JPH0510075B2 - - Google Patents

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JPH0510075B2
JPH0510075B2 JP59202334A JP20233484A JPH0510075B2 JP H0510075 B2 JPH0510075 B2 JP H0510075B2 JP 59202334 A JP59202334 A JP 59202334A JP 20233484 A JP20233484 A JP 20233484A JP H0510075 B2 JPH0510075 B2 JP H0510075B2
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JP
Japan
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gene
dna fragment
dna
coryneform
plasmid
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Kazuhiko Matsui
Kyoshi Miwa
Takanosuke Sano
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Publication date
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Priority to US07/397,370 priority patent/US5017481A/en
Priority to JP4063513A priority patent/JPH0724591B2/ja
Publication of JPH0510075B2 publication Critical patent/JPH0510075B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
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  • Biomedical Technology (AREA)
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】 産業䞊の利甚分野 この発明は、シキミ酞キナヌれ遺䌝子を含有す
る、コリネ型现菌由来のDNA断片、シキミ酞キ
ナヌれ遺䌝子ず−デヒドロキナ酞シンタヌれ遺
䌝子を含有する、コリネ型现菌由来のDNA断片、
及びシキミ酞キナヌれ遺䌝子ず−デヒドロキナ
酞シンタヌれ遺䌝子およびシキミ酞デヒドロゲナ
ヌれ遺䌝子を含有する、コリネ型现菌由来の
DNA断片に関し、たた本発明は、該DNA断片を
含むプラスミドに関し、さらに本発明は、該プラ
スミドを保持するコリネ型现菌に関する。 埓来の技術 シキミ酞キナヌれ以䞋「SK」ず蚘す。は、
シキミ酞をシキミ酞−リン酞に倉換する反応を
觊媒する酵玠であり、シキミ酞−リン酞は、コ
リスミ酞を経由しおプニルアラニン、チロシン
又はトリプトフアンに倉換される。 䞀方、組換えDNA法によりこれら芳銙族アミ
ノ酞生産菌を育皮するこずは、いく぀か知られお
いるが䟋えば特開昭57−208994、特開昭57−
71397、特開昭58−89194、特開昭58−134994等、
SKをコヌドする遺䌝子以䞋「SK遺䌝子」ず蚘
す組蟌たれたものではない。 発明が解決しようずする問題点 本発明の課題は、芳銙族アミノ酞の生合成遺䌝
子をクロヌニングし、該遺䌝子が増幅された、芳
銙族アミノ酞の生産性がより高い埮生物を埗るこ
ずである。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙䞊の問題点を解決するため研
究の結果、コリネ型现菌现胞内で発珟しSKをコ
ヌドする遺䌝子がコリネ型现菌现胞内で増殖しう
るプラスミドベクタヌに接続されおいる組換え
DNAを有するコリネ型现菌を分離するこずに成
功し、埗られたコリネ型现菌が芳銙族アミノ酞の
高い生産性を有するこずを芋し出した。 本発明にいうコリネ型现菌Coryneform
bacteriaは、バヌゞヌス・マニナアル・オブ・
デタヌミネむテむブ・バクテリオロゞヌ
Bargeys Manual of Determinative
Bacteriology第版599頁1974に定矩され
おいる䞀矀の埮生物であり、奜気性、グラム陜
性、非抗酞性、胞子圢成胜を有しない桿菌であ
る。このようなコリネ型现菌のうち特に以䞋に述
べるようなコリネ型グルタミン酞生産性现菌が本
発明においおは、最も奜たしいものである。 コリネ型グルタミン酞生産性现菌の野性株の䟋
ずしおは次のようなものがあげられる。 【衚】 ロリテむクム
