JPH0529437B2 - - Google Patents
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- JPH0529437B2 JPH0529437B2 JP58175710A JP17571083A JPH0529437B2 JP H0529437 B2 JPH0529437 B2 JP H0529437B2 JP 58175710 A JP58175710 A JP 58175710A JP 17571083 A JP17571083 A JP 17571083A JP H0529437 B2 JPH0529437 B2 JP H0529437B2
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるＬ−フエニルアラニンの
製造法に関する。 発酵法によりＬ−フエニルアラニンを製造しよ
うとする場合、野性株は殆んど菌体外にＬ−フエ
ニルアラニンを生産しないので、野性株に人工的
に突然変異を生起せしめてＬ−フエニルアラニン
生産能を付与する方法がとられている。従来知ら
れているＬ−フエニルアラニン生産能を有する人
工変異株としては、プレピバクテリウム又はコリ
ネバクテリウム属のフエニルアラニンアンタゴニ
ストに耐性を有する変異株（米国特許3660235）、
コリネバクテリウム属のチロシンを要求し、フエ
ニルアラニンアンタゴニストに耐性を有する変異
株（米国特許3759790）、ゴレビバクテリム属、コ
リネバクテリウム属のフエニルアラニンアンタゴ
ニストに耐性を有し、デコイニンに感受性を有す
る変異株（特開昭56−64793）等が知られている。 一方、最近上述のような人工変異による育種と
異なるところの遺伝子組換え技術をＬ−フエニル
アラニン生産菌の育種に利用する試みが報告され
ている。即ち、特開昭56−1890には、フエニルア
ラニン合成に関与するエシエリヒア属のクロモゾ
ームDNAフラグメントを組込んだプラスミドを
含有するエシエリヒア・コリの変異株がＬ−フエ
ニルアラニンを生産したことが記載されている。 本願発明者らは、叙上のような従来の発酵法に
よるＬ−フエニルアラニンの製造法に対し、コリ
ネホルム・グルタミン酸生産菌に属するDNA供
与菌より得られるコリスミン酸ムターゼβサブユ
ニツト遺伝子をコードするDNA断片が、コリネ
ホルム・グルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製
できるペクタープラスミドに接続されて、コリネ
ホルム・グルタミン酸生産菌に属し、メチオニン
及びチロシン要求性、ｍ−フルオロフエニルアラ
ニン耐性であるDNA受容菌に導入されて得られ
るＬ−フエニルアラニン生産能を有する微生物を
培養することにより、培養液中にＬ−フエニルア
ラニンを高蓄積できることを知り、本願発明を完
成させた。 すなわち本願発明は、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属するDNA供与菌より得られるコ
リスミン酸ムターゼβサブユニツト遺伝子をコー
ドするDNA断片が、コリネホルム・グルタミン
酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタープラ
スミドに接続されて、コリネホルム・グルタミン
酸生産菌に属し、メチオニン及びチロシン要求
性、ｍ−フルオロフエニルアラニン耐性である
DNA受容菌に導入されて得られるＬ−フエニル
アラニン生産能を有する微生物を培養し、培養液
中に蓄積されたＬ−フエニルアラニンを採取する
ことを特徴とするＬ−フエニルアラニンの製造法
であり、また、本願発明は前記遺伝子がフエニル
アラニンアンタゴニストに耐性を有するコリネホ
ルム・グルタミン酸生産菌より得られたものであ
る上記の製造法である。 コリスミン酸ムターゼβ−サブユニツト遺伝子
を含むDNA断片はコリネホルム・グルタミン酸
生産菌の染色体DNAより得ることができる（フ
エニルアラニン生合成系遺伝子を含むDNA断片
を与えるものをDNA供与菌と称する） コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテオロジー第
８版599頁（1974）に記載されている。 本発明の宿主菌として利用しうるコリネホル
ム・グルタミン酸生産菌の野性株の例としては次
のようなものがあげれる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC 15806 コリネバクデリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミウム
ATCC 13032、13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 コリネバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC 15354 コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタミ
ン酸生産性を失なつた変異株、あるいはその他の
生産物を生産する変異株も含まれる。 DNA供与菌としては、フエニルアラニンアン
タゴニスト耐性などの変異を付与することによ
り、フエニルアラニンまたはその前駆体の生合成
活性が高まつたような変異株を用いれば更によ
い。 フエニルアラニンアンタゴニストの例としては
ｏ−フルオロフエニルアラニン、ｍ−フルオロフ
エニルアラニン、ｐ−フルオロフエニルアラニ
ン、β−３−フエニルアラニン、５−メチルトリ
プトフアン等がある。ここにいうフエニルアラニ
ンの前駆体とは３−デヒドロキシ−Ｄ−アラビノ
ーヘペプツロン酸−７−リン酸、３−デヒドロキ
ナ酸、３−デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキミ
酸−３−リン酸、５−エノールピルビルシキミ
酸、３−リン酸、コリズミン酸、プレフエン酸、
フエニルピルピン酸などをいう。 このような変異株の例としては先に述べた米国
特許3660235、米国特許3759970、特開昭56−
64793等に記載されている。 コリスミン酸ムターゼβ−サブユニツト遺伝子
をコリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体内で
