JPH05148152A - 免疫抑制剤 - Google Patents
免疫抑制剤Info
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- JPH05148152A JPH05148152A JP4073511A JP7351192A JPH05148152A JP H05148152 A JPH05148152 A JP H05148152A JP 4073511 A JP4073511 A JP 4073511A JP 7351192 A JP7351192 A JP 7351192A JP H05148152 A JPH05148152 A JP H05148152A
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- JP
- Japan
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- active ingredient
- cells
- bacillus stearothermophilus
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- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 図示の一般式で表される化合物を有効成分と
する免疫抑制剤。該化合物はバチルス・ステアロサーモ
フイルスの菌体破砕物から抽出されたものでも化学的に
合成されたものでも、何れでもよい。 ［Ｒ１は（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４（Ｒ４はＣ１４〜Ｃ２０のアル
キル基）、Ｒ２、Ｒ３は（Ｃ＝Ｏ）Ｒ５（Ｒ５はＣ１４
〜Ｃ２０のアルキル基）もしくは水素原子を示す］ 【効果】 優れた免疫抑制効果を有し、臓器移植、免疫
異常疾患の治療薬として有効に用いることができる。
する免疫抑制剤。該化合物はバチルス・ステアロサーモ
フイルスの菌体破砕物から抽出されたものでも化学的に
合成されたものでも、何れでもよい。 ［Ｒ１は（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４（Ｒ４はＣ１４〜Ｃ２０のアル
キル基）、Ｒ２、Ｒ３は（Ｃ＝Ｏ）Ｒ５（Ｒ５はＣ１４
〜Ｃ２０のアルキル基）もしくは水素原子を示す］ 【効果】 優れた免疫抑制効果を有し、臓器移植、免疫
異常疾患の治療薬として有効に用いることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、優れた免疫抑制剤に関
するものであり、詳しくは、臓器移植、免疫異常疾患の
治療などに利用できる免疫抑制剤に関するものである。
するものであり、詳しくは、臓器移植、免疫異常疾患の
治療などに利用できる免疫抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、免疫抑制剤としてはシクロスポリ
ンが用いられてきた。
ンが用いられてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来、使用されている
上記の薬剤は、その免疫抑制効果が十分とは言えず、副
作用などの点で必ずしも満足できるものではなかった。
上記の薬剤は、その免疫抑制効果が十分とは言えず、副
作用などの点で必ずしも満足できるものではなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、免疫抑制
効果が高くかつ安全性に優れた薬剤を見いだすべく鋭意
検討を行ったところ、驚くべきことに中等度好熱菌であ
るバチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stear
othermophilus ）の菌体破砕片中に目的の活性を見いだ
し、さらにその有効成分を追求し、その構造を明らかに
することにより本発明を完成するにいたった。
効果が高くかつ安全性に優れた薬剤を見いだすべく鋭意
検討を行ったところ、驚くべきことに中等度好熱菌であ
るバチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stear
othermophilus ）の菌体破砕片中に目的の活性を見いだ
し、さらにその有効成分を追求し、その構造を明らかに
することにより本発明を完成するにいたった。
【０００５】すなわち、本発明は、バチルス・ステアロ
サーモフイルス（Bacillus stearothermophilus ）の菌
体破砕片の抽出物を有効成分とする免疫抑制剤、並びに
下記の一般式で表される化合物を有効成分とする免疫抑