【衚】 ニアフむラム
本発明のコリネ型グルタミン酞生産性现菌には
䞊蚘のようなグルタミン酞生産性を有する野性株
のほかにグルタミン酞生産性を有するたたはグル
タミン酞生産性を倱぀た倉異株も含たれる。 SK遺䌝子を単離する方法は、コリネ型现菌の
SK遺䌝子を有しおいる株より、たず染色䜓遺䌝
子を抜出し䟋えばH.Saito and K.Miura
Biochem.Biophys.Acta726191963の方法
が䜿甚できる。、これを適圓な制限酵玠で切断す
る。぀いで、コリネ型现菌现胞内で増殖し埗るプ
ラスミドベクタヌに接続し、埗られた組換え
DNAを甚いおコリネ型现菌のSK欠損倉異株を圢
質転換せしめ、SK生成掻性を保有するにいた぀
た菌株を単離し、これよりSK遺䌝子を分離でき
る。 染色䜓遺䌝子を切断するために、切断反応時間
等を調節しお切断の皋床を調節すれば、巟広い皮
類の制限酵玠が䜿甚できる。 本発明にお䜿甚されるプラスミドベクタヌは、
コリネ型现菌现胞内においお増殖し埗るものであ
ればどのようなものでも良い。具䜓的に䟋瀺すれ
ば、以䞋のものがあげられる。 (1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pHM 1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ 655 特開昭58−192900参照 (4) pAJ 611 同 侊 (5) pAJ 1844 同 侊 (6) pCG  特開昭57−134500参照 (7) pCG  特開昭58−35197参照 (8) pCG  特開昭57−183799参照 (9) pCG 11 同 侊 プラスミドベクタヌDNAの開裂は、圓該DNA
を䞀箇所で切断する制限酵玠を甚いお切断する
か、耇数郚䜍を切断する制限酵玠を甚いお郚分的
に切断するこずにより行う。 ベクタヌDNAは、染色䜓遺䌝子を切断した際
に甚いられた制限酵玠により切断され、たたは染
色䜓DNA切断フラグメント及び切断されたベク
タヌDNAのそれぞれの䞡端に盞補的な塩基配列
を有するオリゎヌクレオチドを接続せしめお、぀
いでプラスミドベクタヌず染色䜓DNAフラグメ
ントずのラむゲヌシペン反応に付される。 このようにしお埗られた、染色䜓DNAずベク
タヌプラスミドずの組換えDNAをコリネ型现菌
に属する受容菌ぞ導入するには、゚シ゚リヒア・
コリ−12に぀いお報告されおいる様な
MandelM.and HigaA.J.Mol.Biol.
531591970受容菌现胞を塩化カルシりムで凊
理しおDNAの透過性を増す方法、たたはバチル
ス・ズブチリスに぀いお報告されおいる様に
DuncanC.H.WilsonG.A.and YoungF.
E.Gene1531977现胞がDNAを取り
蟌み埗る様になる増殖段階いわゆるコンビテン
トセルに導入する方法により可胜である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、攟線菌類および酵
母に぀いお知られおいる様にChangS.and
ChoenS.N.Molec.Gen.Genet.168111
1979BibbM.J.WardJ.M.and
HopwoodO.A.Nature2743981978
HinnenA.HicksJ.B.and FinkG.R.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA7519291978、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り蟌
むプロトプラストたたはスプロプラストにしお
プラスミドをDNA受容菌に導入するこずも可胜
である。 プロトプラスト法では䞊蚘のバチルス・ズブチ
リスにおいお䜿甚されおいる方法でも充分高い頻
床を埗るこずができるし、特開昭57−183799に蚘
茉されたコリネバクテリりム属たたはブレビバク
テリりム属のプロトプラストにポリ゚チレングリ
コヌルたたはポリビニルアルコヌルず二䟡金属む
オンずの存圚䞋にDNAをずり蟌たせる方法も圓
然利甚できる。ポリ゚チレングリコヌルたたはポ
リビニルアルコヌルの代りに、カルボキシメチル
セルロヌス、デキストラン、フむコヌル、ブルロ
ニツクF68セルバ瀟などの添加によ぀おDNA
のずり蟌みを促進させる方法でも同等の結果が埗
られる。 芳銙族アミノ酞生産菌ずしお、SK欠損株を宿
䞻ずしお圢質転換した株を甚いるこずができる
が、以䞋に瀺すような宿䞻を甚いればより芳銙族
アミノ酞の生産性が高い菌株が埗られるこずがあ
る。 チロシンの堎合 コリネバクテリりム属のプニルアラニンを芁
求し−アミノチロシン、−アミノプニルア
ラニン、−フルオロプニルアラニン、チロシ
ンヒドロキサメヌトに耐性を有する倉異株H.
