JPH05178761A - ビブリオ属により産生されたプロテアーゼを含有する組成物および壊死組織除去および創傷の治癒において使用する方法 - Google Patents
ビブリオ属により産生されたプロテアーゼを含有する組成物および壊死組織除去および創傷の治癒において使用する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 壊死組織除去および創傷の治癒の応用のため
の組成物および方法を提供する。組成物は、ビブリオ属
（Ｖｉｂｒｉｏ）の微生物により産生される、ある種の
プロテアーゼを含有する。 【効果】 本発明の組成物は壊死組成除去および創傷の
治癒に有効である。
の組成物および方法を提供する。組成物は、ビブリオ属
（Ｖｉｂｒｉｏ）の微生物により産生される、ある種の
プロテアーゼを含有する。 【効果】 本発明の組成物は壊死組成除去および創傷の
治癒に有効である。
Description
【０００１】本発明は、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）の
微生物により産生された、ある種のプロテアーゼを含有
する、壊死組織除去の組成物および壊死組織除去および
／または創傷の治癒にこのような組成物を使用する方法
に関する。さらに詳しくは、プロテアーゼは壊死の組織
を有効に消化することができると同時に、生存能力のあ
る生きている組織は実質的に障害されない。プロテアー
ゼは、また、創傷の治癒の性質を有する。
微生物により産生された、ある種のプロテアーゼを含有
する、壊死組織除去の組成物および壊死組織除去および
／または創傷の治癒にこのような組成物を使用する方法
に関する。さらに詳しくは、プロテアーゼは壊死の組織
を有効に消化することができると同時に、生存能力のあ
る生きている組織は実質的に障害されない。プロテアー
ゼは、また、創傷の治癒の性質を有する。
【０００２】創傷の治癒は複雑なプロセスであり、しば
しば創傷区域において、生存能力のない壊死の組織の存
在によりさらに複雑である。壊死組織除去（ｄｅｂｒｉ
ｄｍｅｎｔ）は、創傷から生存能力のない組織を除去し
て、感染を予防しかつ治癒を促進するプロセスである。
しば創傷区域において、生存能力のない壊死の組織の存
在によりさらに複雑である。壊死組織除去（ｄｅｂｒｉ
ｄｍｅｎｔ）は、創傷から生存能力のない組織を除去し
て、感染を予防しかつ治癒を促進するプロセスである。
【０００３】生存能力ある組織と生存能力のない組織と
を区別することができる物質を発見するために、かなり
の努力がなされてきている。活力を失った組織を消化す
るとと同時に生存能力のある組織を攻撃しない物質の発
見は、外科なしで活力を失った組織の除去を可能とす
る。局所的に活力を失った組織を生存能力のある有機
体、例えば、熱傷、溽瘡性潰瘍、圧力性壊死、切開、外
傷性および化膿性創傷、および末梢の脈管の病気に対し
て二次的の潰瘍から除去することが必要である、事実上
すべての病気のプロセスにおいて有益な治療学的因子で
あるであろう。
を区別することができる物質を発見するために、かなり
の努力がなされてきている。活力を失った組織を消化す
るとと同時に生存能力のある組織を攻撃しない物質の発
見は、外科なしで活力を失った組織の除去を可能とす
る。局所的に活力を失った組織を生存能力のある有機
体、例えば、熱傷、溽瘡性潰瘍、圧力性壊死、切開、外
傷性および化膿性創傷、および末梢の脈管の病気に対し
て二次的の潰瘍から除去することが必要である、事実上
すべての病気のプロセスにおいて有益な治療学的因子で
あるであろう。
【０００４】かなりの注意を引き付けた１つの領域はタ
ンパク質分解酵素および他の化学物質を使用して、熱傷
から生ずる焼痂組織の早期の壊死組織除去を行うことで
ある。このような活力を失った組織はきわめてすぐれた
培地であり、そしてひどく熱傷を受けた患者の大部分に
おいて死亡の最も近い原因である敗血症の主な源であ
る。
ンパク質分解酵素および他の化学物質を使用して、熱傷
から生ずる焼痂組織の早期の壊死組織除去を行うことで
ある。このような活力を失った組織はきわめてすぐれた
培地であり、そしてひどく熱傷を受けた患者の大部分に
おいて死亡の最も近い原因である敗血症の主な源であ
る。
【０００５】熱傷において、活力を失った組織は焼痂と
呼ばれる。熱傷の焼痂は表皮および皮膚の層において通
常見いだされる乾燥した血液、化膿性の滲出物および変
性したタンパク質の複雑な混合物である。焼痂の中に見
いだされる変性タンパク質は、主としてコラーゲン、エ
ラスチン、フィブリン、ヘモグロビンおよび他の凝固し
たタンパク質である。
呼ばれる。熱傷の焼痂は表皮および皮膚の層において通
常見いだされる乾燥した血液、化膿性の滲出物および変
性したタンパク質の複雑な混合物である。焼痂の中に見
いだされる変性タンパク質は、主としてコラーゲン、エ
ラスチン、フィブリン、ヘモグロビンおよび他の凝固し
たタンパク質である。
【０００６】コラーゲンは皮膚の乾燥重量の約７５％を
構成し、そして壊死の破片および焼痂の主な構成成分で
ある。保護のムコ多糖の鞘が損傷または破壊された、準
生存可能な中間のコラーゲンの線維は、壊死の組織を創
傷表面に定着させる。これらの線維は、白色がかった持
続性の顕微鏡的フィブリルとして現れ、「コラーゲン・
モス（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｏｓｓ）」と呼ばれてきて
いる；それらは壊死の物質をその基部から分離するため
に完全に排除しなくてはならない。次いで、この完全な
壊死組織除去は顆粒化組織を発現させることができる。
構成し、そして壊死の破片および焼痂の主な構成成分で
ある。保護のムコ多糖の鞘が損傷または破壊された、準
生存可能な中間のコラーゲンの線維は、壊死の組織を創
傷表面に定着させる。これらの線維は、白色がかった持
続性の顕微鏡的フィブリルとして現れ、「コラーゲン・
モス（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｏｓｓ）」と呼ばれてきて
いる；それらは壊死の物質をその基部から分離するため
に完全に排除しなくてはならない。次いで、この完全な
壊死組織除去は顆粒化組織を発現させることができる。
【０００７】タンパク質分解酵素が、とくに熱傷のため
の、壊死組織除去因子として最も有用であるためには、
プロテアーゼは生存能力のある組織と生存能力がない組
織とを区別すること；焼痂の中に見いだされる広範な種
類の変性されたタンパク質を急速にかつ完全に加水分解
すること；生理学的ｐＨおよび温度において機能するこ
と；付加化治療剤（例えば、洗浄剤、局所的抗生物質）
と適合性であること；正常の創傷の治癒または複雑な皮
膚の移植を妨害しないこと；そして種々の配合物中で広
い範囲の温度において安定に止まることが望ましい。あ
る数のタンパク質分解酵素の調製物は、変化する程度の
成功をもって、壊死組織除去因子として使用されてきて
いる。
の、壊死組織除去因子として最も有用であるためには、
プロテアーゼは生存能力のある組織と生存能力がない組
織とを区別すること；焼痂の中に見いだされる広範な種
類の変性されたタンパク質を急速にかつ完全に加水分解
すること；生理学的ｐＨおよび温度において機能するこ
と；付加化治療剤（例えば、洗浄剤、局所的抗生物質）
と適合性であること；正常の創傷の治癒または複雑な皮
膚の移植を妨害しないこと；そして種々の配合物中で広
い範囲の温度において安定に止まることが望ましい。あ
る数のタンパク質分解酵素の調製物は、変化する程度の
成功をもって、壊死組織除去因子として使用されてきて
いる。
【０００８】トラベイス（ＴｒａｖａｓｅR）軟膏は、
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の無菌の
濾液から得られるタンパク質分解酵素を含有する調製物
であり、他の既知の酵素の壊死組織除去因子である［ガ
レット（Ｇａｒｒｅｔｔ）、クリニカル・メディシン
（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（１９６９）
７６：１１−１５］および米国特許第３，４０９，７１
９号。クリケライア（Ｃｒｉｋｅｌａｉｒ）は、酵素の
壊死組織除去因子として、エラスターゼ、すなわち、膵
臓から誘導されたセリンプロテアーゼを記載している。
クレイン（Ｋｒｅｉｎ）ら（米国特許第４，３２９，４
３０号）は、生存能力のない活力を失った組織の消化、
解離および分離に有用である、ブロメリンから誘導され
たタンパク質分解酵素の混合物を記載している。シュミ
ット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）（米国特許第３，９８３，２０
９号）は、焼痂および壊死の組織の壊死組織除去のため
に熱傷の表面に酵素を適用することによって、動物にお
ける熱傷を処置することを教示している。開示された酵
素は、特定の疎水性のポリマー中のパパイン、トリプシ
ン、リゾチーム、ストレプチキナーゼ、フィブリノシ
ン、ピングイナイン、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）お
よびブロメラインを包含した。延長した時間にわたる生
物侵食は、タンパク質分解酵素をゆっくり解放した。
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の無菌の
濾液から得られるタンパク質分解酵素を含有する調製物
であり、他の既知の酵素の壊死組織除去因子である［ガ
レット（Ｇａｒｒｅｔｔ）、クリニカル・メディシン
（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（１９６９）
７６：１１−１５］および米国特許第３，４０９，７１
９号。クリケライア（Ｃｒｉｋｅｌａｉｒ）は、酵素の
壊死組織除去因子として、エラスターゼ、すなわち、膵
臓から誘導されたセリンプロテアーゼを記載している。
クレイン（Ｋｒｅｉｎ）ら（米国特許第４，３２９，４
３０号）は、生存能力のない活力を失った組織の消化、
解離および分離に有用である、ブロメリンから誘導され
たタンパク質分解酵素の混合物を記載している。シュミ
ット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）（米国特許第３，９８３，２０
９号）は、焼痂および壊死の組織の壊死組織除去のため
に熱傷の表面に酵素を適用することによって、動物にお
ける熱傷を処置することを教示している。開示された酵
素は、特定の疎水性のポリマー中のパパイン、トリプシ
ン、リゾチーム、ストレプチキナーゼ、フィブリノシ
ン、ピングイナイン、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）お
よびブロメラインを包含した。延長した時間にわたる生
物侵食は、タンパク質分解酵素をゆっくり解放した。
【０００９】メルケル（Ｍｅｒｋｅｌ）（米国特許第
３，６７７，９００号）は、コラゲナーゼ、ことにビブ
リオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）のある種により産生されたも
の、は壊死組織除去因子として有用であることを開示し
ている。しかしながら、メルケルのコラゲナーゼは、生
理学的ｐＨおよび温度の条件下に、自然の非変性コラー
ゲンを消化することができる酵素であり、そして血清に
より阻害されない。したがって、メルケルのコラゲナー
ゼは生存能力のある組織と生存能力がない組織とを区別
しないように思われる。コラゲナーゼは、また、非常に
狭い基質特異性を有する。さらに、コラゲナーゼは生存
能力皮膚の組織に対する有意な損傷を引き起こし、顆粒
化組織の発現および創傷の完熟を減少すると報告された
［ハミット（Ｈａｍｉｔ）ら、アナルス・オブ・サージ
ェリー（Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．）（１９６０）１５１：５
８９］。
３，６７７，９００号）は、コラゲナーゼ、ことにビブ
リオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）のある種により産生されたも
の、は壊死組織除去因子として有用であることを開示し
ている。しかしながら、メルケルのコラゲナーゼは、生
理学的ｐＨおよび温度の条件下に、自然の非変性コラー
ゲンを消化することができる酵素であり、そして血清に
より阻害されない。したがって、メルケルのコラゲナー
ゼは生存能力のある組織と生存能力がない組織とを区別
しないように思われる。コラゲナーゼは、また、非常に
狭い基質特異性を有する。さらに、コラゲナーゼは生存
能力皮膚の組織に対する有意な損傷を引き起こし、顆粒
化組織の発現および創傷の完熟を減少すると報告された
［ハミット（Ｈａｍｉｔ）ら、アナルス・オブ・サージ
ェリー（Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．）（１９６０）１５１：５
８９］。
【００１０】さらに、タンパク質分解酵素は、外科的癒
着（ｓｒｇｉｃａｌ ａｄｈｉｓｉｏｎ）の防止におい
て有用であると推測された［エリス（Ｅｌｌｉｓ）、ブ
リティッシ・ジャーナル・オブ・サージェリー（Ｂｒ．
Ｊ．Ｓｕｒｇ．）（１９８２）６９：２４１−２４
３］。癒着は線維的の形成により特徴づけられ、この線
維の形成は手術の外傷の数時間以内に起こり、そして線
維芽の内部生長および血液の毛管により有機化されて確
立された線維の癒着を形成するようになる。腹内の癒着
は、主要な腹の手術後、ほとんど避けられない。これら
の癒着は腹の再手術を面倒な切開とし、内蔵の損傷の危
険を伴い、それらは腸閉塞を突如として引き起こす。多
数のタンパク質調製物が癒着の防止のために試験されて
きており、成功の程度は変化し、このような調製物はヘ
パリン、コルトコステロイド、抗ヒスタミン、プラスミ
ン、ストレプトキナーゼ、デキストラン、および組織の
プラスミノゲンアクチベーターを包含し［ドッディ（Ｄ
ｏｏｄｙ）ら、ファーティル・アンド・ステリル（Ｆｅ
ｒｔｉｌ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌ）（１９８９）５１：
５０９−５１２］、そしてかなり有効であると証明され
た因子は存在しなかった。
着（ｓｒｇｉｃａｌ ａｄｈｉｓｉｏｎ）の防止におい
て有用であると推測された［エリス（Ｅｌｌｉｓ）、ブ
リティッシ・ジャーナル・オブ・サージェリー（Ｂｒ．
Ｊ．Ｓｕｒｇ．）（１９８２）６９：２４１−２４
３］。癒着は線維的の形成により特徴づけられ、この線
維の形成は手術の外傷の数時間以内に起こり、そして線
維芽の内部生長および血液の毛管により有機化されて確
立された線維の癒着を形成するようになる。腹内の癒着
は、主要な腹の手術後、ほとんど避けられない。これら