自律複製できるベクタ−プラスミド上に挿入して
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA受容菌、好ましくはコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌に属し、メチオニン及びチロシン要
求性、ｍ−フルオロフエニルアラニン耐性である
DNA受容菌に導入すれば、フエニルアラニン生
産能の向上した株を得ることができる。用いる遺
伝子としては野性型のものの他前述のようなフエ
ニルアラニンアンタゴニスト耐性などにより誘導
された変異型の遺伝子を用いると更によい。野生
型遺伝子を取得後、これが導入されたDNA受容
菌に変異処理を施してベクター上の遺伝子を改良
するか、野生型遺伝子を含むプラスミドDNAに
試験管内で、修飾して遺伝子を改良することは当
然良好な結果を生む場合がある。ここにいう遺伝
子の改良とは、遺伝子産物であるコリスミン酸ム
ターゼβサブユニツトの合成量が増強される１分
子当りの比活性が上昇する、生成物、最終産物に
よる酵素阻害が軽減または解除されるなどフエニ
ルアラニン生産を促進するような望ましい影響を
与える遺伝子の修飾をいう。 具体的にはプロモーター領域の変異または変換
あるいは構造遺伝子の変異、修飾によりこれらは
達せられる。コリスミン酸ムターゼβサブユニツ
ト遺伝子に加え、フエニルアラニン生合成系遺伝
子の複数の遺伝子を同一のベクタープラスミド上
に挿入するか、共存しうる複数のベクター上に
別々に挿入したのち受容菌に導入すればよりよい
結果を与える場合がある。 DNA受容菌として用いるコリネホルム・グル
タミン酸生産菌に属する菌としては、前述したよ
うな各種の菌株を用いうる。受容菌としてフエニ
ルアラニン要求性をもつ菌株を用いればその要求
性の消失により容易に、フエニルアラニン生合成
系遺伝子の導入された形質転換株を選択すること
ができる。またフエニルアラニンアンタゴニスト
に感受性の株を受容菌として用いた場合、フエニ
ルアラニンアンタゴニスト耐性に関与するフエニ
ルアラニン生合成系遺伝子の導入された形質転換
株をフエニルアラニンアンタゴニスト耐性株とし
て容易に選択することができる。より高いフエニ
ルアラニン生産能をもつ形質転換株を得るために
は、フエニルアラニンアンタゴニスト耐性、栄養
要求性などの変異を付与することによつてフエニ
ルアラニンまたはその前駆体の生合成活性が高ま
つたような変異株を受容菌として用いるとよりよ
い結果を与える。更に、フエニルアラニンの菌体
外への透過性が改善された変異様、フエニルアラ
ニンの分解性の低下した変異株、グルタミン、ホ
スホエノールピルビン酸などフエニルアラニン生
合成に素材として供給される代謝産物の生合成能
が高まつたような変異株または組換え体も当然良
い結果を生む場合がある。 使用するベクターとしてはコリネホルム・グル
タミン酸生産菌の中で自律複製できるプラスミド
であればいかなるものでもよい。 例として以下のものがあげられる。 (1) PAM330：特開昭58−67699参照 (2) pHM1519：特開昭58−77895参照 (3) pAJ655 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11882 （FERM−P6571＝FERM−
BP136など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第１図参照 (d) 性 質：pAM330とpBR325（Gene４ 121
（1978）の複合プラスミド。 クロラムフエニコール耐性に与
る。 (4) pAJ611 (a) 宿主菌： エシエリヒア・コリAJ11884 （FERM−P6519＝FERM−
BP138など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第２図参照 (d) 性 質：pAM281とpBR325の複合プラス
ミド。 クロラムフエニコール耐性に与
る。 (5) pAJ440 (a) 宿主菌：バチルスズブチリス AJ 11901 （FERM−BP140＝ATCC39139
など） (b) 分子量： 6.0メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第３図参照 (d) 性 質：pAM330とpUB110 （J. Bacteriol.、134 318 （1978））の複合プラスミド。 カナマイシン耐性に与る。 (6) pAJ1844 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリ AJ11883 （FERM Ｐ−6518＝FERM BP
−137など） (b) 分子量： 5.4メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第４図参照 (d) 性 質：pHM1519とpBR325の複合プラ
スミド。 クロラムフエニコール耐性に与
る。 (7) pAJ3148 (a) 宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミカ
ム SR8203 ATCC39137など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第５図参照 (d) 性 質：pHM1519とpUB110との複合プ
ラスミド。 カナマイシン耐性に与る。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で増
殖可能なプラスミドのその他の例としてはpCG1
（特開昭57−134500）、pCG2（特開昭58−35197）、
pCG4、pCG11（特開昭57−183799）があり、これ
らはいずれも当然使用可能であろう。 DNA供与菌の染色体DNA及び、ベクター
DNAは通常の方法により抽出することができる。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
酵素を用いて切断する。ベクターDNAの開裂は
当該ベクターDNAを一ケ所で切断する制限酵素
を用いて切断するか、複数部位切断する制限酵素
を部分的に作用させることにより達せられる。染
色体DNAについては、制限エンドヌクレアーゼ
による切断が部分的に行われるように、反応条件
を調節すれば多くの種類の制限酵素が使用でき
