JPH0980047A - 抗体結合不溶性固体の安定保存法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】不溶性固体に結合した抗体の失活や不溶性固体
からの抗体の脱離、不溶性固体の劣化による崩壊などが
なく、長期間保存しても一定の抗体化を維持した抗体結
合不溶性固体を提供する。 【解決手段】測定の対象となる抗原性物質を認識する抗
体を不溶性固体に結合し、次いでｐＨ４．０〜６．０の
緩衝液中に保存する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘテロジーニアス
免疫測定法に用いる抗体結合不溶性固体の安定保存方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、生物体液中の物質を測定するため
に種々の免疫測定法が知られている。免疫測定法の極め
て重要な方法の一つはヘテロジーニアス免疫測定法であ
る。ヘテロジーニアス免疫測定法としては、放射線免疫
測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光免
疫測定法などが知られている。これらの免疫測定法は、
被検体液中の微量物質を測定できることから、近年急速
に普及している。ヘテロジーニアス免疫法では、たとえ
ば、酵素免疫測定法（石川栄治ら編集、医学書院、1978
年発行）記載のサンドウィッチ法や競合法などが広く用
いられている。これらの方法では、ガラスビーズやプラ
スチックビーズなどに抗体を結合した不溶性固体を用い
る。ヘテロジーニアス酵素免疫測定法に用いる抗体結合
不溶性固体は、測定するまでの間、１％の牛血清アルブ
ミンを含む通常ｐＨ７前後のリン酸緩衝液中に浸漬状態
で保存されたり、あるいは乾燥状態で保存されたりして
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、抗体結
合不溶性固体を緩衝液に浸漬保存した場合、経時的に不
溶性固体に結合した抗体の失活や、不溶性固体からの抗
体の脱離、不溶性固体の劣化による崩壊などのため、抗
体結合不溶性固体の抗体価が減少するため測定感度が悪
くなるという問題が生じる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決すべく鋭意検討した結果、抗体結合不溶性固体を
保存する緩衝液のｐＨを特定範囲内に調整することによ
り、より保存安定性の優れた抗体結合不溶性固体を得る
ことができることを見いだし、本発明に到達した。

【０００５】即ち本発明は、測定の対象となる抗原性物
質を認識する抗体を不溶性固体に結合し、次いでｐＨ
４．０〜６．０の緩衝液中に保存することを特徴とする
抗体結合不溶性固体の安定保存法である。

【０００６】本発明において、測定の対象となる抗原性
物質としては、特開平２−２０５７７４号公報記載の被
測定抗原性物質があげられる。これらのうち、特に高感
度の測定系が要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及びウ
イルスの測定に本発明の方法は好適である。不溶性固体
に結合する抗体としては、測定の対象となる抗原性物質
を認識するモノクローナル抗体あるいはポリクローナル
抗体のいずれも用いることができる。

【０００７】不溶性固体としては、特開平２−２０５７
７４号公報記載の不溶性固体があげられる。これらのう
ち好ましいものは、簡便且つ安定して抗体が結合でき、
更に、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズ、ガラス試
験管、ガラスシャーレなど）、及びプラスチック（プラ
スチックビーズ、プラスチックチューブ、プラスチック
トレイなど）である。ガラスを用いた場合は、ガラスが
プラスチックより硬いため、傷がつきにくい点や変形し
にくい点で好ましい。

【０００８】不溶性固体上に抗体を結合させる方法は、
特開平２−２０５７７４号公報記載の方法と同様でよ
い。即ち、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結合
させる方法（たとえば、米国特許第４２８０９９２号明
細書及び同第３６５２７６１号明細書）、及びプラスチ
ックに抗体を物理吸着させる方法（たとえば、イー・エ
ングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマン；
バイオキミカ バイオフィジカ アクタ(E.Engvall,J.J
onson,P.Parlmann;Biochimica Biopysica Acta),251
巻、1971年、427〜434頁記載の方法）がある。