の癒着は腹の再手術を面倒な切開とし、内蔵の損傷の危
険を伴い、それらは腸閉塞を突如として引き起こす。多
数のタンパク質調製物が癒着の防止のために試験されて
きており、成功の程度は変化し、このような調製物はヘ
パリン、コルトコステロイド、抗ヒスタミン、プラスミ
ン、ストレプトキナーゼ、デキストラン、および組織の
プラスミノゲンアクチベーターを包含し［ドッディ（Ｄ
ｏｏｄｙ）ら、ファーティル・アンド・ステリル（Ｆｅ
ｒｔｉｌ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌ）（１９８９）５１：
５０９−５１２］、そしてかなり有効であると証明され
た因子は存在しなかった。
【００１１】壊死組織除去および抗癒着性質を推測させ
る他のタンパク質分解因子は知られているが、これらの
因子の多くは無効であり、そして局所的または前身の毒
性を引き起こすことが示された。従来のタンパク質分解
因子のいずれも、壊死組織除去性質および創傷の治癒の
プロセスを促進する能力を包含する、本発明のよりすぐ
れた特性をもたない。
る他のタンパク質分解因子は知られているが、これらの
因子の多くは無効であり、そして局所的または前身の毒
性を引き起こすことが示された。従来のタンパク質分解
因子のいずれも、壊死組織除去性質および創傷の治癒の
プロセスを促進する能力を包含する、本発明のよりすぐ
れた特性をもたない。
【００１２】本発明は、少なくとも１種の製剤学的に許
容されうる担体と有効量のプロテアーゼとの混合物から
なり、前記プロテアーゼは、 （ａ）ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する微生物の培
養により産生される細胞外の中性のプロテアーゼ、前記
プロテアーゼは、次の性質： ｉ、変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリ
ンを包含する壊死の組織の成分を加水分解する； ｉｉ、自然組織を生体内で実質的に加水分解しない；お
よび ｉｉｉ、局所的配合物中で２５℃において貯蔵したと
き、安定な活性を示す；により特徴づけられる； （ｂ）前記プロテアーゼ（ａ）のための発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクションされた組み換え宿
主細胞により発現されたプロテアーゼ；および （ｃ）性質（ｉ）〜（ｉｉｉ）により特徴づけられるプ
ロテアーゼ（ａ）および（ｂ）の突然変異およびハイブ
リッド；から成る群より選択されることを特徴とする、
創傷を処置するための組成物を提供する。
容されうる担体と有効量のプロテアーゼとの混合物から
なり、前記プロテアーゼは、 （ａ）ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する微生物の培
養により産生される細胞外の中性のプロテアーゼ、前記
プロテアーゼは、次の性質： ｉ、変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリ
ンを包含する壊死の組織の成分を加水分解する； ｉｉ、自然組織を生体内で実質的に加水分解しない；お
よび ｉｉｉ、局所的配合物中で２５℃において貯蔵したと
き、安定な活性を示す；により特徴づけられる； （ｂ）前記プロテアーゼ（ａ）のための発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクションされた組み換え宿
主細胞により発現されたプロテアーゼ；および （ｃ）性質（ｉ）〜（ｉｉｉ）により特徴づけられるプ
ロテアーゼ（ａ）および（ｂ）の突然変異およびハイブ
リッド；から成る群より選択されることを特徴とする、
創傷を処置するための組成物を提供する。
【００１３】また、創傷を有効量のこのようなビブリオ
属（Ｖｉｂｒｉｏ）のプロテアーゼを含有する組成物と
接触させることからなる、創傷を壊死組織除去する方法
が提供される。
属（Ｖｉｂｒｉｏ）のプロテアーゼを含有する組成物と
接触させることからなる、創傷を壊死組織除去する方法
が提供される。
【００１４】本発明の主要な目的は、活性成分がビブリ
オ属（Ｖｉｂｒｉｏ）の菌株のビブリオ・プロテオリチ
クス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）
（ＡＴＣＣ ５３５５９）から分離されたプロテアーゼ
である、創傷を壊死組織除去する組成物および方法を提
供することである。さらに、前記プロテアーゼは図１に
示すＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を有する。
オ属（Ｖｉｂｒｉｏ）の菌株のビブリオ・プロテオリチ
クス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）
（ＡＴＣＣ ５３５５９）から分離されたプロテアーゼ
である、創傷を壊死組織除去する組成物および方法を提
供することである。さらに、前記プロテアーゼは図１に
示すＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を有する。
【００１５】本発明の他の目的は、製剤学的に許容され
うる担体が疎水性または親水性である、創傷を壊死組織
除去する組成物を提供することである。親水性配合物は
とくに好ましい。組成物は、２５℃において貯蔵したと
き、実質的な酵素安定性を実証する。酵素は、局所的配
合物中で２５℃において貯蔵するとき、約９０〜９５％
の活性を示す。
うる担体が疎水性または親水性である、創傷を壊死組織
除去する組成物を提供することである。親水性配合物は
とくに好ましい。組成物は、２５℃において貯蔵したと
き、実質的な酵素安定性を実証する。酵素は、局所的配
合物中で２５℃において貯蔵するとき、約９０〜９５％
の活性を示す。
【００１６】他の目的は、広範な種類の創傷に対する壊
死組織除去作用を有する本発明の組成物および方法の能
力であり、このような作用はは次のものを包含するが、
これらに限定されない：完全なおよび部分的な厚さの創
傷の管理；潰瘍性病変、主に圧力性（溽瘡性）潰瘍およ
び静脈瘤、うっ血性および栄養性の潰瘍；皮膚の移植部
位の準備および一般的外科的創傷、例えば、切断、切
開、外傷および化膿性の創傷の準備；膣炎、子宮頸炎、
環状切除、会陰切開、毛巣嚢胞の創傷、カルブンケル、
日焼け、凍傷、および白内障瘢痕組織の処置。
死組織除去作用を有する本発明の組成物および方法の能
力であり、このような作用はは次のものを包含するが、
これらに限定されない：完全なおよび部分的な厚さの創
傷の管理；潰瘍性病変、主に圧力性（溽瘡性）潰瘍およ
び静脈瘤、うっ血性および栄養性の潰瘍；皮膚の移植部
位の準備および一般的外科的創傷、例えば、切断、切
開、外傷および化膿性の創傷の準備；膣炎、子宮頸炎、
環状切除、会陰切開、毛巣嚢胞の創傷、カルブンケル、
日焼け、凍傷、および白内障瘢痕組織の処置。
【００１７】本発明の他の目的は、創傷の治癒性質を有
する組成物および方法を提供することである。創傷の治
癒性質は、創傷が治癒する速度を増加する能力およびま
た創傷の治癒を改良する能力（すなわち、触覚の刺激に
対する反応の維持、瘢痕の低下、新血管化の改良など）
を包含する。創傷の治癒の性質は、外科的または他の創
傷により引き起こされる癒着の防止を包含する。創傷の
治癒は４つの必須の成分に分割することができる：炎
症、脈管形成、コラーゲンの沈積および上皮形成。これ
らのすべては、すべての創傷の治癒においてある役割を
演ずる。とくに、本発明の組成物は創傷の拘縮を引き起
こす能力を示す。
する組成物および方法を提供することである。創傷の治
癒性質は、創傷が治癒する速度を増加する能力およびま
た創傷の治癒を改良する能力（すなわち、触覚の刺激に
対する反応の維持、瘢痕の低下、新血管化の改良など）
を包含する。創傷の治癒の性質は、外科的または他の創
傷により引き起こされる癒着の防止を包含する。創傷の
治癒は４つの必須の成分に分割することができる：炎
症、脈管形成、コラーゲンの沈積および上皮形成。これ
らのすべては、すべての創傷の治癒においてある役割を
演ずる。とくに、本発明の組成物は創傷の拘縮を引き起
こす能力を示す。
【００１８】本発明のプロテアーゼは、それらを創傷の
壊死組織除去および治癒の適用において使用するための
理想的な候補とする、性質の組み合わせにより特徴づけ
られる。例示を目的として、限定せずに、このような性
質は： ｉ、変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリ
ンを包含する壊死の組織の成分を加水分解する； ｉｉ、自然組織を生体内で実質的に加水分解しない；お
よび ｉｉｉ、局所的配合物中で２５℃において貯蔵したと
き、安定な活性を示す；を包含する。
壊死組織除去および治癒の適用において使用するための
理想的な候補とする、性質の組み合わせにより特徴づけ
られる。例示を目的として、限定せずに、このような性
質は： ｉ、変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリ
ンを包含する壊死の組織の成分を加水分解する； ｉｉ、自然組織を生体内で実質的に加水分解しない；お
よび ｉｉｉ、局所的配合物中で２５℃において貯蔵したと
き、安定な活性を示す；を包含する。
【００１９】本発明のプロテアーゼは、生存能力のある
組織と生存能力がない壊死の組織とを区別することがで
き、そしてまた、他のプロテアーゼに対して許容されえ
ない配合物中で持続した期間の間活性である。
組織と生存能力がない壊死の組織とを区別することがで
き、そしてまた、他のプロテアーゼに対して許容されえ
ない配合物中で持続した期間の間活性である。
【００２０】この出願および特許請求の範囲の目的のた
めに、本発明のプロテアーゼの前述性質は次のようにし
て決定する：本発明のプロテアーゼを使用する初期の試
験管内の効能の研究のために、焼痂に関連する構成タン
パク質（例えば、変性したコラーゲン、フィブリン、変
性したエラスチン）および自然組織を酵素加水分解す
る。比較のため、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）から誘導したプロテアーゼ（スチライン）を
使用した。これらのプロテアーゼは疎水性基剤中に配合
され、そしてトラベイス（ＴｒａｖａｓｅR）軟膏［ブ
ーツ−フリント・ラボラトリーズ（Ｂｏｏｔｓ−Ｆｌｉ
ｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、イリノイ州モート
ングローブ］として商業的に入手可能である。トラベイ
ス（Ｔｒａｖａｓｅ）軟膏からのプロテアーゼは、ユナ
イテッツ・ステーツ・ファーマコペイア（Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）ＸＸＩＩ
（１９９０；ｐ．１３０６）のオフィシャルモノグラフ
に記載されているように抽出し、そして以後トラベイス
・プロテアーゼと呼ぶ。各基質の加水分解の評価のため
に、ビブリオリシンおよびトラベイス・プロテアーゼ
を、下に記載するアゾカゼインアッセイにより決定して
等しい活性単位に、各反応混合物に添加した。
めに、本発明のプロテアーゼの前述性質は次のようにし
て決定する：本発明のプロテアーゼを使用する初期の試
験管内の効能の研究のために、焼痂に関連する構成タン
パク質（例えば、変性したコラーゲン、フィブリン、変
性したエラスチン）および自然組織を酵素加水分解す
る。比較のため、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）から誘導したプロテアーゼ（スチライン）を
使用した。これらのプロテアーゼは疎水性基剤中に配合
され、そしてトラベイス（ＴｒａｖａｓｅR）軟膏［ブ
ーツ−フリント・ラボラトリーズ（Ｂｏｏｔｓ−Ｆｌｉ
ｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、イリノイ州モート
ングローブ］として商業的に入手可能である。トラベイ
ス（Ｔｒａｖａｓｅ）軟膏からのプロテアーゼは、ユナ
イテッツ・ステーツ・ファーマコペイア（Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）ＸＸＩＩ
（１９９０；ｐ．１３０６）のオフィシャルモノグラフ
に記載されているように抽出し、そして以後トラベイス
・プロテアーゼと呼ぶ。各基質の加水分解の評価のため
に、ビブリオリシンおよびトラベイス・プロテアーゼ
を、下に記載するアゾカゼインアッセイにより決定して
等しい活性単位に、各反応混合物に添加した。
【００２１】Ａ．アゾカゼインの加水分解 アゾカゼインは、プロテアーゼ活性の測定の標準として
使用する、入手容易なタンパク質である。プロテアーゼ
の試料を、１．０ｍｇ／ｍｌのアゾカゼイン［スルファ
ニルアミドアゾカゼイン、シグマ・コーポレーション
（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．）、ミゾリー州セントルイ
ス］を含有する５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．４）中で、０．５ｍｌの最終体積で３７℃に
おいて１０分間インキュベーションする。このインキュ
ベーション期間の終わりに、０．５ｍｌの１０％ｗ／ｖ
のトリクロロ酢酸を添加し、直ちに混合し、次いで生ず
る混合物を氷上で１０分間貯蔵する。次いで、この混合
物を遠心し、そして生ずる上澄み液の光学密度を４２０
ｎｍにおいてブランクに対して決定し、ここでブランク
は緩衝化アゾカゼイン溶液中に酵素を含有しないか、あ
るいは不活性化された酵素を含有する。１単位の活性
は、４２０ｎｍにおいて２．５の吸収の変化を引き起こ
すために要求される量として定義される。
使用する、入手容易なタンパク質である。プロテアーゼ
の試料を、１．０ｍｇ／ｍｌのアゾカゼイン［スルファ
ニルアミドアゾカゼイン、シグマ・コーポレーション
（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．）、ミゾリー州セントルイ
ス］を含有する５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．４）中で、０．５ｍｌの最終体積で３７℃に
おいて１０分間インキュベーションする。このインキュ
ベーション期間の終わりに、０．５ｍｌの１０％ｗ／ｖ
のトリクロロ酢酸を添加し、直ちに混合し、次いで生ず
る混合物を氷上で１０分間貯蔵する。次いで、この混合
物を遠心し、そして生ずる上澄み液の光学密度を４２０
ｎｍにおいてブランクに対して決定し、ここでブランク
は緩衝化アゾカゼイン溶液中に酵素を含有しないか、あ
るいは不活性化された酵素を含有する。１単位の活性
は、４２０ｎｍにおいて２．５の吸収の変化を引き起こ
すために要求される量として定義される。
