JPH09501563A

JPH09501563A - 抗菌、抗癌および免疫調節活性を有するラパマイシン誘導体

Info

Publication number: JPH09501563A
Application number: JP7505641A
Authority: JP
Inventors: フォード，ブライアン・ダグラス
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1993-07-31
Filing date: 1994-07-25
Publication date: 1997-02-18
Also published as: DE69424051T2; WO1995004060A1; DE69424051D1; EP0711297B1; US5712129A; GB9315914D0; EP0711297A1

Abstract

(57)【要約】式（Ｉ）：

Description

【発明の詳細な説明】抗菌、抗癌および免疫調節活性を有するラパマイシン誘導体本発明は新規化合物、その誘導体、その製法、該化合物を含有する医薬処方、医学的療法、特に微生物感染症の治療における使用、およびまた免疫調節剤としての使用に関する。ラパマイシンは公知化合物であり、真菌のストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）の抽出物として初めて単離され、抗真菌活性を有すると報告された（英国特許第１４３６４４７号）。その後、ラパマイシンは免疫抑制剤として関連付けられた（マーテル、アール・アール（Martel R .R.）ら、カナディアン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・アンド・ファーマコロジー（Can.J.Physiol.Pharmacol.）５５，４８−５１，１９７７）。多種の微生物が種々の化合物を産生することが判明しており、これらの化合物はその後に単離され、有用な治療特性を有することがわかっている。新規な化合物はまた、公知化合物の存在下、微生物をインキュベーションまたは培養によっても得られる。このような新規化合物の１つが４２−Ｏ−デメチルラパマイシンがある。この新規化合物は有用な抗菌および抗癌および免疫調節活性を有することが判明している。したがって、本発明は４２−Ｏ−デメチルラパマイシンおよびその誘導体を提供する。さらには、第二の態様において、本発明は４２−Ｏ−デメチルラパマイシンの製法であって、微生物をラパマイシンと接触させ、続いて４２−Ｏ−デメチルラパマイシンまたはその誘導体をインキュベーションから単離することからなる製法を提供する。４２−Ｏ−デメチルラパマイシンは、式（Ｉ）：で示される構造を有すると考えられる。本明細書においては、該化合物を、ジェイ・フィンドレイ（J.Findlay）らの番号付けシステム（カナディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Can.J.Ch em.）（１９８０）５８，５７９）に従って、４２−Ｏ−デメチルラパマイシンと称する。しかし、ジェイ・マックアルパイン（J.Mc Alpine）らの最新の番号付けシステム（ジェイ・アンチバイオティックス（J.Antibiotics）（１９９１）４４,６８８）によれば、この化合物は３９−Ｏ−デメチルラパマイシンとして知られている。ケミカル・アブストラクツ（Chemical Abstructs（11th Cumultive Index １９８２−９６頁、６０７１９ＣＳ））による番号付けシステムによれば、本発明の化合物は４１−Ｏ−デメチルラパマイシンと称される。式（Ｉ）における化合物は以下の特性を有する：ｉ）高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光学によると、８９９の見かけの分子量を有し； ii）ストレプトマイセス属由来の微生物を、ラパマイシンの存在下、培養し、培地からの４２−Ｏ−デメチルラパマイシンまたはその誘導体を回収することにより得られる； iii）¹³ＣＮＭＲ分光学は、分子中、５０個の炭素の存在を明示する； iv）抗真菌活性を示す；ｖ）免疫調節活性を示す。