JPH0518971A - 化学発光を利用した抗原・抗体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明の抗原・抗体の測定方法は、表面に抗
体が固定された抗体電極を、被検液中に浸漬して抗原−
抗体反応を行ない、被検液中の抗原を電極表面の抗体に
固定し、化学発光性アクリジニウム誘導体で標識された
標識抗体を上記被検液中に添加して再度抗原抗体反応を
行ない、標識抗体を電極表面に固定されている抗原に固
定し、次いで、該電極表面を洗浄して固定されていない
標識抗体を分離した後、該電極を作用極として用いて、
溶存酸素を有する電解液中で該酸素の電気化学的還元を
行なって発光を行ない、その発光量を測定することによ
り被検液中の抗原の濃度を測定することを特徴とする。 【効果】 本発明の方法は、抗原濃度が10^-11 〜10^-5ｇ
／ml程度の液の測定に有効であり、抗原濃度の変化に対
しての発光量の変化が十分大きく、従来の方法に比して
測定精度が著しく向上している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、化学発光を利用して液
中に存在する抗原・抗体の濃度を測定する方法に関す
る。

【０００２】

【従来技術】化学発光を利用して液中に存在する抗原・
抗体の濃度を測定する方法は公知である。例えば、試料
液中に存在する抗体に対応する抗原に予めルミノール、
ピレン等の化学発光を行なう物質を固定化しておき、こ
の抗原を前記液体試料に添加して抗体と反応させると、
反応後の抗原に固定化されている化学発光性物質の電気
化学的発光が抑制される。このことを利用して、その時
の電気化学的発光量を測定することにより、液体試料中
の抗体濃度を測定する方法が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】然しながら、上記方法
は、抗体濃度の変化に対する発光量の変化が小さく、測
定精度が低いという問題がある。従って本発明は、測定
すべき抗体あるいは抗原の濃度変化に対する発光量の変
化が大きく、測定精度が向上した抗原・抗体の測定方法
を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、表面に
抗体が固定された抗体電極を、被検液中に浸漬して抗原
−抗体反応を行ない、被検液中の抗原を電極表面の抗体
に固定し、化学発光性アクリジニウム誘導体で標識され
た標識抗体を上記被検液中に添加して再度抗原抗体反応
を行ない、標識抗体を電極表面に固定されている抗原に
固定し、次いで、該電極表面を洗浄して固定されていな
い標識抗体を分離した後、該電極を作用極として用い
て、溶存酸素を有する電解液中で該酸素の電気化学的還
元を行なって発光を行ない、その発光量を測定すること
により被検液中の抗原の濃度を測定することを特徴とす
る測定方法が提供される。

【０００５】本発明方法の工程を図１に簡単に示す。即
ち、本発明方法においては、電極１表面に、被検液中の
抗原に対しての抗体２が固定される（工程（Ａ））。次
いで、抗原３を有する被検液中に上記抗体電極を浸漬し
て抗原−抗体反応が行なわれ、抗原３は電極表面の抗体
２に固定される（工程（Ｂ））。上記の抗原−抗体反応
が終了した後に、化学発光性アクリジニウム誘導体４で
標識された標識抗体５が添加され、再度抗原−抗体反応
が行なわれ、標識抗体５は、電極表面に固定されている
抗原３に固定され、さらに固定されていない標識抗体５
が洗浄、除去される（工程（Ｃ）、工程（Ｄ））。即
ち、抗原３は、抗体１と標識抗体５との間にサンドイッ
チされた状態となる。ここで抗体５を標識している化学
発光性アクリジニウム誘導体４は、過酸化水素の存在下
で化学発光し、その発光強度は極めて大である。また電
極表面に固定される標識抗体５の量は、被検液中の抗原
濃度が高い程多く、抗原濃度が低い程少ない。次いで、
上記電極を用いて電気化学発光が行なわれる（工程
（Ｅ））。この電気化学発光は、溶存酸素を有する電解
液中で上記電極を作用電極として、該酸素の電気化学的
還元を行なうことにより生じるものであり、酸素の還元
により過酸化水素が発生するため、電極に固定されてい
る標識抗体５を標識しているアクリジニウム誘導体４が
化学発光するものである。従って、本発明方法によって
得られる検量線は図２に示すようなものとなる。

【０００６】以上、本発明の測定方法における各工程を
簡単に説明したが、以下各工程について詳細に説明す
る。

【０００７】抗体電極 本発明においては、電気化学発光を行なうための作用電
極として、表面に抗体が固定化された電極が使用され
る。抗体の電極表面への固定化は、従来公知の技術によ
り行なうことができ、例えば、シランカップリング剤、
あるいはブドウ状球菌より得られるプロティンＡを電極
表面に被膜させ、そして抗体もしくは抗原を結合させる
ことにより行なわれる。また電極表面に固定される抗体
の量は、被検液中に存在する抗原のすべてを有効に固定
し得る量とする。