【００２２】Ｂ．ニンヒドリンのアッセイ ペプチドおよび遊離アミノ酸の解放を生ずる種々の基質
の非特異的加水分解を、記載されているようにニンヒド
リン法［ムーア（Ｍｏｏｒｅ）およびステイン（Ｓｔｅ
ｉｎ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）（１９４８）１７
６：３６７］により、マンドル（Ｍａｎｄｌ）らの手順
［ジャーナル・オブ・クリニカル・イベスティゲイショ
ン（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）（１９５３）３
２：１３２３］の変更により測定した。５０〜１００μ
ｌの加水分解の試料を、０．５ｍｌのメチルセロソルブ
中の４％のニンヒドリンおよび０．５ｍｌの０．２モル
のクエン酸の１．０ｍｌの混合物（ｐＨ５．０、７．１
ミリモルの塩化スズを含有する）に添加した。この溶液
を２０分間沸騰させ、次いで氷浴中で冷却する。５０μ
ｌを１．０ｍｌの５０％のｎ−プロパノールに添加し、
そしてこの溶液の吸収をシマズ分光光度計で６００ｎｍ
において水のブランクに対して読んだ。ロイシンを参照
標準として使用した。
の非特異的加水分解を、記載されているようにニンヒド
リン法［ムーア（Ｍｏｏｒｅ）およびステイン（Ｓｔｅ
ｉｎ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）（１９４８）１７
６：３６７］により、マンドル（Ｍａｎｄｌ）らの手順
［ジャーナル・オブ・クリニカル・イベスティゲイショ
ン（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）（１９５３）３
２：１３２３］の変更により測定した。５０〜１００μ
ｌの加水分解の試料を、０．５ｍｌのメチルセロソルブ
中の４％のニンヒドリンおよび０．５ｍｌの０．２モル
のクエン酸の１．０ｍｌの混合物（ｐＨ５．０、７．１
ミリモルの塩化スズを含有する）に添加した。この溶液
を２０分間沸騰させ、次いで氷浴中で冷却する。５０μ
ｌを１．０ｍｌの５０％のｎ−プロパノールに添加し、
そしてこの溶液の吸収をシマズ分光光度計で６００ｎｍ
において水のブランクに対して読んだ。ロイシンを参照
標準として使用した。
【００２３】プロテアーゼの臨床的性質 本発明のプロテアーゼは創傷の処置における使用によく
適し、そして創傷の壊死組織除去および創傷の治癒の応
用にとくに有用である。性質は、動物およびヒトの臨床
的試験を包含する、ある数の試験の場合において実証す
ることができる。最も広く使用されているアッセイは、
メルツ（Ｍｅｒｔｚ）ら［ジャーナル・サージカル・リ
サーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ）（１９９０）４８：２４５−２４８］により
記載されているように、ブタの部分的厚さの熱傷の創傷
である。このアッセイにおいて、配合したプロテアーゼ
を種々の対照と比較することができる。
適し、そして創傷の壊死組織除去および創傷の治癒の応
用にとくに有用である。性質は、動物およびヒトの臨床
的試験を包含する、ある数の試験の場合において実証す
ることができる。最も広く使用されているアッセイは、
メルツ（Ｍｅｒｔｚ）ら［ジャーナル・サージカル・リ
サーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ）（１９９０）４８：２４５−２４８］により
記載されているように、ブタの部分的厚さの熱傷の創傷
である。このアッセイにおいて、配合したプロテアーゼ
を種々の対照と比較することができる。
【００２４】創傷の壊死組織除去のために、他の指示な
かでも、焼痂の不存在、軟化または溶解；生存能力のあ
る組織の成分の非加水分解；および／または創傷の非刺
激により、有効性を決定する。局所的創傷の治癒のため
に、他の指示なかでも、創傷の拘縮、治癒速度の増加お
よび／または治癒の改良（すなわち、触覚の刺激に対す
る反応の維持、瘢痕の低下、血管化の改良など）によ
り、有効性を決定する。本発明のプロテアーゼの創傷の
治癒の性質は、局所的応用にのみ限定されない。創傷の
治癒の性質は、外科的創傷または他の創傷により引き起
こされる癒着の防止および可能ならば処置を包含するこ
とができる。
かでも、焼痂の不存在、軟化または溶解；生存能力のあ
る組織の成分の非加水分解；および／または創傷の非刺
激により、有効性を決定する。局所的創傷の治癒のため
に、他の指示なかでも、創傷の拘縮、治癒速度の増加お
よび／または治癒の改良（すなわち、触覚の刺激に対す
る反応の維持、瘢痕の低下、血管化の改良など）によ
り、有効性を決定する。本発明のプロテアーゼの創傷の
治癒の性質は、局所的応用にのみ限定されない。創傷の
治癒の性質は、外科的創傷または他の創傷により引き起
こされる癒着の防止および可能ならば処置を包含するこ
とができる。
【００２５】前述したように、癒着は、手術または他の
外傷後、通常腹において、最初に線維の形成を発現す
る、フィブリンおよびコラーゲンの束である。大部分の
癒着は臨床的名病的状態を生じないが、小腸の閉塞およ
び不妊の原因としての役割はよく認識されている。
外傷後、通常腹において、最初に線維の形成を発現す
る、フィブリンおよびコラーゲンの束である。大部分の
癒着は臨床的名病的状態を生じないが、小腸の閉塞およ
び不妊の原因としての役割はよく認識されている。
【００２６】実験のモデルにおいて、癒着は熱的または
機械的外傷、虚血、炎症または異質物質により誘発され
ることがある。癒着の形成の減少における本発明のプロ
テアーゼの有効性を決定するための、よく知られている
モデルは、ウサギの子宮角のモデルである［ドッディ
（Ｄｏｏｄｙ）ら、ファーティル・アンド・ステリル
（Ｆｅｒｔｉｌ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌ）（１９８９）
５１：５０９−５１２］。有効性は、このモデルにおい
て、対照に比較した癒着の量の減少および／または癒着
密度の減少により決定する。
機械的外傷、虚血、炎症または異質物質により誘発され
ることがある。癒着の形成の減少における本発明のプロ
テアーゼの有効性を決定するための、よく知られている
モデルは、ウサギの子宮角のモデルである［ドッディ
（Ｄｏｏｄｙ）ら、ファーティル・アンド・ステリル
（Ｆｅｒｔｉｌ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌ）（１９８９）
５１：５０９−５１２］。有効性は、このモデルにおい
て、対照に比較した癒着の量の減少および／または癒着
密度の減少により決定する。
【００２７】プロテアーゼの調製物 本発明のプロテアーゼは栄養培地中の適当なビブリオ属
（Ｖｉｂｒｉｏ）の種の発酵により産生し、次いで生ず
るブロスからプロテアーゼを回収する。発酵は好気的
に、例えば、無機塩類、例えば、食塩、硫酸ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムおよびあ
る種の微量元素を含有する、カリウム加水分解物、ＮＺ
−アミンＢ、または大豆粉末栄養培地中で、ｐＨ約７．
６〜８．６、好ましくは約７．８、および約２５〜３０
℃、例えば、約２７℃において、培養物が早期の定常期
の生長に到達するまで、実施する。
（Ｖｉｂｒｉｏ）の種の発酵により産生し、次いで生ず
るブロスからプロテアーゼを回収する。発酵は好気的
に、例えば、無機塩類、例えば、食塩、硫酸ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムおよびあ
る種の微量元素を含有する、カリウム加水分解物、ＮＺ
−アミンＢ、または大豆粉末栄養培地中で、ｐＨ約７．
６〜８．６、好ましくは約７．８、および約２５〜３０
℃、例えば、約２７℃において、培養物が早期の定常期
の生長に到達するまで、実施する。
【００２８】その後、酵素を発酵ブロスから普通の手順
により回収することができる。典型的には、ブロスをま
ず遠心または濾過して細胞部分および不溶性物質を分離
する。その後、上澄み液を、例えば、限外濾過により濃
縮する。生ずる限外濾過物質は、そまま使用するか、あ
るいは有機溶媒、例えば、アセトンまたは無機塩、例え
ば、硫酸アンモニウムにより沈澱させ、次いで遠心、イ
オン交換クロマトグラフィーまたは濾過により、壊死組
織除去の組成物において有用な酵素を分離することがで
きる。他の手順、例えば、当業者にとって日常の手順
を、また、使用して、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）の有
機体を培養し、そしてそれから本発明のプロテアーゼを
回収することができる。
により回収することができる。典型的には、ブロスをま
ず遠心または濾過して細胞部分および不溶性物質を分離
する。その後、上澄み液を、例えば、限外濾過により濃
縮する。生ずる限外濾過物質は、そまま使用するか、あ
るいは有機溶媒、例えば、アセトンまたは無機塩、例え
ば、硫酸アンモニウムにより沈澱させ、次いで遠心、イ
オン交換クロマトグラフィーまたは濾過により、壊死組
織除去の組成物において有用な酵素を分離することがで
きる。他の手順、例えば、当業者にとって日常の手順
を、また、使用して、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）の有
機体を培養し、そしてそれから本発明のプロテアーゼを
回収することができる。
【００２９】本発明のプロテアーゼ源として使用するた
めに有用な微生物は、任意の適当なビブリオ属（Ｖｉｂ
ｒｉｏ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、シュ
ードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア属
（Ｓｅｒｒａｔｉａ）またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）または上の性質を有するプロテアーゼを分泌する
他のウサギの微生物種からなることができる。この目的
にとくに好ましい微生物は、ビブリオ・プロテオリチク
ス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（Ａ
ＴＣＣ ５３５５９）である。この微生物の生存能力の
ある培養物は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、米国
マリイランド州２０８５２ロックビレ１２３０１）に最
終的に受託され、際限なく入手可能であり、そしてこの
出願人のＷ．Ｒ．グレイス・アンド・カンパニー（Ｇｒ
ａｃｅ ＆ Ｃｏ．−Ｃｏｎｎ．）は、この出願が許可
されたとき、ＡＴＣＣを通じてこの培養物の永久的な入
手可能性を保証する。ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖ
ｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ
５３５５９）により分泌されるプロテアーゼ、ここで
ビブリオリシンと呼ぶ、のＤＮＡ配列を図１に記載す
る。ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒ
ｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ ５３５５９）は
好ましいプロテアーゼ源からなるが、有用なビブリオ属
（Ｖｉｂｒｉｏ）の微生物の他の源は当業者によりそれ
により産生されるプロテアーゼを前述の手順を使用して
容易に同定することができる。ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）種の直接の培養に加えて、本発明のプロテアーゼ
は、また、本発明のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）誘導プ
ロテアーゼのための構造遺伝子を含有するインサートを
もつ適当な発現ベクターで形質転換またはトランスフェ
クションされた、組み換え宿主細胞を培養することによ
って調製することができる。このような手順は、例え
ば、プロテアーゼの収量を野生型ビブリオ属（Ｖｉｂｒ
ｉｏ）有機体で得られるそれより増加するために、ある
いは改良された突然変異のプロテアーゼを産生するため
に、望ましいことがある。
めに有用な微生物は、任意の適当なビブリオ属（Ｖｉｂ
ｒｉｏ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、シュ
ードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア属
（Ｓｅｒｒａｔｉａ）またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）または上の性質を有するプロテアーゼを分泌する
他のウサギの微生物種からなることができる。この目的
にとくに好ましい微生物は、ビブリオ・プロテオリチク
ス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（Ａ
ＴＣＣ ５３５５９）である。この微生物の生存能力の
ある培養物は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、米国
マリイランド州２０８５２ロックビレ１２３０１）に最
終的に受託され、際限なく入手可能であり、そしてこの
出願人のＷ．Ｒ．グレイス・アンド・カンパニー（Ｇｒ
ａｃｅ ＆ Ｃｏ．−Ｃｏｎｎ．）は、この出願が許可
されたとき、ＡＴＣＣを通じてこの培養物の永久的な入
手可能性を保証する。ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖ
ｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ
５３５５９）により分泌されるプロテアーゼ、ここで
ビブリオリシンと呼ぶ、のＤＮＡ配列を図１に記載す
る。ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒ
ｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ ５３５５９）は
好ましいプロテアーゼ源からなるが、有用なビブリオ属
（Ｖｉｂｒｉｏ）の微生物の他の源は当業者によりそれ
により産生されるプロテアーゼを前述の手順を使用して
容易に同定することができる。ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）種の直接の培養に加えて、本発明のプロテアーゼ
は、また、本発明のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）誘導プ
