JPH0660887B2 - 電気泳動方法 - Google Patents
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- JPH0660887B2 JPH0660887B2 JP62230592A JP23059287A JPH0660887B2 JP H0660887 B2 JPH0660887 B2 JP H0660887B2 JP 62230592 A JP62230592 A JP 62230592A JP 23059287 A JP23059287 A JP 23059287A JP H0660887 B2 JPH0660887 B2 JP H0660887B2
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N27/447—Systems using electrophoresis
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は核酸(DNA，RNA)塩基配列決定のためにポリ(メ
タ)アクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体
膜を用いる電気泳動方法に関するものであり，さらに詳
しくは，核酸塩基フラグメントの良好に分離するために
反転パルス電場を作用させて行う電気泳動方法に関する
ものである。
タ)アクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体
膜を用いる電気泳動方法に関するものであり，さらに詳
しくは，核酸塩基フラグメントの良好に分離するために
反転パルス電場を作用させて行う電気泳動方法に関する
ものである。
［従来の技術］ 近年において遺伝子関連の研究が進むにつれて核酸(DN
A，RNA)の塩基配列決定のための操作の迅速化が求めら
れている。核酸の塩基配列決定法においてはポリアクリ
ルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体膜(以下,ポリアクリ
ルアミドゲル膜,又は,ゲル膜ということがある）を用い
たスラブ電気泳動が必須の操作になっている。
A，RNA)の塩基配列決定のための操作の迅速化が求めら
れている。核酸の塩基配列決定法においてはポリアクリ
ルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体膜(以下,ポリアクリ
ルアミドゲル膜,又は,ゲル膜ということがある）を用い
たスラブ電気泳動が必須の操作になっている。
核酸塩基配列の読み取り又は決定のための核酸フラグメ
ント調製方法として，化学分解法によるマクサム−ギル
バート(Maxam-Gilbert)法と酵素法によるジデオキシ(Di
deoxy)法とがあり,1回の分解操作で多くの塩基配列が決
められるジデオキシ(Dideoxy)法が主流になっている。
ント調製方法として，化学分解法によるマクサム−ギル
バート(Maxam-Gilbert)法と酵素法によるジデオキシ(Di
deoxy)法とがあり,1回の分解操作で多くの塩基配列が決
められるジデオキシ(Dideoxy)法が主流になっている。
ポリアクリルアミドゲル膜を電気泳動用媒体として用い
る電気泳動操作は例えば次のようにして実施される。
る電気泳動操作は例えば次のようにして実施される。
サンプルスロット(サンプル注入孔)が上端部に設けられ
たポリアクリルアミドゲル膜をガラス板やポリエチレン
テレフタレート等の有機ポリマー板等の光透過性水不透
過性支持体で挟んで垂直に配置し，サンプルスロットに
塩基数の異なる核酸フラグメントを含む試料(例,マクサ
ム−ギルバート(Maxam-Gilbert)法で分解した32Pラベル
DNA)を一定量注入し,次いで電場を作用させて電気泳動
操作を行う。この電気泳動操作はポリアクリルアミドゲ
ル膜に単位長さ当り一定の電界を与える直流電圧(例,25
V/cm〜70V/cm)を一定方向(一般に下側が高電位,上側が
低電位)に作用させることで行われる。電界を作用させ
ている間、負電荷を有する高分子電解質であるDNA分子
(DNAフラグメント)は低電位側(陰極)から高電位側(陽
極)に向かって移動し,移動の間にDNA分子はポリアクリ
ルアミドゲルマトリックス中でその塩基数，すなわち分
子量の差によって分離される。一定時間の電気泳動を行
った後，ゲル膜を支持体からはずし，薄いポリマーフィ
ルムで覆った状態にてオートラジオグラフィー処理，又
はイメージングプレートを有するコンピューテッドラジ
オグラフィー装置による処理を行って，分離パターンを
可視化する。色素又は蛍光色素でラベルした核酸フラグ
メントを含む試料を用いて電気泳動分離する場合には，
分離パターンを光−電気変換素子を含む装置により分離
パターンを可視化することができる。
たポリアクリルアミドゲル膜をガラス板やポリエチレン
テレフタレート等の有機ポリマー板等の光透過性水不透
過性支持体で挟んで垂直に配置し，サンプルスロットに
