JPH0510075B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、シキミ酸キナーゼ遺伝子を含有す
る、コリネ型細菌由来のDNA断片、シキミ酸キ
ナーゼ遺伝子と３−デヒドロキナ酸シンターゼ遺
伝子を含有する、コリネ型細菌由来のDNA断片、
及びシキミ酸キナーゼ遺伝子と３−デヒドロキナ
酸シンターゼ遺伝子およびシキミ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子を含有する、コリネ型細菌由来の
DNA断片に関し、また本発明は、該DNA断片を
含むプラスミドに関し、さらに本発明は、該プラ
スミドを保持するコリネ型細菌に関する。 従来の技術 シキミ酸キナーゼ（以下「SK」と記す。）は、
シキミ酸をシキミ酸３−リン酸に変換する反応を
触媒する酵素であり、シキミ酸３−リン酸は、コ
リスミ酸を経由してフエニルアラニン、チロシン
又はトリプトフアンに変換される。 一方、組換えDNA法によりこれら芳香族アミ
ノ酸生産菌を育種することは、いくつか知られて
いるが（例えば特開昭57−208994、特開昭57−
71397、特開昭58−89194、特開昭58−134994等）、
SKをコードする遺伝子（以下「SK遺伝子」と記
す）組込まれたものではない。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、芳香族アミノ酸の生合成遺伝
子をクローニングし、該遺伝子が増幅された、芳
香族アミノ酸の生産性がより高い微生物を得るこ
とである。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研
究の結果、コリネ型細菌細胞内で発現しSKをコ
ードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しう
るプラスミドベクターに接続されている組換え
DNAを有するコリネ型細菌を分離することに成
功し、得られたコリネ型細菌が芳香族アミノ酸の
高い生産性を有することを見し出した。 本発明にいうコリネ型細菌（Coryneform
bacteria）は、バージース・マニユアル・オブ・
デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bargeys Manual of Determinative
Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽
性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であ
る。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述
べるようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本
発明においては、最も好ましいものである。 コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例
としては次のようなものがあげられる。 【表】 ロリテイクム
【表】 ニアフイラム
本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には
上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株
のほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグル
タミン酸生産性を失つた変異株も含まれる。 SK遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌の
SK遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura
Biochem.Biophys.Acta72，619，（1963）の方法
が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断す
る。ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得るプ
ラスミドベクターに接続し、得られた組換え
DNAを用いてコリネ型細菌のSK欠損変異株を形
質転換せしめ、SK生成活性を保有するにいたつ
た菌株を単離し、これよりSK遺伝子を分離でき
る。 染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間
等を調節して切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酵素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば、以下のものがあげられる。 (1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pHM 1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ 655 特開昭58−192900参照 (4) pAJ 611 同 上 (5) pAJ 1844 同 上 (6) pCG １ 特開昭57−134500参照 (7) pCG ２ 特開昭58−35197参照 (8) pCG ４ 特開昭57−183799参照 (9) pCG 11 同 上 プラスミドベクターDNAの開裂は、当該DNA
を一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する
か、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的
に切断することにより行う。 ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際
に用いられた制限酵素により切断され、または染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたベク
ターDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つ
いでプラスミドベクターと染色体DNAフラグメ
ントとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.，Biol.，
53，159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してDNAの透過性を増す方法、またはバチル
ス・ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールの代りに、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、フイコール、ブルロ
ニツクF68（セルバ社）などの添加によつてDNA
のとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得
られる。 芳香族アミノ酸生産菌として、SK欠損株を宿
主として形質転換した株を用いることができる
が、以下に示すような宿主を用いればより芳香族
アミノ酸の生産性が高い菌株が得られることがあ
る。 チロシンの場合 コリネバクテリウム属のフエニルアラニンを要
求し３−アミノチロシン、ｐ−アミノフエニルア
ラニン、ｐ−フルオロフエニルアラニン、チロシ
ンヒドロキサメートに耐性を有する変異株H.
Hagino，K.Nakayawa：Agric.Biol.Chem.，
37，2013（1973）、ブレビバクテリウム属のｍ−フ
ルオロフエニルアラニンに耐性を示す変異株S.
Sugimoto，M.Nakagawa，T.Tsuchida，I.