本明細書において用いる「インキュベーション」なる語（およびこの語の派生語）は、炭素、窒素、硫黄および無機塩の同化源の存在下での生物のゆっくりした好気性成長を意味する。このような好気性成長は、固体または半固体栄養培地、または栄養素が溶解または懸濁した液体培地中で起こる。インキュベーションは好気性表面上でまたは液内培養により起こる。栄養培地は、複合的栄養素からなっていてもよく、または化学的に限定されていてもよい。本発明の方法において用いるのに適当な微生物は、４２−Ｏ−デメチルラパマイシンの産生能を有するストレプトマイセス属に属する細菌株を包含することが見いだされた。さらには、このような株の一例がｓｐ.ＮＣＩＭＢ４０５１５であり、これは天然物およびまたその変異株から単離されることも見いだされた。本明細書において用いる「変異株」なる語は、自発的に、あるいは薬剤が故意に投与されるかそうでないかにかかわらず外部剤の効果により生じるいずれの変異株も意味する。変異株を産生する適当な方法としては、エイチ・アイ・アドラー（H.I.Adler）によって、国際原子力機関、ウィーン、１９７３年、シンポジウムの議事録、２４１頁、「ラジエーション・アンド・ラジオアイソトープ・フォー・インダストリアル・マイクロオーガニズムズ」における「テクニックス・フォア・ザ・デベロプメント・オブ・マイクロオーガニズムズ」にて概要が示されているものが挙げられ、これは以下のものを包含する：（ｉ）電離放射線（例、Ｘ線およびγ線）、紫外線、紫外線＋光増感剤（例、８−メトキシプソラレン）、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ピリミジン塩基類似体（例、５−ブロモウラシル）、アクリジン、アルキル化剤（例、マスタードガス、メタンスルホン酸エチル）、過酸化水素、フェノール、ホルムアルデヒド、熱、および（ii）例えば、組換え、形質転換、形質導入、溶原化、溶原変換、プロトプラスト融合および自然変異体に関する選択的技術を含む遺伝子技法。ベッカー・ビー、リーチェバリアー・エム・ピー、ゴードン・アール・イー、リーチェバリアー・エイチ・エイ（Becker B.、Lechevalier M.P.、Gordon R.E. 、Lechevalier H.A.）、１９６４、アプライド・マイクロバイオロジー（Appl.M icrobiol.）１２、４２１−４２３）およびウィリアムズ・エス・ティ、グッドフェロー・エム、ウェリントン・イー・エム・エイチ、ビッカーズ・ジェイ・シー、アルダーソン・ジー、スネス・ピー・エイチ・エイ、サキン・エム・ジェイおよびモータイマー・エム（Williams S.T.、Goodfellow M,.Wellington E.M.H. 、Vickers J.C.、Alderson.G.、Sneath P.H.A.、Sackin M.J.およびMortimer M. ）１９８３、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（J.Gen.Mi crobiol.）１２９、１８１５−１８３０）の方法を用いて、Ｓp.ＮＣＩＭＢ４０５１５は未報告の非定型ストレプトマイセス株と確認され、したがって、該株もまた、特に生物学的に純粋な形態にて本発明の一部を形成するものである。該株はナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア社（National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd．（Ｎ.Ｃ.Ｉ.Ｍ.Ｂ.）、スコットランド、アバディーン）にＮＣＩＭＢ４０５１５の番号で１９９２年７月７日に寄託されている。ｓｐ.