る。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の方法が使用できる。一方、
ターミナルトランスフエラーゼを用いて、染色体
DNA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシ
アデニル酸とデオキシチシジル酸、または、デオ
キシグアニル酸とデオキシチシジル酸をそれぞれ
付加し、混合したのち、アニーリングして連結せ
しめる方法も利用しうる。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの連結物のコリネホルム・グル
タミン酸生産菌に属する受容菌への導入は、エシ
エリヒア・コリＫ−12について報告されている様
な（Mandel，Ｍ，and Higa，A.，J.Mol.Biol.、
53、159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウムで
処理してDNAの透過性を増す方法、またはバチ
ルス・ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，Ｃ，H.，Wilson，G.A.and Young，
F.E.，Gene，１、153（1977））細胞がDNAを取
り込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテ
ントセル）に導入する方法により可能である。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および
酵母について知られている様に（Chang，Ｓ，
and Choen，S.N.Molec.Gen.Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.Nature、224、398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、75 1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエプラストにしてプ
ラスミドをDNA受容菌に導入することも可能で
ある。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ブブチ
リスの方法でも充分高い頻度を得ることができる
し、特開昭57−183799に記載されたコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属のプロトポ
ラストにプリエチレングリコールまたはポリビニ
ルアルコールと二価金属イオンとの存在下に
DNAをとり込ませる方法も当然利用できる。ポ
リエチレングリコールまたはポリビニルアルコー
ルのかわりに、カルボキシメチルセルロース、デ
キストラン、フイコール、、プルロニツクF68（セ
ルバ社）などの添加によつてDNAのとり込みを
促進させる方法でも同等の結果が得られる。 フエニルアラニン生合成系遺伝子がベクタープ
ラスミドに接続されて、導入された形質転換株を
選択は、フエニルアラニン要求株を受容菌とした
場合にはフエニルアラニン要求性を失なつた株を
選ぶことにより、フエニルアラニンアンタゴニス
ト感受性菌を受容菌としてフエニルアラニンアン
タゴニスト耐性に与るフエニルアラニン生合成系
遺伝子を導入する場合は該アンタゴニスト耐性と
なつた株を選ぶことにより、容易に達せられる
が、フエニルアラニン生産性の向上を指標として
選択することも可能である。ベクター薬剤耐性な
どの遺伝マーカーが存在する場合にはこの形質を
併せて選択に用いれば、より容易に形質転換株を
選ぶことができる。 得られたＬ−フエニルアラニン生産菌を培養す
る方法は、従来のＬ−フエニルアラニン生産菌の
培養方法と特に変らない。即ち、培地としては、
炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常のものである。炭素源としては、グルコーー
ス、シユクロース、ラクトース等及びこれらを含
有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いら
れる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモ
ニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−フエニルアラニンの生
産蓄積が停止するまで行なわれる。 かくして培養液中には著量のＬ−フエニルアラ
ニンが生成蓄積される。培養液よりＬ−フエニル
アラニンを採取するには、通常の方法が適用でき
る。 実施例 １ フエニルアラニンアナログであるｍ−フルオロ
フエニルアラニンに対して抵抗性を有するフエニ
ルアラニン生産菌ブレビバクテリウムラクトフエ
ルメンタム AJ3437（FERM Ｐ−1914、FERM
BP−1071）から調製した染色体DNA（10μg）を
制限酵素PstIで部分分解し、一方、同酵素に対し
て１ケ所切断部位を有し、クロラムフエニコール
耐性のベクタープラスミドpAJ1844（5μg）を同酵
素で完全分解し、65℃、10分の熱処理により酵素
を失活させた後、両者を混合。リガーゼ反応を22
℃で２時間行ない、冷エタノールを加え、沈澱物
をTEN緩衝液に溶解し、プロトプラスト形質転
換に用いた。DNA受容菌としてははｍ−フルオ
ロフエニルアラニン感受性、メチオニン、スレオ
ニン、リジン要求株プレピバクテリウム・ラクト
フアーメンタムNo.64（ATCC39134）を使用した。 本菌のプロトプラストの調製は以下の通りであ
る。５mlのCHG培地で30℃で一晩増殖させた後
再度５mlのCMG培地に植菌し対数増殖期中期
（562mμにおける吸光度0.4）まで増殖させた。こ
れに最終濃度が0.6ユニツト／mlになるようにペ
ニシリンＧを添加し、さらに1.5時間培養した。
１mlを集菌し、SMMP（0.2Mシユークロース、
10mMマレイン酸、10mM塩化マグネシウム及び
1.75％ペナツセイプロス（Difco）で洗浄後、10
mg／mlのリゾチームを含むSMMP1.0mlに懸濁し、
30℃で20時間静置した。プロトプラストが形成さ
れているのを確認後6000rpm10分の遠心分離によ
り菌体を集めた。0.2MMgSO4・7H2Oを含む
SMM（0.25Mシユークロース、10mMマレイン酸