制剤を要旨とするものである。
サーモフイルス（Bacillus stearothermophilus ）の菌
体破砕片の抽出物を有効成分とする免疫抑制剤、並びに
下記の一般式で表される化合物を有効成分とする免疫抑
制剤を要旨とするものである。
【０００６】
【化２】
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
免疫抑制剤の有効成分は一般式化２で表される化合物で
ある。Ｒ4 、Ｒ5 で示される炭素数１４〜２０の直鎖も
しくは分岐アルキル基としてはテトラデカノイル、ペン
タデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、
オクタデカノイル、ノナデカノイル、エイコサノイル、
イソテトラデカノイル、イソペンタデカノイル、イソヘ
キサデカノイル、イソヘプタデカノイル、イソオクタデ
カノイル、イソノナデカノイル、イソエイコサノイル基
などがあげられる。
免疫抑制剤の有効成分は一般式化２で表される化合物で
ある。Ｒ4 、Ｒ5 で示される炭素数１４〜２０の直鎖も
しくは分岐アルキル基としてはテトラデカノイル、ペン
タデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、
オクタデカノイル、ノナデカノイル、エイコサノイル、
イソテトラデカノイル、イソペンタデカノイル、イソヘ
キサデカノイル、イソヘプタデカノイル、イソオクタデ
カノイル、イソノナデカノイル、イソエイコサノイル基
などがあげられる。
【０００８】具体的な化合物としては１，３−ジペンタ
デカノイン、１，３−ジイソペンタデカノイン、１，３
−ジヘキサデカノイン、１，３−ジイソヘキサデカノイ
ン、１，３−ジヘプタデカノイン、１，３−ジイソヘプ
タデカノイン、１，３−ジオクタデカノイン、１，３−
ジイソオクタデカノイン、１，３−ジノナデカノイン、
１，３−ジイソノナデカノイン、１，３−ジエイコサノ
イン、１，３−ジイソエイコサノイン、１，３−ジヘン
エイコサノイン、１，３−ジイソヘンエイコサノイン、
１，２−ジペンタデカノイン、１，２−ジイソペンタデ
カノイン、１，２−ジヘキサデカノイン、１，２−ジイ
ソヘキサデカノイン、１，２−ジヘプタデカノイン、
１，２−ジイソヘプタデカノイン、１，２−ジオクタデ
カノイン、１，２−ジイソオクタデカノイン、１，２−
ジノナデカノイン、１，２−ジイソノナデカノイン、
１，２−ジエイコサノイン、１，２−ジイソエイコサノ
イン、１，２−ジヘンエイコサノイン、１，２−ジイソ
ヘンエイコサノイン、トリペンタデカノイン、トリイソ
ペンタデカノイン、トリヘキサデカノイン、トリイソヘ
キサデカノイン、トリヘプタデカノイン、トリイソヘプ
タデカノイン、トリオクタデカノイン、トリイソオクタ
デカノイン、トリノナデカノイン、トリイソノナデカノ
イン、トリエイコサノイン、トリイソエイコサノイン、
トリヘンエイコサノイン、トリイソヘンエイコサノイン
などがあげられる。
デカノイン、１，３−ジイソペンタデカノイン、１，３
−ジヘキサデカノイン、１，３−ジイソヘキサデカノイ
ン、１，３−ジヘプタデカノイン、１，３−ジイソヘプ
タデカノイン、１，３−ジオクタデカノイン、１，３−
ジイソオクタデカノイン、１，３−ジノナデカノイン、
１，３−ジイソノナデカノイン、１，３−ジエイコサノ
イン、１，３−ジイソエイコサノイン、１，３−ジヘン
エイコサノイン、１，３−ジイソヘンエイコサノイン、
１，２−ジペンタデカノイン、１，２−ジイソペンタデ
カノイン、１，２−ジヘキサデカノイン、１，２−ジイ
ソヘキサデカノイン、１，２−ジヘプタデカノイン、
１，２−ジイソヘプタデカノイン、１，２−ジオクタデ
カノイン、１，２−ジイソオクタデカノイン、１，２−
ジノナデカノイン、１，２−ジイソノナデカノイン、
１，２−ジエイコサノイン、１，２−ジイソエイコサノ
イン、１，２−ジヘンエイコサノイン、１，２−ジイソ
ヘンエイコサノイン、トリペンタデカノイン、トリイソ
ペンタデカノイン、トリヘキサデカノイン、トリイソヘ
キサデカノイン、トリヘプタデカノイン、トリイソヘプ
タデカノイン、トリオクタデカノイン、トリイソオクタ
デカノイン、トリノナデカノイン、トリイソノナデカノ
イン、トリエイコサノイン、トリイソエイコサノイン、
トリヘンエイコサノイン、トリイソヘンエイコサノイン
などがあげられる。
【０００９】本発明における有効成分である化合物を得
るための方法としては、バチルス・ステアロサーモフイ
ルス（Bacillus stearothermophilus ）の菌体から得る
方法と共に有機合成法での製造も可能である。
るための方法としては、バチルス・ステアロサーモフイ