ＮＣＩＭＢ４０５１５を培養するための培地は、適当には、同化炭素および同化窒素の供給源を無機塩と共に含有する。適当な窒素源は、酵母エキス、大豆粉、肉エキス、綿実、小麦粉、麦芽、蒸留乾燥溶解物、アミノ酸、蛋白加水分解物ならびにアンモニウムおよび硝酸塩窒素を包含する。適当な炭素源は、グルコース、ラクトース、マルトース、デンプンおよびグリセロールを包含する。適当には、培地はまた、アルカリ金属イオン（例、ナトリウム）、ハロゲンイオン（例、クロリド）、およびアルカリ土類金属イオン（例、カルシウムおよびマグネシウム）ならびに鉄およびコバルトなどの微量元素を含む。培養は、適当には、約２０〜３５℃、有利には２０〜３０℃の温度で行い、例えば以下に記載するように、単離した後に所望の産物を最適の収率で得るために、培養物をラパマイシンと７日まで、有利には３〜５日接触させる。所望の産物またはその誘導体を培地から単離し、後処理し、このような化合物に関する通常の技法を用いて精製する。このような単離および精製操作はすべて低温ないし外界温度、例えば４〜４０℃好都合には２０〜３５℃の範囲内の温度で行うのが都合よい。所望の化合物は生物学的活性の試験および／またはｈｐｌｃ保持時間をモニターすることによる慣用的方法で容易に同定できる。適当には、分離操作は、好ましくは最終工程として高性能液体クロマトグラフィー工程を包含する。水性メタノールを用いて溶出を行ってもよい。４２−Ｏ−デメチルラパマイシンおよびその誘導体は、結晶性または非結晶性であり、結晶性であるならば、所望により水和または溶媒和されていてもよい。誘導体は、好ましくは医薬上許容される誘導体である。誘導体は、医薬上許容される対イオンとの塩を包含する。本発明の化合物は、適当には、実質的に純粋な形態、例えば少なくとも５０％純度、適当には少なくとも６０％純度、有利には少なくとも７５％純度、好ましくは、少なくとも８５％純度、より好ましくは少なくとも９５％純度、特には少なくとも９８％純度である（％はすべて重量／重量で計算する）。本発明の化合物の不純またはあまり純粋でない形態は、例えば医薬的用途に適したより純粋な形態の同一の化合物またはその関連化合物（例えば、対応する誘導体）の調製に用いられる。４２−Ｏ−デメチルラパマイシンおよびその医薬上許容される誘導体は抗真菌活性を有し、動物、特にヒトを含む哺乳動物、特にヒトおよび家畜（養殖動物を含む）における真菌感染症の予防および治療に有用である。該化合物は、ヒトにおいて、他の微生物の中でも、カンジダ属（例、カンジダ・アルビカンス（Cand ida Albicans））、トリコフィトン属（例、トリコフィトン・メンタグロフイテス（Trichophyton mentagrophytes））、マイクロスポラム属（例、マイクロスポラム・ジプセウム（Microsporum gypseum））またはエピデルモフィトン属（E pidermophyton）により起こる局所性真菌感染症またはカンジダ・アルビカンスにより起こる粘膜感染症（例えば、口腔および膣カンジダ症）の治療に用いられる。これらはまた、例えばカンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、コクシジオデス（Coccidiodes）、パラコクシシオデス（Paracocciciodes）、ヒストプラズマ（Histoplasma）またはブラストマイセス（Blastomyces）属により起こる全身性真菌感染症の治療に用いてもよい。これらはさらに、真菌腫、色素酵母菌症およびムコール菌症の治療にも有用である。４２−Ｏ−デメチルラパマイシンおよびその医薬上許容される誘導体はまた、免疫調節剤としても活性である。本明細書において用いる「免疫調節剤」なる語は、本発明の化合物が、in vitroでのＴ（およびＢ）細胞応答を阻害することにより、および／またはアジュバント誘起性関節炎における炎症系応答処理二次病変において統計的に有意な減少を起こすことによって免疫抑制誘発能を有することを意味する。