【０００９】本発明において、緩衝液のｐＨは４．０〜
６．０、好ましくは４．５〜５．５である。ｐＨが６．
０を越えるとガラスなどの不溶性固体の侵食崩壊が激し
くなり、抗体結合不溶性固体の抗体価が減少するので問
題がある。また、ｐＨが４．０未満では、不溶性固体に
結合した抗体が変性失活するので問題がある。

【００１０】本発明の緩衝液としては、ｐＨを４．０〜
６．０に調整することが必須であるが、この範囲のｐＨ
であれば緩衝液の種類は特に限定されない。たとえば、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン
緩衝液があげられる。好ましいのは、酢酸緩衝液、リン
酸緩衝液である。なお、保存安定性を増強させるため
に、これら緩衝液には、無機塩類（塩化ナトリウム、塩
化カリウムなど）、タンパク質（牛血清アルブミン、Ｉ
ｇＧなど）、防腐剤などを適量添加して用いることがで
きるが、この場合も、後からｐＨを４．０〜６．０に調
整することが必須である。

【００１１】ヘテロジーニアス免疫測定法としては、文
献［たとえば、酵素免疫測定法（石川栄治ら編集、医学
書院、1978年発行）］記載のサンドウィッチ法、競合法
や特開平６−１３００６３記載の測定法を用いることが
できる。サンドウィッチ法は、 被検体液中の測定の対象となる抗原性物質に 不溶性固体と結合しており、且つこの抗原性物質を認
識する抗体と この抗原性物質を認識する標識抗体 を結合させて得た免疫複合体中の標識物質量を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法である。競合
法は、 被検体液中の測定の対象となる抗原性物質に 不溶性固体と結合しており且つこの抗原性物質を認識
する抗体と 標識されている抗原性物質 を結合させて得た免疫複合体中の標識物質量を測定する
ことにより抗原性物質の量を測定する方法である。

【００１２】抗体に標識する標識物質としては、特開平
２−２０５７７４号公報記載の標識物質（酵素、放射線
同位元素、蛍光物質、化学発光物質など）を用いること
ができる。このうち好ましいものは、抗体標識が容易
で、且つ高い感度が得られるペルオキシダーゼ及び¹²⁵
Ｉである。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を更に
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００１４】

【実施例】

実施例１ まず、インスリンに対する抗体を結合したガラスビーズ
の保存安定性を測定した。 （１）ｐＨ５．０酢酸緩衝液の作製 ０．１Ｍ酢酸水溶液に０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を
加えｐＨを５．０に調整した水溶液を作製した。この水
溶液に１Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン、０．９Ｗ／Ｖ％塩
化ナトリウム、０．１Ｗ／Ｖ％アジ化ナトリウムを加え
た後、１ＭＨＣｌ又は１ＭＮａＯＨを適量加えてｐＨを
５．０に再調整し、抗体結合不溶性固体を浸漬する緩衝
液を作製した。 （２）インスリン酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗インスリン抗体結合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗インスリン抗体（ダコ社製）をコーティング
した。コーティング後、このガラスビーズを上記のｐＨ
５．０酢酸緩衝液中に浸漬した。 ｂ）ペルオキシダーゼ標識抗インスリン抗体の作製 抗インスリン抗体（ダコ社製）を文献［エス・ヨシタ
ケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、他；ジェイ．バ
イオケム(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,et.al.;
J.Biochem.),92巻,1982年, 1413-1424頁］に記載の方法
にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダーゼ標識
抗インスリン抗体を得た。この試薬を通常免疫反応用緩
衝液で１０〜５０００倍に希釈して測定に使用した。 ｃ）インスリン標準溶液の調製 ヒトインスリン（ノボ社）を１Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミ
ン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で、濃度
が０、１０、５０、１２５、２５０μＵ／ｍｌとなるよ
うに希釈した。