Shiio.，Agric.Biol.Chem.，37，2327（1973）等
がある。 トリプトフアンの場合 ブレビバクテリウム属のフエニルアラニン、チ
ロシンを要求し、５−メチルトリプトフアンに耐
性を有する変異株（I.Shiio，H.Sato，M.
Nakagawa.，Agric.Biol.Chem.，36，2315
（1972））、ブレビバクテリウム属のフエニルアラ
ニンを要求し、ｍ−フルオロフエニルアラニン、
５−フルオロトリプトフアンに耐性を有する変異
株（I.Shiio，S.Sugimoto，M.Nakagawa.，
Agric.Biol.Chemi.，39，627（1975））、ブレビバ
クテリウム属のチロシンを要求し、５−フルオロ
トリプトフアン、アザセリンに耐性を有する変異
株、コリネバクテリウム属のフエニルアラニン、
チロシンを要求し、５−メチルトリプトフアン、
４−メチルトリプトフアン、６−フルオロトリプ
トフアン、トリプトフアンヒドロキサメート、ｐ
−フルオロフエニルアラニン、チロシンヒドロキ
サメート、フエニルアラニンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株（H.Hagino，K.
Nakayama.，Agric.Biol.Chem.，39，345
（1975））等がある。 フエニルアラニンの場合 ブレビバクテリウム属のｍ−フルオロフエニア
ラニン耐性を有する変異株（S.Sugimoto，M.
Nakagawa，T.Tsuchida，I.Shiio.，Agric.Biol.
Chem.，37，2327（1973））、ブレビバクテリウム
属のチロシン、メチオニンを要求し５−メチルト
リプトフアン、ｐ−フルオロフエニルアラニンに
耐性を有する変異株（特開昭49−116294）、ブレ
ビバクテリウム属のチロシン、メチオニンを要求
し、５−メチルトリプトフアン、ｐ−フルオロフ
エニルアラニン耐性、デコイニン感受性を有する
変異株（特開昭56−64793）コリネバクテリウム
属のチロシンを要求し、ｐ−フルオロフエニルア
ラニン、ｐ−アミノフエニルアラニンに耐性を有
する変異株（H.Hagino，K.Nakayama.，Agric.
Biol.Chem.，38，157（1974））等がある。 SK遺伝子のほかに、以下の遺伝子が挿入され
ていれば芳香族アミノ酸の生産性がより高くなる
ことが多い。実施例で示す様に３−デヒドロキナ
酸シンターゼをコードする遺伝子、シキミ酸デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子が挿入された場
合や、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチユロ
ン酸−７−リン酸（DAHP）シンターゼ遺伝子、
３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子、５−
エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンター
ゼ、コリズミ酸シンターゼ遺伝子があげられる。 加えてトリプトフアン生産菌を得ようとすると
きは、アンスラニル酸シンターゼ遺伝子、アンス
ラニル酸ホスホリボシルトランスフエラーゼ遺伝
子、Ｎ−（5′−ホスホリボシル）アンスラニル酸
イソメラーゼ遺伝子、インドール−３−グリセロ
ールリン酸シンターゼ遺伝子、トリプトフアンシ
ンターゼ遺伝子等が挿入されていればよりよい結
果が得られることがある。 またフエニルアラニン又はチロシン生産菌を得
ようとするときは、プレフエン酸デヒドラターゼ
遺伝子、プレフエン酸トランスアキナーゼ、プレ
チロシンデヒドロゲナーゼ遺伝子、チロシンアミ
ノトランスフエラーゼ遺伝子等がSK遺伝子のほ
かに挿入されていることが望ましい。 このようにして得られた芳香族アミノ酸生産能
を有するコリネ型細菌を培養して芳香族アミノ酸
を生成蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌に
よる芳香族アミノ酸の製造のために使用されてい
た方法と特に大きく違う点はない。即ち、培地と
しては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を
含有する通常のものである。炭素源としては、グ
ルコース、シユクロース、ラクトース等及びこれ
らを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が
用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、
アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用でき
る。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的に芳香族アミノ酸の生産蓄積
が停止するまで行なわれる。 実施例 (1) SK遺伝子を含む染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11225（FERM Ｐ−4370，FERM BP−1219）
を１のCMG培地（ペプトン１ｇ／dl、酵母エ
キス１ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl、及び
NaCl0.5ｇ／dlを含み、PH7.2に調製したもの）に