塩基数の異なる核酸フラグメントを含む試料(例,マクサ
ム−ギルバート(Maxam-Gilbert)法で分解した32Pラベル
DNA)を一定量注入し,次いで電場を作用させて電気泳動
操作を行う。この電気泳動操作はポリアクリルアミドゲ
ル膜に単位長さ当り一定の電界を与える直流電圧(例,25
V/cm〜70V/cm)を一定方向(一般に下側が高電位,上側が
低電位)に作用させることで行われる。電界を作用させ
ている間、負電荷を有する高分子電解質であるDNA分子
(DNAフラグメント)は低電位側(陰極)から高電位側(陽
極)に向かって移動し,移動の間にDNA分子はポリアクリ
ルアミドゲルマトリックス中でその塩基数，すなわち分
子量の差によって分離される。一定時間の電気泳動を行
った後，ゲル膜を支持体からはずし，薄いポリマーフィ
ルムで覆った状態にてオートラジオグラフィー処理，又
はイメージングプレートを有するコンピューテッドラジ
オグラフィー装置による処理を行って，分離パターンを
可視化する。色素又は蛍光色素でラベルした核酸フラグ
メントを含む試料を用いて電気泳動分離する場合には，
分離パターンを光−電気変換素子を含む装置により分離
パターンを可視化することができる。
オートラジオグラフィー処理はポリアクリルアミドゲル
膜を覆っている薄いフィルムの上にX-線用写真フィルム
を密着させて重ねて置き,低温(例えば,氷点下80℃)で一
定時間(例えば,約10時間〜約20時間)露光(32P又は35Sか
らのβ線による感光)を行い,露光終了後X線用写真用フ
ィルムを現像してDNAフラグメントの 分離泳動パターン
を可視画像化する処理である。
膜を覆っている薄いフィルムの上にX-線用写真フィルム
を密着させて重ねて置き,低温(例えば,氷点下80℃)で一
定時間(例えば,約10時間〜約20時間)露光(32P又は35Sか
らのβ線による感光)を行い,露光終了後X線用写真用フ
ィルムを現像してDNAフラグメントの 分離泳動パターン
を可視画像化する処理である。
このようにして得られた DNAフラグメントの分離泳動パ
ターンに基づいて DNAの塩基配列の読み取り又は決定を
することができる。
ターンに基づいて DNAの塩基配列の読み取り又は決定を
することができる。
しかしながら，従来の方法で得られる DNAフラグメント
の分離泳動パターンでは DNA分子の塩基数が約5×101以
下(分子量では約1.5×104以下)の低分子領域で極端に分
離パターンのバンド間隔が広がり,一方塩基数が約2×10
2以上(分子量では約6×104以上）の高分子領域で極端に
バンド間隔が狭まり，低分子量領域ではゲル媒体膜の泳
動パターンの存在しないムダな部分であり，一方高分子
量領域では塩基配列を決定することが困難となる。その
ため１枚の泳動媒体膜で配列を決定できる塩基数は限ら
れた少数である。
の分離泳動パターンでは DNA分子の塩基数が約5×101以
下(分子量では約1.5×104以下)の低分子領域で極端に分
離パターンのバンド間隔が広がり,一方塩基数が約2×10
2以上(分子量では約6×104以上）の高分子領域で極端に
バンド間隔が狭まり，低分子量領域ではゲル媒体膜の泳
動パターンの存在しないムダな部分であり，一方高分子
量領域では塩基配列を決定することが困難となる。その
ため１枚の泳動媒体膜で配列を決定できる塩基数は限ら
れた少数である。
１回の電気泳動操作当り DNAの塩基配列読み取り又は決
定数の増加方法として，ゲル膜の長さを長く，例えば80
cmから100cmのものを用いたり,分離パターンの解像性を
高める目的でβ線強度を小さくするため 32Pのかわりに
35Sで標識する方法や，ゲル膜の分離特性を変える目的
でゲル濃度勾配を有するゲル濃度グラジエントポリアク
リルアミドゲル膜が用いられている。しかしながら，こ
れらの改良方法でも DNAの低分子量領域から高分子量領
域にわたり分離パターンのバンド間隔の不均一性は大き
く，必ずしも満足できる方法ではない。
定数の増加方法として，ゲル膜の長さを長く，例えば80
cmから100cmのものを用いたり,分離パターンの解像性を
高める目的でβ線強度を小さくするため 32Pのかわりに
35Sで標識する方法や，ゲル膜の分離特性を変える目的
でゲル濃度勾配を有するゲル濃度グラジエントポリアク
リルアミドゲル膜が用いられている。しかしながら，こ
れらの改良方法でも DNAの低分子量領域から高分子量領
域にわたり分離パターンのバンド間隔の不均一性は大き
く，必ずしも満足できる方法ではない。
分画パターン(バンド間隔)をコントロールする技術とし
て前述のゲル濃度グラジエントゲル膜，及びpH緩衝剤濃
度グラジエント膜，膜厚グラジエント膜があるが，電気
泳動条件をコントロールすることによる分画パターン
(バンド間隔)を変化させることができる技術はまだ知ら
れていない。
て前述のゲル濃度グラジエントゲル膜，及びpH緩衝剤濃
度グラジエント膜，膜厚グラジエント膜があるが，電気
泳動条件をコントロールすることによる分画パターン
