JPH0488993A - トランス―４，５―デヒドロ―ｌ―リジンの製造法及びその生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗真菌剤として有用なトランス−４゜５−デ
ヒドロ−し−リジンの新規な製造法及びこれを生産する
微生物に関する。

〔従来の技術〕

トランス−４，５−デヒドロ−ＤＬ−リジンは公知化合
物であり、例えばＪ、Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　Ｐｅｒｋ
ｉｎ　ｒ１９７２１Ｂ２５に記載の方法で合成できる。

また、特開昭６３−１８３５２６号公報には、このトラ
ンス−４，５−デヒドロ−ＤＬ−リジン、特にトランス
−４，５−デヒドロ−し−リジンが優れた抗真菌作用を
示すこと、及びＤＬ一体から効率的にＬ一体を得る方法
が記載されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、このトランス−４，５−デヒドロ−Ｌ−
！Ｊリジン製造法は、ラセミ化合物中から光学分割によ
りＤ一体を除去するものであるため、最終工程でのＬ体
の収率を５０％以上にすることは理論上不可能であり、
工業的に有利な方法ではなかった。

従って、優れた抗真菌作用を有するトランス−４，５−
デヒドロ−し−リジンを工業的に有利に製造する方法の
開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者らは鋭意検討を重ねた結
果、ノカルジオプシス属に属する特定の菌が、特異的に
トランス−４，５−デヒドロ−Ｌ−リジンを生産するこ
とを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、ノカルジオプシス属に属するトラン
ス−４，５−デヒドロ−Ｌ−リジン生産菌を培養し、得
られた培養液よりトランス−４，５−デヒドロ−し−リ
ジンを採取することを特徴とするトランス−４，５−デ
ヒドロ−し−リジンの製造法及びこれを生産する微生物
を提供するものである。

本発明のトランス−４，５−デヒドロ−し−リジンを生
産する微生物としては、例えばノカルジオプシス・エス
ピー　ＫＣ−７２２３が挙げられる。このＫＣ−７２２
３株は次のような菌学的性質を有する。なお各種培地上
の性質は特に記載のない限り、２７℃で１４日間培養し
、常法によって観察したものであり、色調の表現はカラ
ー・ハーモニー・マニュアル５４４版（コンテナー・コ
ーポレーション・アメリカ）の分類に従った。

■、形態学的性質 本菌株は数種の培地上で貧弱であるが、気菌糸を形成す
る。それらは単純分枝し、胞子槽は気菌糸上に枝状に生
じ、その先端は直状あるいは部分的に波状を呈する。

胞子は短円筒形で０．３　Ｘ　１．０μｍ程度の大きさ
を示し、２０個以上の連鎖をなす。胞子表面は平滑構造
を有する。鞭毛胞子、胞子のう、菌核などの形成は認め
られず、長生菌子の分断は認められた。

■、各種培地上の性状 １、シュクロース・硝酸塩寒天培地 生育：良好 気菌糸の着生：認められない 気菌糸の色：認められない 長生菌糸の色：微黄色（２４！ｃ） 可溶性色素：微黄色（２１ｃ） ２、グルコース・アスパラギン寒天培地生育：中程度 気菌糸の着生：認められない 気菌糸の色：認められない 長生菌糸の色：淡灰桃色（３ｃ　ａ） 可溶性色素：微黄色（２４！ｃ） ３、グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：良好 気菌糸の着生：認められない 気菌糸の色：認められない 長生菌糸の色：微黄色（２ｅａ） 可溶性色素：微黄色（２ｌ　ｃ） ４、スターチ・無機塩寒天培地 生育：良好 気菌糸の着生：貧弱 気菌糸の色：白（ａ） 長生菌糸の色：微黄白色（２ｃ　ａ） 可溶性色素：認められない ５、チロシン寒天培地 生育：中程度 気菌糸の着生：認められない 気菌糸の色：認められない 長生菌糸の色：淡灰褐色（３ｅｃ） 可溶性色素：認められない ６、栄養寒天培地 生育：中程度 気菌糸の着生：詔められない 気菌糸の色：認められない 長生菌糸の色：微黄白色（２ｃａ） 可溶性色素：認められない ７、イースト・麦芽寒天培地 生育：良好 気菌糸の着生：貧弱 気菌糸の色：白（ａ） 長生菌糸の色：微黄白色（２ｃａ） 可溶性色素：微黄色（２１ｃ） ８、オートミール寒天培地 生育：中程度 気菌糸の着生：認められない 気菌糸の色：認められない 長生菌糸の色：白（ａ） 可溶性色素：認められない ■、生理的性質 １、生育温度範囲　　　　１５℃〜４０℃至適生育温度
　　　　３０℃〜３６℃ ２、ゼラチンの液化　　　　　陰　　性３、　スターチ
の加水分解　　　陽　　性４、脱脂牛乳の凝固　　　　
　陽　　性脱脂牛乳のペプトン化　　陽　　性 ５、　メラニン様色素の生成　　陰　　性６、耐塩性　
　　　　　　　　≦４％ ■、炭素源の利用性 プリドハム・ボッ）　ＩＪ−ブ寒天培地上での炭素源の
利用性を検討した結果、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロ
ース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、シュクロー
ス及びラフィノースを利用した。

