JPH0472568A - 免疫的に活性な物質の測定方法および測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は、微粒子を用い検体中の抗原、抗体などの免疫
的に活性な物質の測定法および測定装置に関する。さら
に詳しくは、本発明は、免疫的に活性な物質を担持した
固体微粒子を用い、抗原抗体反応により生ずる凝集の度
合を光学的に測定する方法および装置に関する。

〔従来技術の説明〕

免疫的に活性な物質、たとえば抗体を担持したポリスチ
レン等の微粒子を水などの液体媒体中に分散させた分散
液（ラテックス試薬）に、上記の免疫的に活性な物質に
対し選択的に反応性を有する物質（例えば抗原）を作用
させることにより起こる凝集を観察することにより測定
を行うラテックス凝集イムノアッセイ法（ＬＡＩＡ）が
ジエー慟エム・シンガーら（Ｊ、Ｍ、Ｓｉｎｇｅｒ　　
ｅｔ　　ａｌ）により見い出され０Ａ、ｍ、Ｊ、Ｍｅｃ
ｉ、、２１　８８８　（１９５６）参照〕、その後、様
々な検討がなされている。その中でも凝集の度合を視覚
により判定する方法が、定量的な測定は困難だが、簡便
でかつ結果が短時間に得られるという利点があることか
ら実用上広く普及している。

近年になって、凝集の度合を光学的に測定する試みがな
され、ニー・フユーチュアら（Ａ、Ｆａｔｕｒｅｅｔ　
　ａｌ）は、凝集反応に伴う濁度の変化を光学的に測定
、動力学的解析から定量分析を行う方法を提案している
［Ａ、Ｆａｔｕｒｅ　　ｅｔ、ａｌ、　；　Ｐｒｏｔｉ
ｄｅｓＢｉｏｌ　Ｆｌｕｉｄｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｃｏ１１
ｏｑ、、　２０　５８９　（１９７２））。

しかし、後述するように、ラテックス試薬そのものの不
安定さから測定値の変動が大きく、又、測定感度上も十
分なものとはいえない。すなわち、ラテックス試薬は液
体分散媒中に固体微粒子が分散している状態のものであ
り、本質的に不安定な系であるため、長期間の貯蔵によ
り凝集を起こしたり、感度が低下したりしやすく、又、
凍結することで分散状態が破壊されるため保存に特段の
配慮を要するなど問題を有している。

これに対して分散媒である液体を除去乾燥させることに
よってラテックス試薬の安定性を改善する方法が提案さ
れている（特開昭５２−１１．７４２０号公報、特開昭
６２−４６２６２号公報）。

しかしながら、ラテックス試薬については、乾燥化する
ことで保存安定性は向上させることができるものの、再
分散して得られたラテックス試薬の凝集反応性の変動が
大きく、その結果測定データがしばしば変動するという
問題がある。

従って、従来技術においてはスライド上での目視による
陰性もしくは陽性の判定など定性的な測定に用いること
ができるが、高精度の定量には不適である。

又、ラテックス試薬などの凝集免疫試薬を毛細管に注入
・凍結乾燥させた該毛細管中で検体と混合させることに
よって反応させ、凝集状態を観察することにより検体中
の免疫的に活性な物質を検出する方法が提案されている
（特開昭５８−７３８６６号公報）。この方法は前述の
提案と同様に試薬の保存安定性が良好であり、さらに簡
便な検査法として魅力あるものではあるが、測定値の再
現性がよくなく、正確な定量ができないという問題点か
ある。

〔発明の目的〕

本発明は、上述の従来技術における問題点を解決して、
測定値の再現性に優れ、正確な定量を可能にする免疫的
測定方法および測定装置を提供することにある。

〔発明の構成・効果〕

本発明者らは、乾燥試薬を用いる従来の測定法における
問題点について検討したところ、従来法における測定値
の変動の原因が、再分散状態のノくラツキによるもので
あるとともに、再分散のための撹拌が長時間に亘り、あ
るいは撹拌強度が強過ぎることにより、固体微粒子と免
疫的に活性な物質との結合が破壊されることによるとみ
られる測定感度の低下にあることを明らかにした。さら
に本発明者らはこれらの現象をもとに、鋭意検討した結
果、乾燥試薬の再分散時、分散状態を光学的に測定しな
がら撹拌し、好適な分散状態に到達した時点で、次の反
応工程に進むことが、高感度で安定な測定を行うために
極めて大きな効果をもたらすことを明らかにした。