ルス（Bacillus stearothermophilus ）の菌体から得る
方法と共に有機合成法での製造も可能である。
【００１０】まず、バチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus ）の菌体から抽出精製
する方法について詳細に述べる。本発明で用いられるバ
チルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearothe
rmophilus ）としては、特定の菌株に限定されるもので
はなく、具体例としては例えば、ＮＣＡ１５０３（微工
研菌寄第４７７８号）、ＵＫ７８８（微工研菌寄第２３
７３号）、ＵＫ５６３（微工研菌寄第７２７５号）、Ｉ
ＦＯ−１２５５０、ＩＦＯ−１２９８３、ＩＦＯ−１３
７３７、ＡＴＣＣ−７９５３（微工研菌寄第４７７５
号）、ＡＴＣＣ−８００５（微工研菌寄第４７７６
号）、ＡＴＣＣ−１０１４９（微工研菌寄第４７７７
号）、ＡＴＣＣ−１２０１６、ＡＴＣＣ−１２９７６、
ＡＴＣＣ−１２９７７、ＡＴＣＣ−１２９７８、ＡＴＣ
Ｃ−１２９７９、ＡＴＣＣ−１２９８０、ＡＴＣＣ−１
５９５１、ＡＴＣＣ−１２９５２、ＡＴＣＣ−２１３６
５などがあげられる。これらの中で、ＮＣＡ−１５０３
（微工研菌寄第４７７８号）が菌体中の免疫抑制活性が
高く目的を達成するために最も好都合である。
（Bacillus stearothermophilus ）の菌体から抽出精製
する方法について詳細に述べる。本発明で用いられるバ
チルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearothe
rmophilus ）としては、特定の菌株に限定されるもので
はなく、具体例としては例えば、ＮＣＡ１５０３（微工
研菌寄第４７７８号）、ＵＫ７８８（微工研菌寄第２３
７３号）、ＵＫ５６３（微工研菌寄第７２７５号）、Ｉ
ＦＯ−１２５５０、ＩＦＯ−１２９８３、ＩＦＯ−１３
７３７、ＡＴＣＣ−７９５３（微工研菌寄第４７７５
号）、ＡＴＣＣ−８００５（微工研菌寄第４７７６
号）、ＡＴＣＣ−１０１４９（微工研菌寄第４７７７
号）、ＡＴＣＣ−１２０１６、ＡＴＣＣ−１２９７６、
ＡＴＣＣ−１２９７７、ＡＴＣＣ−１２９７８、ＡＴＣ
Ｃ−１２９７９、ＡＴＣＣ−１２９８０、ＡＴＣＣ−１
５９５１、ＡＴＣＣ−１２９５２、ＡＴＣＣ−２１３６
５などがあげられる。これらの中で、ＮＣＡ−１５０３
（微工研菌寄第４７７８号）が菌体中の免疫抑制活性が
高く目的を達成するために最も好都合である。
【００１１】これらの菌株の培養には一般によく用いら
れる培地を使用することができる。具体的には、炭素源
としてはブドウ糖、乳糖、でんぷん、糖蜜などの糖類が
使用できる。また窒素源としてはペプトン、肉エキス、
酵母エキスなどの有機の窒素源と共に塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウムなどの無機の窒素源も使用するこ
とができる。また必要に応じてビタミン、ミネラルを添
加してもよい。
れる培地を使用することができる。具体的には、炭素源
としてはブドウ糖、乳糖、でんぷん、糖蜜などの糖類が
使用できる。また窒素源としてはペプトン、肉エキス、
酵母エキスなどの有機の窒素源と共に塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウムなどの無機の窒素源も使用するこ
とができる。また必要に応じてビタミン、ミネラルを添
加してもよい。
【００１２】培養条件としては、好気培養が採用され、
例えば５８℃、１時間から１２時間培養することにより
菌体を得ることができる。さらに、新鮮な培地を一定速
度で供給しながら培養する連続培養法も適用できる。培
地及び培養条件は上記の条件に応じて適宜選定すること
が可能であることは言うまでもない。
例えば５８℃、１時間から１２時間培養することにより
菌体を得ることができる。さらに、新鮮な培地を一定速
度で供給しながら培養する連続培養法も適用できる。培
地及び培養条件は上記の条件に応じて適宜選定すること
が可能であることは言うまでもない。
【００１３】このように培養して得られる培養液から、
ろ過あるいは遠心などの常法によって菌体を得ることが
できる。得られた菌体は超音波破砕、ガラスビーズによ
る磨砕、フレンチプレス、自己消化などの一般によく用
いられる菌体破砕法によって破砕したのち、遠心分離あ
るいはろ過などによって菌体破砕片を得る。このように
して得られる菌体破砕片からエタノール、メタノール、
アセトン、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、
トルエン、ヘキサン、ベンゼンなどの有機溶媒を用いて