(バンド間隔)を変化させることができる技術はまだ知ら
れていない。
最近巨大二重螺旋DNA(約20Kbp以上)を分離する方法とし
てパルス電源を用いる電気泳動法が報告されている。例
えば,1秒〜数百秒の周期をもって電場の方向を180度逆
転させる方法(Ｇ.Ｆ.カルレ他(G.F.Carle et al)「サイ
エンス(Science)」 232,65−68頁(1968年)),２つの交差
する方向から電場を作用させる方法チャールズ Ｒ.カン
ター他(Charles R.Cantor et al)「セル(Cell)」37,67頁
(1984年)；特表昭59−502037)等である。これらの技術
は104bp〜105bp(分子量 6×106〜6×107)のオーダーの
巨大な二重螺旋DNAについて103bpのオーダーで 塩基数
(分子量)の達いを分離する技術であって，塩基数101b〜
103b（分子量3×103〜3×106）の範囲の小さな1本鎖DNA
(DNAの塩基配列の読み取り又は決定のために分離する必
要のある分子量)を１塩基ユニットの違いまで分離する
DNA塩基配列読取り又は決定に用いる電気泳動法とは大
きく異なる技術である。結局,従来,電気泳動法の工夫に
よる DNA塩基配列読取り又は決定のための分離パターン
を改良技術については知られていない。
てパルス電源を用いる電気泳動法が報告されている。例
えば,1秒〜数百秒の周期をもって電場の方向を180度逆
転させる方法(Ｇ.Ｆ.カルレ他(G.F.Carle et al)「サイ
エンス(Science)」 232,65−68頁(1968年)),２つの交差
する方向から電場を作用させる方法チャールズ Ｒ.カン
ター他(Charles R.Cantor et al)「セル(Cell)」37,67頁
(1984年)；特表昭59−502037)等である。これらの技術
は104bp〜105bp(分子量 6×106〜6×107)のオーダーの
巨大な二重螺旋DNAについて103bpのオーダーで 塩基数
(分子量)の達いを分離する技術であって，塩基数101b〜
103b（分子量3×103〜3×106）の範囲の小さな1本鎖DNA
(DNAの塩基配列の読み取り又は決定のために分離する必
要のある分子量)を１塩基ユニットの違いまで分離する
DNA塩基配列読取り又は決定に用いる電気泳動法とは大
きく異なる技術である。結局,従来,電気泳動法の工夫に
よる DNA塩基配列読取り又は決定のための分離パターン
を改良技術については知られていない。
［発明の目的］ 本発明の目的は DNA塩基配列読み取り又は決定のための
電気泳動法における，前述のようなバンド間隔(分画パ
ターン)のアンバランスを排除し，バンド間隔を一様化
し,1枚の分離泳動パターンで従来法に比べて格段に多く
の塩基配列決定をできる，改良された DNA塩基配列読取
り又は決定のための電気泳動法を提供することにある。
電気泳動法における，前述のようなバンド間隔(分画パ
ターン)のアンバランスを排除し，バンド間隔を一様化
し,1枚の分離泳動パターンで従来法に比べて格段に多く
の塩基配列決定をできる，改良された DNA塩基配列読取
り又は決定のための電気泳動法を提供することにある。
［発明の構成］ 本発明は，(メタ)アクリルアミド系化合物と架橋剤が水
の存在下に架橋重合してなるポリ(メタ)アクリルアミド
系水性ゲル及び変性剤として少なくとも１個のカルバモ
イル基を含む化合物を含む電気泳動用ゲル電気泳動用媒
体の内部に異なる塩基数の核酸フラグメントを含む試料
を位置させ，実質的に交差せず対向する向きに交互に反
転をくり返す矩形波状，鋸歯波状又は正弦波状のいずれ
かの波形からなる２方向のパルス電場を，ＤＮＡフラグ
メントを目的とする泳動方向に進ませる方向に作用する
電界パルスのパルス１個の継続時間のほうがＤＮＡフラ
グメントを目的とする泳動方向から戻す方向に作用する
電界パルスのパルス１個の継続時間より長くなるように
して前記電気泳動媒体に作用させ，前記核酸フラグメン
トを分子篩作用の存在下で目的とする泳動方向に移動さ
せて，前記核酸フラグメントの分離を行う電気泳動方法
である。
の存在下に架橋重合してなるポリ(メタ)アクリルアミド
系水性ゲル及び変性剤として少なくとも１個のカルバモ
イル基を含む化合物を含む電気泳動用ゲル電気泳動用媒
体の内部に異なる塩基数の核酸フラグメントを含む試料
を位置させ，実質的に交差せず対向する向きに交互に反
転をくり返す矩形波状，鋸歯波状又は正弦波状のいずれ
かの波形からなる２方向のパルス電場を，ＤＮＡフラグ
メントを目的とする泳動方向に進ませる方向に作用する
電界パルスのパルス１個の継続時間のほうがＤＮＡフラ
グメントを目的とする泳動方向から戻す方向に作用する
電界パルスのパルス１個の継続時間より長くなるように
して前記電気泳動媒体に作用させ，前記核酸フラグメン
トを分子篩作用の存在下で目的とする泳動方向に移動さ
せて，前記核酸フラグメントの分離を行う電気泳動方法
である。
［発明の構成の詳細な説明］ 本明細書においては単量体であるアクリルアミド及びそ
