JPH0523743B2

JPH0523743B2 -

Info

Publication number: JPH0523743B2
Application number: JP25543090A
Authority: JP
Inventors: Kenji Oita; Keiko Nakamura; Hideo Ookawa
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-06-16
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 1993-04-05
Also published as: JPH03172175A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ラツト肝チトクロムＰ−450cの製造
方法に関する。

３−メチルコラントレン投与により誘導される
ラツト肝チトクロムＰ−450cは、還元型で一酸化
炭素と結合し、その差スペクトルが447nmに吸収
極大を示すヘム蛋白質であり、ステロイドや脂肪
酸の代謝、外来の脂溶性有機化合物の酸化的代謝
反応あるいは化学変異剤の代謝活性化などに関与
している。本発明は、この高い水酸化活性を有
し、しかも基質特異性の幅が広いチトクロムＰ−
450cを大腸菌で発現させ、工業的なレベルでの酸
化反応過程や産業排水中の有機化合物の酸化除去
等に応用することを可能にする大腸菌内発現用の
プラスミドを提供するものである。

近年、高等生物由来の生理活性ペチプドをコー
ドするcDNAあるいは合成DNAにプロモータを
接続することにより構築したプラスミドを大腸菌
に導入し、生理活性ペプチドを大腸菌に発現させ
た例は少なくない。インスリン、成長ホルモン、
インターフエロン等は工業的レベルでの微生物生
産が試みられている。しかしながら、細胞のミク
ロソーム膜に局在し、分子量も59300ダルトンと
大きくしかも蛋白分子内にヘムを含有しているチ
トクロムＰ−450cについては、現在のところ大腸
菌内で発現を行つた報告はない。

本発明の大腸菌内発現を目的とした組換え体プ
ラスミドpMG1は、強力プロモーターであるtac
プロモーターの下流に、高い酸化活性を示すラツ
ト肝のチトクロムＰ−450c遺伝子が連結してい
る。さらに、大腸菌での発現を調節する転写因子
であるSD配列やSD配列と開始コドン間の距離等
も十分満たされている。

取得したpMG1プラスミドを用いて大腸菌を形
質転換することにより、大腸菌細胞内にラツト肝
チトクロムＰ−450cが合成され、それを分離、精
製することができる。このようにして、得られた
チトクロムＰ−450c標品とラツト肝のNADPH
−チトクロムＰ−450c還元酵素をともに同時固定
化し、酸化反応を行わせることが可能である。ま
た、産生チトクロムＰ−450cを分離、精製せず、
酸化反応を司どる大腸菌として、固定化しバイオ
リアクターとして応用することもでき、また、活
性汚泥に加えることも可能である。

本発明の組換えプラスミドpMG1は、組換えプ
ラスミドpAU157（Nucl.Acids.Res.12，p2929−
29 38に記載の方法で製造できる。）を大腸菌の強
力プロモーターであるtacプロモーターに接続す
ることにより構築できる。

tacプロモーターは、trpプロモーターの“−35
領域”とlacUV₅プロモーターの“−10領域”か
ら構成されている大腸菌の強力プロモーターの１
つである。

次に実施例により本発明について詳細に説明す
る。

実施例ラツト肝チトクロムＰ−450c遺伝子の大腸菌内
発現を目的とした発現用プラスミドpMG1の構
築ラツト肝チトクロムＰ−450c蛋白質の全コーデ
イング領域をもつ組換え体プラスミドpAU157
（Nucl.Acids.Res.12，p2929−29 38に記載の方法
で製造できる。）より単離したチトクロムＰ−
450cの構造遺伝子を、大腸菌の強力プロモーター
であるtacプロモーター（P.L.バイオケミカル社）
に接続し、大腸菌内発現用プラスミドpMG1を以
下のように構築した。

Ｉ発現ベクターpDG1の構築発現用プラスミドpMG1構築の第一段階とし
て、tacプロモーターを保持する発現ベクター
pDR540（PLバイオケミカル社）を改変し、新た
な発現ベクターpDG1を構築した。以下に、２つ
のステツプに分け、その構築の方法を述べる。