本発明は、以上の判明した事実に基づいて更なる検討の
結果完成に至ったものであり、下述する測定方法および
該測定方法を実施するに適した装置を包含する。

本発明の測定方法は下述する内容のものである。

すなわち、固体微粒子の表面に、検体中の被測定物質に
対し免疫的に活性な物質を化学的に結合させ、この結合
された免疫的に活性な物質に検体を液体媒体中で反応さ
せることにより生ずる反応混合物の凝集の度合を光学的
に測定する方法において、 （Ｉ）表面に、検体中の被測定物質に対し免疫的に活性
な物質を化学的に結合せしめ乾燥させた固体微粒子（以
下“乾燥試薬微粒子”という）を含む反応セル中に、分
散媒および検体を添加する工程、 （ＩＩ）上記反応セル中の分散媒と乾燥試薬微粒子およ
び検体を撹拌し、上記乾燥試薬微粒子の分散媒体中での
分散状態を光学的に測定する工程、（ＩＩＩ）上記工［
（ＩＩ）で得られる光学的な測定データから分散媒中で
の乾燥試薬微粒子の分散状態を測定し、あらかじめ設定
した分散状態に到達した時点で、上記工程（ＩＩ）の撹
拌を停止する工程、 （ＩＶ）上記工程（ＩＩＩ）において設定した分散状態
に到達した検体を含む分散体を反応させて凝集状態を生
ぜしめる工程、 （Ｖ）上記工程（ＩＶ）で生じた反応セル中の反応混合
物を測定セルに流す工程、 （ＶＴ）該測定セルに流された反応混合物の凝集の度合
を光学的に測定する工程、 を含むことを特徴とする免疫的に活性な物質の測定方法
であり、 上述の測定方法を実施するに適した本発明の装置は、下
述する内容のものである。すなわち、固体微粒子の表面
に、検体中の被測定物資に対し免疫的に活性な物質を化
学的に結合させ、この結合された免疫的に活性な物質に
検体を液体媒体中で反応させることにより生ずる反応混
合物の凝集の度合を光学的に測定する装置であって、（
Ｉ）前記反応セルを固定する手段、 （ＩＩ）ｌ記反応セル中に分散媒を注入する手段、（Ｉ
Ｉ［）上記反応セル中に検体を注入する手段、（ｒＶ）
上記反応セル中の内容物を撹拌する手段、（Ｖ）撹拌さ
れた反応セル中の、乾燥試薬微粒子の分散媒体中での分
散状態より得られる光学的測定データから、撹拌の継続
・停止を制御する手段、 （ＶＩ）上記反応混合物の凝集の度合を測定する測定セ
ルを固定する手段、 （ＶＩＩ）上記反応混合物を測定セルに流す手段、（Ｖ
ＩＩＩ）上記測定セルに流された反応混合物の凝集の度
合を光学的に測定する手段、を有することを特徴とする
免疫的に活性な物質の測定装置である。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明に用いられる固体微粒子には、生物に由来する微
粒子、無機系微粒子、有機系微粒子を挙げることができ
る。前記生物に由来する微粒子としては、例えば、赤血
球分散処理されたブドウ球菌、連鎖球菌等の細菌類等が
挙げられる。前記無機系微粒子としては、例えば、シリ
カ、アルミナ、ベントナイト等が挙げられる。また前記
有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル
、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル
類、メタクリル酸エステル類などのビニル系モノマーの
単一重合体および／又は共重合体、スチレン−ブタジェ
ン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジェン共重合
体などのブタンエン系共重合体などの微粒子が挙げられ
る。上述の微粒子の粒子径は、生物に由来する微粒子、
無機系微粒子、有機系微粒子のいずれの場合にあっても
０．０５μｍ乃至５μｍが好ましく、該測定方法に適用
するには０．５μｍ乃至５μｍが特に好ましい。粒子径
が０．０５μｍを上廻ると乾燥試薬の分散が困難になり
、又５μｍを上形ると分散試薬の安定性が不良になる。

固体微粒子の表面に結合させる免疫的に活性な物質とし
ては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、
補体、ＣＲＰ、フェリチン、α、−マイクログロブリン
、β２−マイクログロブリンなど血漿蛋白およびそれら
の抗体　α−フェトプロティン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ
）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ−１
９−９、ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカおよびそれらの
抗体　黄体化ホルモン（Ｌ　Ｈ）、卵胞刺激ホルモン（
ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ニス
トロケン、インスリンなどのホルモン類およびそれらの
抗体　ＨＢＶ関連抗原（ＨＢｓ、　ＨＢｅ、　ＨＢｃ）
、ＨＴＶ、ＡＴＬなどウィルス感染関連物質およびそれ
らの抗体・ノツチリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズ
マ、梅毒トレポネーマなどのバクテリア類およびそれら
の抗体：トキソプラズマ、トリコモナス・り一ンユマニ
ア、トリバノゾーマ、マラリア原虫などの原虫類および
それらの抗体・フェニトイン、フエノバルビタールなど
の抗てんかん薬、キニジン、シゴキンニンなどの心血百
薬、テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラムフェニコー
ル、ゲンタマイシンなどの抗生物質などの薬物類および
それらの抗体　その他酵素、菌体外毒素（ストレリジン
０など）およびそれらの抗体などがあり、検体中の被測
定物質と抗原−抗体反応を起こす物質が検体の種類に応
じて適宜選択されて使用される。

これらの免疫的に活性な物質の中でも、特にｈＣＧ抗体
、ＣＲＰ抗体、β２−マイクログロブリン抗体もしくは
α−フェトプロティンが好ましい。

固体微粒子への免疫的に活性な物質の固定化方法として
は、物理吸着と化学結合があるが、本発明においては化
学結合が好ましい。すなわち、本発明では分散媒中に免
疫的に活性な物質を担持させた乾燥固体微粒子と凝集因
子である検体を同時に強い撹拌により分散させるために
結合力の物理吸着による固定化法では固体微粒子から免
疫活性物質が遊離する場合があることによる。化学結合
による固定化方法については、免疫的に活性な物質は、
その構成成分として蛋白質部分を含んでいることから、
該蛋白質を担体に化学結合させる公知の方法により行う
ことができる（固定化酵素、講談社（１９７５）、千畑
一部編参照）。また、アミノ基やカルボキシル基が官能
基として存在する固体微粒子に対しては、カルボジイミ
ドを縮合剤に使用して免疫的に活性な物質を固定化する
ことができる（特公昭５３−１２９６６号公報又は特開
昭５３５２６２０号公報参照）。

更に、カルバモイル基やアミノ基を有する固体微粒子に
対しては、グルタルアルデヒドなどのポリアルデヒドを
使用して免疫的に活性な物質をそれに共有結合を介して
固定化することができる。更にまた、ヒドロキシル基を
有する固体微粒子に対しては、臭化シアンを使用して免
疫的に活性な物質をそれに共有結合を介して固定化する
ことができる。また、エポキシ基やアルデヒド基を有す
る固体微粒子に対しては、免疫的に活性な物質を直接そ
れと反応せしめ共有結合を介して固定化することができ
る。