及び10mM塩化マグネシウムを含むPH6.5）1.0ml
で洗浄後、0.5mlのSMMPに懸濁し、プロトプラ
スト懸濁液として実験に用いた。 上記の方法により調製されたプロトプラスト
5μ及びDNA10μの混合液に２倍濃度のSMM
（0.5Mシユークロース、20mMマレイン酸及び
20mM塩化マグネシウムを含む、PH6.5）10μ及
び1MEDTA 1μを混合後、40％PEG（ポリエチ
レングリコール＃6000）75μ添加し、混合、室
温に２分間静置。0.5mlのSMMPを加え、洗浄後
１mlのSMMPに懸濁した。フロラムフエニコー
ル耐性遺伝子を発現させるため30℃で２時間振盪
し、再生培地（トリスヒドロキシルアミン12g/
、KG10.5g/、グルコース10g/、MgCl2・
6H2O8.1g/、CaCl2・2H2O 2.2g/、粉末酵母
エキスg/、ペプトン４g/、カザミノ酸１g/
、K2HPO40.2g/、コハク酸ナトリウム ・
2H2O 135g/、クロラムフエニコール3μg/ml及
び寒天末８g/を含むPH7.0）上に塗布し、30℃
で１週間培養した。生じたクロラムフエニコール
耐性コロニーをメチオニン、スレオニン、リジン
各々10mg/d及びｍ−フルオロフエニルアラニ
ン1000μg/mlを含む最少培地（グルコース20g/
、NH4DSO410g/、尿素３g/、KH2PO41.0
ｇ／、MgSO4・7H2O0.4g/、NaCl 0.05g/、
FeSO4・7H2O 10mg/、MnSO410mg/、ｄ−
ビオチン50μg/、チアミン・HCl 200μg/、
クロラムフエニコール10mg/及び寒天20g/を
含むPH7.0）上に移植し、このプレート上で生育
したコロニーを釣り上げた。かくして得られたｍ
−フルオロフエニルアラニン、クロラムフエニコ
ール耐性を示すコロニーAJ12081（FERM Ｐ−
7248、FERRM BP−580）により単離したプラ
スミドを制限酵素PstIで完全分解し、アガロース
ゲル電気泳動を行なつた結果フエニルアラニン生
産菌の染色体DNAに由来する1.2Mdと1.4Mdの
PstI断片がpAJ1844のPstI切断部位に搜入された
プラスミド（pAJ11）を有していた。 次にフエニルアラニン、チロシンを生育に要求
するコリスミン酸ムターゼβサブユニツト欠損株
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12082（FERM Ｐ−7249、FERM BP−581）
を受容菌として本プラスミドを用いて上記の方法
により形質転換したところ得られたクロラムフエ
ニコール耐性株はすべてがフエニルアラニン、チ
ロシン要求性を回復しており、かつフエニルアラ
ニン要求株を指標とした場合にフエニルアラニン
の生産が認められた。この結果本プラスミド上に
はは少なくともコリスミン酸ムターゼβサブユニ
ツトをコードする遺伝子が存在することが判明し
た。 実施例 ２ 実施例１で示したプロトプラスト形質転換法を
用いて、ブレビバクテリウム・ラクトフエルメン
タムNo.64（ATCC39134）、メチオニン、チロシン
要求性のフエニルアラニン生産菌ブレビバクテリ
ウム・ラクトフエルメンタムAJ3437（FERM Ｐ
−−1914、FERM BP−1071）及びコリネバク
テリウム・グルタムミカム（ATCC113060）を
pJ11を用いて形質転換した後、クロラムフエニ
コール耐性で選択し、AJ3437よりAJ12084
（FERM Ｐ−7251、FERM BP−583）を
ATCC13060よりAJ12083（FERM Ｐ−7250、
FERM BP−582）を得た。各形質転換株が
pAJ11を有しているのをアガロースゲル電気泳動
により確認後、フエニルアラニン生産培地（グル
コース130g/、（NH4）2SO420g/、KH2PO41
ｇ／、MgSO4・7H2O1g/、MnSO4・7H210
mg／、ビオチン50μg/ml、チアミン・HC12mg/
、大豆蛋白酸加水分解液、「味液」50ml/。酢
酸３ml/、フマル酸12g/及び炭酸カルシウム
50g/を含む、ただしATCC39134及びAJ12081
の培養の際にはリジン、スレオニン、メチオニン
を各15mg/d、AJ3437（FERM Ｐ−1914、
FERM BP−1071）及びAJ12084にはメチオニ
ン、チロシンを各40mg/dを添加した。PH7.0）
20mlに植菌し、30℃で３日間、あるいは４日間振
盪培養した。結果を第１表に示した。 第 １ 表 菌 株 Ｌ−フエニルアラニン 蓄積量 (mg/d) ATCC39134 0.0 AJ 12081 41 ATCC13060 2.0 AJ 12083 15 AJ 3437 1700 AJ 12084 1900
製造法に関する。 発酵法によりＬ−フエニルアラニンを製造しよ
うとする場合、野性株は殆んど菌体外にＬ−フエ
ニルアラニンを生産しないので、野性株に人工的
に突然変異を生起せしめてＬ−フエニルアラニン
生産能を付与する方法がとられている。従来知ら
れているＬ−フエニルアラニン生産能を有する人
工変異株としては、プレピバクテリウム又はコリ
ネバクテリウム属のフエニルアラニンアンタゴニ
ストに耐性を有する変異株（米国特許3660235）、
コリネバクテリウム属のチロシンを要求し、フエ
ニルアラニンアンタゴニストに耐性を有する変異
株（米国特許3759790）、ゴレビバクテリム属、コ
リネバクテリウム属のフエニルアラニンアンタゴ
ニストに耐性を有し、デコイニンに感受性を有す
る変異株（特開昭56−64793）等が知られている。 一方、最近上述のような人工変異による育種と
異なるところの遺伝子組換え技術をＬ−フエニル
アラニン生産菌の育種に利用する試みが報告され
ている。即ち、特開昭56−1890には、フエニルア
ラニン合成に関与するエシエリヒア属のクロモゾ
ームDNAフラグメントを組込んだプラスミドを
含有するエシエリヒア・コリの変異株がＬ−フエ
ニルアラニンを生産したことが記載されている。 本願発明者らは、叙上のような従来の発酵法に
よるＬ−フエニルアラニンの製造法に対し、コリ
ネホルム・グルタミン酸生産菌に属するDNA供
与菌より得られるコリスミン酸ムターゼβサブユ
ニツト遺伝子をコードするDNA断片が、コリネ
ホルム・グルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製
できるペクタープラスミドに接続されて、コリネ
