によって集められる。細胞は２０％のグリセリン を含む５０ｍＭの塩化カルシウムに再懸濁される。 細胞懸濁液に組み換えプラスミド溶液を添加し、混合する。混合物は氷水で２０ 分間そのままにされ、次いで室温で１０分間保たれる。その後、Ｌブイヨンを添 加し、３７℃で６０分間振り動かしながら培養する。 培養液の一部分を、テトラサイクリン６．２５マイクログラム／′ｍ１を含むＬ ブイヨン寒天プレート（寒天濃度：１．５％）に取り、広げ、そして３７℃で一 晩培養する。ヒトＣＤＮＡライブラリーは、テトラサイクリンに耐性を持つ形質 転換体を選択することによって作られヒトＭＣＦを暗号化するｃＤＮＡを含むプ ラスミドを持つ形質転換体のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするため 、コロニーハイブリダイゼーションアッセイは、以下の化学的に合成されたオリ ゴデオヤシリボヌクレオチドブローブを使用してハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）及 びメセルソ：／　（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ）（Ｇｅｎｅ、１０，６３．１９８０）の 方法に従って行われる。 すなわち、以下の式〔１〕ないし〔４〕によって表されるオリボデ第４−シリボ ヌクレオチドの４種は、ヒト細胞列、ＴＩ（Ｐ−１，ｔｌＴＩ胞、Ｍｅｔ−Ａｓ ｐ−Ｈｉｓ−ＬｅＵ−八５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒ ｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒから情製された、いわゆる天然ヒトＭＣＦの定義された部分 的アミノ酸シークエンスに基づいて化学的に合成され、プローブとして使用され ５　’　−Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｙ　ＣＡ　Ｙ　Ｔ　Ｔ　ＲＧ　Ａ　−３’　（ １）５’　−ＡＴＧＧＡＹＣＡＹＣＴＮＧＡ−８’　（２）５’　−ＧＡＹ八八 へへＡＲＡＣＹＣＡ−３’　（３）５’　−ＧＡＹＡＡＲＣＡＲＡＣＲＣＡ−３ ’　（４）ＹはＣ及びＴを表わし、ＲはＧ及びＡを表わし、ＮはＴ。 Ｃ１八及びＧを表わす。 それゆえ、式〔１〕で表されるプローブは８種のＤＮＡ（１４−ｍａｒ）のかた まりであり、式〔２〕ないし〔４〕で表される各プローブは１６種のＤＮＡ（１ ４−ｍａ　ｒ）のかたまりである。 上記の式の各合成されたプローブ（１００ｐｍｏｌｅ）は７−”Ｐ−ＡＴＰ（約 ５０ｐｍｏｌｅ：特殊な放射活性、５００　ＱＣｉ／ｍｍｏ　１　ｅ）およびＴ ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位）を使用して、反応条件下、■Ｐで末端 ラベル化される。 ヒトＣＤＮＡライブラリーは、以下の２セツトの両プローブでハイブリッド化さ れたヌクレオチドシーフェンスを持つｃＤＮＡを含むクローンをスクリーンする 。 −組は式〔１〕および〔２〕のかたまりプローブの混合物であり、他の組は式〔 ３〕および〔４〕のかたまりプローブの混合物である。コロニーハイブリダイゼ ーションは３６°Ｃ１４０時間の条件下で行われる。結果として３５のクローン が約３６０００クローンから選択される。 ｃＤＮＡは第一にこれらのクローンから単離され、制限酵素マツピング分析を受 けやすい。この分析によって、すべてのこれらのｃＤＮＡは通常のヌクレオチド シーフェンスを含むことが確認される。 最終的に選択された３個の組み換えプラスミド（ブラスミド番号ｐＨＭＣＦ７． Ｉ）８ＭＣＦ２５およびｐＨＭＣＦ２９）のヌクレオチドシーフェンスは、イン ストラクションマニュアル（宝酒造１日本）に従って、゛ジデオキシ鎖末端法に よって、７−ＤＥＡＺＡシークエンスキット（宝酒造）およびｐｔｙｃｉａおよ びｐＵｃ１９をクローンベクターとして、使用することによって決定される。 ヒトＭＣＦＷ＆駆体を暗号化するヌクレオチドシーフェンスおよびヌクレオチド シーフェンスから予測されたアミン酸シークエンスは表１に要約されている。ｐ 　ＨＭＣＦ７およびｐＨＭＣＦ２９に挿入されたヒトＭＣＰ前駆体を暗号化する ヌクレオチドシーフェンス中で、表１に示された塩基番号１０５及び塩基番号２ ２Ｂの塩基はそれぞれＴ及びＧである。 一方、ｐＨＭＣＦ２５のヌクレオチドシーフェンス中塩基番号１０５および塩基 番号２２６での塩基はそれぞれＣ及び八である。 表１ ＡｒｇＬｙｓ工１ｅｓａｒＶａｌＧ１ｎＡｒｇｒ、ａｕＡｌａｓｅｒ　（５０） Ｉ、ｙｓＧｌｕＪｕａＶａｌｌｌａＰｈｅＬｙａ’Ｅ’ｈｒ工１ａＶａｌ　（７ ０）表１において、数字は塩基数を表わす。括弧に入った数字はアミノ酸数を表 わす。。Ｉ＊は翻訳停止コドンを意味する。 塩基番号ｌから塩基番号２９７のヌクレオチドシーフェンスはヒトＭＣＦ＊１に 体を暗号化するヌクレオチドシーフェンスであり、そして塩基番号７０から塩基 番号２９７のヌクレオチドシーフェンス（式（Ａ）で表されるヌクレオチドシー フェンスに相当する）はヒトＭＣＦ前駆体を暗号化するヌクレオチドシーフェン スであり、塩基番号１０５のＹはＣまたはＴを表わし、塩基番号２２６のＲはＧ またはＡを表わす。 