Ｄ−マンニトールの利用は認められなかった。イノシト
ール、Ｌ−ラムノースの利用は疑わしかった。

■、細胞壁成分 １、細胞壁加水分解中のジアミノピメリン酸の分析 ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を含む。

２、細胞壁加水分解中の糖成分の分析 マジュロース、ガラクトース、アラビノース及びキシロ
ースを含まない。

以上の形態的特徴並びに生理的性質をもとに本菌株と類
似する菌株を「バーシーズ・マニュ７ＪＬ。

・オブ・デターミナテイブ・バクテリオロジー」第８版
、シャーリング及びゴツトリーブによるＩＳＰ記載の諸
菌株及びワックスマン著「ジ・了りチノミセテス」第２
巻及びその他の放線菌の新種発表文献を検索したところ
類似株ノカルジオプシス・ムタビリス（Ｎｏｃａｒｄｉ
ｏｐｓｉｓ　ｍｕｔａｂｉｌｉｓ　ＩＦＯ１４３１０）
株が選択された。

しかし、ノカルジオプシス・ムタビリスＩＦ０１４３１
０株（以下ｒＮ、ｍ株」という）は、全菌体糖成分とし
て、ガラクトースを含有するがＫＣ−７２２３株は含有
しない。又、Ｎ、　ｍ株はラフィノースを利用しないが
、にＣ−７２２３株は利用する等の点で両菌株は異なっ
ていた。以上より、ＫＣ−７２２３株はノカルジオプシ
ス・ムタビリスに近縁な新規菌株と判断し、ノカルジオ
プシス・ｓｐ、ＫＣ−７２２３株と命名し、工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研条寄第２９９３号（ＦＥ
！ＲＭ　−ＢＰ−２９９３）として寄託した。

本発明においては、ノカルジオプシス属に属し、トラン
ス−４，５−デヒドロ−し−リジンの生産能を有する菌
であれば、上記ＫＣ−７２２３株だけでなく、その自然
変異株、人工変異株も使用することができることはいう
までもない。

上記の本発明微生物を用いてトランス−４，５−デヒド
ロ−し−リジンを得るには、適当な培地に本発明微生物
を接種し、通常の抗生物質生産のための培養方法に従っ
て培養すればよい。培地としては、資化し得る窒素源と
炭素源を適宜組み合わせて含有せしためものが使用され
る。この炭素源及び窒素源には特に制限はなく、例えば
炭素源としては、澱粉、ブドウ糖、グリセリン、マルト
ース、デキストリン、蔗糖、果糖、糖蜜など；更に菌の
資化性によっては、炭化水素、有機酸なども用いること
ができる。これらは単独でも二種以上を混合して用いて
もよい。一方、窒素源としては大豆粉、酵母エキス、乾
燥酵母、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー
、カザミノ酸、ディスティラーズソリニプル、塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウムな
どが単独で又は組み合わせて用いられる。

その他必要に応じ、食塩、燐酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシ
ウム、塩化コバルト、硫酸亜鉛、塩化鉄、硫酸鉄、リン
酸カリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩、並びに微
量の重金属を添加することができる。さらに菌の発育を
助け、トランス−４，５−デヒドロ−し−リジンの生産
を促進する有機及び無機物質を適宜に添加することがで
きる。