の誘導体をアクリルアミド系化合物，メタアクリルアミ
ド及びその誘導体をメタアクリルアミド系化合物とい
い,これらを総称して(メタ)アクリルアミド系化合物と
いう。また，アクリルアミド系化合物とメタアクリルア
ミド系化合物に共通する説明は，アクリルアミド系化合
物について説明することがある。ポリ(メタ)アクリルア
ミド系水性ゲルはポリアクリルアミド系水性ゲル，ポリ
メタアクリルアミド系水性ゲル，及びコポリ(アクリル
アミド−メタアクリルアミド)系水性ゲルを意味し，こ
れらのゲルに共通する説明は，ポリアクリルアミド系水
性ゲルについて説明することがある。
の誘導体をアクリルアミド系化合物，メタアクリルアミ
ド及びその誘導体をメタアクリルアミド系化合物とい
い,これらを総称して(メタ)アクリルアミド系化合物と
いう。また，アクリルアミド系化合物とメタアクリルア
ミド系化合物に共通する説明は，アクリルアミド系化合
物について説明することがある。ポリ(メタ)アクリルア
ミド系水性ゲルはポリアクリルアミド系水性ゲル，ポリ
メタアクリルアミド系水性ゲル，及びコポリ(アクリル
アミド−メタアクリルアミド)系水性ゲルを意味し，こ
れらのゲルに共通する説明は，ポリアクリルアミド系水
性ゲルについて説明することがある。
本発明の電気泳動方法に用いられる電気泳動用媒体は通
常用いられる形態,例えば薄層状,薄板状,薄膜状(これら
を総称して膜という),円柱状,角柱状いずれをも用いる
ことができるが，通常は膜状の電気泳動用媒体膜が好ま
しい。
常用いられる形態,例えば薄層状,薄板状,薄膜状(これら
を総称して膜という),円柱状,角柱状いずれをも用いる
ことができるが，通常は膜状の電気泳動用媒体膜が好ま
しい。
本発明の電気泳動方法に用いられる電気泳動用媒体とし
ては,ゲル濃度,膜厚が一定のゲル膜及びグラジエント
膜,例えば膜厚グラジエント膜,ゲル濃度グラジエント
膜，pHバッファー濃度グラジエント膜，ゲル濃度グラジ
エント−膜厚グラジエント併用膜のいずれも用いること
ができる。ゲル媒体のゲル濃度としては通常用いること
ができる範囲で制限はないが,例えば4w/v％から25w/v％
の範囲,膜厚としては通常用いることができる範囲で制
限はないが,例えば 操作しやすい100μmから500μmの範
囲である。
ては,ゲル濃度,膜厚が一定のゲル膜及びグラジエント
膜,例えば膜厚グラジエント膜,ゲル濃度グラジエント
膜，pHバッファー濃度グラジエント膜，ゲル濃度グラジ
エント−膜厚グラジエント併用膜のいずれも用いること
ができる。ゲル媒体のゲル濃度としては通常用いること
ができる範囲で制限はないが,例えば4w/v％から25w/v％
の範囲,膜厚としては通常用いることができる範囲で制
限はないが,例えば 操作しやすい100μmから500μmの範
囲である。
本発明の電気泳動方法に用いられる電気泳動用媒体は単
量体である(メタ)アクリルアミド系化合物と架橋剤が水
の存在下に架橋重合してなるポリ(メタ)アクリルアミド
系水性ゲル及び変性剤として少なくとも１個のカルバモ
イル基を含む化合物(例,尿素)を含む電気泳動用ゲル電
気泳動用媒体である。ゲル媒体の成分組成及びゲル形成
方法は，例えば青木,永井共著「最新電気泳動法」(広川書
店，1976年)370−415頁；エレクトロフォレシス(Electr
ophoresis)」2,213−219頁(1981年),同誌 2,220−228頁
(1981年)；特開昭59−126236；特開昭60−60548；特開
昭61−18852；特開昭61−2058；特願昭61−214878；特
開昭62−91849；特開昭60−235819；特開昭61−28512等
に 記載のものを用いることができる。
量体である(メタ)アクリルアミド系化合物と架橋剤が水
の存在下に架橋重合してなるポリ(メタ)アクリルアミド
系水性ゲル及び変性剤として少なくとも１個のカルバモ
イル基を含む化合物(例,尿素)を含む電気泳動用ゲル電
気泳動用媒体である。ゲル媒体の成分組成及びゲル形成
方法は，例えば青木,永井共著「最新電気泳動法」(広川書
店，1976年)370−415頁；エレクトロフォレシス(Electr
ophoresis)」2,213−219頁(1981年),同誌 2,220−228頁
(1981年)；特開昭59−126236；特開昭60−60548；特開
昭61−18852；特開昭61−2058；特願昭61−214878；特
開昭62−91849；特開昭60−235819；特開昭61−28512等
に 記載のものを用いることができる。
ゲル媒体の成分組成は,例えば,アクリルアミド(単量
体),架橋剤(例，N′,N′-メチレンビスアクリルアミ
ド：1,3,5-トリアクリロイルヘキサヒドロ-s-トリアジ
ン),重合開始剤組成物,pH緩衝剤，必要により添加され
る水溶性ポリマー(例,アガロース；ポリビニルピロリド
ン；ポリアクリルアミド）を含有する水溶液(ゲル形成
液)があり，この水溶液を細長い円筒,角筒,２枚のガラ
ス板の間の薄い空間又は容器，有機ポリマーシート(支
持体)の上等で酸素不存在雰囲気中でアクリルアミドゲ