【０００８】電極表面に固定される抗体の種類は、測定
対象である特定の抗原に対して抗体の関係にあるもので
あり、被検液中の抗原に応じて選択される。かかる抗原
及び抗体の例としては次のものを挙げることができる。

【０００９】抗原類； IgG、 IgA、 IgM、 IgE、アルブ
ミン、 HCG、 AFP、カルジオライピン抗原、血液型物
質、コンカナバリン A、 DNT、プロスタグランジン、 C
RP、HBs、ヒト成長ホルモン、ステロイドホルモン、 CE
A、IgD等。

【００１０】抗体類；抗アルブミン抗体、抗HCG 抗体、
抗IgG 抗体、抗IgA 抗体、抗IgM 抗体、抗IgE 抗体、抗
IgD 抗体、抗AFP 抗体、抗DNT 抗体、抗プロスタグラン
ジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗CRP 抗体、抗
HBs 抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイドホル
モン抗体、及びこれらを含む血清、並びにモノクロナー
ル抗体。

【００１１】本発明において、電極表面に固定される抗
体は、後述する標識抗体とは異なる抗原決定基を認識す
るモノクローナル抗体が好適に使用される。尚、抗原で
あるか抗体であるかは相対的なものであるので、例え
ば、上記において抗原として例示されたものを抗体とし
て使用し、抗体として例示されたものを抗原として使用
できることは言うまでもない。

【００１２】また上記抗体を固定すべき電極としては、
これらの固定が有効に行なわれる限り、任意の電極を使
用することができるが、一般的には、白金電極、金電極
等の金属電極、グラファイト、グラッシーカーボン等の
炭素電極、その他ＩＴＯ電極等の酸化物電極が好適に使
用される。

【００１３】第１の抗原−抗体反応 本発明によれば、上記で作成された抗体電極を、被検液
中に浸漬して抗原−抗体反応が行なわれる。これによ
り、被検液中の抗原は、電極表面の抗体に固定される。
この抗原−抗体反応は、被検液中の抗原の全てが電極表
面の抗体に固定されるように十分行なわれる。

【００１４】標識抗体の調製 本発明においては、上記電極表面に固定された抗原に対
して抗体の関係にあるもの、即ち抗体電極の形成に使用
されているものと同種の抗原を認識する抗体を化学発光
性アクリジニウム誘導体で標識する。用いる抗体として
は、前述した抗体電極に用いた抗体とは異なる抗原決定
基を有するモノクローナル抗体が望ましい。ここで化学
発光性アクリジニウム誘導体は、マイルドな条件下で抗
体と共有結合し、特異性の高い化学発光性を持つ標識分
子となる。このような化学発光性アクリジニウム誘導体
としては、例えば、式(1) 、

【化１】 （式中、Ａはアニオンを示す、）で表されるアクリジニ
ウム塩、式(2) 、

【化２】 （式中、Ｒは直鎖状、分岐状もしくは環状の脂肪族また
は芳香族の基であり、これらの基は反応性の基を有して
いてもよく、Ａはアニオンを示す、）で表されるアクリ
ジニウムエステルを挙げることができる。この式(2) の
アクリジニウムエステルの中でも、代表的なものとし
て、アクリジニウム−Ｉ、即ち４−(2−スクシンイミジ
ルオキシカルボニルエチル) フェニル−10−メチルアク
リジニウム−９−カルボキシレート・フルオロ硫酸塩が
挙げられる。またこれら以外にも、特開昭63−57572 号
公報及び特開平１−261461号公報に記載の化学発光性ア
クリジン誘導体、米国特許出願 766,038号明細書、米国
特許第 3,352,791号明細書、英国特許第 1,316,363号明
細書、同 1,461,877号明細書及び特開昭62−61969 号明
細書等に記載の化学発光性アクリジニウムエステルも使
用することができる。

【００１５】上記化学発光性アクリジニウム誘導体を用
いての標識抗体の調製は、例えば抗体の希アルカリ水溶
液中に化学発光性アクリジニウム誘導体を添加して、反
応させることによって容易に行なうことができる。この
場合、反応条件はマイルドなものであってよく、例え
ば、０℃〜室温程度の温度で反応液を攪拌する程度で十
分に反応が進行して標識抗体が得られる。このように抗
体を標識した化学発光性アクリジニウム誘導体は、発光
強度が極めて高く、例えばペルオキシターゼ・エンハン
サー系の数十倍の発光強度を有する。この発光機構は、
従来公知であり、アルカリ性で過酸化水素の存在下で生
じ、格別の触媒の添加を必要としない。