抽出操作を行い有効成分を得ることができる。さらにシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの適
当な分離精製方法により有効成分を含む画分、もしくは
有効成分そのものを得、免疫抑制剤として使用すること
ができる。
ろ過あるいは遠心などの常法によって菌体を得ることが
できる。得られた菌体は超音波破砕、ガラスビーズによ
る磨砕、フレンチプレス、自己消化などの一般によく用
いられる菌体破砕法によって破砕したのち、遠心分離あ
るいはろ過などによって菌体破砕片を得る。このように
して得られる菌体破砕片からエタノール、メタノール、
アセトン、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、
トルエン、ヘキサン、ベンゼンなどの有機溶媒を用いて
抽出操作を行い有効成分を得ることができる。さらにシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの適
当な分離精製方法により有効成分を含む画分、もしくは
有効成分そのものを得、免疫抑制剤として使用すること
ができる。
【００１４】また、本発明の免疫抑制剤は有機合成法に
よっても製造できる。例えば、バイオケミストリー、Bi
ochemistry, 2 , 394 (1963)などに記載された公知の方
法によって製造できる。すなわち、グリセロ−ルをピリ
ジン等の溶媒中で、酸ハロゲン化物ＲＣｌと反応させ、
シリカゲルクロマトグラフィ−により分離精製すること
により容易に得られる。また、酸ハロゲン化物ＲＣｌは
ＲＯＨを塩化チオニルＳＯＣｌ2 と反応させることによ
り得ることができる。
よっても製造できる。例えば、バイオケミストリー、Bi
ochemistry, 2 , 394 (1963)などに記載された公知の方
法によって製造できる。すなわち、グリセロ−ルをピリ
ジン等の溶媒中で、酸ハロゲン化物ＲＣｌと反応させ、
シリカゲルクロマトグラフィ−により分離精製すること
により容易に得られる。また、酸ハロゲン化物ＲＣｌは
ＲＯＨを塩化チオニルＳＯＣｌ2 と反応させることによ
り得ることができる。
【００１５】本発明の化合物はホ乳動物に対して優れた
免疫抑制作用を有するものであり、免疫抑制剤として優
れたものである。
免疫抑制作用を有するものであり、免疫抑制剤として優
れたものである。
【００１６】本発明の化合物は、種々の形態で患者に投
与できる。例えば、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、座
剤、液剤、乳剤、けんだく剤などの形態が使用できる。
これらの形態を用いる場合、安定剤、賦形剤、着色剤、
芳香剤及び甘味剤のような補助剤を用いることができ
る。安定剤としては二酸化炭素、窒素、亜硫酸水素ナト
リウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ブチ
ルヒドロキシアニソ−ル、トコフェロール、ＥＤＴＡな
どを用いることができる。賦形剤としては乳糖、デンプ
ン、結晶セルロース、白糖、ブドウ糖、マンニトール、
炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、
塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、カンゾウ末、カ
ンゾウ粗エキス、乾燥酵母、酵母エキス、精製ラノリ
ン、ゲンチアナ末、ゲンチアナエキス、マルツエキス、
グリセリンなどを用いることができる。また、静脈注
射、筋肉注射、皮下注射などによっても患者に投与可能
である。
与できる。例えば、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、座
剤、液剤、乳剤、けんだく剤などの形態が使用できる。
これらの形態を用いる場合、安定剤、賦形剤、着色剤、
芳香剤及び甘味剤のような補助剤を用いることができ
る。安定剤としては二酸化炭素、窒素、亜硫酸水素ナト
リウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ブチ
ルヒドロキシアニソ−ル、トコフェロール、ＥＤＴＡな
どを用いることができる。賦形剤としては乳糖、デンプ
ン、結晶セルロース、白糖、ブドウ糖、マンニトール、
炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、
塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、カンゾウ末、カ
ンゾウ粗エキス、乾燥酵母、酵母エキス、精製ラノリ
ン、ゲンチアナ末、ゲンチアナエキス、マルツエキス、