ステツプ１：pDR540プラスミドの部分的分解 1μgのpDR540プラスミドDNAに、２ユニツト
の制限酵素BamHI（宝酒造）を加え、10μの
BamHI反応液〔10mMTris−HC（pH8.0），
7mM MgC₂，100mM NaC，2mM−メルカ
プトエタノール，0.01％ウシ血清アルブミン〕中
で37℃１時間反応した。つぎにこの反応液に１ユ
ニツトのS1ヌクレース（PLバイオケミカル社）
および10μのS1ヌクレース反応液
〔100mMNaOAc−HOAc（PH4.0），300mM
NaC，12mMZnSO₄〕を加え、さらに18℃で２
時間反応させた。反応後、反応液に等量のフエノ
ール−クロロホルム溶液〔フエノール：クロロホ
ルム（１：１）〕を加え、混合し、10000rpmで５
分間遠心後、上澄を分取した。つぎに、２倍量の
冷エタノールを加えて、−80℃に15分間放置した
後、10000rpmで10分間遠心し、DNAを回収し、
10μの蒸留水に懸濁した。

ステツプ２：pDG1の構築ステツプ１で調製した10μのDNA溶液に1μg
の Bgリンカー（宝酒造）および４ニツト
のT₄DNAリガーゼ（宝酒造）を加え、20μの
T₄DNAリガーゼ反応液〔66mMTris−HC
（pH7.6），6.6mMMgC ₂．
10mMdithiothreito，1.0mMATP〕中で16℃
15時間反応させた。反応後、反応液をCohenらの
方法（Proc.Nat．Acad.Sci.U.S.A.69，p2110
−2114）を用いて、大腸菌（Escherichiacoli）
DH1株（F^-，recA1，endA1，gyrA96，thi−
１，hsdR17，supE44，λ^-，九州大学医学部遺伝
情報施設保存菌株・住友化学工業株式会社宝塚総
合研究所にても保存）に形質転換し、100μg／ml
のアンピシリン（シグマ社）を含むLBプレート
（１当り10gのポリペプトン，5gのイーストエ
キストラクト，5gのNaC，12gの寒天を含む）
に形質転換体を広げ、出現したコロニーを単離し
た。つぎに、Birnboimらの方法（Nucl，Acids，
Res，７，ｐ−1513−1523）に従つて、コロニー
よりプラスミドDNAを調製し、1μgのプラスミ
ドDNAに対し、１ユニツトの制限酵素Bgを
加えて、Bg反応液〔10mMTris−HC
（PH7.5），7mMMgC₂，100mM NaC，
7mM2−メルカプトエタノール〕中で、37℃、１
時間反応した。反応後、反応液を0.1μg／mlの臭
化エチジウム（アルドリツチ社）を含む1.0％の
アガロースゲル（シグマ社）に供し、100Vで60
分間電気泳動した。紫外線ランプ下で泳動パター
ンを観察し、制限酵素Bgで１カ所切断を受
けたプラスミドを選択し、pDG1プラスミドと名
付けた。構築した発現ベクターは、tacプロモー
ターを保持し、SD配列の下流７塩基に、制限酵
素Bgの認識部位を持つており、この部位に
目的のDNA断片を組込むことにより、目的蛋白
質の発現を行うことができる。

tacプロモーターとチトクロムＰ−450cの開
始コドンを含むDNAの結合（pDGN101の構築）発現用プラスミドpMG1構築の第二段階とし
て、で構築した発現ベクターpDG1より、tac
プロモーターを含むEcoRI−BeDNA断片を
単離し、これに、チトクロムＰ−450遺伝子の開
始コドンを含む約300塩基対のSau3A−Pst
断片を接続し、組換え体プラスミドpDGN101を
得た。以下、４つのステツプに分け、その構築の
方法を述べる。