免疫的に活性な物質を微粒子に固定化せしめるについて
の上述の結合反応については、いずれの場合にあっても
、水又は水及びアルコール類、ケトン類などの水と相溶
性のある有機溶媒との混合溶媒中で行うことが好ましい
。また、反応系中には微粒子の安定化、非特異凝集の生
起を防止する等の目的でリン酸塩緩衝液−生理食塩水、
ＴｒｉｓＨＣ１緩衝液などの緩衝液、牛血清アルブミン
などの不活性蛋白質、界面活性剤などを添加することが
好ましい。上述の結合反応の際の反応溶液のｐＨは通常
６〜１０、好ましくは７〜９である。また該反応溶液中
の微粒子の濃度は通常０．０１〜２０（重量）％である
。

乾燥免疫試薬は上記免疫的に活性な物質を結合させた微
粒子の分散体に用いられている分散媒を除去することに
より得られる。

分散媒の除去は６０’ＣＥ下、好ましくは３０　’ＣＪ
Ｊ下で行うのが免疫的に活性な物質の活性度を維持する
上で有利である。分散媒除去についての特に好ましい態
様においては、凍結乾燥による除去であり、その場合試
薬の感度は定常的に高（維持される。反応セル中に乾燥
免疫試薬を導入するについては、反応セル中に所定量の
免疫的に活性な物質を結合させた微粒子の分散体を入れ
、上述の乾燥を行って分散媒を除去してもよいし、又は
、あらかじめ分散媒を除去した乾燥免疫試薬の所定量を
反応セル中に入れるようにしてもよい。

反応セルとしては、透明なガラス又はプラスチック（例
えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ
塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホンなど）を
材質とするものなどが用いられる。

反応セル中の乾燥免疫試薬を分散する分散媒および反応
混合物を希釈する希釈液は、それぞれ水又は水およびア
ルコール類、ケトン類などの水と相溶性のある有機溶媒
との混合溶媒が使用される。

また分散媒および希釈液は適宜ｐＨ緩衝剤、蛋白質、界
面活性剤、水溶性高分子化合物などが添加される。

ｐＨ緩衝剤は、抗原−抗体反応は一般に溶媒のｐＨの影
響を受けやすいため、最適のｐＨに調節するために添加
され、例えば、リン酸塩やＴｒｉｓ　　ＨＣＩ緩衝剤な
どが使用される。蛋白質は、非特異反応を防止する目的
で添加され、例えば、牛血清アルブミン、ゼラチンなど
が使用される。

界面活性剤、水溶性高分子化合物は、乾燥免疫試薬の分
散助剤として有効であり、例えば、トウイーン２０など
の非イオン界面活性剤やアニオン系界面活性剤、ポリビ
ニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸
塩、ヒドロキシエチルセルロースなどが用いられる。し
かし、これらの添加物は抗原−抗体による凝集反応を阻
害しない範囲で使用される。

また、上記分散媒により乾燥免疫試薬は測定対象によっ
て適宜、希釈調整される。その固形分濃度は使用する測
定セルの種類またサイズにより異なるが、−射的には、
好ましくは０．０１〜５％、より好ましくは０．０５〜
２％の範囲で調整される。

検体、分散媒および乾燥免疫試薬を撹拌処理するには、
検体および乾燥免疫試薬を含む反応セルに所定量の分散
媒を注入し、撹拌具を挿入・撹拌する方法、反応セルを
振盪する方法などを適宜選択できる。

なかでも微粒子の分散で最も効果的である超音液撹拌に
よる撹拌処理が好ましい。超音波撹拌に使用する超音波
については、反応セルの種類またサイズにより異なるが
、−船釣には振動周波数として１５ＫＨｚ乃至５０ＫＨ
ｚの超音波が用いられる。

上記分散工程において、分散媒体中への免疫試薬の分散
の度合は光学的測定手段を用いて測定され、その光学的
測定手段としては、例えば透過光強度を測定する方法、
散乱光強度を測定する方法、透過光と散乱光強度を組合
わせて測定する方法などが適宜使用される。

例えば、透過光強度で分散の度合を測定した場合、第２
図の模式図に示すように、分散が進むに従って反応セル
を透通する光量が減少し、均一に分散状態でほぼ一定に
なる。

又、好ましい分散状態の測定方法は、後述する実験例の
結果から導き出されたものであり、該判定方法は、あら
かじめ測定した分散媒体中での乾燥試薬微粒子の完全分
散体を含む反応セル中を単色光が通過するときの入射光
の強さをＩ０、透過光および７′又は散乱光の強さをＩ
とし、ｆｏｇＩｏ／Ｉ＝Ａ　。

で示される指数Ａ。に対し、上記工Ｗ　（ＩＩ）で得ら
れた乾燥試薬微粒子分散体を含む反応セル中を、上記単
色光が通過するときの入射光の強さをＩ０、透過光およ
び／又は散乱光の強さを■としｌ　ｏｇＩ　Ｏ／ｒ＝Ａ
で示される指数Ａが次の範囲で　あることを確認するこ
とにより行う方法である。　Ａ／Ａ　。

≦１．１ 次の実験例をもとに上記分散判定方法について詳細に説
明する。

実験例」。

後述する実施例１と同様の方法により得られたＣＲＰ感
作ラテックスの一部を１％牛血清アルブミン、５％ショ
糖を添加したｐ　Ｈ７、５のリン酸緩衝液生理食塩水（
以下ＰＢＳ）により、試薬固形分濃度０．２％に調整後
、カラス製光学セル（光路長２ｍｍ）にとり、上記方法
により指数Ａ。を求めたところ２．７５であった（測定
波長６３３ｎｍ）。又、同じく後述する実施例■と同様
の方法により得られたＣＲＰ検出用乾燥試薬微粒子にＰ
ＢＳを添加、試薬固形分濃度０．２％濃度に調整後、Ｃ
ＲＰ標準血清（２ｍｇ／ｄｆ）を加え、超音波撹拌を行
い上記方法により指数Ａを求めた。次いで、各々撹拌停
止６０秒後に、希釈セル中で反応混合物をＰＢＳにより
５００倍に希釈し、希釈液をフローセルに導き、Ａｒレ
ーザ光を照射し粒子からの後方散乱光を検出することに
より希釈液中の試薬微粒子の凝集状態を測定した。この
結果と、予め作っである検量線と対比し、検体中のＣＲ
Ｐ濃度を算出した結果を表３および第４図に示す。