グリセリンなどを用いることができる。また、静脈注
射、筋肉注射、皮下注射などによっても患者に投与可能
である。
【００１７】投与量としては体重１ｋｇあたり０．０１
ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜５０ｍ
ｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇが適当であ
るが、患者の症状、病状の進行程度などにより適宜最適
投与量を選ぶことは言うまでもない。
ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜５０ｍ
ｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇが適当であ
るが、患者の症状、病状の進行程度などにより適宜最適
投与量を選ぶことは言うまでもない。
【００１８】
【実施例】以下、実施例によりさらに具体的に説明す
る。なお、実施例中、％はＷ／Ｖ％を表す。 実施例１ バチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearot
hermophilus ）ＮＣＡ−１５０３（微工研菌寄第４７７
８号）をグルコース０．３５％、酵母エキス０．３％、
ペプトン０．２％、リン酸カリウム０．０４％、リン酸
２ナトリウム０．０４％、硫酸マグネシウム０．１％か
らなる液体培地に接種し、５８℃、４時間前培養した培
養液２．２ｌを１８ｌの同培地を仕込んだ３０ｌジヤー
フアーメンターに移し５８℃、３．５時間培養した。
る。なお、実施例中、％はＷ／Ｖ％を表す。 実施例１ バチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearot
hermophilus ）ＮＣＡ−１５０３（微工研菌寄第４７７
８号）をグルコース０．３５％、酵母エキス０．３％、
ペプトン０．２％、リン酸カリウム０．０４％、リン酸
２ナトリウム０．０４％、硫酸マグネシウム０．１％か
らなる液体培地に接種し、５８℃、４時間前培養した培
養液２．２ｌを１８ｌの同培地を仕込んだ３０ｌジヤー
フアーメンターに移し５８℃、３．５時間培養した。
【００１９】培養液を遠心し、得られた菌体を２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ８）−２ｍＭエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム中で４０℃、２時間攪はんすることにより
自己消化させた。その後、遠心分離することにより沈澱
を得た。この沈澱（５００ｇ）を４ｌの熱エタノール
（１０分間、７０℃）で２回抽出した。この抽出画分を
減圧乾固し１ｌの水に溶解し、５００ｍｌの塩化メチレ
ンで４回抽出した。これをシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーにかけクロロホルム／メタノール（１００／
１）で溶出し、活性画分ＫＭを得た。
リン酸緩衝液（ｐＨ８）−２ｍＭエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム中で４０℃、２時間攪はんすることにより
自己消化させた。その後、遠心分離することにより沈澱
を得た。この沈澱（５００ｇ）を４ｌの熱エタノール
（１０分間、７０℃）で２回抽出した。この抽出画分を
減圧乾固し１ｌの水に溶解し、５００ｍｌの塩化メチレ
ンで４回抽出した。これをシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーにかけクロロホルム／メタノール（１００／
１）で溶出し、活性画分ＫＭを得た。
【００２０】このようにして得られた活性画分ＫＭをさ
らにシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけｎ−ヘ
キサン／酢酸エチル（２／１）で溶出し活性画分ＫＭ−
７３を得た。活性画分ＫＭ−７３の収量は菌体破砕片沈
澱５００ｇから９１．１ｍｇであった。
らにシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけｎ−ヘ
キサン／酢酸エチル（２／１）で溶出し活性画分ＫＭ−
７３を得た。活性画分ＫＭ−７３の収量は菌体破砕片沈
澱５００ｇから９１．１ｍｇであった。
【００２１】本品の構造を確定するために13Ｃ−ＮＭ
Ｒ、 1Ｈ−ＮＭＲおよび赤外吸収スペクトルを測定した
ところ、化２で示される一般式においてＲ4 ，Ｒ5 がイ
ソヘプタデカノイル基、Ｒ2 が水素原子で示される構造
をもつ１，３−ジオクタデカノインであることが明らか
になった。