ホルム・グルタミン酸生産菌に属し、メチオニン
及びチロシン要求性、ｍ−フルオロフエニルアラ
ニン耐性であるDNA受容菌に導入されて得られ
るＬ−フエニルアラニン生産能を有する微生物を
培養することにより、培養液中にＬ−フエニルア
ラニンを高蓄積できることを知り、本願発明を完
成させた。 すなわち本願発明は、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属するDNA供与菌より得られるコ
リスミン酸ムターゼβサブユニツト遺伝子をコー
ドするDNA断片が、コリネホルム・グルタミン
酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタープラ
スミドに接続されて、コリネホルム・グルタミン
酸生産菌に属し、メチオニン及びチロシン要求
性、ｍ−フルオロフエニルアラニン耐性である
DNA受容菌に導入されて得られるＬ−フエニル
アラニン生産能を有する微生物を培養し、培養液
中に蓄積されたＬ−フエニルアラニンを採取する
ことを特徴とするＬ−フエニルアラニンの製造法
であり、また、本願発明は前記遺伝子がフエニル
アラニンアンタゴニストに耐性を有するコリネホ
ルム・グルタミン酸生産菌より得られたものであ
る上記の製造法である。 コリスミン酸ムターゼβ−サブユニツト遺伝子
を含むDNA断片はコリネホルム・グルタミン酸
生産菌の染色体DNAより得ることができる（フ
エニルアラニン生合成系遺伝子を含むDNA断片
を与えるものをDNA供与菌と称する） コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテオロジー第
８版599頁（1974）に記載されている。 本発明の宿主菌として利用しうるコリネホル
ム・グルタミン酸生産菌の野性株の例としては次
のようなものがあげれる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC 15806 コリネバクデリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミウム
ATCC 13032、13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 コリネバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC 15354 コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタミ
ン酸生産性を失なつた変異株、あるいはその他の
生産物を生産する変異株も含まれる。 DNA供与菌としては、フエニルアラニンアン
タゴニスト耐性などの変異を付与することによ
り、フエニルアラニンまたはその前駆体の生合成
活性が高まつたような変異株を用いれば更によ
い。 フエニルアラニンアンタゴニストの例としては
ｏ−フルオロフエニルアラニン、ｍ−フルオロフ
エニルアラニン、ｐ−フルオロフエニルアラニ
ン、β−３−フエニルアラニン、５−メチルトリ
プトフアン等がある。ここにいうフエニルアラニ
ンの前駆体とは３−デヒドロキシ−Ｄ−アラビノ
ーヘペプツロン酸−７−リン酸、３−デヒドロキ
ナ酸、３−デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキミ
酸−３−リン酸、５−エノールピルビルシキミ
酸、３−リン酸、コリズミン酸、プレフエン酸、
フエニルピルピン酸などをいう。 このような変異株の例としては先に述べた米国
特許3660235、米国特許3759970、特開昭56−
64793等に記載されている。 コリスミン酸ムターゼβ−サブユニツト遺伝子
をコリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体内で
自律複製できるベクタ−プラスミド上に挿入して
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA受容菌、好ましくはコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌に属し、メチオニン及びチロシン要
求性、ｍ−フルオロフエニルアラニン耐性である
DNA受容菌に導入すれば、フエニルアラニン生
産能の向上した株を得ることができる。用いる遺
伝子としては野性型のものの他前述のようなフエ
ニルアラニンアンタゴニスト耐性などにより誘導
された変異型の遺伝子を用いると更によい。野生
型遺伝子を取得後、これが導入されたDNA受容
菌に変異処理を施してベクター上の遺伝子を改良
するか、野生型遺伝子を含むプラスミドDNAに
試験管内で、修飾して遺伝子を改良することは当
然良好な結果を生む場合がある。ここにいう遺伝
子の改良とは、遺伝子産物であるコリスミン酸ム
ターゼβサブユニツトの合成量が増強される１分
子当りの比活性が上昇する、生成物、最終産物に
よる酵素阻害が軽減または解除されるなどフエニ
ルアラニン生産を促進するような望ましい影響を
与える遺伝子の修飾をいう。 具体的にはプロモーター領域の変異または変換
あるいは構造遺伝子の変異、修飾によりこれらは
達せられる。コリスミン酸ムターゼβサブユニツ
ト遺伝子に加え、フエニルアラニン生合成系遺伝
子の複数の遺伝子を同一のベクタープラスミド上
に挿入するか、共存しうる複数のベクター上に
別々に挿入したのち受容菌に導入すればよりよい
結果を与える場合がある。 DNA受容菌として用いるコリネホルム・グル
タミン酸生産菌に属する菌としては、前述したよ
うな各種の菌株を用いうる。受容菌としてフエニ
ルアラニン要求性をもつ菌株を用いればその要求
性の消失により容易に、フエニルアラニン生合成
系遺伝子の導入された形質転換株を選択すること
ができる。またフエニルアラニンアンタゴニスト
に感受性の株を受容菌として用いた場合、フエニ
ルアラニンアンタゴニスト耐性に関与するフエニ
ルアラニン生合成系遺伝子の導入された形質転換
株をフエニルアラニンアンタゴニスト耐性株とし
て容易に選択することができる。より高いフエニ
ルアラニン生産能をもつ形質転換株を得るために
は、フエニルアラニンアンタゴニスト耐性、栄養
要求性などの変異を付与することによつてフエニ
ルアラニンまたはその前駆体の生合成活性が高ま
つたような変異株を受容菌として用いるとよりよ
い結果を与える。更に、フエニルアラニンの菌体