ルを架橋重合させて水性ゲル媒体を形成させる。前記の
ゲル形成液から長尺状の水性ゲル媒体を連続して形成さ
せる場合には特開昭59−126236；特開昭62−91849等に
記載の方法に従って,ポリエチレンテレフタレートと長
尺状シートの上で酸素不存在雰囲気中で形成させたもの
が好ましい。
体),架橋剤(例，N′,N′-メチレンビスアクリルアミ
ド：1,3,5-トリアクリロイルヘキサヒドロ-s-トリアジ
ン),重合開始剤組成物,pH緩衝剤，必要により添加され
る水溶性ポリマー(例,アガロース；ポリビニルピロリド
ン；ポリアクリルアミド）を含有する水溶液(ゲル形成
液)があり，この水溶液を細長い円筒,角筒,２枚のガラ
ス板の間の薄い空間又は容器，有機ポリマーシート(支
持体)の上等で酸素不存在雰囲気中でアクリルアミドゲ
ルを架橋重合させて水性ゲル媒体を形成させる。前記の
ゲル形成液から長尺状の水性ゲル媒体を連続して形成さ
せる場合には特開昭59−126236；特開昭62−91849等に
記載の方法に従って,ポリエチレンテレフタレートと長
尺状シートの上で酸素不存在雰囲気中で形成させたもの
が好ましい。
本発明の方法においては,電気泳動媒体,pH緩衝剤，塩基
数の異なる核酸フラグメントを含む試料のゲル媒体への
付着，注入等の電場印加までの操作は常法と同様にして
行うことができる。例えば，試料をゲル媒体膜のサンプ
ル注入口に付着させ，通常の泳動方向に直流電界を 約5
分〜約10分作用させて，試料を目的とする泳動方向に短
距離移動させ，試料をゲル媒体膜の内部の予め定めた泳
動開始部位に位置させる方法は好ましい１方法である。
ついで試料を注入されたゲル媒体にはパルス電場を作用
させる。パルス電場は特定の時間周期で180゜(反対方向
に)反転される。パルス電界は同時に反対向きに作用さ
せることはない。パルス電場強度は常法で作用させる直
流電場と同様の強度範囲である。作用させるパルス電場
の波形は,例 えば,矩形波,鋸歯波,正弦波が好ましい
が，いかなる波形でもよく，制限はない。
数の異なる核酸フラグメントを含む試料のゲル媒体への
付着，注入等の電場印加までの操作は常法と同様にして
行うことができる。例えば，試料をゲル媒体膜のサンプ
ル注入口に付着させ，通常の泳動方向に直流電界を 約5
分〜約10分作用させて，試料を目的とする泳動方向に短
距離移動させ，試料をゲル媒体膜の内部の予め定めた泳
動開始部位に位置させる方法は好ましい１方法である。
ついで試料を注入されたゲル媒体にはパルス電場を作用
させる。パルス電場は特定の時間周期で180゜(反対方向
に)反転される。パルス電界は同時に反対向きに作用さ
せることはない。パルス電場強度は常法で作用させる直
流電場と同様の強度範囲である。作用させるパルス電場
の波形は,例 えば,矩形波,鋸歯波,正弦波が好ましい
が，いかなる波形でもよく，制限はない。
反転パルス電場を作用させる条件は，例えば次の条件が
ある。ここで， EF：DNAフラグメントを進ませる方向の電界強度 ER：DNAフラグメントを戻す方向の電界強度 TF：DNAフラグメントを進ませる方向の 電界パルス１個を継続させる時間 TR：DNAフラグメントを戻す方向の 電界パルス１個を継続させる時間 とすると， EFとERはそれぞれ約10V/cm〜約150V/cmの範囲，好まし
くは約20V/cm〜約100V/cmの範囲で， EF＝ER；EF＞EREF＜ERいずれも作用させうる；TFとTRは
それぞれ約0.1msec〜約100msecの範囲，好ましくは約1m
sec〜約50msecの範囲で， TFはTRより長い時間とする；TF：TRは約 5：1から約
2：1の範囲，好ましくは約 3：1； ただし，EF,ER,TF,TRの組合せはDNAフラグメントを進ま
せる方向になるように組合せる必要があるのはいうまで
もないことである。
ある。ここで， EF：DNAフラグメントを進ませる方向の電界強度 ER：DNAフラグメントを戻す方向の電界強度 TF：DNAフラグメントを進ませる方向の 電界パルス１個を継続させる時間 TR：DNAフラグメントを戻す方向の 電界パルス１個を継続させる時間 とすると， EFとERはそれぞれ約10V/cm〜約150V/cmの範囲，好まし
くは約20V/cm〜約100V/cmの範囲で， EF＝ER；EF＞EREF＜ERいずれも作用させうる；TFとTRは
それぞれ約0.1msec〜約100msecの範囲，好ましくは約1m
sec〜約50msecの範囲で， TFはTRより長い時間とする；TF：TRは約 5：1から約
2：1の範囲，好ましくは約 3：1； ただし，EF,ER,TF,TRの組合せはDNAフラグメントを進ま
せる方向になるように組合せる必要があるのはいうまで
もないことである。
これらの組合せのうちで， EF＝ER；TF＞TRかつTF：TR約 3：1が好ましい。
電気泳動時間は DNAの塩基配列の読み取り又は決定に必
要な塩基数が分離されるのに必要な時間であって,制限
されるものではない。例えば,マーカー色素(例,キシレ