ロテアーゼのための構造遺伝子を含有するインサートを
もつ適当な発現ベクターで形質転換またはトランスフェ
クションされた、組み換え宿主細胞を培養することによ
って調製することができる。このような手順は、例え
ば、プロテアーゼの収量を野生型ビブリオ属（Ｖｉｂｒ
ｉｏ）有機体で得られるそれより増加するために、ある
いは改良された突然変異のプロテアーゼを産生するため
に、望ましいことがある。
【００３０】プロテアーゼのクローニングの技術は組み
換えＤＮＡ技術の分野においてよく知られており、そし
て任意の適当なクローニング手順を本発明のプロテアー
ゼの調製に使用することができる。このような手順は、
例えば、次の文献に記載されている：米国特許第４，４
６８，４６４号；欧州公開特許出願第０，１３０，７５
６号；ＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ８７／０４４６１号；
およびロフラー（Ｌｏｆｆｌｅｒ）、フッド・テクノロ
ジー（Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ．６４−
７０（１９８６年１月）；それらの全体をここに引用に
よって加える。本発明のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）プ
ロテアーゼをクローニングするとくに好ましい手順は、
この出願人の米国特許第４，９６６，８４６号に記載さ
れており、その開示をここに引用によって加える。この
特許の手順に従い、前述のアッセイにより本発明のプロ
テアーゼを合成することが決定された、ビブリオ属（Ｖ
ｉｂｒｉｏ）源の細胞のＤＮＡを使用して、遺伝子のラ
イブラリーをまず調製する。染色体のＤＮＡをビブリオ
属（Ｖｉｂｒｉｏ）源の細胞から抽出し、そして既知の
手順により制限酵素で消化して、ＤＮＡを大きい断片に
切断する。Ｓａｕ３Ａを使用する部分的消化は好ましい
が、他の制限酵素（例えば、ＭｂｏＩ、ＢｓｍＩなど）
を使用することができる。次いで、ＤＮＡ断片をプロテ
アーゼ酵素を発現するクローンの分離を可能とするため
に適当なベクターの中に結合する。この目的に好ましい
ベクターは、ＢｓｍＩ消化したＥ．ｃｏｌｉのコスミド
ベクターｐＨＣ７９［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｉｅｓ）］である。次いで、組み換えベクター
（すなわち、プロテアーゼ含有ゲノムからのＤＮＡ断片
を含有するｐＨＣ７９コスミド）をバクテリオファージ
粒子、好ましくはバクテリオファージラムダの中にパッ
ケージングし、これによりバクテリオファージラムダ粒
子において遺伝子のライブラリーを産生する。バクテリ
オファージ中の遺伝子のライブラリーの産生のために、
コスミドのベクターまたはラムダのベクターを使用す
る。他の場合において、プラスミドのベクターを使用す
ることができる。
換えＤＮＡ技術の分野においてよく知られており、そし
て任意の適当なクローニング手順を本発明のプロテアー
ゼの調製に使用することができる。このような手順は、
例えば、次の文献に記載されている：米国特許第４，４
６８，４６４号；欧州公開特許出願第０，１３０，７５
６号；ＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ８７／０４４６１号；
およびロフラー（Ｌｏｆｆｌｅｒ）、フッド・テクノロ
ジー（Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ．６４−
７０（１９８６年１月）；それらの全体をここに引用に
よって加える。本発明のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）プ
ロテアーゼをクローニングするとくに好ましい手順は、
この出願人の米国特許第４，９６６，８４６号に記載さ
れており、その開示をここに引用によって加える。この
特許の手順に従い、前述のアッセイにより本発明のプロ
テアーゼを合成することが決定された、ビブリオ属（Ｖ
ｉｂｒｉｏ）源の細胞のＤＮＡを使用して、遺伝子のラ
イブラリーをまず調製する。染色体のＤＮＡをビブリオ
属（Ｖｉｂｒｉｏ）源の細胞から抽出し、そして既知の
手順により制限酵素で消化して、ＤＮＡを大きい断片に
切断する。Ｓａｕ３Ａを使用する部分的消化は好ましい
が、他の制限酵素（例えば、ＭｂｏＩ、ＢｓｍＩなど）
を使用することができる。次いで、ＤＮＡ断片をプロテ
アーゼ酵素を発現するクローンの分離を可能とするため
に適当なベクターの中に結合する。この目的に好ましい
ベクターは、ＢｓｍＩ消化したＥ．ｃｏｌｉのコスミド
ベクターｐＨＣ７９［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｉｅｓ）］である。次いで、組み換えベクター
（すなわち、プロテアーゼ含有ゲノムからのＤＮＡ断片
を含有するｐＨＣ７９コスミド）をバクテリオファージ
粒子、好ましくはバクテリオファージラムダの中にパッ
ケージングし、これによりバクテリオファージラムダ粒
子において遺伝子のライブラリーを産生する。バクテリ
オファージ中の遺伝子のライブラリーの産生のために、
コスミドのベクターまたはラムダのベクターを使用す
る。他の場合において、プラスミドのベクターを使用す
ることができる。
【００３１】次いで、生ずるバクテリオファージ粒子を
使用して、遺伝子ライブラリーのＤＮＡ断片を適当なグ
ラム陰性宿主細胞の中に挿入する。好ましくは、組み換
えバクテリオファージ粒子を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ、
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１をトランセクション
する（ｔｒａｎｓｅｃｔ）が、必要に応じてＥ．ｃｏｌ
ｉの他の株を使用するすることができる。Ｅ．ｃｏｌｉ
株は細胞外の中性のプロテアーゼ酵素を自然に合成しな
いので、Ｅ．ｃｏｌｉのクローンは下に記載するアッセ
イによりプロテアーゼの存在および発現について評価す
ることができる。
使用して、遺伝子ライブラリーのＤＮＡ断片を適当なグ
ラム陰性宿主細胞の中に挿入する。好ましくは、組み換
えバクテリオファージ粒子を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ、
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１をトランセクション
する（ｔｒａｎｓｅｃｔ）が、必要に応じてＥ．ｃｏｌ
ｉの他の株を使用するすることができる。Ｅ．ｃｏｌｉ
株は細胞外の中性のプロテアーゼ酵素を自然に合成しな
いので、Ｅ．ｃｏｌｉのクローンは下に記載するアッセ
イによりプロテアーゼの存在および発現について評価す
ることができる。
【００３２】プロテアーゼ酵素を合成するビブリオ属
（Ｖｉｂｒｉｏ）のコロニーは、ミルクのカゼイン成分
のタンパク質分解の加水分解のために、ミルクの寒天プ
レート上で透明なゾーンを生成するであろうことが知ら
れている。非組み換えＥ．ｃｏｌｉのコロニーはプロテ
アーゼを自然に分泌しない。こうして、プロテアーゼ遺
伝子を含有する本発明のＥ．ｃｏｌｉのクローンは、し
たがって、このアッセイにより同定される。このミルク
の透明化アッセイはＥ．ｃｏｌｉおよび細胞外プロテア
ーゼを自然に産生しない他の宿主株とともに使用するた
めに好ましい。他のグラム陰性およびグラム陽性の株を
宿主として使用することができる。
（Ｖｉｂｒｉｏ）のコロニーは、ミルクのカゼイン成分
のタンパク質分解の加水分解のために、ミルクの寒天プ
レート上で透明なゾーンを生成するであろうことが知ら
れている。非組み換えＥ．ｃｏｌｉのコロニーはプロテ
アーゼを自然に分泌しない。こうして、プロテアーゼ遺
伝子を含有する本発明のＥ．ｃｏｌｉのクローンは、し
たがって、このアッセイにより同定される。このミルク
の透明化アッセイはＥ．ｃｏｌｉおよび細胞外プロテア
ーゼを自然に産生しない他の宿主株とともに使用するた
めに好ましい。他のグラム陰性およびグラム陽性の株を
宿主として使用することができる。
【００３３】他のプロテアーゼアッセイを使用すること
によって、確証をなすことができる。例えば、これらの
クローンの発酵ブロスが基質、例えば、ハイド（Ｈｉｄ
ｅ）粉末のアジュアー（ａｚｕｒｅ）、アゾコール（ａ
ｚｏｃｏｌｌ）またはＮ−［３−（２−フリル）アクロ
イル］−アラニル−フェニルアラニアミド（ＦＡＡＰ
Ａ）を加水分解できることを実証することによって、ク
ローンをプロテアーゼ酵素の発現について確証すること
ができる。あるいは、これらのアッセイは第１の場合に
おいて使用して、プロテアーゼ遺伝子を含有するクロー
ンを同定することができる。
によって、確証をなすことができる。例えば、これらの
クローンの発酵ブロスが基質、例えば、ハイド（Ｈｉｄ
ｅ）粉末のアジュアー（ａｚｕｒｅ）、アゾコール（ａ
ｚｏｃｏｌｌ）またはＮ−［３−（２−フリル）アクロ
イル］−アラニル−フェニルアラニアミド（ＦＡＡＰ
Ａ）を加水分解できることを実証することによって、ク
ローンをプロテアーゼ酵素の発現について確証すること
ができる。あるいは、これらのアッセイは第１の場合に
おいて使用して、プロテアーゼ遺伝子を含有するクロー
ンを同定することができる。
【００３４】２つの面において、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他
の「非分泌性」宿主（すなわち、プロテアーゼを自然に
分泌しない宿主）中の中性のプロテアーゼ遺伝子の発現
をミルク寒天プレート上の透明化（ｃｌｅａｒｉｎｇ）
ゾーンとして検出できることは意味がある。第１に、こ
れは活性な機能的酵素がグラム陰性宿主により合成され
ていることの証拠である。第２に、ミルク寒天プレート
上のプロテアーゼの細胞外の存在は、ある方法で、分泌
または細胞溶菌により、具体化されている証拠である。
Ｅ．ｃｏｌｉおよびある他の遺伝子バクテリアは通常有
意の量のプロテアーゼを培地の中に分泌しないので、こ
れはこれらの非分泌性宿主中のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）プロテアーゼ遺伝子の発現の結果として産生された
プロテアーゼ酵素を回収する能力により重要である。
の「非分泌性」宿主（すなわち、プロテアーゼを自然に
分泌しない宿主）中の中性のプロテアーゼ遺伝子の発現
をミルク寒天プレート上の透明化（ｃｌｅａｒｉｎｇ）
ゾーンとして検出できることは意味がある。第１に、こ
れは活性な機能的酵素がグラム陰性宿主により合成され
ていることの証拠である。第２に、ミルク寒天プレート
上のプロテアーゼの細胞外の存在は、ある方法で、分泌
または細胞溶菌により、具体化されている証拠である。
Ｅ．ｃｏｌｉおよびある他の遺伝子バクテリアは通常有
意の量のプロテアーゼを培地の中に分泌しないので、こ
れはこれらの非分泌性宿主中のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）プロテアーゼ遺伝子の発現の結果として産生された
プロテアーゼ酵素を回収する能力により重要である。
【００３５】また、好ましい性能特性を実質的に保持す
る前述のプロテアーゼの突然変異およびハイブリッドを
ここで使用されると考えられる。ここで使用するとき、
用語「突然変異」は、野生型または親の酵素と比較した
ときアミノ酸配列の中に変化が存在するプロテアーゼを
呼ぶ。「ハイブリッド」は、２またはそれ以上の親の酵
素からのアミノ酸配列を組み合わせ、そして両者に共通
する特性を示す、遺伝子操作したプロテアーゼを呼ぶ。
る前述のプロテアーゼの突然変異およびハイブリッドを
ここで使用されると考えられる。ここで使用するとき、
用語「突然変異」は、野生型または親の酵素と比較した
ときアミノ酸配列の中に変化が存在するプロテアーゼを
呼ぶ。「ハイブリッド」は、２またはそれ以上の親の酵
素からのアミノ酸配列を組み合わせ、そして両者に共通
する特性を示す、遺伝子操作したプロテアーゼを呼ぶ。
【００３６】突然変異のプロテアーゼの調製の技術は、
当業者によく知られており、そして微生物の輻射線また
は化学物質への暴露および部位特異的突然変異を包含す
る。輻射線または化学物質による突然変異誘発は、本質
的に不規則なプロセスであり、そして所望の特性を有す
る酵素を産生する微生物を同定するための面倒な選択お
よびスクリーニングを必要とすることがある。こうし
て、本発明の目的に好ましい突然変異の酵素は、部位特
異的突然変異により調製される。この手順は、前以て決
定した部位における少なくとも１つのアミノ酸の置換、
欠失および／または挿入がプロテアーゼ酵素中で産生さ
れるような、酵素の遺伝子の修飾を包含する。部位特異
的突然変異の技術は、当業者によく知られており、そし
て、例えば、特許出願に記載されている：欧州公開特許
出願第０，１３０，７５６号およびＰＣＴ公開特許出願
第ＷＯ８７／０４４６１号、それらの開示をここに引用
によって加える。
当業者によく知られており、そして微生物の輻射線また
は化学物質への暴露および部位特異的突然変異を包含す
る。輻射線または化学物質による突然変異誘発は、本質
的に不規則なプロセスであり、そして所望の特性を有す
る酵素を産生する微生物を同定するための面倒な選択お
よびスクリーニングを必要とすることがある。こうし
て、本発明の目的に好ましい突然変異の酵素は、部位特
異的突然変異により調製される。この手順は、前以て決
定した部位における少なくとも１つのアミノ酸の置換、
欠失および／または挿入がプロテアーゼ酵素中で産生さ
れるような、酵素の遺伝子の修飾を包含する。部位特異
的突然変異の技術は、当業者によく知られており、そし
て、例えば、特許出願に記載されている：欧州公開特許
出願第０，１３０，７５６号およびＰＣＴ公開特許出願
第ＷＯ８７／０４４６１号、それらの開示をここに引用
によって加える。
【００３７】カセット突然変異誘発として知られてい
る、１つのこのような手順において、サイレント制限部
位をプロテアーゼ遺伝子中に導入し標的の１または２以
上のコドンを密接にフランキングする。次いで、二本鎖
の合成オリゴヌクレオチドのカセットを制限部位の間の
ギャップの中に結合する。カセットを操作してギャップ
中の解読配列を回復し、そして標的コドンにおいて変更
したコドンを導入する。親のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）プロテアーゼについてのこのような手順を使用する
ことは、野生型または親のプロテアーゼの性質を改良す
るために望ましいであろう。例えば、プロテアーゼの活
性部位におけるまたはその付近におけるメチオニン、ヒ
スチジン、システインまたはトリプトファン残基を、エ
ステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、Ｖｏｌ．２６０、Ｎｏ．１１、ｐ．２５１８−