治療の適応症は、以下の病状の治療を包含するが、これに限定されるわけではない：慢性関節リウマチ、全身性紅斑狼瘡、多発性硬化症、急性移植／移植片拒絶反応、重症筋無力症、全身性進行性硬化症、多発性骨髄腫、アトピー性皮膚炎、高イムノグロブリンＥ、Ｂ型肝炎抗原陰性慢性活動性肝炎、ハシモト甲状腺炎、家族性地中海熱、グレイブス病、自己免疫性溶血性貧血、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病。４２−Ｏ−デメチルラパマイシンおよびその医薬上許容される誘導体はまた発癌性腫瘍に対しても活性を有する。さらに詳細には、該化合物は腫瘍の大きさを減少させ、腫瘍の増殖を阻害し、および／または腫瘍を有する動物の生存期間を延長するのに有用である。したがって、本発明は、医学的療法における用途として、特に抗真菌剤または免疫調節剤、あるいは発癌性腫瘍に対する薬剤として用いるための４２−Ｏ−デメチルラパマイシンまたはその誘導体を提供する。さらには、本発明は、有効量の４２−Ｏ−デメチルラパマイシンまたはその誘導体を投与することによる、真菌感染症に罹患しているヒトまたは動物の治療方法を提供する。さらに、本発明は、有効量の４２−Ｏ−デメチルラパマイシンまたはその誘導体を投与することによる、免疫調節を必要とするヒトまたは動物の治療方法を提供する。本発明はまた、ヒトまたは動物における発癌性腫瘍の治療方法であって、このようなヒトまたは動物に有効かつ非毒性量の４２−Ｏ−デメチルラパマイシンまたはその誘導体を投与することからなる方法を提供する。本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩と、医薬上許容される希釈剤または担体とからなる医薬組成物を提供する。組成物は、好ましくはヒトに用いる場合、錠剤、カプセル、注射またはクリーム形である。ヒトに用いる場合、４２−Ｏ−デメチルラパマイシンまたはその誘導体は単独で投与できるが、一般には意図する投与経路および標準的製薬慣習に従って選択された医薬担体との混合物として投与される。例えば、これらはデンプンまたはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤形、またはカプセルまたは単独または賦形剤と混合した膣坐剤、またはフレーバーもしくは着色剤を含有するエリキシルまたは懸濁液の形態で経口投与される。これらは非経口的に、例えば静脈内、筋肉内または皮下注射してもよい。非経口投与の場合、これらは他の物質、例えば溶液を等張にするのに十分な塩またはグルコースを有してもよい滅菌溶液の形態で用いるのが最適である。真菌感染症のヒト患者に経口および非経口投与する場合、式（Ｉ）の抗真菌性化合物の一日の投与レベルは、経口または非経口経路により投与する場合には、０.０５〜１００、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ（分割用量）であると思われる。このような化合物の錠剤またはカプセルは、適宜１個でまたは一度に２個またはそれ以上投与する場合、５ｍｇ〜０.５ｇの活性化合物を含有すると考えることができる。医師はどのような場合にも個々の患者に対して最適で、患者の年令、体重および応答に依存して実際の投与量を決定する。前記の投与量は平均的なケースの例である。もちろん、より高または低用量がよい場合もありえるが、これも本発明の範囲に含まれる。免疫調節を必要とするヒト患者についても同様に、該化合物またはその誘導体の一日の非経口または経口投与量は、好ましくは、０.１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。当業者は、慣用的実験操作により、いずれの有効かつ非毒性量の化合物またはその誘導体が発癌性腫瘍の治療の目的に合うか決定できる。しかし、一般には、有効量は１日に付き体重１ｋｇ当たり約０.０５〜１００ミリグラムの範囲であると考えられる。