植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行ない、対数
増殖期の菌体を集めた。 この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたの
ち、通常のフエノール処理法により、染色体
DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを得
た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダルト
ン）を用い、そのDNAを次の様にして調製した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ12037
（FERM−Ｐ 7234，FERM−BP 577）を100ml
のCMG培地に接種し、30℃で対数増殖期後期ま
で培養したのち、リゾチームSDS処理により溶菌
させ、30000×ｇ，30分の超遠心により上清を得
た。フエノール処理ののち、２容のエタノールを
加えてDNAを沈澱回収した。これを少量のTEN
緩衝液（20mMトリス塩酸塩、20mM NaCl，
1mM EDTA（PH8.0））に溶解後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAJ1844プ
ラスミドDNA約15μgを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μgと(2)で得たプラスミ
ドDNA5μgとを制限エンドヌクレアーゼPstＩで
それぞれを37℃に１時間保持し、切断した。65℃
に10分間加熱した後、両反応液を混合し、ATP
及びジチオスレイトール存在下、T₄フアージ由
来のDNAリガーゼによつて10℃に24時間保持し
DNA鎖を連結せしめた。ついで反応液を、65℃
にて５分間加熱し、反応液に２倍容のエタノール
を加えて連結されたDNAの沈澱を採取した。 (4) SK遺伝子のクローニング SK遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラ
クトフエルメンタムAJ12157（ブレビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンタムAJ12036（FERM−
P7559）を親株とし、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジンにより変異処理すること
によりフエニルアラニン，トリプトフアン，チロ
シンの３アミノ酸を生育に要求する変異株として
選択した。）を受容菌として用いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストトラ
ンスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌株を
５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地（PH
6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリゾチ
ームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図つた。6000×ｇ、10分間遠心
分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと(3)で調製したDNA10μgを
5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が30％になる様に添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませるために室
温に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地１mlで洗浄後、SMMP培地１mlに再
懸濁し、形質発現のため、30℃で２時間培養し
た。この培養液をPH7.0のプロトプラスト再生培
地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留
水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン12ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、
MgCl₂・6H₂O8.1ｇ、CaCl₂・2H₂O2.2ｇ、ペプ
トン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Difco社）１ｇ、K₂HPO₄0.2ｇ、コハク酸ナト
リウム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコー
ル3μg／mlを含む。 30℃で２週間培養後、約25000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれ
を最少培地（２％グルコース、１％硫酸アンモニ
ウム、0.3％尿素、0.1％リン酸二水素カリウム、
0.04％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、
2ppmマンガンイオン、200μg／サイアミン塩
酸塩、50μg／ビオチン、クロラムフエニコー
ル10μg／ml、PH7.0、寒天1.8％）にレプリカし、