【００１６】第２の抗原・抗体反応 本発明方法においては、上記で調製された標識抗体また
は抗原の溶液を被検液に添加して再度抗原・抗体反応を
行なう。これによって、標識抗体は、電極表面の抗体に
固定されている抗原に固定される。即ち、上記抗原は、
電極表面の抗体と標識抗体とでサンドイッチされた状態
で保持される。この場合、被検液中の抗原濃度が高けれ
ば固定される標識抗体の割合は大きく、一方、被検液中
の抗原濃度が低ければ固定される標識抗体の割合は小さ
くなることが理解されるべきである。従って、後述する
電気化学的な発光量は、被検液中の抗原濃度が高ければ
大きく、逆に抗体または抗原濃度が低ければ小さいもの
となる。

【００１７】洗浄 再度の抗原・抗体反応終了後、上記電極を被検液中から
取り出して洗浄し、電極表面に存在する固定されていな
い標識抗体を除去する。この洗浄は、電極表面に固定さ
れている標識抗体に悪影響を及ぼさない限り、任意の液
を用いて行なうことができるが、一般には、リン酸ナト
リウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて行なうことが
好適である。

【００１８】電気化学的発光 本発明によれば、上記標識抗体が固定された電極を作用
極とし、溶存酸素を有する電解液を用いて、該酸素の電
気化学的還元を行なうことにより電気化学的発光を生じ
せしめる。即ち、溶存酸素の電気化学的還元により作用
極表面に過酸化水素が発生し、これが電極表面に固定さ
れている標識抗体に接触することにより発光を生じるも
のである。

【００１９】この方法において、用いる電解液として
は、溶存酸素を有していることが必須であり且つその溶
存酸素は、その電極表面に固定されている標識抗体（化
学発光性物質で標識されている）の発光を生じせしめる
に十分な量の過酸化水素を発生させるに十分な量でなく
てはならない。通常、この条件が満たされないことは稀
であり、溶存酸素量が不十分である恐れのあるときは、
測定に先立って用いる電解液中に空気や一定分圧以上の
酸素含有ガスを通気することにより、十分な溶存酸素量
を確保できる。

【００２０】また用いる電解液としては、一般にｐＨが
７以上のアルカリ性水溶液であることが好ましく、通
常、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が好適
に使用される。

【００２１】溶存酸素の電気化学的還元による発光を行
なうに必要な作用電極の設定電位は、用いる電解液や電
極物質の特性、環境条件等によっても異なるが、例えば
室温において、ｐＨが 7〜7.4 のＰＢＳを電解液として
使用し且つ電極（抗原または抗体電極）として白金電極
を使用した場合には、−1.5 〜−0.2 Ｖ（vs. Ag／AgC
l）程度の電位を与えればよい。またこの際に使用され
る対電極としては、白金、金等の金属電極、グラファイ
ト、グラッシーカーボン等の炭素電極、その他ＩＴＯな
どの酸化物系の電極を使用することができる。

【００２２】かくして生じる発光量は、例えば、光電子
増倍管等の光検出装置を用いて測定される。この発光量
は、既に述べた通り、被検液中の抗原濃度が高ければ大
きく、逆に抗原濃度が低ければ低くなる。従って、この
発光量を測定することにより、被検液中の抗原または抗
体濃度を測定することが可能となる。

【００２３】

【実施例】抗体抗ヒトIgG 固定化電極の作成 ＩＴＯ電極を十分に洗浄した後、アセトンにより水分を
除去し、次いで該電極を２％γ−アミノプロピルトリエ
トキシシランアセトン溶液に浸し、室温で30分放置する
ことによりシラン処理を行なった。シラン処理後、電極
を蒸留水で数回洗浄し、次いで５％グルタルアルデヒド
（ＧＡ）水溶液に浸し、３時間室温で放置することによ
りＧＡ処理を行なった。ＧＡを除去後、アルデヒド臭が
なくなるまで、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で該電極の洗浄を行なった。上記電極を、過剰量の
抗ヒトIgG を含む水溶液中（目安として10〜20μｇ／ml
に浸漬し、室温で１時間反応させた。次いでＰＢＳで数
回洗浄後、１％エタノールアミンで30〜60分ほど処理を
行ない、表面に残った活性基をブロックした。またＩＴ
Ｏ電極の代わりに白金電極を使用した以外は、上記と全
く同様にして抗体電極を作成した。