アミノ酸番号ｌからアミノ酸番号９９のアミノ酸シークエンスは、ヒトＭＣＦ前 駆体のアミノ酸シークエンス（式〔！Ｉ〕で表されるアミノ酸シークエンスに相 当する）であり、そしてアミノ酸番号２４からアミノ階番号９９のアミノ酸シー クエンスは、ヒトＭＣＦのアミノ酸シークエンス（式（１）で表されるアミノ酸 シークエンスに相当する）である。アミノ酸番号７６でのアミノ酸（Ｘ）はＡｌ ａまたはＴｈｒを意味する。 実施例２ ヒトＭＣＦポリペプチドの製造 （１）発現プラスミドｐＨＭｃ０７６の構成式（１）（ＸｆＪ（Ａｌａを表わす ）で表されるアミノ酸シークエンスに相当する、表１に示されたヒトＭＣＦ前駆 体ポリペプチドの２４番目の部位から９９番目の部位のアミノ酸シークエンスか らなるポリペプチドを製造するための発現プラスミドは、以下の方法によって構 成される。 実施例１に記載された組み換えプラスミドｐＨＭＣＦ７から、全ヒトＭＣＦポリ ペプチドを暗号化するヌクレオチドシーフェンスを含む巨大ＤＮＡフラグメント を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌで消化することによって単離される。次いで 、このＤＮＡフラグメントをファージベクターＭ１３ｍｐ１８（宝酒造）中に、 そのポリリンカーシーフェンスのＰｓｔＩ分裂部位でクローン化する。 結果として生じた組み換えファージＤＮＡを使用することによって、５’−ＴＴ ＴＡＡＡＴＴＡＴＧｉ’である特殊なヌクレオチドシーフェンスは、ヒトＭＣＦ 前駆体ポリペプチドのＮ末端から２３番目の部位のＡｌａに相当するコドンと、 ２４番目の部位でＧｉｎに相当するコドンの間に挿入され、５°−ＴＧＡＣＴＣ ＧＡＧ−８°である特殊なヌクレオチドシーフェンスは、該前駆体ポリペプチド のＣ末端のＴｈｒに相当するコドンに結合された翻訳停止コドン（ＴＧＡ）と、 ３′−翻訳されていないヌクレオチドシーフェンスの間に挿入され、それはクン ケル（Ｋｕｎｋｅｌ）氏等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＢｎｚｙｍｏｌ、　、 　１５４．３６７、１９８７）に従って部位−直接突然変異の技術によって行わ れる。 部位−直接突然変異はインストラクションマニュアル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ ｓ、）に従って試験管内突然変異キットでＭｕｔａ−Ｇｅｎｅを使用して行われ る。すなわち、大腸菌ＪＭ、１０５は組み換えファージＤＮＡで感染され、次い で組み換えファージを集めるため培養される。 その後、大腸菌ＣＪ２３６は上記で得られた組み換えファージで感染され、ウリ ジン（１マクログラム／ｍ１）とクロラムフェニコール（２０マクロクラム／ｍ １）に追加された２　ｘＴＹ媒体〔組成物：１．６％トリプトン、１％酵母抽出 物、０．５％ＮａＣ１）中、３７℃で５時間、培養さオニ、る、１ ウラシルをへな一ネ舘゛７丁−ジＤ　Ｎ　Ａは、培養媒体か一一、単一　頬Ｃさ 　濱１．　る　。 別々番２二、以１・の式「、５〕と（Ｇｊ″ｒ！表される突然変異性オリゴデオ キジリボフクレオヂドブラインーの２種は化学的に合成される。 ５’−ＣＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴ’ＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴ ＧＣ−３″　式〔５〕５’−ＣＣＧＡＡＧＡＣＴＴＧＡＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣ ＡＣＴＣＡＣＴＣＣＡＣ−８”　式〔６〕各突然変異性プライマーの５′−末端 は前もってリン酸化される。リン酸化プライマーは、上記のように合成されたウ ラシルを含む一重鎖ファージＤＮＡで、アニール緩衝液〔組成物＋２ｍＭ塩化マ グネシウム及び５０ｍＭＮａＣ１を含む２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７，４））中、７０℃で１０分間、次いで１℃／分の速度で３０℃に冷却するこ とによってアニール化される。 その後、プライマーは、合成緩衝液〔組成物：０．４ｍＭの各デオキシヌクレオ シドトリホスフェート（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＴＴＰ）　、０．７ ５ｍＭのＡＴＰ、８．７５ｍＭの塩化マグネシウム及び１，５ｍＭのＤＴＴを含 む１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，４））中、相補的鎖を合成するた め、Ｔ　４　ＤＮＡポリメラーゼで延長され、末端は氷の上で５分間、２５℃で ５分間および３７℃で９０分間の連続培養によってＴ４ＤＮＡリガーゼで連結さ れる。 反応４；１−２０℃に凍ら什ることによって停止される。 