HaginoK.NakayawaAgric.Biol.Chem.
3720131973、ブレビバクテリりム属の−フ
ルオロプニルアラニンに耐性を瀺す倉異株S.
SugimotoM.NakagawaT.TsuchidaI.
Shiio.Agric.Biol.Chem.3723271973等
がある。 トリプトフアンの堎合 ブレビバクテリりム属のプニルアラニン、チ
ロシンを芁求し、−メチルトリプトフアンに耐
性を有する倉異株I.ShiioH.SatoM.
Nakagawa.Agric.Biol.Chem.362315
1972、ブレビバクテリりム属のプニルアラ
ニンを芁求し、−フルオロプニルアラニン、
−フルオロトリプトフアンに耐性を有する倉異
株I.ShiioS.SugimotoM.Nakagawa.
Agric.Biol.Chemi.396271975、ブレビバ
クテリりム属のチロシンを芁求し、−フルオロ
トリプトフアン、アザセリンに耐性を有する倉異
株、コリネバクテリりム属のプニルアラニン、
チロシンを芁求し、−メチルトリプトフアン、
−メチルトリプトフアン、−フルオロトリプ
トフアン、トリプトフアンヒドロキサメヌト、
−フルオロプニルアラニン、チロシンヒドロキ
サメヌト、プニルアラニンヒドロキサメヌトに
耐性を有する倉異株H.HaginoK.
Nakayama.Agric.Biol.Chem.39345
1975等がある。 プニルアラニンの堎合 ブレビバクテリりム属の−フルオロプニア
ラニン耐性を有する倉異株S.SugimotoM.
NakagawaT.TsuchidaI.Shiio.Agric.Biol.
Chem.3723271973、ブレビバクテリりム
属のチロシン、メチオニンを芁求し−メチルト
リプトフアン、−フルオロプニルアラニンに
耐性を有する倉異株特開昭49−116294、ブレ
ビバクテリりム属のチロシン、メチオニンを芁求
し、−メチルトリプトフアン、−フルオロフ
゚ニルアラニン耐性、デコむニン感受性を有する
倉異株特開昭56−64793コリネバクテリりム
属のチロシンを芁求し、−フルオロプニルア
ラニン、−アミノプニルアラニンに耐性を有
する倉異株H.HaginoK.Nakayama.Agric.
Biol.Chem.381571974等がある。 SK遺䌝子のほかに、以䞋の遺䌝子が挿入され
おいれば芳銙族アミノ酞の生産性がより高くなる
こずが倚い。実斜䟋で瀺す様に−デヒドロキナ
酞シンタヌれをコヌドする遺䌝子、シキミ酞デヒ
ドロゲナヌれをコヌドする遺䌝子が挿入された堎
合や、−デオキシ−−アラビノ−ヘプチナロ
ン酞−−リン酞DAHPシンタヌれ遺䌝子、
−デヒドロキナ酞デヒドラタヌれ遺䌝子、−
゚ノヌルピルビルシキミ酞−−リン酞シンタヌ
れ、コリズミ酞シンタヌれ遺䌝子があげられる。 加えおトリプトフアン生産菌を埗ようずするず
きは、アンスラニル酞シンタヌれ遺䌝子、アンス
ラニル酞ホスホリボシルトランスプラヌれ遺䌝
子、−5′−ホスホリボシルアンスラニル酞
む゜メラヌれ遺䌝子、むンドヌル−−グリセロ
ヌルリン酞シンタヌれ遺䌝子、トリプトフアンシ
ンタヌれ遺䌝子等が挿入されおいればよりよい結
果が埗られるこずがある。 たたプニルアラニン又はチロシン生産菌を埗
ようずするずきは、プレプン酞デヒドラタヌれ
遺䌝子、プレプン酞トランスアキナヌれ、プレ
チロシンデヒドロゲナヌれ遺䌝子、チロシンアミ
ノトランスプラヌれ遺䌝子等がSK遺䌝子のほ