２５２１（１９８５）が示唆するように、置換して化学
的酸化に対する安定性を改良することができる。
る、１つのこのような手順において、サイレント制限部
位をプロテアーゼ遺伝子中に導入し標的の１または２以
上のコドンを密接にフランキングする。次いで、二本鎖
の合成オリゴヌクレオチドのカセットを制限部位の間の
ギャップの中に結合する。カセットを操作してギャップ
中の解読配列を回復し、そして標的コドンにおいて変更
したコドンを導入する。親のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）プロテアーゼについてのこのような手順を使用する
ことは、野生型または親のプロテアーゼの性質を改良す
るために望ましいであろう。例えば、プロテアーゼの活
性部位におけるまたはその付近におけるメチオニン、ヒ
スチジン、システインまたはトリプトファン残基を、エ
ステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、Ｖｏｌ．２６０、Ｎｏ．１１、ｐ．２５１８−
２５２１（１９８５）が示唆するように、置換して化学
的酸化に対する安定性を改良することができる。
【００３８】親または野生型のプロテアーゼのハイブリ
ッドは、前述のカセット突然変異誘発手順に類似する既
知のタンパク質操作手順により、１つの親酵素の遺伝子
のある領域［これはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）から誘
導することは必要ではない］を第２親酵素の遺伝子の中
に結合することによって、同様に調製することができ
る。
ッドは、前述のカセット突然変異誘発手順に類似する既
知のタンパク質操作手順により、１つの親酵素の遺伝子
のある領域［これはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）から誘
導することは必要ではない］を第２親酵素の遺伝子の中
に結合することによって、同様に調製することができ
る。
【００３９】配合および投与 入手可能な賦形剤および担体を使用して壊死組織除去の
プロテアーゼの配合物は、当業者に知られている標準の
方法により調製される。プロテアーゼは、軟膏、ローシ
ョン、ゲル、泥膏、フォーム、エアゾールに配合する
か、あるいはビーズ上に固定化することができる。プロ
テアーゼは、また、創傷の包帯、テープまたはガーゼ中
に固定化することができる。酵素の配合物は親水性また
は疎水性であることができる。疎水性基剤の例はパラフ
ィン−鉱油を包含し、そして親水性基剤はペトロラタム
−プロピレン水基剤を包含する。親水性配合物は、とく
に酵素が室温における貯蔵の間に配合物中で安定である
場合、好ましい。好ましさの理由は、創傷に投与する前
に、調製の温度を上昇させる必要でないことを包含す
る。より重要なことには、親水性軟膏中の酵素は壊死の
組織の加水分解のためにより許容されるべきであり、そ
して疎水性基剤と対照的に、軟膏は生理的塩類溶液によ
り創傷から容易に除去することができる。追加の活性成
分、例えば、抗生物質、保湿剤、デオキシリボヌクレア
ーゼ、フィブロネクチン、成長因子、例えば、線維芽生
長（ＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長
因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１お
よびＩＧＦ−２）、および／または血小板誘導成長因子
（ＰＤＧＦ）などを、必要に応じて、配合物の中に含め
ることができる。
プロテアーゼの配合物は、当業者に知られている標準の
方法により調製される。プロテアーゼは、軟膏、ローシ
ョン、ゲル、泥膏、フォーム、エアゾールに配合する
か、あるいはビーズ上に固定化することができる。プロ
テアーゼは、また、創傷の包帯、テープまたはガーゼ中
に固定化することができる。酵素の配合物は親水性また
は疎水性であることができる。疎水性基剤の例はパラフ
ィン−鉱油を包含し、そして親水性基剤はペトロラタム
−プロピレン水基剤を包含する。親水性配合物は、とく
に酵素が室温における貯蔵の間に配合物中で安定である
場合、好ましい。好ましさの理由は、創傷に投与する前
に、調製の温度を上昇させる必要でないことを包含す
る。より重要なことには、親水性軟膏中の酵素は壊死の
組織の加水分解のためにより許容されるべきであり、そ
して疎水性基剤と対照的に、軟膏は生理的塩類溶液によ
り創傷から容易に除去することができる。追加の活性成
分、例えば、抗生物質、保湿剤、デオキシリボヌクレア
ーゼ、フィブロネクチン、成長因子、例えば、線維芽生
長（ＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長
因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１お
よびＩＧＦ−２）、および／または血小板誘導成長因子
（ＰＤＧＦ）などを、必要に応じて、配合物の中に含め
ることができる。
【００４０】局所的投与は創傷の壊死組織除去に最も適
当であるが、投与の他の道筋はある種の条件下に望まし
いことがある。標準の配合物は、例えば、０．０１〜１
０重量％のプロテアーゼを使用して用いられる。このよ
うな配合物は、１〜６回／日で影響を受けた領域に適用
される。軟膏または他の配合物の適用および濃度は、も
ちろん、創傷のひどさおよびタイプおよび被検体の性質
に依存する。
当であるが、投与の他の道筋はある種の条件下に望まし
いことがある。標準の配合物は、例えば、０．０１〜１
０重量％のプロテアーゼを使用して用いられる。このよ
うな配合物は、１〜６回／日で影響を受けた領域に適用
される。軟膏または他の配合物の適用および濃度は、も
ちろん、創傷のひどさおよびタイプおよび被検体の性質
に依存する。
【００４１】局所的投与は、また、外傷を受けた組織の
血管化および治癒を刺激するために適当である。基質は
熱傷、骨の破損、外科的剥離、例えば、形成外科のも
の、切断、裂傷、とこずれ、治癒が遅い潰瘍、腱炎、滑
液包炎、膣炎、子宮頸炎、環状切除、会陰切開、毛巣嚢
胞の創傷、カルブンケル、日焼け、凍傷。
血管化および治癒を刺激するために適当である。基質は
熱傷、骨の破損、外科的剥離、例えば、形成外科のも
の、切断、裂傷、とこずれ、治癒が遅い潰瘍、腱炎、滑
液包炎、膣炎、子宮頸炎、環状切除、会陰切開、毛巣嚢
胞の創傷、カルブンケル、日焼け、凍傷。
【００４２】局所的、または可能ならば全身的投与は、
外科的または他の創傷により引き起こされる癒着の防
止、または可能ならば処置に適当である。局所的投与
は、注射、皮下の移植または標的に直接近接して移植し
た解放が遅い配合物によることができる。移植は、こと
に外科的条件下に、直接実施される。解放が遅い形態
は、当業者の範囲内であるように、ポリマーの中に配合
することができる。配合物中のプロテアーゼの濃度は、
ある数の因子、例えば、状態のひどさおよびポリマーか
らのプロテアーゼの解放速度に依存する。
外科的または他の創傷により引き起こされる癒着の防
止、または可能ならば処置に適当である。局所的投与
は、注射、皮下の移植または標的に直接近接して移植し
た解放が遅い配合物によることができる。移植は、こと
に外科的条件下に、直接実施される。解放が遅い形態
は、当業者の範囲内であるように、ポリマーの中に配合
することができる。配合物中のプロテアーゼの濃度は、
ある数の因子、例えば、状態のひどさおよびポリマーか
らのプロテアーゼの解放速度に依存する。
【００４３】次の略号を本発明の説明を通じて使用し
た： ＨＢＯ3 − ホウ酸 ＣａＣｌ2 − 塩化カルシウム ＣａＳＯ4 − 硫酸カルシウム ｃｍ − センチメートル ＣｕＳＯ4 − 硫酸銅 ℃ − セ氏度 ｇ − グラム Ｉ．Ｍ． − 筋肉内 キロ塩基 − キロ塩基対 ＭｇＳＯ４ − 硫酸マグネシウム ＭｎＣｌ2 − 塩化マグネシウム ｍｇ − ミリグラム ｍｌ − ミリリットル ｍｍ − ミリメートル ｍＭ − ミリモル Ｍ − モル ｍＳ − ミリシーメン（ｍｉｌｌｉ ｓｅｍ
ｅｎ） ｎｍ − ナノメートル Ｏ．Ｄ． − 光学密度 ％ − パーセント Ｋ2ＨＰＯ4 − リン酸カリウム ＮａＯＨ − 水酸化ナトリウム Ｎａ2ＭｏＯ３− モリブデン酸ナトリウム Ｎａ２ＳＯ４ − 硫酸ナトリウム Ｈ2Ｏ − 水 ｗ／ｖ − 水対体積 ＺｎＳＯ4 − 硫酸亜鉛
た： ＨＢＯ3 − ホウ酸 ＣａＣｌ2 − 塩化カルシウム ＣａＳＯ4 − 硫酸カルシウム ｃｍ − センチメートル ＣｕＳＯ4 − 硫酸銅 ℃ − セ氏度 ｇ − グラム Ｉ．Ｍ． − 筋肉内 キロ塩基 − キロ塩基対 ＭｇＳＯ４ − 硫酸マグネシウム ＭｎＣｌ2 − 塩化マグネシウム ｍｇ − ミリグラム ｍｌ − ミリリットル ｍｍ − ミリメートル ｍＭ − ミリモル Ｍ − モル ｍＳ − ミリシーメン（ｍｉｌｌｉ ｓｅｍ
ｅｎ） ｎｍ − ナノメートル Ｏ．Ｄ． − 光学密度 ％ − パーセント Ｋ2ＨＰＯ4 − リン酸カリウム ＮａＯＨ − 水酸化ナトリウム Ｎａ2ＭｏＯ３− モリブデン酸ナトリウム Ｎａ２ＳＯ４ − 硫酸ナトリウム Ｈ2Ｏ − 水 ｗ／ｖ − 水対体積 ＺｎＳＯ4 − 硫酸亜鉛
【００４４】
【実施例】次の実施例は本発明の実施を特別に例示する
が、これらの実施例は本発明を限定しない。
が、これらの実施例は本発明を限定しない。
【００４５】実施例１ ビブリオリシンの調製 ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔ
ｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ ５３５５９を、次の組
成（ｇまたはｍｌ／リットル）をもつ培地中で培養し
た：ＮＺ−アミンＢ、４０；Ｎａ２ＳＯ４、２５；テキ
トロース１０；Ｋ2ＨＰＯ4、４；ＭｇＳＯ４・７Ｈ
2Ｏ、０．４；ダラスチル（Ｄａｒａｓｔｉｌ）−８２
７０［デアルボーン（Ｄｅａｒｂｏｒｎ）、０．１ｍｌ
および６．１ｍｌの微量元素の溶液。微量元素の溶液
は、次のものからなる（ｇ／ｌ）：ＺｎＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ、１８．２９；ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１８．８６；
ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．９１ｇ；ＨＢＯ3、０．０
７；およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ2Ｏ、０．０４。滅菌
の前に、ｐＨを７．０に調節した。
ｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ ５３５５９を、次の組
成（ｇまたはｍｌ／リットル）をもつ培地中で培養し
た：ＮＺ−アミンＢ、４０；Ｎａ２ＳＯ４、２５；テキ
トロース１０；Ｋ2ＨＰＯ4、４；ＭｇＳＯ４・７Ｈ
2Ｏ、０．４；ダラスチル（Ｄａｒａｓｔｉｌ）−８２
７０［デアルボーン（Ｄｅａｒｂｏｒｎ）、０．１ｍｌ
および６．１ｍｌの微量元素の溶液。微量元素の溶液
は、次のものからなる（ｇ／ｌ）：ＺｎＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ、１８．２９；ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、１８．８６；
ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．９１ｇ；ＨＢＯ3、０．０
７；およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ2Ｏ、０．０４。滅菌
の前に、ｐＨを７．０に調節した。
【００４６】ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、１．５または１
０リットル中で培養した。前述の培地を含有する発酵槽
を、同一組成の培地を含有する震盪フラスコ内でビブリ
オ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌ
ｙｔｉｃｕｓ）を成長させることによって得られた１％
（ｖ／ｖ）培養物とともに２０時間インキュベーション
した。発酵は２８℃、１，０００〜１，２５０ｒｐｍお
よび１．０体積の空気／体積の培地／分の通気で実施し
た。発酵のｐＨは、酸および塩基の滴定物の自動的添加
によりｐＨ７．８に維持した。
ｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、１．５または１
０リットル中で培養した。前述の培地を含有する発酵槽
を、同一組成の培地を含有する震盪フラスコ内でビブリ
オ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌ
ｙｔｉｃｕｓ）を成長させることによって得られた１％
（ｖ／ｖ）培養物とともに２０時間インキュベーション
した。発酵は２８℃、１，０００〜１，２５０ｒｐｍお
よび１．０体積の空気／体積の培地／分の通気で実施し
た。発酵のｐＨは、酸および塩基の滴定物の自動的添加
によりｐＨ７．８に維持した。
【００４７】ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の成長を６４０ｎｍ
において光学密度を測定することによって監視し、そし
てプロテアーゼ活性を前述のアゾカゼインのアッセイに
より監視した。発酵の早期の定常期の間に、産生物のプ
ロテアーゼは、前述のアゾカゼインのアッセイにより測
定して、ほぼ８５，２００〜１２７，８００アゾカゼイ
ン単位／リットルの力価に到達する。このブロスを遠心
により収穫して細胞部分を分離した。
ｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の成長を６４０ｎｍ
において光学密度を測定することによって監視し、そし
てプロテアーゼ活性を前述のアゾカゼインのアッセイに
より監視した。発酵の早期の定常期の間に、産生物のプ
ロテアーゼは、前述のアゾカゼインのアッセイにより測
定して、ほぼ８５，２００〜１２７，８００アゾカゼイ
ン単位／リットルの力価に到達する。このブロスを遠心
により収穫して細胞部分を分離した。
【００４８】タンパク質分解活性を含有する上澄み液
を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｓ１０Ｙ１０らせん状に
巻いたフィルター［アミコン・コーポレーション（Ａｍ
ｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．）、マサチュセッツ州レキシント
ン］を使用して濃縮した。レンテンテイト（ｒｅｎｔｅ