外への透過性が改善された変異様、フエニルアラ
ニンの分解性の低下した変異株、グルタミン、ホ
スホエノールピルビン酸などフエニルアラニン生
合成に素材として供給される代謝産物の生合成能
が高まつたような変異株または組換え体も当然良
い結果を生む場合がある。 使用するベクターとしてはコリネホルム・グル
タミン酸生産菌の中で自律複製できるプラスミド
であればいかなるものでもよい。 例として以下のものがあげられる。 (1) PAM330：特開昭58−67699参照 (2) pHM1519：特開昭58−77895参照 (3) pAJ655 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11882 （FERM−P6571＝FERM−
BP136など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第１図参照 (d) 性 質：pAM330とpBR325（Gene４ 121
（1978）の複合プラスミド。 クロラムフエニコール耐性に与
る。 (4) pAJ611 (a) 宿主菌： エシエリヒア・コリAJ11884 （FERM−P6519＝FERM−
BP138など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第２図参照 (d) 性 質：pAM281とpBR325の複合プラス
ミド。 クロラムフエニコール耐性に与
る。 (5) pAJ440 (a) 宿主菌：バチルスズブチリス AJ 11901 （FERM−BP140＝ATCC39139
など） (b) 分子量： 6.0メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第３図参照 (d) 性 質：pAM330とpUB110 （J. Bacteriol.、134 318 （1978））の複合プラスミド。 カナマイシン耐性に与る。 (6) pAJ1844 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリ AJ11883 （FERM Ｐ−6518＝FERM BP
−137など） (b) 分子量： 5.4メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第４図参照 (d) 性 質：pHM1519とpBR325の複合プラ
スミド。 クロラムフエニコール耐性に与
る。 (7) pAJ3148 (a) 宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミカ
ム SR8203 ATCC39137など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第５図参照 (d) 性 質：pHM1519とpUB110との複合プ
ラスミド。 カナマイシン耐性に与る。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で増
殖可能なプラスミドのその他の例としてはpCG1
（特開昭57−134500）、pCG2（特開昭58−35197）、
pCG4、pCG11（特開昭57−183799）があり、これ
らはいずれも当然使用可能であろう。 DNA供与菌の染色体DNA及び、ベクター
DNAは通常の方法により抽出することができる。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
酵素を用いて切断する。ベクターDNAの開裂は
当該ベクターDNAを一ケ所で切断する制限酵素
を用いて切断するか、複数部位切断する制限酵素
を部分的に作用させることにより達せられる。染
色体DNAについては、制限エンドヌクレアーゼ
による切断が部分的に行われるように、反応条件
を調節すれば多くの種類の制限酵素が使用でき
る。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の方法が使用できる。一方、
ターミナルトランスフエラーゼを用いて、染色体
DNA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシ
アデニル酸とデオキシチシジル酸、または、デオ
キシグアニル酸とデオキシチシジル酸をそれぞれ
付加し、混合したのち、アニーリングして連結せ
しめる方法も利用しうる。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの連結物のコリネホルム・グル
タミン酸生産菌に属する受容菌への導入は、エシ
エリヒア・コリＫ−12について報告されている様
な（Mandel，Ｍ，and Higa，A.，J.Mol.Biol.、
53、159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウムで
処理してDNAの透過性を増す方法、またはバチ
ルス・ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，Ｃ，H.，Wilson，G.A.and Young，
F.E.，Gene，１、153（1977））細胞がDNAを取
り込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテ
ントセル）に導入する方法により可能である。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および
酵母について知られている様に（Chang，Ｓ，
and Choen，S.N.Molec.Gen.Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.Nature、224、398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、75 1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエプラストにしてプ
ラスミドをDNA受容菌に導入することも可能で
ある。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ブブチ
リスの方法でも充分高い頻度を得ることができる
し、特開昭57−183799に記載されたコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属のプロトポ