Ｒ、 1Ｈ−ＮＭＲおよび赤外吸収スペクトルを測定した
ところ、化２で示される一般式においてＲ4 ，Ｒ5 がイ
ソヘプタデカノイル基、Ｒ2 が水素原子で示される構造
をもつ１，３−ジオクタデカノインであることが明らか
になった。
【００２２】図１に 1Ｈ−ＮＭＲ分析結果、図２に赤外
吸収スペクトル分析結果を示した。
吸収スペクトル分析結果を示した。
【００２３】実施例２ 実施例１で得られた活性成分を用いてマウス混合リンパ
球反応（ＭＬＲ）を行い本発明の化合物の免疫抑制活性
を調べた。脾細胞浮遊液の調製：C57BL/6 マウスおよび
BALB/Cマウスから脾臓を摘出し、約５ｍｌのハンクス溶
液（日水製薬、ＨＢＳＳ）に浸した後、脾臓よりスライ
ドグラスで脾細胞を押し出し、均一な細胞浮遊液を得
た。この細胞浮遊液をナイロンメッシュでろ過後、遠心
分離し赤血球を１７ｍＭトリス−１４４ｍＭ塩化アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて除去した。脾細胞
をハンクス溶液で洗浄した後、細胞数を調整し用いた。
球反応（ＭＬＲ）を行い本発明の化合物の免疫抑制活性
を調べた。脾細胞浮遊液の調製：C57BL/6 マウスおよび
BALB/Cマウスから脾臓を摘出し、約５ｍｌのハンクス溶
液（日水製薬、ＨＢＳＳ）に浸した後、脾臓よりスライ
ドグラスで脾細胞を押し出し、均一な細胞浮遊液を得
た。この細胞浮遊液をナイロンメッシュでろ過後、遠心
分離し赤血球を１７ｍＭトリス−１４４ｍＭ塩化アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて除去した。脾細胞
をハンクス溶液で洗浄した後、細胞数を調整し用いた。
【００２４】刺激細胞の調製：BALB/Cの脾細胞を５ｘ１
０7 ／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０（日水製薬）
に浮遊させ、５００μｇ／ｍｌの濃度のマイトマイシン
Ｃ（和光純薬製）１００μｌを加えた後３７℃、３０分
間放置した。ハンクス溶液で３回遠心分離による洗浄を
行い、細胞数を６．７ｘ１０6 ／ｍｌの濃度となるよう
に培地（ＧＩＢＣＯ社、ＲＰＭＩ１６４０）を用いて調
製し刺激細胞として用いた。
０7 ／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０（日水製薬）
に浮遊させ、５００μｇ／ｍｌの濃度のマイトマイシン
Ｃ（和光純薬製）１００μｌを加えた後３７℃、３０分
間放置した。ハンクス溶液で３回遠心分離による洗浄を
行い、細胞数を６．７ｘ１０6 ／ｍｌの濃度となるよう
に培地（ＧＩＢＣＯ社、ＲＰＭＩ１６４０）を用いて調
製し刺激細胞として用いた。
【００２５】応答細胞の調製：C57BL/6 の脾細胞を６．
７ｘ１０6 ／ｍｌの濃度となるように培地（ＧＩＢＣＯ
社、ＲＰＭＩ１６４０）を用いて調製し応答細胞として
用いた。
７ｘ１０6 ／ｍｌの濃度となるように培地（ＧＩＢＣＯ
社、ＲＰＭＩ１６４０）を用いて調製し応答細胞として
用いた。
【００２６】検体の調製：検体はエタノールに溶解し、
エタノール濃度が最終０．４％となるように調製した。
エタノール濃度が最終０．４％となるように調製した。
【００２７】混合リンパ球反応：上述の２種類の細胞浮
遊液各々７５μｌづつに検体５０μｌを平底９６穴マイ
クロプレートのウエルに入れた。３７℃、５％炭酸ガス
−９５％空気に調節された炭酸ガスインキュベーター中
で４日間培養を行ったのち、［ 3Ｈ］−チミジン（Amer
ican Radiolabelled Chemicals Inc. ）５０μｌを加
え、さらに炭酸ガスインキュベーター中で１６時間培養
した。培養終了後セルハーベスター細胞をガラスろ紙上
に回収し、［ 3Ｈ］−チミジン取り込み量を液体シンチ
レーションカウンターで測定した。検体無添加群に対す
るチミジンの取り込み量の抑制率を求めた。比較検体と
してシクロスポリンを用いた。
遊液各々７５μｌづつに検体５０μｌを平底９６穴マイ
クロプレートのウエルに入れた。３７℃、５％炭酸ガス
−９５％空気に調節された炭酸ガスインキュベーター中
で４日間培養を行ったのち、［ 3Ｈ］−チミジン（Amer
ican Radiolabelled Chemicals Inc. ）５０μｌを加
え、さらに炭酸ガスインキュベーター中で１６時間培養
した。培養終了後セルハーベスター細胞をガラスろ紙上
に回収し、［ 3Ｈ］−チミジン取り込み量を液体シンチ
レーションカウンターで測定した。検体無添加群に対す
るチミジンの取り込み量の抑制率を求めた。比較検体と
してシクロスポリンを用いた。
【００２８】図３に本発明品であるＫＭ−７３およびシ