ンシアノール)をゲル媒体の1レーンに注入してその泳動
距離を読み取り，適当な泳動距離に達した時刻に電界印
加をやめる方法がある。
要な塩基数が分離されるのに必要な時間であって,制限
されるものではない。例えば,マーカー色素(例,キシレ
ンシアノール)をゲル媒体の1レーンに注入してその泳動
距離を読み取り，適当な泳動距離に達した時刻に電界印
加をやめる方法がある。
特定の時間周期で反転されるパルス電場を作用させて電
気泳動分離することにより,1枚の(1個）の分離パターン
の最下端の塩基数は同じにして，従来の一定方向の電場
(直流電場)による電気泳動分離では読取りが困難になる
塩基数2×102〜3×102の範囲のバンド間隔を適当に広げ
るようにコントロールすることによって，塩基配列の読
取りのできる塩基数範囲を増加させることができる。
気泳動分離することにより,1枚の(1個）の分離パターン
の最下端の塩基数は同じにして，従来の一定方向の電場
(直流電場)による電気泳動分離では読取りが困難になる
塩基数2×102〜3×102の範囲のバンド間隔を適当に広げ
るようにコントロールすることによって，塩基配列の読
取りのできる塩基数範囲を増加させることができる。
電気泳動分離操作が終った後の分離パターンの可視画像
化処理は，常法に従って実施することができる(従来の
技術の欄の記載参照)。
化処理は，常法に従って実施することができる(従来の
技術の欄の記載参照)。
［発明の効果］ 本発明の電気泳動方法は DNA塩基フラグメントの分離パ
ターンのバンド間隔をパルス電場の条件をコントロール
することにより容易に変化させることができるので，諸
種の DNA塩基配列の読取り又は決定のための電気泳動法
に簡易に適用できるという特徴を有する。
ターンのバンド間隔をパルス電場の条件をコントロール
することにより容易に変化させることができるので，諸
種の DNA塩基配列の読取り又は決定のための電気泳動法
に簡易に適用できるという特徴を有する。
本発明の電気泳動方法は 塩基数が102オーダー程度の1
本鎖DNAについても作用させるパルス電場の条件を適宜
に選択することにより，目的とする塩基数領域の DNAフ
ラグメントのバンド間隔を広げることも狭めることも可
能になるという特徴を有する。
本鎖DNAについても作用させるパルス電場の条件を適宜
に選択することにより，目的とする塩基数領域の DNAフ
ラグメントのバンド間隔を広げることも狭めることも可
能になるという特徴を有する。
また,従来の技術では,数百程度の塩基数の領域のバンド
間隔は極めて接近していて DNA塩基配列の読取り誤りが
生じやすいという問題点があったが，本発明の方法にお
いてはパルス電場の条件をコントロールすることにより
DNA塩基フラグメントの分離パターンのバンド間隔を容
易に広げることができるので，この問題点も解決され
る。
間隔は極めて接近していて DNA塩基配列の読取り誤りが
生じやすいという問題点があったが，本発明の方法にお
いてはパルス電場の条件をコントロールすることにより
DNA塩基フラグメントの分離パターンのバンド間隔を容
易に広げることができるので，この問題点も解決され
る。
本発明の電気泳動方法においてはパルス電場の条件をコ
ントロールすることにより DNA塩基フラグメントの分離
パターンのバンド間隔を低分子領域で狭め,高分子領域
で広げることができるので,従来と同じ泳動距離を有す
る１つのポリアクリルアミドゲル媒体で従来技術による
よりも多くの塩基数を読み取ることができる特徴も有す
る。
ントロールすることにより DNA塩基フラグメントの分離
パターンのバンド間隔を低分子領域で狭め,高分子領域
で広げることができるので,従来と同じ泳動距離を有す
る１つのポリアクリルアミドゲル媒体で従来技術による
よりも多くの塩基数を読み取ることができる特徴も有す
る。
実施例１及び比較例１ ［DNA試料と電気泳動分離操作の準備］ 常法に従い２本の平滑表面の透明ガラス板を支持体とし
て 200μmの間隔で対向させてゲル容器を形成し，容器
の中でポリアクリルアミド水性ゲル膜(濃度8.0w/v％)を
作成し，このポリアクリルアミドゲル膜を電気泳動用媒
体膜として使用した。
て 200μmの間隔で対向させてゲル容器を形成し，容器
の中でポリアクリルアミド水性ゲル膜(濃度8.0w/v％)を
作成し，このポリアクリルアミドゲル膜を電気泳動用媒
体膜として使用した。
この２枚のガラスに挟まれたゲル膜を上下端部に電極液
槽(上部が陰極,下部が陽極)を備えた泳動装置に垂直に
立てて載置した。上下端部に電極液槽に電極液として,T
BEバッファー(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
−エチレンジアミン四酢酸・2ナトリウム−硼素バッファ
ー；pH8.3)を満たした。M-13mp8 DNAを用い ジデオキシ
法により調製した DNAフラグメント試料をゲル媒体膜上
部のサンプルスロットにマイクロシリンジを用いて1μL
ずつ注入した。
槽(上部が陰極,下部が陽極)を備えた泳動装置に垂直に