化合物を前記投与量範囲で投与した場合、許容できない毒学的効果はないと考えられる。本発明の化合物および組成物は、投与について、他の抗真菌、抗癌または免疫調節剤と同様に、ヒトまたは獣医学的医薬において用いるための都合のよい方法にて処方できる。経口投与用化合物および錠剤およびカプセルは、単位投与形態であり、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガントまたはポリビニルピロリドンなどの結合剤；例えばラクトース、シュガー、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシンなどの増量剤；例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカなどの錠剤成型滑沢剤；例えばジャガイモデンプンなどの崩壊剤；およびラウリル硫酸ナトリウムなどの医薬上許容される湿潤剤などの通常の賦形剤を含んでもよい。錠剤は通常の製薬慣習において周知の方法により被覆してもよい。経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、あるいは使用前に水または他の適当なビヒクルで復元する乾燥製品として提供できる。このような液体製剤は、例えばソルビトール、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用油脂などの懸濁化剤；例えばレシチン、ソルビタンモノオレアートまたはアカシアなどの乳化剤；例えばアーモンド油、油性エステル（例、グリセリン）、プロピレングリコール、またはエチルアルコールなどの非水性ビヒクル（食用油を含んでもよい）；例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルまたはソルビン酸などの保存剤、および所望により通常のフレーバーまたは着色剤等の通常の添加剤を含んでもよい。局所投与を意図とする本発明の組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼剤、点耳剤、含浸包帯剤およびエアゾルなどの形態であってもよく、例えば保存剤、薬物浸透を助成する溶媒、および軟膏およびクリームにおける皮膚軟化薬などの適当な通常の添加剤を含んでもよい。このような局所処方はまた、通常の適合性担体、例えばクリームまたは軟膏基剤およびローションではエタノールまたはオレイルアルコールを含有してもよい。このような担体は、処方の約１％〜約９８重量％を構成する。より一般的には、処方の約８０重量％までを構成する。本発明の組成物は通常の坐剤基剤、例えばカカオ脂または他のグリセリドを含む坐剤として処方してもよい。非経口投与を意図とする本発明の組成物は、流状の単位投与形であるのが好都合であり、これは該化合物と滅菌ビヒクル、プロピレングリコールを用いて調製できる。化合物は、用いるビヒクルおよび濃度に応じて、ビヒクルに懸濁または溶解させてもよい。非経口用懸濁液は、化合物を溶解させる代わりにビヒクル中に懸濁させ、滅菌処理を濾過により行うことができない以外は、実質的に同様の方法で調製される。その代わりとして、化合物を、滅菌ビヒクルに懸濁させる前に、酸化エチレンに暴露して滅菌してもよい。界面活性剤または湿潤剤をこのような懸濁液に配合して、化合物の均一な分散を促進するのが好都合である。本発明の組成物は吸入投与してもよい。「吸入」とは、経鼻内または経口吸入投与を意味する。エアゾル処方または計量吸入器のようなかかる投与に関して適当な投与形は通常の技術により調製できる。以下の実施例を用いて本発明を説明する。実施例１４２−Ｏ−デメチルラパマイシンの調製ラパマイシンから４２−Ｏ−デメチルラパマイシンの産生能を有する培養体は、ストレプトマイセス属に分類され、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collection of Industria l and Marine Bacteria）、スコットランド、アバディーン・エイ・ビー２１アール・ワイ、マチャー・ドライブ・ストリート、２３番に受入番号ＮＣＩＭＢ４０５１５で寄託されている。