ラストにプリエチレングリコールまたはポリビニ
ルアルコールと二価金属イオンとの存在下に
DNAをとり込ませる方法も当然利用できる。ポ
リエチレングリコールまたはポリビニルアルコー
ルのかわりに、カルボキシメチルセルロース、デ
キストラン、フイコール、、プルロニツクF68（セ
ルバ社）などの添加によつてDNAのとり込みを
促進させる方法でも同等の結果が得られる。 フエニルアラニン生合成系遺伝子がベクタープ
ラスミドに接続されて、導入された形質転換株を
選択は、フエニルアラニン要求株を受容菌とした
場合にはフエニルアラニン要求性を失なつた株を
選ぶことにより、フエニルアラニンアンタゴニス
ト感受性菌を受容菌としてフエニルアラニンアン
タゴニスト耐性に与るフエニルアラニン生合成系
遺伝子を導入する場合は該アンタゴニスト耐性と
なつた株を選ぶことにより、容易に達せられる
が、フエニルアラニン生産性の向上を指標として
選択することも可能である。ベクター薬剤耐性な
どの遺伝マーカーが存在する場合にはこの形質を
併せて選択に用いれば、より容易に形質転換株を
選ぶことができる。 得られたＬ−フエニルアラニン生産菌を培養す
る方法は、従来のＬ−フエニルアラニン生産菌の
培養方法と特に変らない。即ち、培地としては、
炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常のものである。炭素源としては、グルコーー
ス、シユクロース、ラクトース等及びこれらを含
有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いら
れる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモ
ニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−フエニルアラニンの生
産蓄積が停止するまで行なわれる。 かくして培養液中には著量のＬ−フエニルアラ
ニンが生成蓄積される。培養液よりＬ−フエニル
アラニンを採取するには、通常の方法が適用でき
る。 実施例 １ フエニルアラニンアナログであるｍ−フルオロ
フエニルアラニンに対して抵抗性を有するフエニ
ルアラニン生産菌ブレビバクテリウムラクトフエ
ルメンタム AJ3437（FERM Ｐ−1914、FERM
BP−1071）から調製した染色体DNA（10μg）を
制限酵素PstIで部分分解し、一方、同酵素に対し
て１ケ所切断部位を有し、クロラムフエニコール
耐性のベクタープラスミドpAJ1844（5μg）を同酵
素で完全分解し、65℃、10分の熱処理により酵素
を失活させた後、両者を混合。リガーゼ反応を22
℃で２時間行ない、冷エタノールを加え、沈澱物
をTEN緩衝液に溶解し、プロトプラスト形質転
換に用いた。DNA受容菌としてははｍ−フルオ
ロフエニルアラニン感受性、メチオニン、スレオ
ニン、リジン要求株プレピバクテリウム・ラクト
フアーメンタムNo.64（ATCC39134）を使用した。 本菌のプロトプラストの調製は以下の通りであ
る。５mlのCHG培地で30℃で一晩増殖させた後
再度５mlのCMG培地に植菌し対数増殖期中期
（562mμにおける吸光度0.4）まで増殖させた。こ
れに最終濃度が0.6ユニツト／mlになるようにペ
ニシリンＧを添加し、さらに1.5時間培養した。
１mlを集菌し、SMMP（0.2Mシユークロース、
10mMマレイン酸、10mM塩化マグネシウム及び
1.75％ペナツセイプロス（Difco）で洗浄後、10
mg／mlのリゾチームを含むSMMP1.0mlに懸濁し、
30℃で20時間静置した。プロトプラストが形成さ
れているのを確認後6000rpm10分の遠心分離によ
り菌体を集めた。0.2MMgSO4・7H2Oを含む
SMM（0.25Mシユークロース、10mMマレイン酸
及び10mM塩化マグネシウムを含むPH6.5）1.0ml
で洗浄後、0.5mlのSMMPに懸濁し、プロトプラ
スト懸濁液として実験に用いた。 上記の方法により調製されたプロトプラスト
5μ及びDNA10μの混合液に２倍濃度のSMM
（0.5Mシユークロース、20mMマレイン酸及び
20mM塩化マグネシウムを含む、PH6.5）10μ及
び1MEDTA 1μを混合後、40％PEG（ポリエチ
レングリコール＃6000）75μ添加し、混合、室
温に２分間静置。0.5mlのSMMPを加え、洗浄後
１mlのSMMPに懸濁した。フロラムフエニコー
ル耐性遺伝子を発現させるため30℃で２時間振盪
し、再生培地（トリスヒドロキシルアミン12g/
、KG10.5g/、グルコース10g/、MgCl2・
6H2O8.1g/、CaCl2・2H2O 2.2g/、粉末酵母
エキスg/、ペプトン４g/、カザミノ酸１g/
、K2HPO40.2g/、コハク酸ナトリウム ・
2H2O 135g/、クロラムフエニコール3μg/ml及
び寒天末８g/を含むPH7.0）上に塗布し、30℃
で１週間培養した。生じたクロラムフエニコール
耐性コロニーをメチオニン、スレオニン、リジン
各々10mg/d及びｍ−フルオロフエニルアラニ
ン1000μg/mlを含む最少培地（グルコース20g/
、NH4DSO410g/、尿素３g/、KH2PO41.0
ｇ／、MgSO4・7H2O0.4g/、NaCl 0.05g/、
FeSO4・7H2O 10mg/、MnSO410mg/、ｄ−
ビオチン50μg/、チアミン・HCl 200μg/、
クロラムフエニコール10mg/及び寒天20g/を
含むPH7.0）上に移植し、このプレート上で生育
したコロニーを釣り上げた。かくして得られたｍ
−フルオロフエニルアラニン、クロラムフエニコ
ール耐性を示すコロニーAJ12081（FERM Ｐ−
7248、FERRM BP−580）により単離したプラ
スミドを制限酵素PstIで完全分解し、アガロース
ゲル電気泳動を行なつた結果フエニルアラニン生
産菌の染色体DNAに由来する1.2Mdと1.4Mdの
PstI断片がpAJ1844のPstI切断部位に搜入された
プラスミド（pAJ11）を有していた。 次にフエニルアラニン、チロシンを生育に要求
するコリスミン酸ムターゼβサブユニツト欠損株
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12082（FERM Ｐ−7249、FERM BP−581）
を受容菌として本プラスミドを用いて上記の方法