【００２４】アクリジニウム誘導体の抗体抗ヒトIgG へ
の固定化 抗体抗ヒトIgG を、0.25Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ9.0 : 0.25Ｍの炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムを
混合して得る）に溶解し、次いで希釈液により抗原蛋白
濃度を20mg／mlとした（１mg／mlは、OD_280nm ＝1.33に
相当する）。アクリジニウム誘導体〔４−(2−スクシン
イミジルオキシカルボニルエチル)フェニル−10−メチ
ルアクリジニウム−９−カルボキシレート・フルオロ硫
酸塩、 C₂₈ H₂₃ N₂ O₆ FSO₃ ＝ 582.56 〕を、抗体抗
ヒトIgG １mg当たり0.05ｇ加え、静かに攪拌を続けなが
ら、室温で３時間反応させた。ＰＢＳで平衡化させたSe
phadex G−25カラム（ Pharmacia社製, 商品名) を用い
て前記抗体と結合しなかった遊離のアクリジニウム誘導
体を、フラクション分取にて取り除いた。この時、溶出
液としてはＰＢＳを用いた。上記で得られた抗体抗ヒト
IgG 粗分画溶液を、アフィニティカラムにかけ、４℃で
一晩循環させた。次いで、ｐＨ7.4 のＰＢＳを用いてカ
ラムに吸着したアクリジニウム誘導体を洗浄し、その
後、ｐＨ2.3 のグリシン−HCl 緩衝液で活性のあるアク
リジニウム固定化抗体を溶出させ、NaOHで中和後、ｐＨ
7.4 のＰＢＳに透析し、アクリジニウム誘導体で標識さ
れた標識抗体を調製した。

【００２５】実施例１ 前記で調製されたＩＴＯ抗体電極を被検液中に浸漬し、
１時間抗原−抗体反応を行なって被検液中の抗原を電極
表面の抗体に固定した。次いで被検液１ml当たり、前記
で調製された標識抗体溶液（標識抗原濃度：１μｇ／m
l）１mlを添加した混合液に、前記で作成された抗体電
極を浸漬し、１時間抗原・抗体反応を行ない、標識抗体
を上記で固定された抗原に固定した。次いで、該電極を
取り出して、ＰＢＳで３回洗浄することにより、遊離の
標識抗体を分離した。上記の処理が行なわれた電極を作
用極、及び対電極として白金電極を使用し、作用極に−
1.3 Ｖ（vs. Ag／AgCl）の電位を30秒間与えて電気化学
発光を行なった。尚、電解液としては、ｐＨ7.4 のＰＢ
Ｓを用いた。30秒間の発光をフォトカウンティング法に
より計測、積算した。この様にして、抗原濃度が既知の
種々の被検液を使用して、抗原濃度と最大発光量との関
係を測定したところ、図３に示す線図が得られた。さら
に抗原濃度が既知の数種の液について、上記と同様にし
て発光量を測定し、図３の線図（検量線）から抗原濃度
を求めたところ、測定値は実際値とよく一致していた。

【００２６】実施例２ ＩＴＯ抗体電極の代わりに白金抗体電極を使用し、これ
に与える電位を−1.5Ｖ（vs. Ag／AgCl）とした以外
は、実施例と全く同様にして発光を行ない、抗原濃度と
最大発光量との関係を測定したところ、図４に示す線図
が得られた。

【００２７】

【発明の効果】本発明の方法は、抗原濃度が10^-11 〜10
^-5ｇ／ml程度の液の測定に有効であり、抗原濃度の変化
に対しての発光量の変化が十分大きく、従来の方法に比
して測定精度が著しく向上している。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法の工程を簡単に示す図。

【図２】本発明の測定方法を実施することによって得ら
れる検量線の代表例を示す図。

【図３】実施例１による測定によって得られた抗原濃度
と発光量との関係を示す線図。

【図４】実施例２による測定によって得られた抗原濃度
と発光量との関係を示す線図。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 表面に抗体が固定された抗体電極を、被
   検液中に浸漬して抗原−抗体反応を行ない、被検液中の
   抗原を電極表面の抗体に固定し、 化学発光性アクリジニウム誘導体で標識された標識抗体
   を上記被検液中に添加して再度抗原抗体反応を行ない、
   標識抗体を電極表面に固定されている抗原に固定し、 次いで、該電極表面を洗浄して固定されていない標識抗
   体を分離した後、 該電極を作用極として用いて、溶存酸素を有する電解液
   中で該酸素の電気化学的還元を行なって発光を行ない、
   その発光量を測定することにより被検液中の抗原の濃度
   を測定することを特徴とする測定方法。