かに挿入されおいるこずが望たしい。 このようにしお埗られた芳銙族アミノ酞生産胜
を有するコリネ型现菌を培逊しお芳銙族アミノ酞
を生成蓄積せしめる方法は、埓来コリネ型现菌に
よる芳銙族アミノ酞の補造のために䜿甚されおい
た方法ず特に倧きく違う点はない。即ち、培地ず
しおは、炭玠源、窒玠源、無機むオン、曎に必芁
に応じアミノ酞、ビタミン等の有機埮量栄逊玠を
含有する通垞のものである。炭玠源ずしおは、グ
ルコヌス、シナクロヌス、ラクトヌス等及びこれ
らを含有する柱粉加氎分解液、ポむ、糖蜜等が
甚いられる。窒玠源ずしおは、アンモニアガス、
アンモニア氎、アンモニりム塩その他が䜿甚でき
る。 培逊は奜気的条件䞋で培地のPH及び枩床を適宜
調節し぀぀、実質的に芳銙族アミノ酞の生産蓄積
が停止するたで行なわれる。 実斜䟋 (1) SK遺䌝子を含む染色䜓DNAの調補 ブレビバクテリりム・ラクトプルメンタム
AJ11225FERM −4370FERM BP−1219
をのCMG培地ペプトンdl、酵母゚
キスdl、グルコヌス0.5dl、及び
NaCl0.5dlを含み、PH7.2に調補したものに
怍菌し、30℃で玄時間振盪培逊を行ない、察数
増殖期の菌䜓を集めた。 この菌䜓をリゟチヌム・SDSで溶菌させたの
ち、通垞のプノヌル凊理法により、染色䜓
DNAを抜出粟補し、最終的に3.5mgのDNAを埗
た。 (2) ベクタヌDNAの調補 ベクタヌずしおpAJ1844分子量5.4メガダルト
ンを甚い、そのDNAを次の様にしお調補した。 たずpAJ1844をプラスミドずしお保有するブレ
ビバクテリりム・ラクトプルメンタムAJ12037
FERM− 7234FERM−BP 577を100ml
のCMG培地に接皮し、30℃で察数増殖期埌期た
で培逊したのち、リゟチヌムSDS凊理により溶菌
させ、30000×30分の超遠心により䞊枅を埗
た。プノヌル凊理ののち、容の゚タノヌルを
加えおDNAを沈柱回収した。これを少量のTEN
緩衝液20mMトリス塩酞塩、20mM NaCl
1mM EDTAPH8.0に溶解埌、アガロヌスゲ
ル電気泳動にかけ分離埌、切り出しおpAJ1844プ
ラスミドDNA箄15ÎŒgを埗た。 (3) 染色䜓DNA断片のベクタヌぞの挿入 (1)で埗た染色䜓DNA10ÎŒgず(2)で埗たプラスミ
ドDNA5ÎŒgずを制限゚ンドヌクレアヌれPstで
それぞれを37℃に時間保持し、切断した。65℃
に10分間加熱した埌、䞡反応液を混合し、ATP
及びゞチオスレむトヌル存圚䞋、T4フアヌゞ由
来のDNAリガヌれによ぀お10℃に24時間保持し
DNA鎖を連結せしめた。぀いで反応液を、65℃
にお分間加熱し、反応液に倍容の゚タノヌル
を加えお連結されたDNAの沈柱を採取した。 (4) SK遺䌝子のクロヌニング SK遺䌝子が欠損したブレビバクテリりム・ラ
クトプルメンタムAJ12157ブレビバクテリり
ム・ラクトプルメンタムAJ12036FERM−
P7559を芪株ずし、−メチル−−ニトロ−
−ニトロ゜グアニゞンにより倉異凊理するこず
によりプニルアラニントリプトフアンチロ
シンのアミノ酞を生育に芁求する倉異株ずしお
遞択した。を受容菌ずしお甚いた。 圢質転換の方法ずしおは、プロトプラストトラ
ンスフオヌメヌシペン法を甚いた。たず、菌株を
mlのCMG液䜓培地で察数増殖期の初期たで培
逊し、ペニシリンを0.6ナニツトml添加埌、
さらに1.5時間振盪培逊し、遠心分離により菌䜓