ステツプ１：3600塩基対のEcoR−Pst断片
の調製 1μgのpBR322DNA（和光純薬）に、１ユニツ
トの制限酵素EcoR（宝酒造）および１ユニツ
トの制限酵素Pst（宝酒造）を加え、20μの
EcoR反応液〔100mM Tris−HC，（PH7.5）、
7mMMgC₂，50mM NaC，7mM2−メルカ
プトエタノール，0.01％ウシ血清アルブミン〕中
で37℃１時間反応した。反応後。反応液を
0.1μg／mlの臭化エチジウムを含む1.0％の低融点
アガロースゲル（ベセスダ・リサーチ社）に供
し、電気泳動を行つた。泳動後、紫外線ランプ下
で、3.6KbのEcoR−PstDNA断片に相当す
るゲル部分を切り出し、エツペンドルフ管にと
り、65℃で５分間加熱した。融解したゲルに２倍
量のTE緩衝液〔10mMTris−HC（PH8.0），
0.5mMEDTA〕を加え、次にTE緩衝液で飽和し
たフエノールを加えて、フエノール抽出を行つ
た。10000r.p.m.で５分間遠心し、上層を分取し
た後、1/40量の4MNaCおよび２倍量のエタノ
ールを加えて−80℃に10分間放置することにより
DNAをエタノール沈殿した。その後10000rpmで
10分間遠心し、約0.2μgの3.6Kb EcoR−Ｐ st
DNA断片を回収し、10μの蒸留水に懸濁し
た。

ステツプ２ tacプロモーター断片の調製 1μgの発現ベクターpDG1に、１ユニツトの制
限酵素EcoRおよび１ユニツトの制限酵素Bg
を加え、20μのEcoR反応液中で37℃１時
間反応した。反応後、ステツプ１と同様の操作に
より、低融点アガロース電気泳動を行い、約420
塩基のEcoR−BgDNA断片をゲルより切
り出し、DNAを回収し、10μの蒸留水に懸濁
した。

ステツプ３チトクロムＰ−450c遺伝子の開始
コドンを含むSau3A1−Pst断片の調製 5μgのpAU157DNAに、５ユニツトの制限酵素
Pstを加え、20μのPst反応液〔20mM Tris
−HC（PH7.5），10mMMgC₂，50mM
（NH₄）₂SO₄，0.01％ウシ血清アルブミン〕中で
37℃１時間反応し、低融点アガロース電気泳動
後、約300塩基対のPstDNA断片を切り出し、
DNA回収後、10μの蒸留水に懸濁した。なお、
このDNA断片中にあるSau3A1切断部位の４塩
基下流にチトクロムＰ−450c遺伝子の開始コドン
が存在していることが判明している。そこで、こ
のPstDNA断片を含む溶液に、３ユニツトの制
限酵素Sau3A1（宝酒造）を加え、20μの
Sau3A1反応液〔10mMTris−HC（pH7.5），
7mM MgC₂，100mM NaC〕中で37℃１時
間反応させ、等量のフエノールークロロホルム溶
液で処理後、DNAを回収し、10μの蒸留水に
懸濁した。

ステツプ４組換え体プラスミドpDGN101の
構築ステツプ１・２・３で調製した、3600塩基対の
EcoR−PstDNA断片、400塩基対のEcoR
−BgDNA断片および開始コドンを保持する
Sau3A1−PstDNA断片混液をそれぞれ0.2μgづ
つ混合し、7.2ユニツトのT₄DNAリガーゼを加
え、45μのT₄DNAリガーゼ反応液中で16°C2時
間反応した。その後、Cohenらの方法に従い、反
応液で大腸菌DH1株を形質転換した。形質転換
体をRutherらの方法（Mo．Gen.Genetics
178，P475−477）に従い、200μg／mlの５−ブロ
ム−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド（半井化学）、および15μg／mlのテトラ
サイクリン（シグマ社）を含むLBプレートに広
げ、出現した青色コロニーを単離した。前述の
Birnboimらの方法に従い、コロニーよりプラス
ミドDNAを調製し、2μgのプラスミドDNAに対
し、２ユニツトの制限酵素Hind（宝酒造）お
よび２ユニツトの制限酵素Bg（ニツポンジ
ーン）を加え、20μのHind反応液中で37℃１
時間反応した。反応液を1.0％アガロースゲル電
気泳動で分析し、2300塩基対、900塩基対、450塩
基対、350塩基対および250塩基対の５つのDNA
断片が検出されるプラスミドを選択し、
pDGN101とした。