実」１例−？ 実験例１と同様の実験をカルボキン化ポリスチレンの代
わりに、カルボキシル化したスチレン−メチルメタクリ
レート共重合体、ポリメチルメタクリレートなど他の組
成の微粒子を用いて、又粒子径を変えて行った。結果を
横軸に撹拌処理時間、縦軸にＡ／Ａ　ｏをプロットし、
第５図に示す。なお、測定感度Ｍ度ともに良好な部分を
実線でその他の部分を破線で結んだ。

実験例１．２の結果から明らかなように、Ａ／Ａ　。

が１．１を越えている場合、測定感度が不良である。又
、同一の実験を繰り返し実施したところ、Ａ／Ａ　ｏが
１．１を越えている場合、測定値の変動が大きいことが
明らかになった。つまり、Ａ／Ａ。

１．１が測定感度、測定値の変動の２面から臨界的な値
であることを見出した。又、表−３からも見られるよう
に長時間撹拌処理を行うにつれ測定感度の低下傾向が見
られることを見出した。

すなわち、乾燥試薬微粒子を検体を含む分散媒中に撹拌
処理する際、光学的測定をしながらＡ／Ａｏが上述の範
囲を満足する時点で撹拌処理を終了させ、ひき続き次の
工程に進むことにより、被測定物質の種類にかかわらず
、微量成分てあっても測定値の変動が少ない、安定な測
定ができるようになった。次に、乾燥試薬微粒子の完全
分散体の指数Ａ。の求め方は、通常、固体微粒子に免疫
的に活性な物質を化学的に結合させる際、水又は水を主
体とする混合媒体中で行われるため、実験例１で示すよ
うに結合後乾燥する前の感作試薬ラテックス懸濁液の分
散媒の組成を乾燥試薬微粒子の再分散に用いる分散媒の
組成と合わせた上、光学的な測定を行い定めるのが好ま
しい。

さらに本発明では乾燥試薬および検体を含む撹拌工程に
おいて、上述のような光学測定で分散状態をチエツクす
るとともに、得られた分散状態の測定結果とあらかじめ
設定した分散状態を示す光学データと対比し、撹拌工程
の継続、停止もしくは撹拌強度の制御を行う。

撹拌終了後、検体中に試薬中の微粒子表面に結合された
免疫的に活性な物質と反応性を有する物質（被測定物質
）が含まれる場合は、被測定物質と免疫的に活性な物質
が反応、抗原−抗体反応を起こし、検体中の被測定物質
の濃度に応じ凝集が進行する。

なお、生じた凝集塊が解離しない範囲で反応セル中に撹
拌具を挿入し撹拌したり、反応セルを振盪するなどの方
法により撹拌することもできる。

また、この撹拌は上述の乾燥試薬および検体を含む分散
媒の撹拌処理に比べ弱い撹拌力でなされることが好まし
い。

凝集反応の進行した反応セル中の反応混合物は希釈セル
中で前述の希釈液により希釈される。希釈濃度はひき続
き行われるフローセルに反応混合希釈物を導くときに、
凝集塊が一つずつ送られる濃度に適宜調整される。

反応混合希釈物の凝集状態は、凝集塊を一つずつフロー
セルに送り込み光学的な反作用を順次測定することによ
りなされ、例えば、臨床検査３０（１，１）１２５９に
示されるような光軸直交型、同一光軸型のフローサイト
メータなどが好適に用いられる。

得られた測定データから検体中の被測定物質の濃度の算
出は、例えばあらかじめ被測定物質の濃度と反応後の反
応混合希釈物の凝集状態の関係を示す検量線をつくり、
それと検体と試薬の反応混合希釈物の凝集状態を対比す
ることにより行われる。本発明による測定方法の基本原
理を示すフローチャートを第３図に示す。

本発明による測定装置は、前記のとおり、前記反応セル
を固定する手段、上記反応セル中に分散媒を注入する手
段、上記反応セル中に検体を注入する手段、上記反応セ
ル中の内容物を撹拌する手段、撹拌された反応セル中の
、乾燥試薬微粒子の分散媒体中での分散状態より得られ
る光学的測定データから、撹拌の継続・停止を制御する
手段、上記反応混合物の凝集の度合を測定する測定セル
を固定する手段、上記反応混合物を測定セルに流す手段
、上記測定セルに流された反応混合物の個々の凝集粒子
の凝集の度合を光学的に測定する手段を有する。また、
反応混合物を測定セルに流す前に反応混合物を希釈液に
希釈する手段を有していてもよい。さらに検体を希釈す
る手段、抗原過剰（ブローシン現象）をチエツクする手
段を付加してもよい。

本発明を実施するにあたって適宜好適な装置を用いるこ
とができるが、本発明の方法を実施するに適した好まし
い装置の一例を第１図に示す。

第１図に示す装置においては、乾燥ラテックス試薬の入
ったアクリル樹脂製又は（石英）ガラス製の反応セル２
には、ラテックス試薬の分散時の光学データおよび反応
混合物の凝集の度合から求めた検量線データをメモリよ
り呼び出すコードを表示したバーコード１２が上部に貼
り付けである。反応セル２はセルホルダー兼恒温槽１０
にセットされる該恒温槽１０には、撹拌機能を付与する
ための超音波振動子からなる撹拌装置１１が付属してい
る。反応セル２に貼り付けたバーコードはバーコード読
み取り装置１３でデータを読み取り、データ処理装置１
４に送られる。分散媒は恒温槽７中の分散媒容器８より
送液バルブ１７を通じて反応セル中に一定量注入される
。又、検体は検体容器９より送液バルブ１８を通じて反
応セル２に一定量注入される。