上記のように得られた環状二本鎖ＤＮＡＩえ１．大腸菌ＪＭ１０５に導入され、 そして突然変異された二本鎖複製形態ＤＮＡを単離するため培養される５、突然 変異されたＤＮＡのヌクレＡチドシークエンスは培養媒体から単離されたー・重 鎖ＤＮＡをシーフェンスすること（ジデオキシ法）によって確認される。 結果として生じた突然変異された二本鎖ＤＮＡは、ヒ）ＭＣＦポリペプチドのた めのコード部位を含むＤＮＡフラグメントを単離するため、制限エンドヌクレア ーゼＤｒａｌ及びＸｈｏｌで消化される。単離されたＤＮＡフラグメントは正文 に’　ＭＣＦ　（Ｄｒ　ａ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ）−フラグメント”として参照され る。 別々に、参照の実施例１で記載されたような発現プラスミドｐＥＰ２０５は制限 エンドヌクレアーゼＤｒａＩおよびＸｈｏＩで消化され、アンピシリン耐性遺伝 子および複製起点（″ＥＰ２０５ベクターーＤＮＡフラグメント”として正文に 参照）を持つ結果として生じたより巨大なりＮＡフラグメントは単離され、そし てこのＥＰ２０５ベクター−ＤＮＡフラグメントは、ヒトＭＣＰを作るための発 現プラスミドｐＨＭｃＯ７６を構成するため、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによって、 前もって作られたＭＣＦ　（Ｄｒ　ａ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ）−７ラグメントと連結 される。 結果として生じた発現プラスミドｐＨＭｃＯ７６は実施例１で記載された方法に 従って大腸菌ＨＢＩＯＩに導入される。 発現プラスミドで形質転換された大腸菌ＨＢＩＯＩは２５マイクログラム／ｍｌ のアンピシリンを含むＬＢ寒天プレー）・（寒天濃度：１，５％）の上で培養さ れる。 ８７℃で一晩培養した後、アンピシリン耐性コロニーは形質転換体を得るため選 択される。アンピシリン耐性クロー・ンの一つである形質転換体は大腸菌ＨＢＩ ＯＩ／ｐＨＭＣ０７６を名付けられ、式ＣＩ）（ＸｆＪ＜Ａｌａを表わす）で表 されるアミノ酸シークエンスからなるヒトＭＣＦポリペプチドを作るために使用 される。 （２）ヒトＭＣＦポリペプチドの製造 −１−記のように得られた大腸菌ＨＢ　１０１／ｐＨＭＣＯ７６を３７°Ｃで一 晩培養する。培養は養分媒体（組成物＝１．５％リン酸すトリウム２塩基性１２ 水和物、０゜３％リン酸カリウム１塩基性、０．１％塩化アンモニウム、２　ｍ 　ｇ　／　ｌのビタミンＢ　１．０．５％カサミノ酸（ｅａｓａｍｉｎｏ　ａｃ ｉｄｓ）　、　２　ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、１％ト リブＦ・ン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣ１及び０．４％グリセロール〕の １００倍量に接種され、その後、３−インドールアクリル酸を最終濃度２０マイ クログラム／ｍｌに添加する。 培養は３５ないし３７℃で、２０ないし３０時間で行われる。細胞は遠心分離に よって集められ、０．１％リソチーム及び３０ｍＭＮａＣ＋を含む５０ｍＭ）リ スーＭＣＩ緩衝液（ｐ）１８．０）に懸濁される。懸濁液は氷水に３０分間その ままにされる。さらに、ドライアイス／エタノール浴で凍結し、そして３７℃で 解凍することが細胞を分裂させるため、繰り返される。 １０％エチレンイミンポリマーの１１５０量を添加した後、浄化された細胞−抽 出物を遠心分離により得る。 この細胞−抽出物に、リン酸アンモニウムを添加して７０％飽和状態にし、形成 された沈澱物を遠心分離により集める。沈澱物は蒸留水に溶解され、次いで５ｒ ｎＭホスフェート緩衝生理食塩水（ｐＨ６，５）で透析される。 透析物はセファクリル（Ｓｅｐｈａｅｒｙｌ、）　Ｓ　−２００（Ｐｈａｒｎ＋ ａｅｊａ）のカラムに適用され、ヒトＭＣＦポリペプチドを含む留分を５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析および単球走性活性から判断することによ って集められ、プールされる。 プールされた留分は２０ｍＭホスフゴート緩衝液（ｐＨ６，５）で透析され、次 いで透析物は１１１Ｔもって同緩衝液で平衡化されたＣＭ−セファロース（Ｐｈ ａｒｍａｅｆａ）のカラムに適用される。ヒトＭＣＦポリペプチドはＮａＣ１モ ル濃度（０ないし０．５Ｍ）の傾きでカラムから溶出される。 ヒトＭＣＦポリペプチドを含む留分は集められ、プールされ、そして限外ろ過に よって濃縮される。さらに、濃縮物は精製されたヒｌ−Ｍ　ＣＦポリペプチドを 得るためトヨビール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＨＷ　−５５カラム（ＴＯ５ＯＨＣ ｏ、。 日本）でゲルろ過されやすい。 （３）ヒトＭＣＦポリペプチドの製造 上記のように得られた形質転換体（大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＨＭｃＯ７Ｂ）を培養 する。