立てて載置した。上下端部に電極液槽に電極液として,T
BEバッファー(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
−エチレンジアミン四酢酸・2ナトリウム−硼素バッファ
ー；pH8.3)を満たした。M-13mp8 DNAを用い ジデオキシ
法により調製した DNAフラグメント試料をゲル媒体膜上
部のサンプルスロットにマイクロシリンジを用いて1μL
ずつ注入した。
［電気泳動操作］ 本発明の方法 DNA試料を注入した後 約10分ゲル媒体膜に35V/cmの直流
電場(下端側が高電位)を作用させて DNA試料をゲル膜内
部の泳動開始位置に移動させた。その後第1表に記載の2
通りのスイッチングサイクルでほぼ矩形波に相当する下
端側高電位(ＥF)電界と上端側高電位(ＥR)電界を、両者
の繰り返しの間に休止時間を置かずに、連接して交互に
印加してマーカー色素(キシレンシアノール FF；カラー
インデックス(Colour Index)▲No-▼42135；ケミカル・
アブストラクツ・レジストリ番号(CA Registry ▲No
-▼）[2650-17-1]）が27cm移動するまで(ＤＮＡフラグ
メントを進ませる方向のパルス電界印加時間の合計約13
5分,ＤＮＡフラグメントを戻す方向のパルス電界印加時
間の合計約45分，反転パルス電界印加時間の総計約180
分)電気泳動分離を行った。
電場(下端側が高電位)を作用させて DNA試料をゲル膜内
部の泳動開始位置に移動させた。その後第1表に記載の2
通りのスイッチングサイクルでほぼ矩形波に相当する下
端側高電位(ＥF)電界と上端側高電位(ＥR)電界を、両者
の繰り返しの間に休止時間を置かずに、連接して交互に
印加してマーカー色素(キシレンシアノール FF；カラー
インデックス(Colour Index)▲No-▼42135；ケミカル・
アブストラクツ・レジストリ番号(CA Registry ▲No
-▼）[2650-17-1]）が27cm移動するまで(ＤＮＡフラグ
メントを進ませる方向のパルス電界印加時間の合計約13
5分,ＤＮＡフラグメントを戻す方向のパルス電界印加時
間の合計約45分，反転パルス電界印加時間の総計約180
分)電気泳動分離を行った。
従来技術による方法 DNA試料を注入した後ゲル媒体膜に 平均35V/cmの直流電
場(下端側が高電位)を作用させマーカー色素（キシレン
シアノール FF)が27cm移動するまで(電界印加時間約90
分)電気泳動分離を行った。
場(下端側が高電位)を作用させマーカー色素（キシレン
シアノール FF)が27cm移動するまで(電界印加時間約90
分)電気泳動分離を行った。
［分離パターンの可視化］ 電気泳動操作が終了したゲル媒体膜を常法に従いオート
ラジオグラフィー処理を行い,DNAフラグメント試料の分
離泳動パターンをX-線用写真フィルムに可視画像として
得た。
ラジオグラフィー処理を行い,DNAフラグメント試料の分
離泳動パターンをX-線用写真フィルムに可視画像として
得た。
［電気泳動方法の評価］ X-線用写真フィルムの DNAフラグメント試料の分離泳動
パターン可視画像のバンド間隔と読み取り可能な塩基数
を調べたところ，第１表に記載の結果が得られた。
パターン可視画像のバンド間隔と読み取り可能な塩基数
を調べたところ，第１表に記載の結果が得られた。
180゜反転する２方向のパルス電界を周期的に作用させ
る本発明の電気泳動方法においては,DNAフラグメント試
料の分離泳動パターンを最上端領域のバンドがゲル膜の
上向きにシフトしており，その結果高分子量部分領域で
バンド間隔が広がっていた。第１表のデータから，本発
明の方法によると読みとれる塩基数が従来技術の直流電
界を作用させる方法に比べて実施例例1Aで約33％，実施
例例1Bで約13％増加したことが明らかである。
る本発明の電気泳動方法においては,DNAフラグメント試
料の分離泳動パターンを最上端領域のバンドがゲル膜の
上向きにシフトしており，その結果高分子量部分領域で
バンド間隔が広がっていた。第１表のデータから，本発
明の方法によると読みとれる塩基数が従来技術の直流電
界を作用させる方法に比べて実施例例1Aで約33％，実施
例例1Bで約13％増加したことが明らかである。
実施例２及び比較例例２ 2枚のポリエチレンテレフタレートフィルム(透明支持
体)に挟まれたプレハブ ポリアクリルアミドゲル膜(富
士写真フイルム(株)製；ゲル濃度8.0w/v％,膜厚0.2mm,
長さ40cm×幅20cm）を用いて実施例１及び比較例例２と
同様にして操作を行ったところ，第２表に記載の結果が
得られた。
体)に挟まれたプレハブ ポリアクリルアミドゲル膜(富
士写真フイルム(株)製；ゲル濃度8.0w/v％,膜厚0.2mm,
長さ40cm×幅20cm）を用いて実施例１及び比較例例２と
同様にして操作を行ったところ，第２表に記載の結果が
得られた。
本発明の180゜反転する２方向のパルス電界を周期的に
作用させる本発明の電気泳動方法においては,DNAフラグ