培養１００ｍｌＭ２培地［アルカソイ，１０ｇ／ｌ；グリセロール，２０ｇ／ｌ; ＣoＣl₂・６Ｈ₂Ｏ，０.００５ｇ／ｌ；ＭgＣl₂・２Ｈ₂Ｏ，０.１ｇ／ｌ；ＦeＣl₃ ，０.０３ｇ／ｌ；ＺnＣl₂，０.００５ｇ／ｌ；ＣuＣl₂・２Ｈ₂Ｏ，０.００５ｇ／ｌ；ＭnＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ，０.００５ｇ／ｌ（pＨ６.６未調整）］を入れた５個の５００ｍｌフラスコの各々に、ペトリ皿にてよく成長させたＡ３寒天上培養物［酵母エキス，５ｇ／ｌ；麦芽エキス，１０ｇ／ｌ；グリセロール，１０ｇ／ｌ；大豆ペプトン，５ｇ／ｌ；寒天Ｎo.３，２０ｇ／ｌ（pＨ６.５）］からの２プラグの寒天を接種した。別法として、ペトリ皿からのラージループフル（larg e loopful）のよく成長させた培養物を３ｍｌのツィーン（Tween）８０と混合し、全内容物を５００ｍｌフラスコ中の１００ｍｌのＭ２培地に添加し、２８℃、２４０ｒｐｍで３日間成長させ、ついで１ｍｌの培養ブロスに用いて５個の各５００ｍｌフラスコの１００ｍｌのＭ２培地に接種する。ついで、フラスコを２８ ℃２４０ｒｐｍで成長させた。インキュベーション５日後、ラパマイシン（２０ｍｇ）をアセトン（３.５ｍｌ）中溶液として各フラスコに添加した。ラパマイシンは、１９９０年９月１４日に寄託されたラパマイシン産生培地、ＮＣＩＭＢ４０３１９から、または米国特許第３９２９９９２号（１９７５年１２月３０日）に開示されているラパマイシン産生微生物、例えばＮＲＲＬ５４９１を培養することにより得ることができる。その全開示を出典明示により本明細書の一部とする。フラスコを２８℃、２４０ｒｐｍで約２０時間インキュベートした。単離操作溶媒抽出フラスコの内容物を希硫酸で増量させ、pＨ４に調節した。５００ｍｌのジクロロメタンを添加し、混合物を２時間撹拌し、遠心分離により相を分離して有機溶媒相を回収し、さらに２００ｍｌのジクロロメタンを添加し、１時間撹拌した。有機溶媒相を合し、真空下で油状物にまで濃縮した。該油状物に、１００ｍｌのメタノールを添加し、メタノール抽出物を濾過し、濾液を真空下で油状物に濃縮した。シリカクロマトグラフィー該油状物をアセトン：ヘキサン（１５：８５）中に充填したKiselgel 60（７０〜２３０メッシュ）カラム（２５×５０ｍｍ）に添加した。添加後、カラムをアセトン−ヘキサンの段階勾配で溶出した。３５：６５のアセトニトリル：ヘキサンで溶出したフラクションは４２−Ｏ−デメチルラパマイシンを含有する。これらを合し、真空下で濃縮乾固し、−２０℃で保存した。分取用ｈｐｌｃ貯蔵した固体をメタノール（５００ｍｌ）に溶解し、１００μｌ部を別々に逆相ミクロソルブＣ−１８カラムおよびプレカラム（２１.４ｍｍ×２５ｃｍおよび２１.４×５ｃｍ）（ライニン・インストラメンツ・ユーエスエイ（Rainin In struments USA））に注入した。注入後、メタノール：Ｈ₂Ｏ（７８：２２）、６ｍｌ／分で溶出を続け、２７８ｎｍでのＵＶ吸収に関してモニター観察した。合計５つの注入体からの目的化合物を含有するフラクションをプールし、真空下で濃縮してメタノールを除去し、凍結乾燥した。目的化合物含有のフラクションを、Spherisorb Ｓ１０ＯＤＳ２（ＰhaseＳep ）カラム（２５ｃｍ×４.６ｍｍ）およびＷatersプレカラムを用いて逆相ｈｐｌｃにより分析した。カラムを２７８ｎｍでＵＶ吸収によりモニター観察し、メタノール：水（７８：２２）で２ｍｌ／分で溶出した。これらの条件下で、目的化合物の保持時間は６.８分であった（保持時間８.４分のラパマイシンと異なる）。分光分析データ得られた化合物は質量分光分析法（ＦＡＢ）[Ｍ＋Ｎa]⁺＝９２２およびプロトンおよび¹³Ｃ核磁気共鳴分光分析法（以下、表１参照）により特徴付けられる。