次いで、発現プラスミドを慣用の方法で形質転換体から単離し、セシウム クロライド−エチジウムプロミド勾配（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、氏等、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　 Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ７５−９６ ．１９８２）に平衡化するため超遠心分離によって精製する。 ヒトＭＣＦポリペプチドは、原核生物ＤＮＡ−直接翻訳キット（コード番号Ｎ　 ３８０　；　Ａｍｅｒｓｈｅｍ　Ｉｎｔｌ、　ｐｌｃ。 英国）で上記の発現プラスミドＤＮＡの使用によって作られる。発現プラスミド および上記の翻訳キットを使用したポリペプチドの製造はインストラクションマ ニュアル（Ａｍｅｒｓｈｅｍ　Ｉｎｔｌ、　ｐｉｅ）に従い、必要ならばＲＮア ーゼ阻害剤（ヒトの胎盤から：　Ａｍｅｒｓｈｅｍ　Ｉｎｔｌ、　ｐｉｅ）を添 加することによって行われる。 ヒトＭＣＦポリペプチドが上記に示されたようなヒト単球のための走化活性を作 ることが前もって記載された方法によって確かめられる。 ヒトＭＣＦポリペプチドは前（２）に記載された方法によってｔｒｉされる。 ヒトＭＣＦポリペプチドの分子量は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に よって約１３＋１ｋＤａになることが決定される。 実施例３ ヒトＭＣＦ活性を持つポリペプチドの製造表１に示されたヒトＭＣＦＲｇ体ポリ ペプチドのＮ末端から２７番目の部位または３ｏ番目の部位のアミノ酸がＮ末端 であり、実施例２に記載されたヒトＭＣＦポリペプチドからＮ末端領域を切った ポリペプチドであるアミノ酸シークエンスからなるヒトＭＣＰ活性を持つポリペ プチドを作るための幾つかの発現ブラミドが構成された。 すなわち、実施例２に記載された発現プラスミドＨＭＣ０７６から、実施例２に 記載されたＭＣＦ　（Ｄｒ　ａ　１−Ｘｈｏｌ）−フラグメントを含むＤＮＡフ ラグメントは＃ｆｆｌエンドヌクレアーゼ主ＬヱＩしよび５ａｉｌで消化される ことによって単離される。 次いで、このＤＮＡフラグメントをファージベクターＭ１３ｍｐ１９（宝酒造） 中に、そのポリリンカーシーフェンスの５ａｌＩとＸｂａｌの制限エンドヌクレ アーゼ分裂部位でクローン化する。 鋳型として結果として生じた組み換えファージＤＮＡと以下に示された幾つかの 突然変異性プライマーを使用して、ヒトＭＣＦポリペプチドのＮ末端アミノ酸の ためのヌクレオチドシーフェンスコードは、実施例２に記載された部位−直接突 然変異の技術によってＭＣＦ（Ｄｒａ　１−Ｘｈｏ　Ｉ）−フラグメントから欠 失される。結果として生じた欠失されたＤＮＡフラグメントは、幾つかの発現プ ラスミドを構成するため、実施例２に記載のＥＰ２０５ベクターＤＮＡフラグメ ントで連結される。 部位−直接突然変異に使用された突然変異性プライマーのヌクレオチドシーフェ ンスは次の通りである。 表１　（ＸがＡｌａを表わす）に示されたヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの２７ 番目の部位から９９番目の部位のアミノ酸シークエンスからなるポリペプチドを 作るための発現プラスミドを構成する場合（以下”Ｎ３−ＭＣＦポリペプチド“ と略す）： ５’　−ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴ八ＴＧＧＣＡＡＴＣへＡＴＧＣＣＣ−３’ ヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチド（表１のＸがＡｌａを表わす）の３０番目の部位 から９９番目の部位のアミノ酸シークエンスからなるポリペプチドを作るための 発現プラスミドを構成する場合（以下”ＮＯ−ＭＣＦポリペプチド”と略す）： ５’　−ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＣ；ＧＣＣＣＣＡＧＴＣＡＣＣ，ＴＧＣ−３ ’ 実施例２に記載された方法に従って、各突然変異性二本鎖複製形ｆｌＤＮＡは作 られ、そして単離される。次いで、各結果として生じた突然変異性二本鎖ＤＮＡ は、望ましいポリペプチドのためのコード領域を含む各ＤＮＡフラグメントを単 離するため、制限エンドヌクレアーゼＤｒａｌ及びＸｈｏｌで消化される。 望ましいポリペプチドを作るための発現プラスミドは、これらのＤＮＡフラグメ ントのそれぞれを連結させることによって、発現ベクターｐＥＰ２０５から誘導 されたＥＰ２０５ベクターＤＮＡフラグメントで構成される。 Ｎ３−ＭＣＦポリペプチドを作るための発現プラスミドはｐＨＭｃ０７３で表さ れ、Ｎ６−ＭＣＦポリペプチドを作るための発現プラスミドはｐＨＭｃＯ７０で 表される。 （２）ヒトＭＣＦ活性をもつポリペプチドの製造上記のように構成された発現プ ラスミドは、実施例２に記載された方法に従って大腸菌ＨＢＩＯＩに導入される 。