クロラムフエニコール耐性でかつフエニルアラニ
ン、トリプトフアン、チロシン要求性の消失した
５株を得た。 (5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液
を調製し、アガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを検出したところ、全ての株でベ
クターのpAJ1844よりも明らかに大きなプラスミ
ドが検出された。 ５株のプラスミドをそれぞれ組換えに用いた制
限酵素PstＩで切断すると全てのプラスミドに共
通な2.9kbのDNA挿入断片が認められた。従つて
SK遺伝子2.9kbのPstIDNA断片上に存在すると
思われる。ベクターpAJ1844のPstＩ切断点に
2.9kbのDNA断片が挿入された組換プラスミドを
pAJ927と名付け、2.9kbのDNA断片以外に
1.15kbと4.3kbのPstIDNA断片を有する組換えプ
ラスミドをpAJ1219と名付け、pAJ927を保持す
る株をAJ12158FERM Ｐ−7865，FERM BP−
888，pAJ1219を保持する株をAJ12159FERM Ｐ
−7866，FERM BP−889と名付けた。 (6) 再トランスホーメーシヨン (5)で検出された2.9キロベースのDNA断片を含
む組換えプラスミド上にSK遺伝子が存在するこ
とを確認するためこのプラスミドDNA pAJ1219
とpAJ927を用い、ブレビバクテリウム・ラクト
フエルメンタムAJ12157を再度、形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれ10個を釣り上げフエニルアラニン、ト
リプトフアン、チロシンの三重要求性をテストし
たところ、これらのいずれも要求性が消失してお
り、上記の組換えプラスミド上にSK遺伝子が存
在することが明らかとなつた。 (7) 形質転換株のSK活性 被検株をトリプトフアン生産培地（グルコース
130ｇ、（NH₄）₂SO₄25ｇ、KH₂PO₄１ｇ、
MgSO₄・7H₂O1ｇ、フマル酸12ｇ、酢酸３ml、
大豆蛋白酸加水分解液「味液」50ml、MnSO₄・
4H₂O10mg、ビオチン50μg、サイアミン塩酸塩
2000μg及びCaCO₃50ｇを水１に含む。PH6.5）
20mlで30℃にて22時間培養した菌体より、超音波
処理により、溶菌液を調製し、これを32000×ｇ、
20分間遠心分離して上清を得た。この上清を粗酵
素液として用い50mM Veronal緩衝液（PH9.0）、
1mMシキミ酸、4mM ATP、5mM MgCl₂、
10mM NaFから成る反応液中で30℃、30分間反
応させ、反応終了後1Mトリス−塩酸緩衝液（PH
7.8）0.2mlを加え、100℃で２分間処理し、酵素
を失活させる。冷却後3.0mlの反応液（シキミ酸
を２〜10μg含むように適当に希釈した反応液）
に0.5mlの１％過ヨウ素酸を加え、３時間室温に
放置し、0.5mlの1N水酸化ナトリウムを加え、た
だちに0.3mlの0.1Mグリシンを添加し、380mμの
吸光度を測定することによりシキミ酸を定量し
た。反応液中に添加したシキミ酸の量から反応終
了後のシキミ酸の量を差し引き、SK活性を求め
た。第１表に測定結果を示す。 【表】 (8) 組換えプラスミド pAJ927，pAJ1219上のシキミ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子及び３−デヒドロキナ酸シンターゼ遺
伝子の同定 pAJ927及びpAJ1219を大腸菌Ｋ−12株由来の
シキミ酸デヒドロゲナーゼ欠損株AB2834、３−
デヒドロキナ酸シンターゼ欠損株AB2847（Ｊ・
Pittardet al，J.Bacteriol.，1494，91，1966）に
導入した。 大腸菌Ｋ−12株の変異株AB2834，2847へは
DNA受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して
DNAの透過性を増す方法を用いてpAJ927，
pAJ1219を形質転換し、生じたクロラムフエニル
コール耐性コロニーのうちそれぞれ10個を釣り上
げフエニルアラニン、チロシン、トリプトフアン
要求性を調べた。pAJ927，pAJ1219ともAB2847
の全ての要求性を消失したが、AB2834の要求性
はpAJ927の形質転換株では消失せず、pAJ1219
の形質転換株では全ての要求性が消失した。 従つて、pAJ927にはSK，３−デヒドロキナ酸
シンターゼ遺伝子が2.9kbの挿入PstIDNA断片上
にクローニングされており、pAJ1219にはSK，
３−デヒドロキナ酸シンターゼ、シキミ酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子がクローニングされていること
が判明した。 (9) 形質転換株のシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性 (7)で述べた方法により野生株AJ12036、および
pAJ1219の形質転換株の粗酵素液を調製した。 0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、0.8mM
NADP，4mMシキミ酸から成る反応液中に上述
の粗酵素液を添加し、340nmの吸光度の増加を測
定しシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を求めた。結