該反応セル中はただちに恒温槽１０中で超音波撹拌され
る。その撹拌工程において光源Ｉから放射される光束は
光学セル２に導入される。光源１はコヒーレント光を放
射させる場合、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザー（波長６３２．
８ｎｍ）、半導体レーザー（波長７８Ｑｎｍ、８３０　
ｎ　ｍ　）などが用いられる。又光源としてインコヒー
レント光を放射する場合には、タングステンランプやハ
ロゲンランプなどが使用でき、適当な波長をモノクロメ
ータ−やフィルターで選択する。

反応セル２に導入された光束は分散もしくは吸収され、
透過光はフォトダイオードからなる光検出器３で検知さ
れ散乱光は光検出器４で光量検知される。

又、光源１の光量変動は光検出器５で検出され、データ
処理装置１４に送られる。

光検出器３．４の検出信号もデータ処理装置１４に送ら
れ、Ａ／Ｄ変換回路から比較演算回路に入り、メモリー
回路のラテックス試薬の分散時の光学データと対比させ
る。

その結果より、信号が超音波撹拌の制御装置１５に送ら
れ、超音波撹拌の停止、継続又は分散強度を制御する。

撹拌工程が終了すると反応セル２中では凝集反応が始ま
る。反応混合物は検査線作成時の反応条件に合せ、適宜
送液バルブ１９を通して希釈セル２０に送られる。又、
併せて恒温槽２１中の希釈剤容器２２より送液バルブ２
３を通じて希釈剤が所定量送られ、反応混合希釈物を得
る（この時、撹拌機２４により希釈液を撹拌してもよい
）。反応混合希釈物は送液バルブ２５を通じてフローセ
ル２６に送られる。レーザー光源２７より放射される光
束はフローセル２６に導入され、反応混合希釈物中の凝
集粒子が通過する際の散乱光を光検出器２８で光量検知
する。これらの信号は、データ処理装置１４へ送られ、
そのＡ／Ｄ変換回路から測定演算回路で、あらかじめ入
力しである検量線データをもとに濃度データに演算処理
され、結果は表示装置１６に表示される。

以下の実施例と比較例において、本発明の詳細な説明す
る。

支ｌ眉」 抗体感作懸濁液の調製： 抗ヒトＣＲＰヤギ血清（Ｂｉｏ　Ｍａｋｏｒ製）をＰｒ
ｏｔｅｉｎ−Ａ　　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（ファルマシ
ア製）のカラムクロマトグロフイーによりＩｇＧ分画に
精製し、ｐＨ５，５の０．１Ｍリン酸塩緩衝液に１０ｍ
ｇ／ｍｆの濃度となるように希釈した。

粒径０，７１ｎｍのカルボキシル化ポリスチレン（日本
合成ゴム■製ＧＯ７０］）　１０％水−懸濁液１０ｒｎ
ｊ！に縮合剤として１−シクロへキシル−３−〔２−モ
ルホリニル−（４）−エチル〕カルボンイミド　メト−
ｐ−トルエンスルホネート（以下刃ルポジイミドＴｓ）
の１％水溶液２５ｒｒ＋ｊｌ！を加え、さらに上述のＩ
ｇＧ分画抗体２０ｍ　ｌを加え、室温で３時間撹拌し、
感作ラテツクスを得た。

上記感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％牛血清アルブミ
ン３％シヨ糖となるよう調製したｐＨ７，２のリン酸塩
緩衝液−生理食塩水（以下ＰＢＳ）を加え、ＣＲＰ抗体
感作ラテックス懸濁液とした。

試薬の乾燥化・ 上記で調製したＣＲＰ感作ラテックス懸濁液を液体窒素
中で凍結減圧乾燥し、ＣＲＰ検出用乾燥試薬微粒子を得
た。

測定−再現性評価： 標準ＣＲＰ血清（協和油化型）をＴｒｉｓ　　ＨＣＲ緩
衝液で希釈し、５μｇ　／　ｍ　！！の濃度としたもの
をＣＲＰ検体とした。

上記乾燥試薬微粒子１　、２　ｍ　ｇの入ったガラス製
光学セル（光路長２　ｍ　ｍ　）に試薬固形分濃度が０
．２％となるようにＰＢＳを添加する。

さらに上記セル中にＣＲＰ抗体（５μｇ／ｍｆ）を０．
３ｍ　Ｉ加えた。直ちに上記セル内容物を超音波撹拌処
理し、その撹拌過程で入射光の強さをＩ０、透過光を１
とし、βｏｇｌｏ／Ｉ−Ａで示される指数Ａを求める（
測定波長λ＝　６３３　ｎ　ｍ　）。

一方、あらかじめ上述〔抗体感作ラテックス懸濁液の調
整〕で得られたＣＲＰ抗体感作ラテックスを０．２％の
濃度に調整し、上記と同様の方法により透過光測定をし
、ｎｏｇｌｏ／Ｉを求めたところ２．７５　（−Ａ。）
であった。撹拌工程は上記で求めたＡがＡ／Ａｏ≦１．
１　（Ａ≦３．０３）を満足した時点で停止させ、停止
３００秒後に希釈セル（２０ｍ　ｌポリエチレンテレフ
タレート製）中で、反応混合物をＰＢＳにより５００倍
に希釈・混合した。得られた反応混合希釈物をフローセ
ルに送り、波長４８８ｎｍのレーザー光を照射し反応混
合希釈物中の粒子の凝集状態を測定した。このデータと
あらかじめ測定された検量線データとを対比し、ＣＲＰ
検体中のＣＲＰの濃度を測定、この操作を１０回行い再
現性を評価した。