メント試料の分離泳動パターンの最上端領域のバンドが
ゲル膜の上向きにシフトしており，その結果高分子量部
分領域でバンド間隔が広がっていた。第２表のデータか
ら，本発明の方法によると読みとれる塩基数が従来技術
の直流電界を作用させる方法に比べて約28％増加しとこ
とが明らかである。
作用させる本発明の電気泳動方法においては,DNAフラグ
メント試料の分離泳動パターンの最上端領域のバンドが
ゲル膜の上向きにシフトしており，その結果高分子量部
分領域でバンド間隔が広がっていた。第２表のデータか
ら，本発明の方法によると読みとれる塩基数が従来技術
の直流電界を作用させる方法に比べて約28％増加しとこ
とが明らかである。
Claims (7)
- 【請求項１】(メタ)アクリルアミド系化合物と架橋剤が
水の存在下に架橋重合してなるポリ(メタ)アクリルアミ
ド系水性ゲル及び変性剤として少なくとも１個のカルバ
モイル基を含む化合物を含む電気泳動用ゲル電気泳動用
媒体の内部に異なる塩基数の核酸フラグメントを含む試
料を位置させ， 実質的に交差せず対向する向きに交互に反転をくり返す
矩形波状、鋸歯波状又は正弦波状のいずれかの波形から
なる２方向のパルス電場を，ＤＮＡフラグメントを目的
とする泳動方向に進ませる方向に作用する電界パルスの
パルス１個の継続時間のほうがＤＮＡフラグメントを目
的とする泳動方向から戻す方向に作用する電界パルスの
パルス１個の継続時間より長くなるようにして前記電気
泳動媒体に作用させ，前記核酸フラグメントを分子篩作
用の存在下で目的とする泳動方向に移動させて，前記核
酸フラグメントの分離を行う電気泳動方法。 - 【請求項２】前記２方向のパルス電場を作用させる条件
が，ＴFを ＤＮＡフラグメントを進ませる方向の電界パ
ルス１個を継続させる時間， ＴRを ＤＮＡフラグメントを戻す方向の電界パルス１個
を継続させる時間， とすると， ＴFとＴRは それぞれ 0.1msec〜100msecの範囲であり，
かつ， ＴF：ＴR比が 5：1から 2：1 の範囲である 特許請求の範囲第１項に記載の電気泳動方法。 - 【請求項３】前記２方向の電場が実質的に等しい強度で
交互に作用させられる特許請求の範囲第１項又は第２項
に記載の電気泳動方法。 - 【請求項４】前記電気泳動媒体が実質的に一定のゲル濃
度と実質的に一定の厚さを有する薄板状又は薄膜状の電
気泳動媒体膜である特許請求の範囲第１項又は第２項に
記載の電気泳動方法。 - 【請求項５】前記電気泳動媒体が薄板状又は薄膜状の膜
であり，かつ膜厚グラジエント，ゲル濃度グラジエント
及びpH緩衝剤濃度グラジエントのいずれか少なくとも一
つのグラジエントを有する電気泳動媒体膜である特許請
求の範囲第１項又は第２項に記載の電気泳動方法。 - 【請求項６】前記電気泳動用媒体膜が有機ポリマーから
なるシート状支持体の上に設けられている特許請求の範
囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の電気泳動方
法。 - 【請求項７】前記電気泳動用媒体膜がガラスからなるシ
ート状支持体の上に設けられている特許請求の範囲第１
項ないし第５項のいずれかに記載の電気泳動方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62230592A JPH0660887B2 (ja) | 1987-09-14 | 1987-09-14 | 電気泳動方法 |
| US07/243,975 US4900416A (en) | 1987-09-14 | 1988-09-13 | Electrophoretic method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62230592A JPH0660887B2 (ja) | 1987-09-14 | 1987-09-14 | 電気泳動方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6473246A JPS6473246A (en) | 1989-03-17 |
| JPH0660887B2 true JPH0660887B2 (ja) | 1994-08-10 |
Family
ID=16910155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62230592A Expired - Fee Related JPH0660887B2 (ja) | 1987-09-14 | 1987-09-14 | 電気泳動方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4900416A (ja) |
| JP (1) | JPH0660887B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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