通気培養法を用いる場合には、さらに脂肪油、シリコー
ン油、パラフィンなどの消泡剤が用いられる。

培養方法としては、固体培地上での培養も可能であるが
、一般抗生物質生産の方法と同様に液体培養法、特に深
部培養法を用いることが好ましい。

培養は好気的条件下で行なわれ、培養温度は２０〜３５
℃、特に２５〜３０℃が好ましい。振盪培養又はタンク
培養のいずれの場合も２〜６日間培養を行なうと、活性
物質が培養液中に生産蓄積される。培養液中の生産量が
最大に達した時点で培養を停止し、培養液中より目的の
抗生物質を単離精製する。

培養濾液から本物質を単離精製するには、目的とする物
質が水に可溶で一般の有機溶媒に難溶の水溶性塩基性物
質であるため、通常の水溶性塩基性抗生物質の単離、精
製法を利用することができる。このためイオン交換樹脂
、活性炭、セルロース、シリカゲル、アルミナ等による
吸脱着法、補助剤として高級脂肪酸を加えブタノール、
アミルアルコール等で抽出する方法などを適当に組み合
わせて用いることができる。

培養濾液を弱酸性陽イオン交換樹脂の層に通すと、目的
物質が吸着される。これを０．１〜３．０規定のアルカ
リ又は酸で溶出し、活性成分を凍結乾燥すると、目的物
質の粗粉末が得られる。このとき用いられる弱酸性陽イ
オン交換樹脂としては、アンバーライト　ＩＲＣ−５０
、Ｉ　ＲＣ−８４又１ｔｃＧ−５０（ローム・アンド・
ハース社製）、ダイヤイオンＷＫ−１０又はＷＫ−２０
（三菱化成社製）などがあげられる。またアルカリとし
てはアンモニア水、水酸化す）ＩＪウム水溶液などが、
酸としては蟻酸、塩酸、硫酸などがあげられる。

培養濾液をｐＨ７〜９に調整し、目的物質を活性炭に吸
着させ、酸性の水又は塩酸メタノールで溶出させる方法
も利用できる。

こうして得られる粗粉末は、弱酸性陽イオン交換樹脂、
ＣＭ−セファデックス、ＣＭ−セルロースなどに吸着さ
せ、アンモニア水、蟻酸アンモニウム水溶液などを用い
、濃度勾配法又は濃度段階法で溶出することにより、目
的物が遊離塩基として得られる。

単離された目的物は、更にセルロース、シリカゲル、ア
ルミナなどを用いる吸着クロマトグラフィー、セファデ
ックスＧ−１０などを用いるゲル濾過法、ダウエックス
１×２などを用いるイオン交換クロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィーなどを適用することによって
精製することができる。これらの方法は単独で又は組み
合せて適用することができる。

こうして得られる遊離塩基は、更に無機酸例えば塩酸、
硫酸、臭化水素酸又は有機酸例えば酢酸、しゅう酸、メ
タンスルホン酸などを加え、常法により酸付加塩に導く
ことができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、トランス−４，５−デヒドロ−し−リ
ジンを特異的に生産する微生物を用い、これを培養する
ことにより優れた抗真菌作用を有するトランス−４，５
−デヒドロ−Ｌ−リジンを効率よく生産することができ
る。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 埼玉県深谷市で採取した土壌試料を、滅菌水に懸濁させ
、これを、ポテト浸出液（ポテト１０％、トマトペース
ト０．５％、オートミル１％）に肉エキス０．１％、マ
イコスタチン５０μｇ／ｍ！、ペニシリンＧＯ１４μｇ
／ｍｌ、ポリミキシンＢ２μｇ／−、ナリジキシン酸８
μｇ／ｒｎｌ及び寒天１．５％を加えた培地（ｐＨ７，
０）に塗抹し、２７℃で７日間培養を行い、生じた集落
を採取することによって、トランス−４，５−デヒドロ
−Ｌ−リジン生産菌（ノカルジオプシス・ｓｐ、　ＫＣ
−７２２３）を得た。