ｎｔａｔｅ）の導電性がほぼ１ｍＳでありかつｐＨが中
性となるまで、濃縮物を１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する
１０ｍＭのトリス緩衝液で透析濾過した。この物質を凍
結乾燥し、そして使用するまで−２０℃で貯蔵するか、
あるいは軟膏に配合した。
を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｓ１０Ｙ１０らせん状に
巻いたフィルター［アミコン・コーポレーション（Ａｍ
ｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．）、マサチュセッツ州レキシント
ン］を使用して濃縮した。レンテンテイト（ｒｅｎｔｅ
ｎｔａｔｅ）の導電性がほぼ１ｍＳでありかつｐＨが中
性となるまで、濃縮物を１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する
１０ｍＭのトリス緩衝液で透析濾過した。この物質を凍
結乾燥し、そして使用するまで−２０℃で貯蔵するか、
あるいは軟膏に配合した。
【００４９】実施例２ フィブリンの加水分解 フィブリンは創傷の焼痂中に見いだされるタンパク質成
分であり、そして癒着の発生において見いだされる。フ
ィブリン溶解活性を測定するために、ヒト血漿フィブリ
ン［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］を、０．９％のＮａＣｌお
よび０．１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する１００ｍＭのＴ
ＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−ア
ミノエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．５）の１ｍｌ
当たり１０．０ｍｇのフィブリンを含有する反応器中
で、３７℃において加水分解した。試験酵素のビブリオ
リシンおよびトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）を反応溶液
を１０単位／ｍｌ（アゾカゼイン単位）の濃度に一定に
混合しながら添加した；コラゲナーゼ（０．１４ｍｇ／
ｍｌ、シグマ；ＶＩＩ型）を反応に添加した。試料を周
期的に取り出し、そして前述のニンヒドリンアッセイを
使用して遊離アミノ基についてアッセイした。
分であり、そして癒着の発生において見いだされる。フ
ィブリン溶解活性を測定するために、ヒト血漿フィブリ
ン［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］を、０．９％のＮａＣｌお
よび０．１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する１００ｍＭのＴ
ＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−ア
ミノエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．５）の１ｍｌ
当たり１０．０ｍｇのフィブリンを含有する反応器中
で、３７℃において加水分解した。試験酵素のビブリオ
リシンおよびトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）を反応溶液
を１０単位／ｍｌ（アゾカゼイン単位）の濃度に一定に
混合しながら添加した；コラゲナーゼ（０．１４ｍｇ／
ｍｌ、シグマ；ＶＩＩ型）を反応に添加した。試料を周
期的に取り出し、そして前述のニンヒドリンアッセイを
使用して遊離アミノ基についてアッセイした。
【００５０】ビブリオリシンによるヒトフィブリンの加
水分解速度は、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテア
ーゼを使用して観測された速度よりほぼ４倍速かった
（図２）。さらに、フィブリンの加水分解はより広範で
あった。１時間で、ビブリオリシンはフィブリン基質お
２６％を加水分解し、これに対してトラベイス（Ｔｒａ
ｖａｓｅ）プロテアーゼについては７．５％であった。
これらのデータは高度に有意である。なぜなら、トラベ
イス（Ｔｒａｖａｓｅ）は他の焼痂成分と比較してフィ
ブリンの加水分解に最も有効であると報告されているか
らである［シェイクスピア（Ｓｈａｋｅｓｐｅａｒ
ｅ）、Ｐ．Ｇ．ら、熱傷（Ｂｕｒｎｓ）（１９７９）、
６：１５−２０］。コラゲナーゼは、期待するように、
フィブリンの加水分解を示さなかった（図２）。
水分解速度は、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテア
ーゼを使用して観測された速度よりほぼ４倍速かった
（図２）。さらに、フィブリンの加水分解はより広範で
あった。１時間で、ビブリオリシンはフィブリン基質お
２６％を加水分解し、これに対してトラベイス（Ｔｒａ
ｖａｓｅ）プロテアーゼについては７．５％であった。
これらのデータは高度に有意である。なぜなら、トラベ
イス（Ｔｒａｖａｓｅ）は他の焼痂成分と比較してフィ
ブリンの加水分解に最も有効であると報告されているか
らである［シェイクスピア（Ｓｈａｋｅｓｐｅａｒ
ｅ）、Ｐ．Ｇ．ら、熱傷（Ｂｕｒｎｓ）（１９７９）、
６：１５−２０］。コラゲナーゼは、期待するように、
フィブリンの加水分解を示さなかった（図２）。
【００５１】実施例３ 変性したコラーゲンの加水分解 深い皮膚の熱傷または潰瘍に関連する焼痂は、生存能力
のある組織に結合した変性したコラーゲンから主として
成ることが示された。こうして、有効な壊死組織除去因
子は壊死の組織のコラーゲン成分を消化しなくてはなら
ない。コラーゲンの加水分解を評価するために、２つの
源のコラーゲンを使用した：ヒトの胎盤のコラーゲン
（シグマ、ＩＶ型）およびウシのアキレス腱のコラーゲ
ン［ワーチントン・バイオケミカルス（Ｗｏｒｔｈｉｎ
ｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。後者の基質を
１００℃に２分間加熱してコラーゲンを変性した。
のある組織に結合した変性したコラーゲンから主として
成ることが示された。こうして、有効な壊死組織除去因
子は壊死の組織のコラーゲン成分を消化しなくてはなら
ない。コラーゲンの加水分解を評価するために、２つの
源のコラーゲンを使用した：ヒトの胎盤のコラーゲン
（シグマ、ＩＶ型）およびウシのアキレス腱のコラーゲ
ン［ワーチントン・バイオケミカルス（Ｗｏｒｔｈｉｎ
ｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。後者の基質を
１００℃に２分間加熱してコラーゲンを変性した。
【００５２】ヒトの胎盤のコラーゲンの加水分解のため
に、反応混合物は０．１ｍＭのＣａＣｌ2を含有するト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の１ｍｌ当たり２．
０ｍｇのコラーゲンを含有した。１０アゾカゼイン単位
の各試験酵素を各反応混合物に添加し、３７℃において
予備平衡化した。コラゲナーゼ（０．１４ｍｇ／ｍｌ）
を、また、反応混合物に添加した。試料を周期的に取り
出し、そして遊離アミノ酸および小さいペプチドを前述
のニンヒドリンアッセイ手順により決定した。ビブリオ
リシンおよびトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）のプロテア
ーゼによるヒト胎盤コラーゲンの加水分解を図３に示
す。データが示すように、ビブリオリシンはトラベイス
（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテアーゼに比較してよりすぐれ
たコラーゲンの加水分解活性を示し、そしてコラゲナー
ゼに対する活性において匹敵する。
に、反応混合物は０．１ｍＭのＣａＣｌ2を含有するト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の１ｍｌ当たり２．
０ｍｇのコラーゲンを含有した。１０アゾカゼイン単位
の各試験酵素を各反応混合物に添加し、３７℃において
予備平衡化した。コラゲナーゼ（０．１４ｍｇ／ｍｌ）
を、また、反応混合物に添加した。試料を周期的に取り
出し、そして遊離アミノ酸および小さいペプチドを前述
のニンヒドリンアッセイ手順により決定した。ビブリオ
リシンおよびトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）のプロテア
ーゼによるヒト胎盤コラーゲンの加水分解を図３に示
す。データが示すように、ビブリオリシンはトラベイス
（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテアーゼに比較してよりすぐれ
たコラーゲンの加水分解活性を示し、そしてコラゲナー
ゼに対する活性において匹敵する。
【００５３】変性したアキレス腱のコラーゲンの加水分
解するために、反応混合物は０．９％のＮａＣｌおよび
０．１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する１００ｍＭのＴＥＳ
緩衝液（ｐＨ７．５）の１ｍｌ当たり１０ｍｇのコラー
ゲンを含有した。各プロテアーゼの１ｍｌ当たり５アゾ
カゼイン単位を、３７℃において予備インキュベーショ
ンした反応溶液に添加した；０．１ｍｇのワーチントン
コラゲナーゼ（ＣＬＳＩＩＩ）を、また、使用した。コ
ラーゲンの加水分解を、前述のニンヒドリンアッセイ手
順により、時間の関数として決定した。これらの結果を
表Ｉに要約する。
解するために、反応混合物は０．９％のＮａＣｌおよび
０．１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する１００ｍＭのＴＥＳ
緩衝液（ｐＨ７．５）の１ｍｌ当たり１０ｍｇのコラー
ゲンを含有した。各プロテアーゼの１ｍｌ当たり５アゾ
カゼイン単位を、３７℃において予備インキュベーショ
ンした反応溶液に添加した；０．１ｍｇのワーチントン
コラゲナーゼ（ＣＬＳＩＩＩ）を、また、使用した。コ
ラーゲンの加水分解を、前述のニンヒドリンアッセイ手
順により、時間の関数として決定した。これらの結果を
表Ｉに要約する。
【００５４】
【表１】 表Ｉ 次の時間（分）に遊離したロイシン（ｍＭ）の当量 酵素 0 20 45 60 120 ビブリオリシン 0 10.4 12.4 16.8 17.2 トラベイス 0 3.5 7.9 8.6 13.1 コラゲナーゼ 0 7.1 8.9 11.9 21.2 前述したように、ビブリオリシンはトラベイス（Ｔｒａ
ｖａｓｅ）プロテアーゼに比較してコラーゲンに対して
例外的な活性を示し、そしてコラーゲンの消化はコラゲ
ナーゼおよびビブリオリシンに匹敵した。本発明の酵素
は、頑強な活力を失った創傷組織を構成するコラーゲン
の線維を破壊するとき有効であるので、熱傷または潰瘍
の処置にいっそう適した治療剤である。
ｖａｓｅ）プロテアーゼに比較してコラーゲンに対して
例外的な活性を示し、そしてコラーゲンの消化はコラゲ
ナーゼおよびビブリオリシンに匹敵した。本発明の酵素
は、頑強な活力を失った創傷組織を構成するコラーゲン
の線維を破壊するとき有効であるので、熱傷または潰瘍
の処置にいっそう適した治療剤である。
【００５５】実施例４ エラスチンの加水分解 エラスチンはヒトの皮膚の小さい成分（３％）を表す。
この基質の加水分解は、０．９％のＮａＣｌおよび０．
１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する１００ｍＭのＴＥＳ緩衝
液（ｐＨ７．５）の１ｍｌ当たり６．６ｍｇのエラスチ
ン−コンゴレッド（シグマ）を含有する反応溶液を使用
して決定した。酵素（ビブリオリシンおよびトラベイ
ス）を、反応溶液（３７℃）に、５アゾカゼイン単位／
ｍｌの濃度に添加した；０．７５ｍｌの試料を周期的に
取り出し、０．５ｍｌの０．７Ｍのソレンソンス（Ｓｏ
ｒｅｎｓｏｎｓ）緩衝液（ｐＨ６．０）に添加し、そし
て直ちに遠心した。上澄み液の吸収を４９５ｎｍにおい
て測定した。
この基質の加水分解は、０．９％のＮａＣｌおよび０．
１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する１００ｍＭのＴＥＳ緩衝
液（ｐＨ７．５）の１ｍｌ当たり６．６ｍｇのエラスチ
ン−コンゴレッド（シグマ）を含有する反応溶液を使用
して決定した。酵素（ビブリオリシンおよびトラベイ
ス）を、反応溶液（３７℃）に、５アゾカゼイン単位／
ｍｌの濃度に添加した；０．７５ｍｌの試料を周期的に
取り出し、０．５ｍｌの０．７Ｍのソレンソンス（Ｓｏ
ｒｅｎｓｏｎｓ）緩衝液（ｐＨ６．０）に添加し、そし
て直ちに遠心した。上澄み液の吸収を４９５ｎｍにおい
て測定した。
【００５６】エラスチンの加水分解を図４に示す。再
び、ビブリオリシンは、等しい単位基準で、トラベイス
（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテアーゼよりわずかにすぐれて
壊死の組織のこの成分を加水分解する。
び、ビブリオリシンは、等しい単位基準で、トラベイス
（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテアーゼよりわずかにすぐれて
壊死の組織のこの成分を加水分解する。
【００５７】実施例５ 周囲温度における貯蔵寿命の安定性 疎水性および親水性の軟膏に配合したビブリオリシンに
ついての貯蔵寿命の安定性を、周囲温度（抗体２５℃）
において評価した。ビブリオリシンの粉末を、１，２０
０アゾカゼイン単位／ｇの基剤の濃度に、（１）パラフ
ィン−鉱油基剤（疎水性）および（２）ペトロラタム−
プロピレングリコール水基剤（親水性）の中に配合し
た。トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）を疎水性軟膏中に配
合されているので、１部のこの物質を１部の親水性軟膏
と混合して、ビブリオリシンの親水性条件を部分的にシ
ミュレーションすることを試みた。
ついての貯蔵寿命の安定性を、周囲温度（抗体２５℃）
において評価した。ビブリオリシンの粉末を、１，２０
０アゾカゼイン単位／ｇの基剤の濃度に、（１）パラフ
ィン−鉱油基剤（疎水性）および（２）ペトロラタム−
プロピレングリコール水基剤（親水性）の中に配合し
た。トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）を疎水性軟膏中に配
合されているので、１部のこの物質を１部の親水性軟膏
と混合して、ビブリオリシンの親水性条件を部分的にシ
ミュレーションすることを試みた。
【００５８】トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテアー
ゼについてＵＳＰの方法に記載されているように、ビブ
リオリシンを疎水性軟膏から抽出した。親水性配合物あ
ＴＥＳ緩衝液で直接抽出した。次いで、残留するタンパ
ク質分解活性をアゾカゼインの加水分解により決定し
た。
ゼについてＵＳＰの方法に記載されているように、ビブ
リオリシンを疎水性軟膏から抽出した。親水性配合物あ
ＴＥＳ緩衝液で直接抽出した。次いで、残留するタンパ
ク質分解活性をアゾカゼインの加水分解により決定し
た。
【００５９】周囲温度における親水性基剤中のビブリオ
リシンの貯蔵寿命の安定性、ならびに疎水性−親水性複
合体中のトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテアーゼの
残留活性を図５に示す。結果が示すように、ビブリオリ
シンは６０日のインキュベーション期間にわたってきわ
めてすぐれた安定性（＞８０％の残留活性）を有する。
比較により、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）配合物から
のプロテアーゼはそのもとの活性のわずかに４３％を維
持した。両者の酵素は、周囲温度において疎水性基剤に
ついて匹敵する貯蔵寿命の安定性を示した。
リシンの貯蔵寿命の安定性、ならびに疎水性−親水性複
合体中のトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）プロテアーゼの
残留活性を図５に示す。結果が示すように、ビブリオリ
シンは６０日のインキュベーション期間にわたってきわ
めてすぐれた安定性（＞８０％の残留活性）を有する。
比較により、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）配合物から
のプロテアーゼはそのもとの活性のわずかに４３％を維
持した。両者の酵素は、周囲温度において疎水性基剤に
ついて匹敵する貯蔵寿命の安定性を示した。
【００６０】実施例６ 生体内の研究 本発明のプロテアーゼの壊死組織除去性質を生体内で評
価するために、白色の家畜のブタを選択した。なぜな
ら、これらのブタの皮膚は形態学的および機能的にヒト
の皮膚に類似するからである。したがって、１匹の体重
１５〜２０ｋｇの若い特異的病原体不含（ＳＰＦ）のブ
タを２週間飼育した後、実験を開始した。動物に基本規
定食を任意に与え、そして温度（１９〜２１℃）および
光（１２時間／１２時間のＬＤ）がコントロールされた
動物の設備内に個々に収容した。実験の動物は、メルツ
（Ｍｅｒｔｚ）ら［ジャーナル・サージカル・リサーチ
（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｓｙｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）（１９９０）、４８：２４５−２４８］により記載
されているように、準備し、麻酔し、そして９６の熱傷
の創傷を動物の外部の２／３につくった。熱傷の創傷を
４つの処置群に分割し、そして６日の期間の間に特定の
時間の間隔で評価した。熱傷の創傷を次の処置群の１つ
に割り当てた：（１）シルベイデン（Ｓｉｌｖａｄｅｎ
ｅR）［マリオン（Ｍａｒｉｏｎ）クリーム中のビブリ
オリシン（１，２００単位／ｇ）、（２）トラベイス
（Ｔｒａｖａｓｅ）軟膏（１，２００単位／ｇ）、
（３）シルベイデン（ＳｉｌｖａｄｅｎｅR）クリーム
の対照、（４）処置なしの対照。すべての処置群をテガ
ダーム（ＴｅｇａｄｅｒｍR）ポリウレタン包帯で覆っ
た。このテガダーム（ＴｅｇａｄｅｒｍR）ポリウレタ
ン包帯は、気体透過性であり、透明であり、そして外部
の微生物の攻撃に対するバリヤーを提供する。処置は直
ちであるか、あるいは遅延して、それぞれ、焼痂の形成
の防止および硬化した焼痂（熱傷後９６時間）の壊死組
織除去を評価した。
価するために、白色の家畜のブタを選択した。なぜな
ら、これらのブタの皮膚は形態学的および機能的にヒト
の皮膚に類似するからである。したがって、１匹の体重
１５〜２０ｋｇの若い特異的病原体不含（ＳＰＦ）のブ
タを２週間飼育した後、実験を開始した。動物に基本規
定食を任意に与え、そして温度（１９〜２１℃）および
光（１２時間／１２時間のＬＤ）がコントロールされた
動物の設備内に個々に収容した。実験の動物は、メルツ
（Ｍｅｒｔｚ）ら［ジャーナル・サージカル・リサーチ
（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｓｙｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）（１９９０）、４８：２４５−２４８］により記載
されているように、準備し、麻酔し、そして９６の熱傷
の創傷を動物の外部の２／３につくった。熱傷の創傷を
４つの処置群に分割し、そして６日の期間の間に特定の
時間の間隔で評価した。熱傷の創傷を次の処置群の１つ
に割り当てた：（１）シルベイデン（Ｓｉｌｖａｄｅｎ
ｅR）［マリオン（Ｍａｒｉｏｎ）クリーム中のビブリ
オリシン（１，２００単位／ｇ）、（２）トラベイス
（Ｔｒａｖａｓｅ）軟膏（１，２００単位／ｇ）、
（３）シルベイデン（ＳｉｌｖａｄｅｎｅR）クリーム
の対照、（４）処置なしの対照。すべての処置群をテガ
ダーム（ＴｅｇａｄｅｒｍR）ポリウレタン包帯で覆っ
た。このテガダーム（ＴｅｇａｄｅｒｍR）ポリウレタ
ン包帯は、気体透過性であり、透明であり、そして外部
の微生物の攻撃に対するバリヤーを提供する。処置は直
ちであるか、あるいは遅延して、それぞれ、焼痂の形成
の防止および硬化した焼痂（熱傷後９６時間）の壊死組
織除去を評価した。
【００６１】この実験の対照群のために、処置を受けな
かった熱傷の創傷は４日後比較的硬い焼痂を形成した
が、熱傷の創傷のシルベイデン（Ｓｉｌｖａｄｅｎ
ｅR）クリームの処置はわずかに柔らかい焼痂を生じ
た。
かった熱傷の創傷は４日後比較的硬い焼痂を形成した
が、熱傷の創傷のシルベイデン（Ｓｉｌｖａｄｅｎ
ｅR）クリームの処置はわずかに柔らかい焼痂を生じ
た。
【００６２】第１、２および３日に処置した熱傷のトラ
ベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）軟膏の処置は、触診で明らか
である凹形の形状を発生した。さらに、６日の処置期間
を通じて創傷のまわりに紅班が認められた。これらの結
果が示唆するように、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）の
処置は壊死の深さを増加し、そしてまわりの皮膚を刺激
していた。これらの観察はザワッキ（Ｚａｗａｃｋｉ）
［外科（Ｓｕｒｇｅｒｙ）（１９７４）７７：１３２］
のものと一致し、彼はトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）が
生存能力のある細胞を境界的に破壊するばかりでなく、
かつまたＩＩ度熱傷における損傷のレベルを実際に深く
することを示した。実験の後者の日に処置した熱傷の焼
痂（焼痂の発生後）は事実軟化し始め、そして処置の２
４時間以内に壊死の組織を溶解した。しかしながら、紅
班は認められた。
ベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）軟膏の処置は、触診で明らか
である凹形の形状を発生した。さらに、６日の処置期間
を通じて創傷のまわりに紅班が認められた。これらの結
果が示唆するように、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）の
処置は壊死の深さを増加し、そしてまわりの皮膚を刺激
していた。これらの観察はザワッキ（Ｚａｗａｃｋｉ）
［外科（Ｓｕｒｇｅｒｙ）（１９７４）７７：１３２］
のものと一致し、彼はトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）が
生存能力のある細胞を境界的に破壊するばかりでなく、
かつまたＩＩ度熱傷における損傷のレベルを実際に深く
することを示した。実験の後者の日に処置した熱傷の焼
痂（焼痂の発生後）は事実軟化し始め、そして処置の２
４時間以内に壊死の組織を溶解した。しかしながら、紅
班は認められた。
【００６３】ビブリオリシンは、創傷を受けた直後に処
置する熱傷の創傷の有意の焼痂の形成を防止した。創傷
を深くしたトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）の処置と異な
り、ビブリオリシン軟膏は生存能力のある組織の成分を
加水分解しなかった。最も有意には、ビブリオリシンで
処置した創傷は、より小さい焼痂の大きさにより示され
るように、創傷の拘縮を示した。第４、５および６日
（焼痂の発生後）の熱傷の処置は、創傷の表面の軟化、
ある体積の流体の発生、およびフィブリンのかさぶたの
形成の不存在により明らかなように、２４時間以内に焼
痂を軟化しかつ溶解した。薄い紅班が１つの処置期間−
熱傷後４日にのみ認められた。こうして、本発明の酵素
は、他のこのような酵素の産生物と異なり、創傷の治癒
を増強する、有効な壊死組織除去因子である。
置する熱傷の創傷の有意の焼痂の形成を防止した。創傷
を深くしたトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）の処置と異な
り、ビブリオリシン軟膏は生存能力のある組織の成分を
加水分解しなかった。最も有意には、ビブリオリシンで
処置した創傷は、より小さい焼痂の大きさにより示され
るように、創傷の拘縮を示した。第４、５および６日
（焼痂の発生後）の熱傷の処置は、創傷の表面の軟化、
ある体積の流体の発生、およびフィブリンのかさぶたの
形成の不存在により明らかなように、２４時間以内に焼
痂を軟化しかつ溶解した。薄い紅班が１つの処置期間−
熱傷後４日にのみ認められた。こうして、本発明の酵素
は、他のこのような酵素の産生物と異なり、創傷の治癒
を増強する、有効な壊死組織除去因子である。
【００６４】配列のリスト （１）一般の情報： （ｉ）出願人：フォートネイ、ドナルド Ｚ． ダーハム、ドナルド Ｄ． （ｉｉ）発明の名称：ビブリオ属により産生されたプロ
テアーゼを含有する組成物および壊死組織除去および創
傷の治癒における使用方法 （ｉｉｉ）配列の番号：１ （ｉｖ）対応する住所： （Ａ）居住人：Ｗ．Ｒ．グレイス・アンド・カンパニー
−Ｃｏｎｎ． （Ｂ）ストリート：７３７９ルート３２ （Ｃ）市：コロンビア （Ｄ）州：マリイランド （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：２１０４４ （Ｖ）コンピューターの解読： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパーティブ
ル （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ドナスター （ｖｉ）現在の応用データ： （Ａ）応用番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）前の出願のデータ： （Ａ）出願番号：ＵＳ ５６７８８４ （Ｂ）提出日：１９９０年９月１５日 （ｖｉｉｉ）代理人／情報： （Ａ）名前：アプレビイ、バネッサ Ｌ （Ｂ）登録番号：３３２２３ （Ｃ）参照番号／処理番号：０１７９１４ （ｉｘ）遠距離通信の情報： （Ａ）電話：３０１ ５３１ ４５１５ （２）情報：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１９８０塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムのＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
テアーゼを含有する組成物および壊死組織除去および創
傷の治癒における使用方法 （ｉｉｉ）配列の番号：１ （ｉｖ）対応する住所： （Ａ）居住人：Ｗ．Ｒ．グレイス・アンド・カンパニー
−Ｃｏｎｎ． （Ｂ）ストリート：７３７９ルート３２ （Ｃ）市：コロンビア （Ｄ）州：マリイランド （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：２１０４４ （Ｖ）コンピューターの解読： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパーティブ
ル （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ドナスター （ｖｉ）現在の応用データ： （Ａ）応用番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）前の出願のデータ： （Ａ）出願番号：ＵＳ ５６７８８４ （Ｂ）提出日：１９９０年９月１５日 （ｖｉｉｉ）代理人／情報： （Ａ）名前：アプレビイ、バネッサ Ｌ （Ｂ）登録番号：３３２２３ （Ｃ）参照番号／処理番号：０１７９１４ （ｉｘ）遠距離通信の情報： （Ａ）電話：３０１ ５３１ ４５１５ （２）情報：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：１９８０塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムのＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【００６５】
【表２】
【図１】ビブリオリシン遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１）の表示である。示すＤＮＡ配列は、ビ
ブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅ
ｏｌｙｔｉｃｕｓ）遺伝子の６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片の部分からなる（米国特許第４，９６６，８４６
号に記載されている、ビブリオリシンをエンコードす
る）。オープンリーディングフレームはほぼ塩基２４９
−２０７８から存在し、それらの中にビブリオリシンを
エンコードするＤＮＡ領域が見いだされる。
ＩＤ ＮＯ．１）の表示である。示すＤＮＡ配列は、ビ
ブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅ
ｏｌｙｔｉｃｕｓ）遺伝子の６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片の部分からなる（米国特許第４，９６６，８４６
号に記載されている、ビブリオリシンをエンコードす
る）。オープンリーディングフレームはほぼ塩基２４９
−２０７８から存在し、それらの中にビブリオリシンを
エンコードするＤＮＡ領域が見いだされる。