旦」 撹拌工程において、超音波による分散時間を一定にする
こと以外は実施例−１と全く同様に再現性を調べた。

く結果〉 実施例Ｉならびに比較例１の結果を表１に示す。

この結果から、乾燥試薬の分散状態をチエツクし、一定
の分散状態に達したときに撹拌を停止した場合、ＣＲＰ
濃度の測定値が一番真値（５，０μｇ／　ｍ　ｌ　）に
近く、かつ測定値の変動が小さい。撹拌処理時間を１５
秒に固定した場合、乾燥試薬の分散が不十分で試薬微粒
子が単分散せず、ＣＲＰとの反応前に凝集状態の粒子が
存在し、みかけの測定値を上げているとみられる。

撹拌処理時間を３０秒に固定した場合、実施例１と概ね
撹拌処理時間は同一であるが、分散状態が個々に変動が
ある為、ＣＲＰ濃度の測定値の変動が大きくなっている
。又、撹拌処理時間を３００秒にした場合、乾燥試薬の
分散は十分となるが、撹拌による抗体の活性低下のため
か、感度が低下し、ＣＲＰ測定値が真値に比べ低くなっ
ている。

２−ｈＣＧの 抗体感作ラテックス懸濁液の調製・ 抗ｈＣＧ抗体（ウサギ）　（Ｂｉｏ　Ｍａｋｏｒ製）を
ＰｒｏｔｅｉｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（ファルマシ
ア製）のカラムクロマトグラフィーによりＩｇＧ分画に
精製し、そのＩｇＧ分画１０ｍｇ／ｍＡをｐＨ７，２の
０　、１　ｈｉミリン塩緩衝液に希釈した。

粒径０．７１ｎｍのカルボキシル化ポリスチレン（日本
合成ゴム■製ＧＯ７０１）１０％水−懸濁液４ｍｌにカ
ルボンイミドＴｓの１％水溶液２０ｍＲを加え、さらに
ＩｇＧ分画抗体２０ｍ　、ｆ’を加え室温で２時間撹拌
し、固定化した抗体感作ラテックスを得た。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％牛血清アルブ
ミン３％シヨ糖、２％カルボキシメチルセルロースナト
リウム塩となるよう添加し、ＰＢＳを加え再分散しｈＣ
Ｇ抗体感作ラテックス懸濁液とした。

試薬の乾燥化 上記で調製したｈＣＧ感作感作ラテックス液濁液体窒素
中で凍結減圧乾燥しｈＣＧ検出用乾燥試薬微粒子を得た
。

測定−再現性評価： ｈＣＧ乾燥試薬微粒子１　、２　ｍ　ｇの入ったガラス
製光学セル（光路長２ｍｍ）に試薬固形分０．２％濃度
となるようにＰＢＳを添加する。

さらに上記セル中にｈＣＧ標準液（日本ケミカルリサー
チ製）をｌ０ＩＵ／ｍｆの濃度に調製したもの（以下ｈ
ＣＧ検体）を１００μｌ加えた。直ちに上記セル中を超
音波撹拌処理し、その撹拌はあらかじめ測定した０、２
％ｂｃＧ感作ラテックス懸濁液の波長６３３ｎｍでの吸
光指数Ａ　ｏ　（２，８１）に対し、撹拌中の吸光指数
ＡとするとＡ／Ａ　ｏ≦１．１（すなわちＡｓ２．０９
）を満足した時点で停止する。その工程での撹拌時間は
４０秒であった。停止後３００秒後に希釈セル（２０ｍ
　！！ポリエチレンテレフタレート製）中で、反応混合
物をＰＢＳにより５００倍に希釈・混合した。得られた
反応混合希釈物をフローセルに送り、波長４８８ｎｍの
レーザー光を照射し反応混合希釈物中の粒子の凝集状態
を測定した。このデータとあらかじめ測定された検量線
データとを対比し、ｈＣＧ検体中のｈＣＧの濃度を測定
、この操作を１０回行い再現性を評価した。

匿較主」 撹拌工程において超音波撹拌の時間を一定（４５秒、３
００秒）にすること以外は実施例２と全く同様に再現性
（１０回の測定繰返し）を調べるために変動係数を算出
した。

実　　　３−ＡＦＰの　１ 抗体感作ラテックス懸濁液の調製・ 抗ヒトα−フェトプロティン（ウマ）（ＡＦＰ）　血清
（ミドリ十字Ｖ）をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ　　５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ（ファルマシア製）のカラムクロマトグラフィ
ーによりＩｇＧ分画に精製し、さらにｐＨ７，２の０．
１Ｍリン酸塩緩衝液で１０ｍｇ／ｍｊ’の濃度に希釈し
、ＩｇＧ分画抗体とした。

粒径０．７１ｎｍのカルボキシル化ポリスチレン（日本
合成ゴム■製ＧＯ７０１）　１０％水−懸濁液５ｍＡに
カルボジイミドＴｓの１％水溶液２０ｍ　ｌを加え、さ
らにＩｇＧ分画抗体２０ｍ　ｌを加え、室温で２時間撹
拌し、抗体感作ラテックスを得た。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％濃度の牛血清
アルブミン、３％濃度となるようショ糖を添加しｐＨ７
，２のＰＢＳを加え、ＡＦＰ抗体感作ラテックス懸濁液
とした。