を集め、菌䜓を0.5Mシナヌクロヌス、20mMマ
レむン酞、20mM塩化マグネシりム、3.5ペナ
ツセむブロスDifcoからなるSMMP培地PH
6.50.5mlで掗浄した。次いで10mgmlのリゟチ
ヌムを含むSMMP培地に懞濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図぀た。6000×、10分間遠心
分離埌、プロトプラストをSMMPで掗浄し0.5ml
のSMMPに再床懞濁した。この様にしお埗られ
たプロトプラストず(3)で調補したDNA10ÎŒgを
5mM EDTA存圚䞋で混合し、ポリ゚チレングリ
コヌルを最終濃床が30になる様に添加した埌、
DNAをプロトプラストに取り蟌たせるために宀
枩に分間攟眮した。このプロトプラストを
SMMP培地mlで掗浄埌、SMMP培地mlに再
懞濁し、圢質発珟のため、30℃で時間培逊し
た。この培逊液をPH7.0のプロトプラスト再生培
地䞊に塗垃した。プロトプラスト再生培地は蒞留
氎あたりトリスヒドロキシメチルアミノ
メタン12、KCl0.5、グルコヌス10、
MgCl2・6H2O8.1、CaCl2・2H2O2.2、ペプ
トン、粉末酵母゚キス、カザミノ酞
Difco瀟、K2HPO40.2、コハク酞ナト
リりム135、寒倩及びクロラムプニコヌ
ル3ÎŒgmlを含む。 30℃で週間培逊埌、玄25000個のクロラムフ
゚ニコヌル耐性コロニヌが出珟しおきたのでこれ
を最少培地グルコヌス、硫酞アンモニ
りム、0.3尿玠、0.1リン酞二氎玠カリりム、
0.04硫酞マグネシりム氎塩、2ppm鉄むオン、
2ppmマンガンむオン、200ÎŒgサむアミン塩
酞塩、50ÎŒgビオチン、クロラムプニコヌ
ル10ÎŒgml、PH7.0、寒倩1.8にレプリカし、
クロラムプニコヌル耐性でか぀プニルアラニ
ン、トリプトフアン、チロシン芁求性の消倱した
株を埗た。 (5) 圢質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液
を調補し、アガロヌスゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを怜出したずころ、党おの株でベ
クタヌのpAJ1844よりも明らかに倧きなプラスミ
ドが怜出された。 株のプラスミドをそれぞれ組換えに甚いた制
限酵玠Pstで切断するず党おのプラスミドに共
通な2.9kbのDNA挿入断片が認められた。埓぀お
SK遺䌝子2.9kbのPstIDNA断片䞊に存圚するず
思われる。ベクタヌpAJ1844のPst切断点に
2.9kbのDNA断片が挿入された組換プラスミドを
pAJ927ず名付け、2.9kbのDNA断片以倖に
1.15kbず4.3kbのPstIDNA断片を有する組換えプ
ラスミドをpAJ1219ず名付け、pAJ927を保持す
る株をAJ12158FERM −7865FERM BP−
888pAJ1219を保持する株をAJ12159FERM 
−7866FERM BP−889ず名付けた。 (6) 再トランスホヌメヌシペン (5)で怜出された2.9キロベヌスのDNA断片を含
む組換えプラスミド䞊にSK遺䌝子が存圚するこ
ずを確認するためこのプラスミドDNA pAJ1219
ずpAJ927を甚い、ブレビバクテリりム・ラクト
プルメンタムAJ12157を再床、圢質転換した。 生じたクロラムプニコヌル耐性コロニヌのう
ちそれぞれ10個を釣り䞊げプニルアラニン、ト