発現用プラスミドpMG1の構築で構築した組換え体プラスミドpDGN101お
よびpAU157プラスミドとpBR322プラスミドか
ら、発現用プラスミドpMG1を構築した。以下、
４つのステツプに分け、構築の方法について述べ
る。

ステツプ１ 300塩基のHind−Pst断片の
調製 2μgのpDGN101プラスミドに、２ユニツトの
制限酵素Hindを加え、20μのHind反応液
中で37℃１時間反応し、1.0％低融点アガロース
電気泳動を行い、3900塩基対のHindDNA断片
を単離した。つぎにこのDNA溶液に、２ユニツ
トの制限酵素Pstを加え、20μのPst反応液
中で37℃１時間反応し、同様の操作により、tac
プロモーターを含む300塩基対のHind−Pst
DNA断片を調製した。このDNAを、以後、
DNA断片ａと呼ぶ。

ステツプ２ Pvu−HincDNA断片および
Pst−HincDNA断片の調製 5μgのpAU157プラスミドDNAに５ユニツトの
制限酵素Pvu（バイオラボ社）を加え、20μ
のPvu反応液〔7mMTris−HC（PH7.4）、
150mM NaC、6mMgC₂、6mM2−メルカプ
トエタノール、100μg／mlウシ血清アルブミン〕
中で37℃１時間反応し、DNAを回収した。引き
つづき、このDNA溶液に５ユニツトの制限酵素
Hinc（宝酒造）を加え、20μのHinc反応
液〔10mMTris−HC（PH8.0）、7mMMgC
_２、60mM NaC、7mM2−メルカプトエタノー
ル〕中で37℃１時間反応し、1.0％の低融点アガ
ロースゲルで電気泳動後、3200塩基対のPvu−
HincDNA断片を単離した（DNA断片ｂとす
る。）また、同時に2100塩基対のHincDNA断片を
同様の方法で調製し、引きつづきこのDNA溶液
に３ユニツトの制限酵素Pstを加え、20μの
Pst反応液中で37℃１時間反応した。得られた
反応生成物を1.0％の低融点アガロースゲルで分
離し、1000塩基対のPst−HincDNA断片を
単離した（DNA断片ｃとする。）ステツプ３ 700塩基対のHind−Pvu
DNA断片の調製 2μgのpBR322DNAに２ユニツトの制限酵素
Pvuを加え、20μのPvu反応液中で37℃１
時間反応し、DNAを回収した。次いでこのDNA
溶液に２ユニツトの制限酵素Hindを加え、20μ
のHind反応液中で37℃１時間反応した。反
応生成物を、1.0％低融点アガロースゲルで分離
し、700塩基対のPvu−HindDNA断片を単
離した（DNA断片ｄとする。）ステツプ４ステツプ１・２・３で調製したDNAを各々約
0.2μgづつ混合し、３ユニツトのT₄DNAリガー
ゼを加え、30μのT₄DNAリガーゼ反応液中で
16℃15時間反応した。反応後、反応液で大腸菌
DH1株を形質転換し、200μg／mlの５−ブロム−
４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
シドおよび10μg／mlのアンピシリン（シグマ社）
を含むLBプレートに広げ、出現した青色コロニ
ーを単離した。コロニーよりプラスミドDNAを
調製し、1μgのプラスミドDNAに対して１ユニ
ツトの制限酵素Hincを加えて、20μのHind
反応液中で37℃１時間反応させた後、反応生成
物を1.0％のアガロースゲルで分析した。分析し
たプラスミドのうち、3300塩基対、500塩基対お
よび1300塩基対のDNA断片が検出されプラスミ
ドを選択し、pMG1と名付けた。