【００１５】（３）免疫反応用緩衝液の調製 １Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン、０．９Ｗ／Ｖ％塩化ナト
リウム含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を免
疫反応用緩衝液に用いた。 （４）抗インスリン抗体結合ガラスビーズの保存安定性
試験 標準溶液又は被検試料５０μｌ、免疫反応用緩衝液４５
０μｌを入れた試験管に抗インスリン抗体結合ガラスビ
ーズを１個入れ、インキュベーション（３７℃、１５分
間）したのち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次
に、ペルオキシダーゼ標識抗インスリン抗体含有免疫反
応用緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、インキュベー
ション（３７℃、１５分間）した。再度、生理食塩水に
てビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過酸化水
素含有オルトーフェニレンジアミン溶液）５００μｌ中
に移してインキュベーション（３７℃、１５分間）した
のち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加えて反応を停止
した。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定し、ビーズに
結合した酵素の酵素活性を測定した。抗インスリン抗体
結合ビーズを４０℃で０カ月、１カ月間、２カ月間、６
カ月間、１年間保存した時のインスリン標準溶液２５０
Ｕ／ｍｌの吸光度及び０カ月吸光度との比を表１に示し
た。

【００１６】

【表１】

【００１７】実施例２ 次にβ2-マイクログロブリンに対する抗体を結合したガ
ラスビーズの保存安定性を測定した。 （１）ｐＨ５．０酢酸緩衝液の作製 実施例１（１）のｐＨ５．０酢酸緩衝液と同じ緩衝液を
用いた。 （２）β2-マイクログロブリン酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗β2-マイクログロブリン抗体結合ガラスビーズの
作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗β2-マイクログロブリンポリクローナル抗体
（ダコ社）をコーティングした。コーティング後、ｐＨ
５．０酢酸緩衝液に浸漬した。 ｂ）ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンの作
製 β2-マイクログロブリンに文献［ナカネ・ピー・ケイ、
カワオイ・エイ；ジェイ．ヒストケム．サイトケム(NAK
ANE,P.K.,KAWAOI,A.;J.Histochem.Cytochem.),22巻,197
4年,1084頁］記載の方法にてペルオキシダーゼを結合
し、ペルオキシダーゼ標識β2-マイクログロブリンを得
た。この試薬は通常免疫反応用緩衝液で１０〜５０００
倍に希釈して使用した。 ｃ）β2-マイクログロブリン標準溶液の調製 ヒトβ2-マイクログロブリン（ゼルコ社製）を１Ｗ／Ｖ
％牛血清アルブミン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で、濃度が０、１、２、４、８ｍｇ／Ｌとなる
ように希釈した。

【００１８】（３）免疫反応用緩衝液の作製 １Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン、０．９Ｗ／Ｖ％塩化ナト
リウム含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を免
疫反応用緩衝液に用いた。 （４）抗β2-マイクログロブリン抗体結合ガラスビーズ
の保存安定性試験 標準溶液又は被検試料５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識
β2-マイクログロブリン含有免疫反応用緩衝液４５０μ
ｌを入れた試験管に抗β2-マイクログロブリン抗体結合
ガラスビーズを１個入れ、インキュベーション（３７
℃、１５分間）した。生理食塩水にてビーズを洗浄した
のち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オルト−フェ
ニレンジアミン溶液）５００μｌ中に移し、インキュベ
ーション（３７℃、１５分間）したのち、１．５規定硫
酸水溶液３ｍｌを加えて反応を停止した。この液の４９
２ｎｍの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素
活性を測定した。抗β2-マイクログロブリン抗体結合ビ
ーズを４０℃で０カ月、１カ月間、２カ月間、６カ月
間、１年間保存した時のβ2-マイクログロブリン標準溶
液０ｍｇ／Ｌの吸光度及び０カ月の吸光度との比を表２
に示した。