実施例２ ポテト・デキストロース寒天斜面に生育したノカルジオ
プシス・ｓｐ、ＫＣ−７２２３株を可溶性澱粉１％、グ
ルコース１％、大豆粉１．５％、ＫＨ，ＰＯ。

０．２７％、Ｎａ、ＨＰＯ４０，１８％、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２００，０５％及びＣｏＣｌ２　・６Ｈ−００，０
００５％からなる培地に接種し、２８℃で７２時間振盪
培養して種培養液とした。

次いで、グルコース２％、大豆粉１％、肉エキス０．２
％、酵母エキス０．２％、Ｍｇ５Ｏ１・７Ｈ，００，０
５％、ＣｏＣｆ２・６Ｈ，ＯＯ，０００５％及び綿実油
０．５％からなる培地１５１を３０ｆ容量のステンレス
タンク中に仕込み、この培地中に前記の種培養液１００
−を接種し、通気量５１／分、攪拌数３００ｒ、　ｐ、
　ｍ、、２８℃で７２時間培養した。

培養終了後、培養液を濾過し、得られた濾液（２ＯＡ）
をアンバーライトＩ　ＲＣ−５０［Ｈ”：ＮＨ，＋型（
１：　４）　：］のカラム（１１）に吸着し、水洗後０
．５Ｎアンモニア水で溶出した。活性区分を集め、減圧
下濃縮後、ＣＭ−セファデックスＣ−２５（ＮＨ４＋型
）のカラム（１００ｒｎｌ）に吸着させ、水〜０．２Ｎ
アンモニア水で濃度勾配溶出を行った。活性画分を集め
、減圧下濃縮後、濃縮液をセルロースカラム（２００１
ｆｆ）の上部に載せ、メタノール：水：６Ｎ−塩酸：ピ
リジン（４０：　１３：　２　：　５）の溶媒系で溶出
分画した。活性画分を濃縮し、ｐＨを５に調整後、水を
展開溶媒とするセファデックスＧ−１０のカラムクロマ
トグラフィー（３００ｍｌ）で精製し、凍結乾燥して無
色の粉末（６０■）を得た。

得られた物質の理化学的性質は下記のとおりである。

１、比旋光度（塩酸塩）； 〔α〕＝５−５．７°　（ｃ　０．７　、　Ｈ２Ｏ）２
、紫外線吸収スペクトル； 末端吸収を示すのみである。

３、赤外線吸収スペクトル； 臭化水素ペレット中で測定したスペクトルは図１に示す
とおりである。

４、　　’Ｉｔ−ＮＭＲ； 重水中で測定した’Ｈ−ＮＭＲスペクトルは図２に示す
とおりである。

５、　　”Ｃ−ＮＭＲ； 重水中で測定した”　Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図３に示
すとおりである。

以下余白 ６、　薄層クロマトグラフィー； （デイフコ社製）に被験菌の懸濁液を塗抹して、２７℃
で２〜４日間培養して測定した。

プレート：セルロースプレート Ａｒｔ、　５７１８（メルク社製） ７、呈色反応； ニンヒドリン反応及びライドンスミス反応に陽性である
。

以上の理化学的性質より、本物質はトランス−４，５−
デヒドロ−し−リジンであることが確認された。

試験例１ 実施例２で得られたトランス−４，５−デヒドロ−Ｌ−
！Ｊリジン真菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を
測定したところ以下の通りであった。なお測定は、イー
ストモルフォロジー寒天プレート

【図面の簡単な説明】

図１は本発明物質の赤外線吸収スペクトル、図２ハ１Ｈ
−ＮＭＲスヘクトル、図３　ｆｔ１３Ｃ−ＮＭＲスペク
トルを示す。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ノカルジオプシスに属するトランス−４，５−デヒ
   ドロ−Ｌ−リジン生産菌を培養し、得られた培養液より
   トランス−４，５−デヒドロ−Ｌ−リジンを採取するこ
   とを特徴とするトランス−４，５−デヒドロ−Ｌ−リジ
   ンの製造法。 ２、ノカルジオプシス属に属するトランス−４，５−デ
   ヒドロ−Ｌ−リジン生産菌。 ３、ノカルジオプシス・エスピー （Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓｓｐ．）ＫＣ−７２２３で
   ある請求項２記載のトランス−４，５−デヒドロ−Ｌ−
   リジン生産菌。