試薬の乾燥化。

上記で調製したＡＦＰ抗体感作ラテックス懸濁液を液体
窒素中で凍結し減圧乾燥し、ＡＦＰ検出用乾燥試薬微粒
子とした。

測定−再現性評価： ＡＦＰ検出用乾燥試薬微粒子１．２ｍｇの入ったガラス
製光学セル（光路長２ｍｍ）に試薬固形分濃度が０．２
％となるようにＰＢＳを添加する。

さらに上記セル中に５０μｇ／ｍｆのＡＦＰ標準液（以
下ＡＦＰ検体）を２００μｌ加える（ＡＦＰ検体は標準
ＡＦＰ血清（協和油化製）をＴｒｉｓ　　ＨＣ１緩衝液
で希釈し所定の濃度にしたもの）。直ちに上記セル中を
超音波撹拌処理し、その撹拌はあらかじめ測定した０、
２％ＡＦＰ感作ラテックス懸濁液の波長６３３ｎｍでの
吸光指数Ａ　。（２，７１）に対し、撹拌中の吸光指数
ＡとするとＡ／Ａｏ≦１．１（すなわちＡｓ２．９８）
を満足した時点で停止する。

その工程での撹拌時間は３０秒であった。

停止後、３００秒後に希釈セル（２０ｍｌポリエチレン
テレフタレート製）中で、反応混合物をＰＢＳにより５
００倍に希釈・混合した。得られた反応混合希釈物をフ
ローセルに送り、波長４８８ｎｍのレーザー光を照射し
反応混合希釈物中の粒子の凝集状態を測定した。このデ
ータとあらかじめ測定された検量線データとを対比し、
ＡＦＰ検体中のＡＦＰの濃度を測定、この操作を１０回
行い再現性を評任した。

匿較主」 撹拌工程において超音波撹拌の時間を一定（３０秒、３
００秒）にすること以外は実施例３と全く同様に再現性
（１０回の測定繰返し）を調べるために変動係数を算出
した。

４−　　マイクロ　ロブリンの 抗体感作ラテックス懸濁液の調製。

抗β２−マイクログロブリン（ウサギ）　（Ｂｉ。

Ｍ　ａ　ｋ　ｏ　ｒ製）をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ　　５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　（フアルマシア製）のカラムクロマト
グラフィーによりＩｇＧ分画に精製し、さらにｐＨ７，
２の０．１Ｍリン酸塩緩衝液で］Ｏｍｇ／ｍｌの濃度に
希釈し、ＩｇＧ分画抗体とした。

粒径０．７１ｎｍＯカルボキシル化ポリスチレン（日本
合成ゴム■製ＧＯ７０１）　１０％水−懸濁液４ｍｌに
カルボジイミドＴｓの１％水溶液２０ｍ　ｌを加え、さ
らにＩｇＧ分画抗体２０ｍ　ｌを加え、室温で３時間撹
拌し、抗体感作ラテックスを得た。

上記の感作ラテツクスを遠心洗浄後、１％濃度の生血清
アルブミン、３％濃度となるようにショ糖を添加しｐＨ
７，２のＰＢＳを加えβ２−マイクログロブリン抗体感
作ラテックス懸濁液とした。

試薬の乾燥化： 上記で調製したβ２−マイクログロブリン抗体感作ラテ
ックス懸濁液を液体窒素中で凍結し減圧乾燥しβ２−マ
イクログロブリン検出用乾燥試薬微粒子とした。

測定−再現性評価： β２−マイクログロブリン検出用乾燥試薬微粒子１　、
２　ｍ　ｇの入ったガラス製光学セル（光路長２ｍｍ）
に試薬固形分濃度が０．２％となるようにＰＢＳを添加
する。

さらに上記セル中に５μｇ／ｍｌのβ２−マイクログロ
ブリン標準液（以下ＭＧ検体）を１００μｌ加える（Ｍ
Ｇ検体は標準β２−マイクログロブリン血清（協和油化
製）をＴｒｉｓ　　ＨＣｌ緩衝液て希釈し所定の濃度に
したもの）。直ちに上記セル中を超音波撹拌処理し、そ
の撹拌はあらかじめ測定した０、２％β２−マイクログ
ロブリン抗体感作ラテックス懸濁液の波長６３３ｎｍで
の吸光指数Ａ。

（２，８０）に対し、撹拌中の吸光指数ＡとするとＡ／
Ａｏ≦１．１（すなわちＡｓ３．０６）を満足した時点
で停止する。その工程での撹拌時間は４０秒であった。

停止後、３００秒後に希釈セル（２０ｍｆポリエチレン
テレフタレート製）中で、反応混合物をＰＢＳにより５
００倍に希釈・混合した。得られた反応混合希釈物をフ
ローセルに送り、波長４８８ｎｍのレーザー光を照射し
反応混合希釈物中の粒子の凝集状態を測定した。このデ
ータとあらかじめ測定された検量線データとを対比し、
ＭＧ検体中のβ２−マイクログロブリンの濃度を測定、
この操作を１０回行い再現性を評価した。

また実施例１と同様に変動係数Ｃ，Ｖ、（％）を算出し
た。

垣較ｌ」 撹拌工程において超音波撹拌の時間を一定（３５秒、３
００秒）にすること以外は実施例４と全（同様に再現性
（１０回の測定繰返し）を調べるために変動係数を算出
した。

実施例２〜４、比較例２〜４の測定結果を表２に示す。

表２の結果より、被測定物質をｈＣＧ、β２マイクログ
ロブリン、ＡＦＰに変えても撹拌処理時間を可変に制御
する実施例の方が撹拌時間を固定した比較例に比べて真
の値に近い測定データが得られ、変動係数が小さくなり
再現性が向上した。

表　　１ Ｄ ＊　　　ＣＶ＝　−Ｘ１００ 表 Ｏ：測定感度良好、　△・やや不良、×：不良＊みかけ
の測定値が高くなるが、真の値からの差は大〔発明の効
果の概要〕 以上説明したように、本発明は抗原−抗体反応を利用し
検体中の抗原、抗体などの免疫的に活性な物質を定量で
きる。