【００１９】

【表２】

【００２０】実施例３ 抗β2-マイクログロブリン抗体結合ガラスビーズを実施
例２（１）のｐＨ５．０酢酸緩衝液の代わりに下記のｐ
Ｈ５．５リン酸緩衝液に浸漬した時の保存安定性の経時
的測定を実施例２（２）〜（４）と同様の方法で行っ
た。結果を表２に示した。 （１）ｐＨ５．５リン酸緩衝液の作製 ０．１Ｍリン酸カリウム水溶液に０．１Ｍリン酸２ナト
リウム水溶液を加えｐＨを５．５に調整した水溶液を作
製した。この水溶液に１Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン、
０．９Ｗ／Ｖ％塩化ナトリウム、０．１Ｗ／Ｖ％アジ化
ナトリウムを加えた後、１ＭＨＣｌ又は１ＭＮａＯＨを
適量加えてｐＨを５．５に再調整し、抗体結合不溶性固
体を浸漬する緩衝液を作製した。

【００２１】比較例１ 実施例１と比較するために、抗インスリン抗体結合ガラ
スビーズを実施例１（１）のｐＨ５．０酢酸緩衝液の代
わりに下記のｐＨ６．５リン酸緩衝液に浸漬した時の保
存安定性の経時的測定を実施例１（２）〜（４）と同様
の方法で行った。結果を表１に示した。 （１）ｐＨ６．５リン酸緩衝液の作製 ０．０５Ｍリン酸カリウム水溶液に０．０５Ｍリン酸２
ナトリウム水溶液を加えｐＨを６．５に調整した水溶液
を作製した。この水溶液に１Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミ
ン、０．９Ｗ／Ｖ％塩化ナトリウム、０．１Ｗ／Ｖ％ア
ジ化ナトリウムを加えた後、１ＭＨＣｌ又は１ＭＮａＯ
Ｈを適量加えてｐＨを６．５に再調整し、抗体結合不溶
性固体を浸漬する緩衝液を作製した。

【００２２】比較例２ 実施例２及び実施例３と比較するために、抗β2-マイク
ログロブリン抗体結合ガラスビーズを実施例２（１）の
ｐＨ５．０酢酸緩衝液の代わりに下記のｐＨ６．５リン
酸緩衝液に浸漬した時の保存安定性の経時的測定を実施
例２（２）〜（４）と同様の方法で行った。結果を表２
に示した。 （１）ｐＨ６．５リン酸緩衝液の作製 比較例１（１）のｐＨ６．５リン酸緩衝液と同じ緩衝液
を用いた。

【００２３】表１、表２で明らかなように、ｐＨ５．０
及びｐＨ５．５の緩衝液に抗体結合不溶性固体を浸漬し
た場合、経時的な吸光度の低下がほとんどなく優れた保
存安定性を示しているが、ｐＨ６．５では経時的な吸光
度の低下が激しく、保存安定性が不良になっている。

【００２４】

【発明の効果】本発明のｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中
に保存した抗体結合不溶性固体は、長期間の保存安定性
が優れている。すなわち、抗体結合不溶性固体をｐＨ
４．０〜６．０の緩衝液中に浸漬保存した場合、不溶性
固体に結合した抗体の失活や不溶性固体からの抗体の脱
離、不溶性固体の劣化による崩壊などがなくなるので、
長期間保存しても一定の抗体価を維持した抗体結合不溶
性固体を得ることができる。以上の点から、本発明の保
存法は、すべてのヘテロジーニアス免疫測定法に用いる
抗体結合不溶性固体に適用でき、特に高感度の測定系が
要求されるホルモン、腫瘍関連抗原及びウイルスの測定
に用いる抗体結合不溶性固体に有用である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 測定の対象となる抗原性物質を認識する
   抗体を不溶性固体に結合し、次いでｐＨ４．０〜６．０
   の緩衝液中に保存することを特徴とする抗体結合不溶性
   固体の安定保存法。
2. 【請求項２】 不溶性固体がガラスである請求項１記載
   の安定保存法。