により形質転換したところ得られたクロラムフエ
ニコール耐性株はすべてがフエニルアラニン、チ
ロシン要求性を回復しており、かつフエニルアラ
ニン要求株を指標とした場合にフエニルアラニン
の生産が認められた。この結果本プラスミド上に
はは少なくともコリスミン酸ムターゼβサブユニ
ツトをコードする遺伝子が存在することが判明し
た。 実施例 ２ 実施例１で示したプロトプラスト形質転換法を
用いて、ブレビバクテリウム・ラクトフエルメン
タムNo.64（ATCC39134）、メチオニン、チロシン
要求性のフエニルアラニン生産菌ブレビバクテリ
ウム・ラクトフエルメンタムAJ3437（FERM Ｐ
−−1914、FERM BP−1071）及びコリネバク
テリウム・グルタムミカム（ATCC113060）を
pJ11を用いて形質転換した後、クロラムフエニ
コール耐性で選択し、AJ3437よりAJ12084
（FERM Ｐ−7251、FERM BP−583）を
ATCC13060よりAJ12083（FERM Ｐ−7250、
FERM BP−582）を得た。各形質転換株が
pAJ11を有しているのをアガロースゲル電気泳動
により確認後、フエニルアラニン生産培地（グル
コース130g/、（NH4）2SO420g/、KH2PO41
ｇ／、MgSO4・7H2O1g/、MnSO4・7H210
mg／、ビオチン50μg/ml、チアミン・HC12mg/
、大豆蛋白酸加水分解液、「味液」50ml/。酢
酸３ml/、フマル酸12g/及び炭酸カルシウム
50g/を含む、ただしATCC39134及びAJ12081
の培養の際にはリジン、スレオニン、メチオニン
を各15mg/d、AJ3437（FERM Ｐ−1914、
FERM BP−1071）及びAJ12084にはメチオニ
ン、チロシンを各40mg/dを添加した。PH7.0）
20mlに植菌し、30℃で３日間、あるいは４日間振
盪培養した。結果を第１表に示した。 第 １ 表 菌 株 Ｌ−フエニルアラニン 蓄積量 (mg/d) ATCC39134 0.0 AJ 12081 41 ATCC13060 2.0 AJ 12083 15 AJ 3437 1700 AJ 12084 1900
第１図：複合プラスミドpAI655の制限酵素切
断地図、第２図：複合プラスミドpAJ611の制限
酵素切断地図、第３図：複合プラスミドpAJ1844
の制限酵素切断地図、第４図：複合プラスミド
pAJ440の制限酵素切断地図、第５図：複合プラ
スミドpAJ3148の制限酵素切断地図。
断地図、第２図：複合プラスミドpAJ611の制限
酵素切断地図、第３図：複合プラスミドpAJ1844
の制限酵素切断地図、第４図：複合プラスミド
pAJ440の制限酵素切断地図、第５図：複合プラ
スミドpAJ3148の制限酵素切断地図。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA供与菌より得られるコリスミン酸ムターゼ
βサブユニツト遺伝子をコードするDNA断片が、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体内で自
律複製できるベクタープラスミドに接続されて、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属し、メチ
オニン及びチロシン要求性、ｍ−フルオロフエニ
ルアラニン耐性であるDNA受容菌に導入されて
得られるＬ−フエニルアラニン生産能を有する微
生物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ−フエニ
ルアラニンを採取することを特徴とするＬ−フエ
ニルアラニンの製造法。 ２ 遺伝子がフエニルアラニンアンタゴニストに
耐性を有するコリネホルム・グルタミン酸生産菌
より得られたものである特許請求の範囲第１項記
載の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58175710A JPS6066984A (ja) | 1983-09-22 | 1983-09-22 | 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法 |
| CA000463704A CA1283070C (en) | 1983-09-22 | 1984-09-20 | Process for production of l-phenylalanine by fermentation |
| DE8484111301T DE3485006D1 (de) | 1983-09-22 | 1984-09-21 | Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin durch fermentation. |
| EP19840111301 EP0137387B1 (en) | 1983-09-22 | 1984-09-21 | Process for production of l-phenylalanine by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58175710A JPS6066984A (ja) | 1983-09-22 | 1983-09-22 | 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法 |
Publications (2)
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| JPS6066984A JPS6066984A (ja) | 1985-04-17 |
| JPH0529437B2 true JPH0529437B2 (ja) | 1993-04-30 |
Family
ID=16000881
Family Applications (1)
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| JP58175710A Granted JPS6066984A (ja) | 1983-09-22 | 1983-09-22 | 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法 |
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