リプトフアン、チロシンの䞉重芁求性をテストし
たずころ、これらのいずれも芁求性が消倱しおお
り、䞊蚘の組換えプラスミド䞊にSK遺䌝子が存
圚するこずが明らかずな぀た。 (7) 圢質転換株のSK掻性 被怜株をトリプトフアン生産培地グルコヌス
130、NH42SO425、KH2PO4、
MgSO4・7H2O1、フマル酞12、酢酞ml、
倧豆蛋癜酞加氎分解液「味液」50ml、MnSO4・
4H2O10mg、ビオチン50ÎŒg、サむアミン塩酞塩
2000ÎŒg及びCaCO350を氎に含む。PH6.5
20mlで30℃にお22時間培逊した菌䜓より、超音波
凊理により、溶菌液を調補し、これを32000×、
20分間遠心分離しお䞊枅を埗た。この䞊枅を粗酵
玠液ずしお甚い50mM Veronal緩衝液PH9.0、
1mMシキミ酞、4mM ATP、5mM MgCl2、
10mM NaFから成る反応液䞭で30℃、30分間反
応させ、反応終了埌1Mトリス−塩酞緩衝液PH
7.80.2mlを加え、100℃で分間凊理し、酵玠
を倱掻させる。冷华埌3.0mlの反応液シキミ酞
を〜10ÎŒg含むように適圓に垌釈した反応液
に0.5mlの過ペり玠酞を加え、時間宀枩に
攟眮し、0.5mlの1N氎酞化ナトリりムを加え、た
だちに0.3mlの0.1Mグリシンを添加し、380mΌの
吞光床を枬定するこずによりシキミ酞を定量し
た。反応液䞭に添加したシキミ酞の量から反応終
了埌のシキミ酞の量を差し匕き、SK掻性を求め
た。第衚に枬定結果を瀺す。 【衚】 (8) 組換えプラスミド pAJ927pAJ1219䞊のシキミ酞デヒドロゲナ
ヌれ遺䌝子及び−デヒドロキナ酞シンタヌれ遺
䌝子の同定 pAJ927及びpAJ1219を倧腞菌−12株由来の
シキミ酞デヒドロゲナヌれ欠損株AB2834、−
デヒドロキナ酞シンタヌれ欠損株AB2847・
Pittardet alJ.Bacteriol.1494911966に
導入した。 倧腞菌−12株の倉異株AB28342847ぞは
DNA受容菌现胞を塩化カルシりムで凊理しお
DNAの透過性を増す方法を甚いおpAJ927
pAJ1219を圢質転換し、生じたクロラムプニル
コヌル耐性コロニヌのうちそれぞれ10個を釣り䞊
げプニルアラニン、チロシン、トリプトフアン
芁求性を調べた。pAJ927pAJ1219ずもAB2847
の党おの芁求性を消倱したが、AB2834の芁求性
はpAJ927の圢質転換株では消倱せず、pAJ1219
の圢質転換株では党おの芁求性が消倱した。 埓぀お、pAJ927にはSK−デヒドロキナ酞
シンタヌれ遺䌝子が2.9kbの挿入PstIDNA断片䞊
にクロヌニングされおおり、pAJ1219にはSK
−デヒドロキナ酞シンタヌれ、シキミ酞デヒド
ロゲナヌれ遺䌝子がクロヌニングされおいるこず
が刀明した。 (9) 圢質転換株のシキミ酞デヒドロゲナヌれ掻性 (7)で述べた方法により野生株AJ12036、および
pAJ1219の圢質転換株の粗酵玠液を調補した。 0.1Mトリス−塩酞緩衝液PH7.4、0.8mM
NADP4mMシキミ酞から成る反応液䞭に䞊述
の粗酵玠液を添加し、340nmの吞光床の増加を枬
定しシキミ酞デヒドロゲナヌれ掻性を求めた。結
果を第衚に瀺す。 【衚】 (10) SK遺䌝子のサブクロヌニング pAJ927を制限酵玠Bglで完党に切断し、65
℃、10分間加熱した埌、ATP及びゞチオスレむ
トヌル存圚䞋でT4フアヌゞ由来のDNAリガヌれ