さらに、結果として生じた形質転換体を培養することによって、ヒトＭＣＦ活 性をもつポリペプチドは実施例２に記載の方法に従って作られる。 上の発現プラスミドを使用することによって、ポリペプチドは原核生物ＤＮＡ− 直接翻訳キット（ＡｍｅｒｓｈｅｍＩｎｔｌ、　ｐｉｅ、英国）は試験管中で合 成された。発現プラスミドは慣用の方法によって単離され、そして形質転換体（ 大腸菌ＨＢ　１０１／ｐＨＭＣ０７Ｂ）を培養する。 次いで、発現プラスミドを慣用の方法で形質転換体から単離し、セシウムクロラ イド−エチジウムプロミド勾配（Ｍａｎｊａｔｊｓ、　Ｔ、氏等、Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ７５−９６．１９ ８２）に平衡化するため超遠心分離によって精製する。 発現プラスミドおよび上記の翻訳キットを使用したボリベブチドの製造はインス トラクンヨンマニュアル（Ａｍｅｒｓｈｅｍ　Ｉｎｔｌ、　ｐｌｃ）に従い、ト リチウムでラベルされたロイシンを使用し、及びＲＮアーゼ阻害剤（ヒトの胎盤 から：　Ａｍｅｒｓｈｅｍ　Ｉｎｔｌ、、　ｐｉｅ）を添加することによって行 われる。 生成物は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ 、　ｕ、　Ｋ、　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０．１９７０）のオートラ ジオゲラフィンによって、または生物活性に基づいて同定される。 （３）ヒトＭ　ＣＦ−活性を持つポリペプチドの製造上記のように得られた形質 転換体を培養し、発現プラスミドを実施例２に記載された方法に従って単離され る。 さらに、上記の発現プラスミノのそれぞれを使用することによって、Ｎｌ−ＭＣ ＦポリペプチドおよびＮａ−ポリペプチドが実施例２に記載された方法に従って 製造される。これらのポリペプチドはヒト単球のための走性活性をもつことが確 かめられた。 Ｎ　３−ＭＣＦポリペプチドおよびＮａ−ポリペプチドの両分子量は、５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって約１２＋１ｋＤａになることが決定さ れる。 先のポリペプチドの移動性が後者のポリペプチドよりも少し遅いので、先のポリ ペプチドは幾分高分子量である。 実施例４ ヒトＭＣＦ活性を持つポリペプチドの製造（１）発現プラスミドの構成 表１　（ＸがＡｌａを表わす）に示されたヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの３４ 番目の部位から９９番目の部位のアミノ酸シークエンスからなるヒトＭＣＦ活性 を持つポリペプチドを作るだめの発現プラスミドは、実施例２に記載された方法 に従って構成される。しかし、部位−直接突然変異のために使用された化学的に 合成された突然変異性プライマーのヌクレオチドシーフェンスは次のとおりであ る。 ５’　−ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＣＣ− ３’ ＮＩＯ−ＭＣＦポリペプチドを作るための発現プラスミドはｐＨＭｃＯ６６で表 される。発現プラスミド（ｐＨＭＣＯ６８）は形質転換体を得るため、実施例２ に記載された方法に従って、大腸菌ＨＢＩＯＩに導入される。 （２＞Ｎｌ　Ｏ−ＭＣＦポリペプチドの製造発現プラスミド（ｐＨＭｃｏ　６６ ）は実施例２に記載された方法に従って単離される。さらに、発現プラスミドの 使用によって、ＮＩＯ〜ＭＣＦポリペプチドは実施例２に記載された方法に従っ て作られる。このポリペプチドはヒト単球のための走性活性を持つことが確かめ られる。 ＮＩＯ−ＭＣＦポリペプチドの分子量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動によって約１１＋１ｋＤａになることが決定される。 参考実施例１ 発現ベクター　ＥＰ２０５の構築 プラスミドｐＢＲ３２２を制限エンドヌクレアーゼＡｖｅ　Ｉおよびｐｖｕ　］ ’［で消化し、そして生成するより大きいＤＮＡ断片（大きさ約３．７ｋｂｐ） を単離した。ｄＧＴＰＳｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの存在下、大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ断片）でその粘着末端をブラント末喘に充ＪＲ した後、両末端をＴ　４　ＤＮＡリガーゼにより連結し、新しいプラスミドベク ター（ｐＢＲ３６と表される）を＃構築した。このベクターはプラスミドｐＢＲ ３２２の複製開始近傍に位置するコピー数調節遺伝子領域を欠失されていた。 プラスミドベクターｐＢＲ３６を制限エンドヌク１７アーゼＥｃｏ旧　およびｐ ｓｔ　Ｉで消化し、そしてアンピシリン耐性遺伝その」二流領域を含むより小さ いＤＮＡ断片（大きさ約０．７５ｋｂｐ）を単離した。生成するＤＮＡ断片は［ Ａｍｐ（Ｐｓｔｌ−Ｂｃｏ［？ｌ）断片」ど記載される。 