また、本発明では乾燥免疫試薬を使用するため、従来の
水中に分散した試薬に比べ試薬の保管上次のような利点
がある。

１、試薬が乾燥状態であるため水中に分散した試薬のよ
うに経時的な自然凝集が生じない。

２、試薬の保管時の温度管理が緩和される。

（従来の試薬は凍結不可で保管に注意が必要）３、乾燥
試薬は安定でより長期の保管が可能。

以上の利点を有する乾燥免疫試薬を用いその微粒子と検
体を含む分散媒の撹拌処理工程でその分散状体を光学的
に測定し、撹拌力を制御することで以後のひき続き生ず
る凝集反応がスムーズに進み、得られたデータの再現性
および信頼性を大幅に向上させることが可能になる。

また試薬撹拌処理工程において最小限の撹拌時間に制御
可能なため感度の低下を防ぐと同時に測定時間の短縮化
が計られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施するのに適した装置の典型
的−例を模式的に示す図であり、第２図は各工程におけ
る透過率変化を示す図であり、第３図は本発明の測定方
法フローチャートである。第４図および第５図は実験例
１および２における撹拌時間とＡ／Ａ　ｏの関係を示す
図である。 第１図において、 ｌ・・・光源 ２・・・反応セル ３〜５．２８・・・光検出器 ６・・・ハーフミラ− ７・・・分散媒用恒温槽 ８・・・分散媒容器 ９・・・検体容器 １０、２１・・・セルホルダー兼恒温槽１１・・・撹拌
装置ｆ（超音波振動子と振盪機）１２・・・バーコード １３・・・バーコード読み取り装置 １４・・・データ処理装置 １５・・・撹拌装置の制御装置 １６・・・表示装置 １７．１８．１９．２３．２５・・・送液バルブ２０・
・・希釈セル ２２・・・希釈剤容器 ２９・・・撹拌装置 ２６・・・フローセル ２７・・・レーザー光源 ２９・・・送液チューブ １痒処搾哨菅 椿押廻理萌閣

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）固体微粒子の表面に、検体中の被測定物資に対し
   免疫的に活性な物質を化学的に結合させ、この結合され
   た免疫的に活性な物質に検体を液体媒体中で反応させる
   ことにより生ずる反応混合物の凝集の度合を光学的に測
   定する方法であって、 （ I ）表面に、検体中の被測定物質に対し免疫的に活
   性な物質を化学的に結合せしめ乾燥させた固体微粒子（
   以下“乾燥試薬微粒子”という）を含む反応セル中に、
   分散媒および検体を添加する工程、 （II）上記反応セル中の分散媒と乾燥試薬微粒子および
   検体を撹拌し、上記乾燥試薬微粒子の分散媒体中での分
   散状態を光学的に測定する工程、 （III）上記工程（II）で得られる光学的な測定データ
   から分散媒中での乾燥試薬微粒子の分散状態を測定し、
   あらかじめ設定した分散状態に到達した時点で、上記工
   程（II）の撹拌を停止する工程、 （IV）上記工程（III）において設定した分散状態に到
   達した検体を含む分散体を反応させて凝集状態を生ぜし
   める工程、 （Ｖ）上記工程（IV）で生じた反応セル中の反応混合物
   を測定セルに流す工程、 （VI）該測定セルに流された反応混合物の凝集の度合を
   光学的に測定する工程、 を含むことを特徴とする免疫的に活性な物質の測定方法
   。
2. （２）上記工程（III）の分散状態の判定を、分散媒体
   中での乾燥試薬微粒子の分散状態における光学的な測定
   データをあらかじめ作成し、上記工程（II）で得られた
   乾燥試薬微粒子分散体の光学的な測定データと対比し、
   分散を確認することにより行う、請求項１記載の測定方
   法。
3. （３）上記工程（III）の分散状態の判定を、あらかじ
   め測定した分散媒体中での乾燥試薬微粒子の完全分散体
   を含む反応セル中を単色光が通過するときの入射光の強
   さをＩ＿０、透過光および／又は散乱光の強さをＩとし
   、ｌｏｇＩ＿０／Ｉ＝Ａ＿０で示される指数Ａ＿０に対
   し、上記工程（II）で得られた乾燥試薬微粒子分散体を
   含む反応セル中を、上記単色光が通過するときの入射光
   の強さをＩ＿０、透過光および／又は散乱光の強さをＩ
   としｌｏｇＩ＿０／Ｉ＝Ａで示される指数Ａが次の範囲
   であることを確認することにより行う、請求項１記載の
   測定方法。 Ａ／Ａ＿０≦１．１
4. （４）上記工程（VI）の凝集状態の光学的な測定を、上
   記工程（Ｖ）で得られた反応混合物を希釈液で希釈し、
   該希釈液を流しながら行う、請求項１記載の測定方法。
5. （５）固体微粒子の表面に、検体中の被測定物質に対し
   免疫的に活性な物質を化学的に結合させ、この結合され
   た免疫的に活性な物質に検体を液体媒体中で反応させる
   ことにより生ずる反応混合物の凝集の度合を光学的に測
   定する装置であって、 （ I ）前記反応セルを固定する手段、 （II）上記反応セル中に分散媒を注入する手段、（III
   ）上記反応セル中に検体を注入する手段、（IV）上記反
   応セル中の内容物を撹拌する手段、（Ｖ）撹拌された反
   応セル中の、乾燥試薬微粒子の分散媒体中での分散状態
   より得られる光学的測定データから、撹拌の継続・停止
   を制御する手段、 （VI）上記反応混合物の凝集の度合を測定する測定セル
   を固定する手段、 （VII）上記反応混合物を測定セルに流す手段、（VIII
   ）上記測定セルに流された反応混合物の凝集の度合を光
   学的に測定する手段、 を有することを特徴とする免疫的に活性な物質の測定装
   置。