によ぀お℃に䞀晩攟眮しDNA鎖を連結せしめ
た。぀いで反応液を65℃にお10分間加熱し、反応
液に倍容の゚タノヌルを加えお連結された
DNAの沈柱を採取した。TEN緩衝液に溶解埌、
制限酵玠BamHIで切断し、65℃、10分間加熱し
た埌、反応液に倍容の゚タノヌルを加えお
DNAの沈柱を採取し、これに少量のTEN緩衝液
を加え圢質転換に甚いた。 (4)で瀺した圢質転換方法を甚いおブレビバクテ
リりム・ラクトプルメンタムAJ12157を圢質転
換した。30℃で週間クロラムプニコヌル
3ÎŒgmlを含む再生培地で再生させた埌、最少培
地にレプリカし、クロラムプニコヌル耐性でか
぀プニルアラニン、チロシン、トリプトフアン
の䞉重芁求性が同時に消倱した株を倚数埗た。こ
れらの株党おがpAJ927により小型のプラスミド
pAJ912を有しおいた。尚pAJ927及びpAJ912は
図に瀺す制限酵玠切断地図を有する。 pAJ912を甚いおAJ12157を再床圢質転換し、
生じたクロラムプニコヌル耐性コロニヌを釣り
䞊げプニルアラニン、チロシン、トリプトフア
ンの芁求性をテストしたずころ、これらのいずれ
もが同時に䞉぀の芁求性を消倱しおおり、䞊蚘の
組換えプラスミド䞊にSK遺䌝子が存圚するこず
が明らかずな぀た。 次にpAJ912を倧腞菌−12株の倉異株−デ
ヒドロキナ酞シンタヌれ欠損株AB2847に圢質転
換した。生じたクロラムプニコヌル耐性コロニ
ヌを釣り䞊げプニルアラニン、チロシン、トリ
プトフアン芁求性を調べたが、いずれもが芁求性
を回埩しなか぀た。したが぀おpAJ912は−デ
ヒドロキナ酞シンタヌれ遺䌝子が䞀郚もしくは完
党に消倱しおいるものず考えられる。 (11) 各圢質転換株のトリプトフアン生産胜 䞊蚘のpAJ927pAJ912pAJ1219を甚い、
−フルオロプニルアラニン及び−フルオロト
リプトフアン耐性株ブレビバクテリりム・ラクト
プルメンタムM247及びコリネバクテリりム・
グルタミカムATCC13060を(4)で述べた方法
により圢質転換し、クロラムプニコヌル耐性を
指暙ずしお圢質転換株を遞択した。かくしお埗ら
れたAJ12160FERM −7867FERM BP−
890AJ12161FERM −7868FERM BP−
891AJ12169FERM −7869FERM BP−
892AJ12170FERM −7870FERM BP−
893AJ12171FERM −7871FERM BP−
894を培逊し、トリプトフアン生産胜を調べた
ずころ第衚に瀺す結果を埗た。 培逊はトリプトフアン生産培地グルコヌス
130、NH42SO425g、フマル酞12、酢酞
ml、KH2PO4、MnSO4・7H2O10mg、
MgSO4・7H2O1、−ビオチン50ÎŒg、サむア
ミン塩酞塩2000ÎŒg、メチオニン400mg、チロシン
650mg、倧豆蛋癜酞加氎分解液「味液」50ml、
CaCO350を氎に含む、PH6.5。20mlを500
mlの坂口フラスコに入れたものに被怜菌株を怍え
぀け、30℃にお72時間、振盪䞋に行な぀た。培逊
埌、遠心䞊枅䞭の−トリプトフアンをロむコノ
ストツク・メセントロむデスLeuconostoc
mesenteroidesATCC8042を定量菌株ずしお甚
いるバむオアツセむ法によ぀お求めた。 【衚】 【衚】 尚、AJ12157M247を埗るためには寄蚗され
たAJ12158及びAJ12160より宿䞻现胞を損うこず