このＡｍｐ（Ｐｓｔｌ　ＢｃｏＲＩ）断片は実施例２に記載したようなファージ ベクターＭｌ　３ｒｎｐ　１８中にクローン化された。制限エンドヌクレアーゼ Ｄｒａ　ｌで認識可能な特定のヌクレオチド配列（ＴＴＴＡＡＡ）を消失するた めに、生成する組換えファージＤＮＡを使用することにより、粕ｒｌ（Ｐｓｔ［ −１ＥｃｏＲＩ）断片のヌクレオチド配列中の１個の塩基（Ａ）を、実施例２に 記載したような方法に従って特定部位の突然変異誘発により別の１ｎ、Ｗ（Ｇ） に変化させた。 詳しくは、ウラシルを含む一重鎖フデージＤＮ人が上記組換えファージＤＮＡに 感染させた大腸菌ＣＪ２８（３の培養培地から単離された。 突然変異原性プライマーとしての下式〔７〕により表現されるオリゴデオキシリ ボヌクレオチドは化学的に合成された。 ５’　−ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴ（、−３′式〔７〕 リン酸化プライマーはウラシル含有ＤＮＡ鋳型とアニール化された。実施例２に 記載された方法に従って、所望の突然変異二本鎖ＤＮＡが単離された。 上記のＡｍｐ（Ｐｓｔｌ−［！ｃｏＲＩ）断片に相当するが、制限エンドヌクレ アーゼＤｒａ　Ｉ切断認識配列を含まないＤＮＡ断片（以下、突然変異Ａｍｐ（ Ｐｓｔｌ−１１ｃａｌ？り断片と記載する）を単離するために、生成する突然変 異二本鎖ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｓｉ　Ｉおよび１ｃｏＲＩで消化し た。 プラスミドベクターｐＢＲ３（ｉのアンピシリン耐性遺伝子中のＤγａｌ切断認 識配列の切除された新しいベクターを構築するために、突然変異Ａｍｐ（Ｐｓｔ ｌ−ＥｃｏＲＩ）断片は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびｐｓｔ　Ｉ での消化によりベクターｐＩ３Ｒ３６から単離されたより大きいＤＮＡ断片と連 結された。 さらに、この新しいベクターｐＢＲｓ６０１を制限エンドヌクレアーゼＤｒａ　 Ｉで消化し、そして生成するより大きいＤＮＡ断片を単離した。より大きいＤＮ Ａ断片を５ｒａａ　Ｉリンカ−（宝酒造株式会社）とＴ４ＤＮＡリガーゼにより 連結し、新しいプラスミドベクターを構築した。 ＢＲ３８の誘導体であり、そして制限エンドヌクレアーゼＤｒａ　Ｉのための認 識配列を全く含まない。この新しいプラスミドベクターは１）ＢＲ３６０２と表 される３ｍａ　Ｉリンカ−のヌクレオチド配列は下に示されている。 ５’　−Ｃ（：、ＣＧＧＧ−８′ さらに、この新しいベクターｐＢＲ３６０２を制限エンドヌクレアーゼＡａｔ　 Ｉｆおよび３ａＬ　Ｉで消化し、そして生成するより大きいＤＮＡ断片を単離し た（以下、［ｐＢＲ３６０２（Ａａｔ　ｌｌ−５ａｌＩ）断片と記載される）。 別に、参考実施例２に記載されるようなヒトインターロイキン−１αを産生する ための発現プラスミドｐＨｌＰＨ３８３ａを制限エンドヌクレアーゼＡａｔ　■ および５ａＩＩで消化し、そして大腸菌トリプトファンプロモーター配列および ヒトインターロイキン−１のためのコード領域を含む生成りＮＡ断片を単離した 。この生成するＤＮＡ断片はｒｔｒｐプロモーター／ＩＬ１α−ＤＮＡ断片」と 記載される。 このｔｒｐプロモーター／ＩＬ１ａ−ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼによりｐ ＢＲ３６０２（Ａａｔ　ＩＦ−Ｓａｉｌ）断片と連結して新しい発現プラスミド を横築した。この新しい発現プラスミドはｐＥＰ２０５と表される。 参考実施例２ 発現プラスミド　ＨＩ　Ｐ　Ｈ３８３ａの構築ヒトインターロイキン−１前駆体 ポリペプチドをコード化するクローン化ｃＤＮＡを欧州特許公告第０１８８９２ ０号に記載の方法に従って単離された。ヒトインターロイキン−１ｃＤＮＡを含 有する組換えプラスミドｐＨＬ　４　（Ｐｕｒｕｔａｎｉ　Ｙ、等、　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３．５８６９、１９８５）から、ｃＤＮＡ 挿入物が制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ　Ｉとの消化により単離され、そしてさ らに、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ旧およびＢｓｔ　Ｎｒで消化され、成熟ヒ トインターロイキン−１αのコード領域の中央部分を含むＤＮＡ断片（大きさ約 ４１１ｂｐ）が単離された。単離されたＤＮＡ断片は欧州特許公告第０１８８９ ２０号に示された表５の塩基Ｎ１１３９８から塩基Ｎａ８０ｇのヌクレオチド配 列に相当する。 このＤＮＡ断片は、連続的に、下の式〔８〕および