ＵＶ分光分析法は、アセトン中、２７５ｎｍでＵＶ１_maxを示す。実施例２４２−Ｏ−デメチルラパマイシンの生物活性化合物を以下のバイオアッセイを用いて抗真菌および免疫抑制活性について分析した。Ａ．抗真菌活性のアッセイ対数期増殖の酵母生物（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cere visiae）を完全寒天培地（ＹＰＤ）上にプレートした。適当な水性溶媒または有機溶媒中に溶解した化合物を寒天上に穿孔したウェル中に入れた。プレートを４８時間インキュベートし、阻害領域を測定した。化合物の効力を、阻害領域ｖｓ .薬剤濃度の対数のプロットを回帰分析することにより定量した。Ｂ．免疫抑制活性の有糸分裂誘発アッセイＢＤＦＩ雌マウスの脾臓細胞を１０％ウシ胎児血清（５×１０⁶／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ中にて確立した。この１００ｍｌ部の懸濁液（５×１０⁵細胞）を９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（リンブロ（Linbro）、フロー・ラボラトリース（Flow Laboratories））中に分配した。有糸分裂誘発刺激物としてコンカナバリンＡ（５μｇ／ｍｌ）を添加し、マイクロタイターウェル中の最終容積をＲＰＭＩで２００μＬに調節した。細胞培養物を３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で７２時間インキュベートし、０,５μＣi ³Ｈ−チミジン（比活性２.００Ｃi ／モル）で７２時間の培養の最後の１８時間パルス処理した。細胞を自動式複数試料収穫装置で収穫し、細胞結合の放射活性をベックマン液体シンチレーションカウンターで計数した。結果を４回の測定の平均値で表わした。細胞生存能を７２時間インキュベーションした後にトリパンブルー排除により測定した。試験すべき化合物を細胞の添加の前に適当な希釈度でマイクロタイタープレートに添加した。本発明の化合物に関するこれらの２つの分析の結果を表２に示す。実施例３組成物例Ａ〜ＨＡ− カプセル組成物カプセル形の本発明の医薬組成物は、標準的な２ピース系硬ゼラチンカプセルを粉末形の本発明の化合物（５０ｍｇ）、ラクトース（１００ｍｇ）、タルク（３２ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウム（８ｍｇ）を満たすことにより調製する。Ｂ− 注射可能な非経口用組成物注射による投与に適した形態の本発明の医薬組成物を、１.５重量％の本発明の化合物を１０容量％のポリエチレングリコールおよび水中に撹拌することにより調製する。溶液を濾過により滅菌する。Ｃ− 軟膏組成物本発明の化合物１.０ｇ白色軟パラフィン１００.０ｇまで適量本発明の化合物を少量のビヒクル中に分散させ、徐々に多量のビヒクル中に配合して、滑らかで均質な製品を得る。ついで、折畳み性金属チューブに該分散液を充填する。Ｄ− 局所用クリーム組成物本発明の化合物１.０ｇポーラワックスＧＰ２００２０.０ｇラノリン無水物２.０ｇ白ミッロウ２.５ｇヒドロキシ安息香酸メチル０.１ｇ蒸留水１００.０ｇまで適量ポーラワックス、ミツロウおよびラノリンを一緒に６０℃で加熱する。ついで本発明の化合物を添加し、よく分散させ、組成物をゆっくりと撹拌しなから冷却する。Ｅ− 局所ローション組成物本発明の化合物１.０ｇソルビタンモノラウレート０.６ｇポリソルベート２００.６ｇセトステアリルアルコール１.２ｇグリセリン６.０ｇヒドロキシ安息香酸メチル０.２ｇ精製水（Ｂ.Ｐ.）１００.００ｍｌまで適量ヒドロキシ安息香酸メチルおよびグリセリンを７０ｍｌの水中に７５℃で溶解する。ソルビタンモノラウレート、ポリソルベート２０およびセトステアリルアルコールを一緒に７５℃で融解させ、該水溶液に添加する。得られたエマルジョンを均質化し、一定して撹拌しながら冷却し、本発明の化合物を残りの水中の懸濁液として添加する。