なく宿䞻现胞䞭の耇合プラスミドを陀去するこず
が可胜である。即ち、プラスミドは宿䞻より自然
に倱なわれるこずもあるし、「陀去」操䜜によ぀
お陀くこずもできるBact.Rev.36p361−
4051972。他の陀去操䜜の䟋は以䞋の通りであ
る。AJ12158AJ12160をCMG液䜓培地に接皮
し、37℃で䞀晩培逊高枩凊理埌、培逊液を適
圓に垌釈し、クロラムプニコヌルを含有しない
CMG寒倩培地に塗垃し、30℃で〜日間培逊
する。かくしおクロラムプニコヌル感受性株ず
しお分離される株がAJ12157M247である。
【図面の簡単な説明】
図はプラスミドpAJ927及びpAJ912の制限酵
玠切断地図を瀺す。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  䞋匏の制限酵玠地図䞭Bglの䜍眮に挿入断
    片を有するか、あるいは有さないコリネ型现菌由
    来のシキミ酞キナヌれ遺䌝子含有DNA断片。  䞋匏の制限酵玠切断パタヌンを有し−デヒ
    ドロキナ酞シンタヌれ遺䌝子を含む特蚱請求の範
    囲第項蚘茉のDNA断片。  䞋匏の制限酵玠切断パタヌンを有し−デヒ
    ドロキナ酞シンタヌれ遺䌝子を含むコリネ型现菌
    由来のシキミ酞キナヌれ遺䌝子含有DNA断片を
    内郚に含有し、玄8.35kbであり䞡端に制限酵玠
    Pst郚䜍を有しシキミ酞デヒドロゲナヌれ遺䌝
    子を含む特蚱請求の範囲第項蚘茉のDNA断片。  䞋匏の制限酵玠地図䞭Bglの䜍眮に挿入断
    片を有するか、あるいは有さないコリネ型现菌由
    来のシキミ酞キナヌれ遺䌝子含有DNA断片が挿
    入されたプラスミド。  䞋匏の制限酵玠切断パタヌンを有し−デヒ
    ドロキナ酞シンタヌれ遺䌝子を含むコリネ型现菌
    由来のシキミ酞キナヌれ遺䌝子含有DNA断片が
    挿入された特蚱請求の範囲第項蚘茉のプラスミ
    ド。  䞋匏の制限酵玠切断パタヌンを有し−デヒ
    ドロキナ酞シンタヌれ遺䌝子を含むコリネ型现菌
    由来のシキミ酞キナヌれ遺䌝子含有DNA断片を
    内郚に含有し、玄8.35kbであり䞡端に制限酵玠
    Pst郚䜍を有しシキミ酞デヒドロゲナヌれ遺䌝
    子を含むコリネ型现菌由来のDNA断片が挿入さ
    れた特蚱請求の範囲第項蚘茉のプラスミド。  䞋匏の制限酵玠地図䞭Bglの䜍眮に挿入断
    片を有するか、あるいは有さないコリネ型现菌由
    来のシキミ酞キナヌれ遺䌝子含有DNA断片が挿
    入されたプラスミドを保持するコリネ型现菌。  䞋匏の制限酵玠切断パタヌンを有し−デヒ
    ドロキナ酞シンタヌれ遺䌝子を含むコリネ型现菌
    由来のシキミ酞キナヌれ遺䌝子含有DNA断片が
    挿入されたプラスミドを保持する特蚱請求の範囲
    第項蚘茉のコリネ型现菌。  䞋匏の制限酵玠切断パタヌンを有し−デヒ
    ドロキナ酞シンタヌれ遺䌝子を含むコリネ型现菌
    由来のシキミ酞キナヌれ遺䌝子含有DNA断片を
    内郚に含有し、玄8.35kbであり䞡端に制限酵玠
    Pst郚䜍を有しシキミ酞デヒドロゲナヌれ遺䌝
    子を含むコリネ型现菌由来のDNA断片が挿入さ
    れたプラスミドを保持する特蚱請求の範囲第項
    蚘茉のコリネ型现菌。
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