〔９〕により表現される化学 的に合成されたオリゴデオキシリボヌクレオチドアダプターとＴ４ＤＮＡリガー ゼにより連結された。生成するＤＮＡ断片はｒＳＤ−Ｉ　Ｌ−断片」と記載され る。 合成オリゴデオキシリボヌクレオチドアダプター〔８〕は、下の式（ａ）ないし くｅ）により表現される５種のＤＮＡ断片の連続的連結により調製された。 ５’−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣ３’−ＴＴＧ入ＴＣＡＴＧＣＧ ＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴ　［ａ］５’−ＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡ ３　’　−ＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣ［ｂ　］］５ｒ−７ｒＡ’！ ’ＧＴＣＡＴＣＡＣＣＴＩ’Ｍ’ＡＧ３Ｉ届ＴＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣωλ刀　 Ｅｅ１３−−ＡＣＴＣＧ’ｌ’ＴＡＣＡＣ’ｆｆｉ’ＡＴＧ？Ｉ’ＧＡＡＡ？Ａ Ｃ’Ｉ’Ｃ［ｄ］式

〔９〕のヌクレオチド配列は以下のとおりだった＝５’　− ＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＧＡ３’　−ＣＣＧＣＡＣＴＡＣＴＧＡＧＣＴＣ ＴＡＧ式

〔９〕 別に、発現ベクターｐ　Ｅ　Ｐ　３０２　（Ｐｕｒｕｔａｎｉ　Ｙ、等。 Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３．５８６９．１９８５）を制限 エンドヌクレアーゼ１ｌｐａ　ＩおよびＢａｒｎ　ＩＩＩで消化し、そして大腸 菌トリプトファンプロモーター配列およびアンピシリン耐性遺伝子を含む生成す るより大きいＤＮＡ断片が単離された（以下、ｒＥＰ３０２ベクターＤＮＡ断片 」と記載される）。 ＥＰ３０２ベクターＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより、上記のようにし て製造した５Ｄ−ＩＬＩ−断片と連結し、成熟ヒトインターロイキン−１αポリ ペプチドを産生ずる発現プラスミドｐＨｌＰＨ３８３ａを構築した。 特許庁長官　殿　平成３年９月＋ｇ日 １、事件の表示　平成２年特許願第５０２２７６号２、発明の名称 ヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドオ・、工び該ポリペプチドをコー ド化するＤＮＡ８、補正をする一者 事件との関係　特許出願人 名称　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　東京都千代田区神田駿河台ｌの６゜お茶の水スクエアＢ館 「自発」 ６、補正の対象 明細書および請求の範囲の欄 ７、補正の内容 （１）請求の範囲を別紙の通り補正する。 （２）明細書第２頁Ｉ：″から第５行ないし７第４行の［その主要部分からなる ヒトＭＣＦ活性を存するポリペプチドをコード化するＤＮＡＪを［そのいずれか の部分からなるヒトＭＣＦ活性を有するポリペプチドの発現のためにコード化す る単離されたＤ　ＮＡ配列」と補正する。 （３）同第２頁下から第１行の［宿主細胞Ｊを「微生物宿主」と補正する。 （４）　同第３頁第２行から第３行の［その主要部分からなるヒトＭＣＦ活性を 有するポリペプチド」を［いずれかの部分からなるヒトＭＣＦ活性を有する実質 的に純粋なポリペプチド」と補正する。 （５）同第３頁第１０行、第１３行の［その主要部分からなる」を［そのいずれ かの部分からなる」と補正する。 以上 ［請求の範囲 １、次式〔Ｉ〕　： Ｇｉｎ　１？ｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　入１ａ、Ｐｒｏ　Ｖａｌ 　ＴｈｒＣｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　 Ｌｙｓ工１ｅＳａｒ　ＶａＪ−ＧｌｎＡｒｇ　Ｌｅｕ’　Ａ、Ｌａ　Ｓｅｒ　Ｔ ｙｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒ ｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕλ１ａＶａｌ　工１ｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　工１ｅ　 Ｖａｌ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ工ｌｅ　Ｃｙｓ　Ｘ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ 　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ（式中、ＸはＡｌａまたはＴｈｒを意味する ）により表現されるアミノ酸配列またはそのいずれかの部分からなるヒト単球走 化性因子活性を有するポリペプチドの発現のためにコード化する単離されたＤＮ Ａ配列。 ２、次式〔■〕　： Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　入１ａ入１ａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌ ｅｕＰｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈ ｒ　ＡｓｎＡｒｇ　Ｉ、ｙｓ　工ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅ ｕ　Ａｌａ　５ｅｒＴｙｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ 　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。 Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｖａｌ　工１ａ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　工ｌｅ　 ＶａｌＡｌａ　ＬＹ！Ｉ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｃｙｓ　Ｘ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ 　ＧｉｎＬｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＭｅヒＡｓｐ　Ｈ ｌｓ　ＬｅｕＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙ ｓ　Ｔｈｒ　［１（式中、ＸはＡｌａまたはＴｈｒを意味する）により表現され るアミノ酸配列またはその突然変異体ＤＮＡからなるヒト単球走化性因子前駆体 の発現のためにコード化するＤＮＡの５″末端から２８ないし３３コドンを欠失 させ単離されたＤＮＡ配列。 ３、請求項１記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。 ４、請求項２記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。 ５、請求項３記載のベクターにより形質転換された微生物宿主。 ６、請求項４記載のベクターにより形質転換された微生物宿主。 ７、ヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドの発現に適する条件下で、請 求項５記載の形質転換された微生物宿主を培養し、そして該ポリペプチドを回収 することを特徴とするヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドの製造方法 。 ８、ヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドの発現に適する条件下で、請 求項６記載の形質転換された微生物宿主を培養し、そして該ポリペプチドを回収 することを特徴とするヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドの製造方法 。 ９、請求項７記載の方法により製造されたヒト単球走化性因子活性を有するポリ ペプチド。 １０、請求項８記載の方法により製造されたヒト単球走化性因子活性を有するポ リペプチド。 １１、ヒト単球走化性因子活性を表現できる請求項１で示されたアミノ酸配列（ １）又は該アミノ酸配列のいずれかの部分からなるヒト単球走化性因子活性を有 する実質的に純粋なポリペプチド。 １２、　Ｎ末端１ないし１０のアミノ酸を欠失した請求項１で示されたアミノ酸 配列（Ｉ）からなるヒト単球走化性因子活性を有する実質的に純粋なポリペプチ ド。」 国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．次式（Ｉ）： 【配列があります】（Ｉ） （式中、ＸはＡｌａまたはＴｈｒを意味する）により表現されるアミノ酸配列ま たはその主要部分からなるヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチドをコー ド化するＤＮＡ。
2. ２．次式（ＩＩ）： 【配列があります】（ＩＩ） （式中、ＸはＡｌａまたはＴｈｒを意味する）により表現されるアミノ酸配列か らなるヒト単球走化性因子前駆体をコード化するＤＮＡの５′末端から２４ない し３８ロドンを欠失させたＤＮＡまたはその突然変異対立ＤＮＡ。
3. ３．請求項１記載のＤＮＡが挿入されている発現ベクターで形質転換された宿主 細胞を用いることを特徴とする、ヒト単球走化性因子活性を存するポリペプチド の製造方法。
4. ４．請求項２記載のＤＮＡが挿入されている発現ベクターで形質転換された宿主 細胞を用いることを特徴とする、ヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチド の製造方法。
5. ５．請求項１記載の式（Ｉ）により表現されるアミノ酸配列またはその主要部分 からなるヒト単球走化性因子活性を存するポリペプチド。
6. ６．請求項１記載の式（Ｉ）により表現されるアミノ酸配列においてＮ末端の１ ないし１０個のアミノ酸が欠失されているアミノ酸配列からなるヒト単球走化性 因子活性を有するポリペプチド。