クロスポリンのマウス混合リンパ球反応に及ぼす効果を
調べた結果を示した。ＫＭ−７３はシクロスポリンに比
べ低濃度で混合リンパ球反応を抑制することから、免疫
抑制剤としてその効果が優れていることが分かる。
クロスポリンのマウス混合リンパ球反応に及ぼす効果を
調べた結果を示した。ＫＭ−７３はシクロスポリンに比
べ低濃度で混合リンパ球反応を抑制することから、免疫
抑制剤としてその効果が優れていることが分かる。
【００２９】実施例３ 検体の添加を混合リンパ球反応開始後４８時間目に行う
以外、実施例２と同様にして行った。
以外、実施例２と同様にして行った。
【００３０】図４に混合リンパ球反応の結果を示した。
従来の薬剤であるシクロスポリンと比較してＫＭ−７３
は混合リンパ球反応を開始した後に添加した場合にも抑
制効果がみられ免疫抑制効果は顕著であることがわか
る。
従来の薬剤であるシクロスポリンと比較してＫＭ−７３
は混合リンパ球反応を開始した後に添加した場合にも抑
制効果がみられ免疫抑制効果は顕著であることがわか
る。
【００３１】実施例４ ＫＭ−７３ ５ｍｇ ブドウ糖 １００ｍｇ 生理食塩水 １０ｍｌ 上記の混合液をメンブレンフィルターでろ過後再び除菌
ろ過を行い、そのろ過液を無菌的にバイアルに分注し、
窒素ガスを充填した後、密封して静脈内注射薬とした。
ろ過を行い、そのろ過液を無菌的にバイアルに分注し、
窒素ガスを充填した後、密封して静脈内注射薬とした。
【００３２】実施例５ ＫＭ−７３ ５０ｇ 乳糖 ９３５ｇ ステアリン酸マグネシウム １５ｇ 上記成分をそれぞれ秤量した後、均一に混合し、混合粉
末をハードゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填しカ
プセル剤を調製した。
末をハードゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填しカ
プセル剤を調製した。
【００３３】
【発明の効果】本発明の免疫抑制剤は優れた免疫抑制効
果を有し、臓器移植、免疫異常疾患の治療薬として有効
に用いることができる。
果を有し、臓器移植、免疫異常疾患の治療薬として有効
に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の有効成分の精製標品の 1Ｈ−ＮＭＲ分
析結果である。
析結果である。
【図２】本発明の有効成分の精製標品の赤外吸収スペク
トル分析結果である。
トル分析結果である。
【図３】本発明の有効成分の混合リンパ球反応に及ぼす
効果を示す説明図である。
効果を示す説明図である。
【図４】本発明の有効成分を混合リンパ球反応開始後に
添加したときの効果を示す説明図である。
添加したときの効果を示す説明図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 バチルス・ステアロサーモフイルス（Ba
cillus stearothermophilus ）の菌体破砕片の抽出物を
有効成分とする免疫抑制剤。 - 【請求項２】 下記の一般式で表される化合物を有効成
分とする免疫抑制剤。 【化１】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4073511A JPH05148152A (ja) | 1991-10-04 | 1992-02-24 | 免疫抑制剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-285697 | 1991-10-04 | ||
| JP28569791 | 1991-10-04 | ||
| JP4073511A JPH05148152A (ja) | 1991-10-04 | 1992-02-24 | 免疫抑制剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05148152A true JPH05148152A (ja) | 1993-06-15 |
Family
ID=26414652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4073511A Pending JPH05148152A (ja) | 1991-10-04 | 1992-02-24 | 免疫抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05148152A (ja) |
-
1992
- 1992-02-24 JP JP4073511A patent/JPH05148152A/ja active Pending
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