【図２】基質のフィブリンに作用するビブリオリシン、
トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）およびコラゲナーゼの能
力を比較する。
トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）およびコラゲナーゼの能
力を比較する。
【図３】基質の変性コラーゲンに作用するビブリオリシ
ン、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）およびコラゲナーゼ
の能力を比較する。
ン、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）およびコラゲナーゼ
の能力を比較する。
【図４】基質のエラスチンに作用するビブリオリシンお
よびトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）の能力を比較する。
よびトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）の能力を比較する。
【図５】親水性ビブリオリシン配合物および親水性／疎
水性トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）配合物の２５℃にお
ける貯蔵寿命の安定性を比較する。
水性トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）配合物の２５℃にお
ける貯蔵寿命の安定性を比較する。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はビブリオリシン遺伝子のＤＮＡ配列（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）の表示である。示すＤＮＡ配列
は、ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏｐｒｏ
ｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）遺伝子の６．７ｋｂのＨｉｎｄ
ＩＩＩ断片の部分からなる（米国特許第４，９６６，
８４６号に記載されている、ビブリオリシンをエンコー
ドする）。オープンリーディングフレームはほぼ塩基２
４９−２０７８から存在し、それらの中にビブリオリシ
ンをエンコードするＤＮＡ領域が見いだされる。
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）の表示である。示すＤＮＡ配列
は、ビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏｐｒｏ
ｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）遺伝子の６．７ｋｂのＨｉｎｄ
ＩＩＩ断片の部分からなる（米国特許第４，９６６，
８４６号に記載されている、ビブリオリシンをエンコー
ドする）。オープンリーディングフレームはほぼ塩基２
４９−２０７８から存在し、それらの中にビブリオリシ
ンをエンコードするＤＮＡ領域が見いだされる。
【図２】図２は図１の続きである。
【図３】図３は図２の続きである。
【図４】図４は基質のフィブリンに作用するビブリオリ
シン、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）およびコラゲナー
ゼの能力を比較する。
シン、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）およびコラゲナー
ゼの能力を比較する。
【図５】図５は基質の変性コラーゲンに作用するビブリ
オリシン、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）およびコラゲ
ナーゼの能力を比較する。
オリシン、トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）およびコラゲ
ナーゼの能力を比較する。
【図６】図６は基質のエラスチンに作用するビブリオリ
シンおよびトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）の能力を比較
する。
シンおよびトラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）の能力を比較
する。
【図７】図７は親水性ビブリオリシン配合物および親水
性／疎水性トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）配合物の２５
℃における貯蔵寿命の安定性を比較する。
性／疎水性トラベイス（Ｔｒａｖａｓｅ）配合物の２５
℃における貯蔵寿命の安定性を比較する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/57 // Ｃ１２Ｎ 9/52 ＺＮＡ 7823−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:63）
Claims (39)
- 【請求項１】 少なくとも１種の製剤学的に許容されう
る担体と有効量のプロテアーゼとの混合物からなり、前
記プロテアーゼは、 （ａ）ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する微生物の培
養により産生される細胞外の中性のプロテアーゼ、前記
プロテアーゼは、次の性質： ｉ、変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリ
ンを包含する壊死の組織の成分を加水分解する； ｉｉ、自然組織を生体内で実質的に加水分解しない；お
よび ｉｉｉ、局所的配合物中で２５℃において貯蔵したと
き、安定な活性を示す；により特徴づけられる； （ｂ）前記プロテアーゼ（ａ）のための発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクションされた組み換え宿
主細胞により発現されたプロテアーゼ；および （ｃ）性質（ｉ）〜（ｉｉｉ）により特徴づけられるプ
ロテアーゼ（ａ）および（ｂ）の突然変異およびハイブ
リッド；から成る群より選択されることを特徴とする、
創傷を処置するための組成物。 - 【請求項２】 創傷の壊死組織除去に有用である、請求
項１の組成物。 - 【請求項３】 創傷の治癒の促進に有用である、請求項
１の組成物。 - 【請求項４】 外科的癒着の予防または処置に有用であ
る、請求項１の組成物。 - 【請求項５】 ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する前
記微生物はビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ
ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ５３５５
９）である、請求項１の組成物。 - 【請求項６】 前記プロテアーゼは第１図に示すＤＮＡ
配列（ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１）を有する、請求項１の組
成物。 - 【請求項７】 局所的投与に適する、請求項１の組成
物。 - 【請求項８】 前記担体は疎水性である、請求項１の組
成物。 - 【請求項９】 前記担体は親水性である、請求項１の組
成物。 - 【請求項１０】 さらに抗生物質を含む、請求項１の組
成物。 - 【請求項１１】 さらに創傷の治癒因子を含む、請求項
１の組成物。 - 【請求項１２】 前記創傷の治癒因子は成長因子であ
る、請求項１１の組成物。 - 【請求項１３】 プロテアーゼは創傷の拘縮を行う能力
によりさらに特徴づけられる、請求項３の組成物。 - 【請求項１４】 前記安定な活性は約８０％〜約９５％
である、請求項１の組成物。 - 【請求項１５】 創傷を有効量の請求項１の組成物に投
与することからなる、創傷を壊死組織除去する方法。 - 【請求項１６】 前記創傷は熱傷である、請求項１５の
方法。 - 【請求項１７】 創傷を有効量の請求項１の組成物に投
与することからなる、創傷を治癒する方法。 - 【請求項１８】 前記創傷は熱傷である、請求項１７の
方法。 - 【請求項１９】 創傷を有効量の請求項１の組成物に投
与することからなる、外科的癒着の予防または処置する
方法。 - 【請求項２０】 創傷に有効量のプロテアーゼを接触さ
せることからなり、前記プロテアーゼは、 （ａ）ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する微生物の培
養により産生される細胞外の中性のプロテアーゼ、前記
プロテアーゼは、次の性質： ｉ、変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリ
ンを包含する壊死の組織の成分を加水分解する； ｉｉ、自然組織を生体内で実質的に加水分解しない；お
よび ｉｉｉ、局所的配合物中で２５℃において貯蔵したと
き、安定な活性を示す；により特徴づけられる； （ｂ）前記プロテアーゼ（ａ）のための発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクションされた組み換え宿
主細胞により発現されたプロテアーゼ；および （ｃ）性質（ｉ）〜（ｉｉｉ）により特徴づけられるプ
ロテアーゼ（ａ）および（ｂ）の突然変異およびハイブ
リッド；から成る群より選択されることを特徴とする、
創傷から壊死の組織を除去する方法。 - 【請求項２１】 前記創傷は熱傷である、請求項２０の
方法。 - 【請求項２２】 ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する
前記微生物はビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ ５３５
５９）である、請求項２０の方法。 - 【請求項２３】 前記プロテアーゼは第１図に示すＤＮ
Ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を有する、請求項２
０の方法。 - 【請求項２４】 前記プロテアーゼを少なくとも１種の
製剤学的に許容されうる担体と混合した後投与する、請
求項２０の方法。 - 【請求項２５】 前記プロテアーゼは創傷に局所的に適
用する、請求項２０の方法。 - 【請求項２６】 創傷に治療学的に有効量のプロテアー
ゼを投与することからなり、前記プロテアーゼは、 （ａ）ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する微生物の培
養により産生される細胞外の中性のプロテアーゼ、前記
プロテアーゼは、次の性質： ｉ、変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリ
ンを包含する壊死の組織の成分を加水分解する； ｉｉ、自然組織を生体内で実質的に加水分解しない；お
よび ｉｉｉ、局所的配合物中で２５℃において貯蔵したと
き、安定な活性を示す；により特徴づけられる； （ｂ）前記プロテアーゼ（ａ）のための発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクションされた組み換え宿
主細胞により発現されたプロテアーゼ；および （ｃ）性質（ｉ）〜（ｉｉｉ）により特徴づけられるプ
ロテアーゼ（ａ）および（ｂ）の突然変異およびハイブ
リッド；から成る群より選択されることを特徴とする、
創傷の治癒を増強する方法。 - 【請求項２７】 前記創傷は熱傷である、請求項２６の
方法。 - 【請求項２８】 前記創傷は外科的創傷である、請求項
２６の方法。 - 【請求項２９】 外科的癒着を予防または処置する、請
求項の方法。 - 【請求項３０】 ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する
前記微生物はビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ ５３５
５９）である、請求項２６の方法。 - 【請求項３１】 前記プロテアーゼは第１図に示すＤＮ
Ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を有する、請求項２
６の方法。 - 【請求項３２】 前記プロテアーゼを少なくとも１種の
製剤学的に許容されうる担体と混合した後投与する、請
求項２６の方法。 - 【請求項３３】 前記プロテアーゼは創傷に局所的に適
用する、請求項２６の方法。 - 【請求項３４】 前記プロテアーゼを前記外科的創傷に
注射または移植する、請求項２９の方法。 - 【請求項３５】 熱傷の組織に治療学的に有効量のプロ
テアーゼを投与することからなり、前記プロテアーゼ
は、 （ａ）ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する微生物の培
養により産生される細胞外の中性のプロテアーゼ、前記
プロテアーゼは、次の性質： ｉ、変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリ
ンを包含する壊死の組織の成分を加水分解する； ｉｉ、自然組織を生体内で実質的に加水分解しない；お
よび ｉｉｉ、局所的配合物中で２５℃において貯蔵したと
き、安定な活性を示す；により特徴づけられる； （ｂ）前記プロテアーゼ（ａ）のための発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクションされた組み換え宿
主細胞により発現されたプロテアーゼ；および （ｃ）性質（ｉ）〜（ｉｉｉ）により特徴づけられるプ
ロテアーゼ（ａ）および（ｂ）の突然変異およびハイブ
リッド；から成る群より選択されることを特徴とする、
熱傷の焼痂を加水分解する方法。 - 【請求項３６】 ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する
前記微生物はビブリオ・プロテオリチクス（Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ ５３５
５９）である、請求項３５の方法。 - 【請求項３７】 前記プロテアーゼは第１図に示すＤＮ
Ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を有する、請求項３
５の方法。 - 【請求項３８】 前記プロテアーゼを少なくとも１種の
製剤学的に許容されうる担体と混合した後投与する、請
求項３５の方法。 - 【請求項３９】 前記プロテアーゼは創傷に局所的に適
用する、請求項３５の方法。
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