発現用プラスミドpMG1によるラツト肝チトク
ロムＰ−450cの発現構築した発現用プラスミドpMG1を用いて、大
腸菌内でラツト肝チトクロムＰ−450cの発現を行
つた。以下にその詳細な方法を述べるステツプ１マキシ・セル法による発現蛋白の標
識構築したpMG1プラスミドを、Cohenらの方法
に従い、大腸菌CSR603株（uvr A6，rec Al，
phr，thr，1eu，pro，his，arg，lac，gal，ara，
xyl，mtl，str）（九州大学理学部分子遺伝学講座
保存菌株；住友化学工業株式会社、宝塚総合研究
所にても保存）に形質転換し、形質転換体
CSR603（pMG1）株を得た。得られたコロニーを
培養し、サンカー（Sancar）らのマキシセル法
（J.M.B148p45−62）に従い、発現蛋白の標識を
行た。まず、大腸菌CSR603（pMG1）株を、Ｋ培
地〔１％カザミノ酸、0.1μg／mlチアミン＋M9培
地、但しM9培地は、Na₂HPO₄6g、KH₂PO₄3g、
NaC0.5g、NH₄Ｃ1gに蒸留水を加えて１
とし、オートクレーブ後、0.01MCaC₂を10ml、
1MMgSO₄を１mlを加えたもの。〕中で37℃１晩
培養した。その0.1mlを10mlのＫ培地に植え継ぎ、
37℃でインキユベートして、OD₆₆₀が0.2になるま
で増殖させた。滅菌した時計皿に10mlの培養液を
移し、15Wの紫外線ランプ直下約90cmの距離で、
５〜20秒照射した。照射後、培養液を100ml容三
角フラスコに移し、37℃で１時間培養し、サイク
ロセリンを100μg／mlになるように加え、37℃で
８〜12時間インキユベートした。3000rpmで15分
間遠心して集菌し、ハーシーソルト（5.4gNaC
，3.0gKC，1.1gNH₄Ｃ，15mg CaC₂・
2H₂Ｏ、0.2gMgC₂・6H₂Ｏ，0.2mg FeC₃・
6H₂Ｏ，87mgKH₂PO₄，12.1gTrizmabase／１
）で２回洗浄した。つぎに菌を５mlのハーシ培
地〔ハーシソルト100ml当たり、0.5mlスレオニン
（２％）、１mlロイシン（１％）、１mlプロリン
（２％）、１mlアルギニン（２％）、0.1mlチアミン
（0.1％）〕に懸濁し、37℃１時間インキユベート
した。さらに³⁵Ｓ−メチオニン（1000Ci／
mmole）を50μCi／mlになる様に加え、37℃で１
時間インキュベートした。遠心して集菌し、0.1
mlの２％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）に懸濁
後、100℃で４分間熱処理し、タンパク質を溶解
させた。以上のようにして、調製した粗抽出液の
25μに対して、75μの沈降用緩衝液〔25％
Triton Ｘ−100、190mM NaC，
6mMEDTA，50mMTrisHC（pH7.4）〕を加
え、抗Ｐ−450cgGを10μgを添加し、４℃で１
晩放置した。これに、Ｔ緩衝液〔２％Triton Ｘ
−100，2mM Met，150mM NaC，
5mMEDTA，50mMTris−HC（pH7.4）〕で
平衡化したProteinA−SepharoseCL−4B（フア
ルマシア社）を50μ添加し、10分ごとに攪拌し
ながら、室温で１時間反応させた。12000r.p.m.
で５分間遠心し、沈殿したゲルを１mlのＴ緩衝液
で２回洗浄し非特異的吸着物を除去した。得られ
たゲルを50μのサンプル緩衝液（上記）中で１
分間煮沸して、ゲルに吸着した免疫沈降物を溶出
した後、溶出液を、Laemmliらの方法
（Nature227p680−685）に従つて、SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、フルオログラ
フイーを行つた。結果を第１図に示す。Ａは対称
として用いたpAU157の例で、免疫沈降物は検出
されなかつたが、pMG1を用いたＢでは、ラツト
肝チトクロムＰ−450cに相当する免疫沈降物が確
認された。また、その発現量は、検出量から推定
して大腸菌細胞当り、10²〜10³分子であると考え
られる。

以上のことから、大腸菌CSR603株に組換え体
プラスミドpMG1を導入することにより、ラツト
肝チトクロムＰ−450c蛋白が発現することが確認
された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ラツト肝チトクロムＰ−450c蛋白の
大腸菌内での発現量を示すフルオログラフイー結
果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１プラスミドpMG1で形質転換した大腸菌を培
養することを特徴とするラツト肝チトクロムＰ−
450cの製造方法。