懸濁液全体を均質化するまで撹拌する。Ｆ− 点眼用組成物本発明の化合物０.５ｇヒドロキシ安息香酸メチル０.０１ｇヒドロキシ安息香酸プロピル０.０４ｇ精製水Ｂ.Ｐ.（Ｂ.Ｐ.＝英国薬局方）１００.００ｍｌまで適量ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピルを７０ｍｌの精製水中に７５℃で溶解させ、得られた溶液を冷却する。ついで、本発明の化合物を添加し、溶液を膜フィルター（０.２２μｍ孔径）を通して濾過することにより滅菌し、無菌状態にて適当な滅菌容器中に充填する。Ｇ− 吸入投与用組成物１５〜２０ｍｌの容積のエアゾル容器に関して：１０ｍｇの本発明の化合物を０.２〜０.２％のポリソルベート８５またはオレイン酸などの滑沢剤と混合し、このような混合物をフレオンなどの噴射剤中に、好ましくは（１,２−ジクロロテトラフルオロエタン）およびジフルオロクロロメタンの混合物中に分散させ、経鼻または経口吸入投与のいずれかのエアゾル容器アダプターに入れる。Ｈ− 吸入投与用組成物１５〜２０ｍｌの容積のエアゾル容器に関して：１０ｍｇの本発明の化合物をエタノール（６〜８ｍｌ）に溶かし、０.１〜０.２％のポリソルベート８５またはオレイン酸などの滑沢剤を添加し、これをフレオンなどの噴射剤中に、好ましくは（１,２−ジクロロテトラフルオロエタン）およびジフルオロクロロメタンの混合物中に分散させ、経鼻または経口吸入投与のいずれかのエアゾル容器アダプターに入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims

【特許請求の範囲】１．４２−Ｏ−デメチルラパマイシンである、式（Ｉ）：で示される化合物またはその誘導体。２．以下の特性：ｉ）高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光学によると、８９９の見かけ分子量を有し； ii） ¹³ＣＮＭＲ分光学によれば、分子中に５０個の炭素を有し； iii）抗真菌活性を示し； iv）免疫調節活性を示す；を有する化合物であって、ラパマイシンの存在下、ストレプトマイセス属に由来の微生物を培養し、培地から回収することにより得られる化合物。３．微生物をラパマイシンと接触させ、その後、インキュベーションから４２−Ｏ−デメチルラパマイシンまたはその誘導体を単離することからなる請求項１に記載の化合物の製法。４．物質または化合物あるいはその誘導体を、吸着性樹脂への吸着作用により、他の抗菌活性な物質および／または不活性な物質との混合物の溶液から単離することからなる請求項３記載の方法。５．産生微生物がストレプトマイセス属に属する請求項３または請求項４記載の方法。６．産生微生物がストレプトマイセスＮＣＩＭＢ４０５１５である請求項３、請求項４または請求項５記載の方法。７．請求項１または請求項２に記載の化合物またはその混合物、またはその医薬上許容される誘導体と、医薬上許容される担体または賦形剤とからなる医薬組成物。８．治療にて用いるための請求項１または請求項２記載の化合物またはその混合物、あるいはその医薬上許容される誘導体。９．免疫調節剤として、抗癌剤としてまたはヒトを含む動物における微生物感染症の治療にて用いるための請求項１または請求項２記載の化合物またはその混合物、あるいはその医薬上許容される誘導体。 10．抗癌剤または免疫調節剤として、あるいはヒトを含む動物における微生物感染症の治療用の医薬の製造における、請求項１または請求項２記載の化合物またはその混合物、あるいはその医薬上許容される誘導体の使用。 11．動物を免疫調節するか、動物における微生物感染症を治療するか、または特にヒトおよび飼育哺乳動物における発癌性腫瘍を治療する方法であって、請求項１または請求項２記載の化合物またはその混合物、またはその医薬上許容される誘導体、あるいは請求項７に記載の組成物を、その処理を必要とする患者に投与することを特徴とする方法。 12．ストレプトマイセスＮＣＩＭＢ４０５１５。