果を第２表に示す。 【表】 (10) SK遺伝子のサブクローニング pAJ927を制限酵素Bglで完全に切断し、65
℃、10分間加熱した後、ATP及びジチオスレイ
トール存在下でT4フアージ由来のDNAリガーゼ
によつて４℃に一晩放置しDNA鎖を連結せしめ
た。ついで反応液を65℃にて10分間加熱し、反応
液に２倍容のエタノールを加えて連結された
DNAの沈澱を採取した。TEN緩衝液に溶解後、
制限酵素BamHIで切断し、65℃、10分間加熱し
た後、反応液に２倍容のエタノールを加えて
DNAの沈澱を採取し、これに少量のTEN緩衝液
を加え形質転換に用いた。 (4)で示した形質転換方法を用いてブレビバクテ
リウム・ラクトフエルメンタムAJ12157を形質転
換した。30℃で２週間クロラムフエニコール
3μg／mlを含む再生培地で再生させた後、最少培
地にレプリカし、クロラムフエニコール耐性でか
つフエニルアラニン、チロシン、トリプトフアン
の三重要求性が同時に消失した株を多数得た。こ
れらの株全てがpAJ927により小型のプラスミド
pAJ912を有していた。尚pAJ927及びpAJ912は
図１に示す制限酵素切断地図を有する。 pAJ912を用いてAJ12157を再度形質転換し、
生じたクロラムフエニコール耐性コロニーを釣り
上げフエニルアラニン、チロシン、トリプトフア
ンの要求性をテストしたところ、これらのいずれ
もが同時に三つの要求性を消失しており、上記の
組換えプラスミド上にSK遺伝子が存在すること
が明らかとなつた。 次にpAJ912を大腸菌Ｋ−12株の変異株３−デ
ヒドロキナ酸シンターゼ欠損株AB2847に形質転
換した。生じたクロラムフエニコール耐性コロニ
ーを釣り上げフエニルアラニン、チロシン、トリ
プトフアン要求性を調べたが、いずれもが要求性
を回復しなかつた。したがつてpAJ912は３−デ
ヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子が一部もしくは完
全に消失しているものと考えられる。 (11) 各形質転換株のトリプトフアン生産能 上記のpAJ927，pAJ912，pAJ1219を用い、ｍ
−フルオロフエニルアラニン及び５−フルオロト
リプトフアン耐性株ブレビバクテリウム・ラクト
フエルメンタムM247及びコリネバクテリウム・
グルタミカム（ATCC13060）を(4)で述べた方法
により形質転換し、クロラムフエニコール耐性を
指標として形質転換株を選択した。かくして得ら
れたAJ12160（FERM Ｐ−7867，FERM BP−
890），AJ12161（FERM Ｐ−7868，FERM BP−
891），AJ12169（FERM Ｐ−7869，FERM BP−
892），AJ12170（FERM Ｐ−7870，FERM BP−
893），AJ12171（FERM Ｐ−7871，FERM BP−
894）を培養し、トリプトフアン生産能を調べた
ところ第３表に示す結果を得た。 培養はトリプトフアン生産培地（グルコース
130ｇ、（NH₄）₂SO₄25g、フマル酸12ｇ、酢酸３
ml、KH₂PO₄１ｇ、MnSO₄・7H₂O10mg、
MgSO₄・7H₂O1ｇ、ｄ−ビオチン50μg、サイア
ミン塩酸塩2000μg、メチオニン400mg、チロシン
650mg、大豆蛋白酸加水分解液「味液」50ml、
CaCO₃50ｇを水１に含む、PH6.5。）20mlを500
mlの坂口フラスコに入れたものに被検菌株を植え
つけ、30℃にて72時間、振盪下に行なつた。培養
後、遠心上清中のＬ−トリプトフアンをロイコノ
ストツク・メセントロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）ATCC8042を定量菌株として用
いるバイオアツセイ法によつて求めた。 【表】 【表】 尚、AJ12157，M247を得るためには寄託され
たAJ12158及びAJ12160より宿主細胞を損うこと
なく宿主細胞中の複合プラスミドを除去すること
が可能である。即ち、プラスミドは宿主より自然
に失なわれることもあるし、「除去」操作によつ
て除くこともできる（Bact.Rev.，36，p361−
405（1972））。他の除去操作の例は以下の通りであ
る。AJ12158，AJ12160をCMG液体培地に接種
し、37℃で一晩培養（高温処理）後、培養液を適
当に希釈し、クロラムフエニコールを含有しない
CMG寒天培地に塗布し、30℃で１〜３日間培養
する。かくしてクロラムフエニコール感受性株と
して分離される株がAJ12157，M247である。

【図面の簡単な説明】

図１はプラスミドpAJ927及びpAJ912の制限酵
素切断地図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下式の制限酵素地図中Bglの位置に挿入断
   片を有するか、あるいは有さないコリネ型細菌由
   来のシキミ酸キナーゼ遺伝子含有DNA断片。 ２ 下式の制限酵素切断パターンを有し３−デヒ
   ドロキナ酸シンターゼ遺伝子を含む特許請求の範
   囲第１項記載のDNA断片。 ３ 下式の制限酵素切断パターンを有し３−デヒ
   ドロキナ酸シンターゼ遺伝子を含むコリネ型細菌
   由来のシキミ酸キナーゼ遺伝子含有DNA断片を
   内部に含有し、約8.35kbであり両端に制限酵素
   Pst部位を有しシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝
   子を含む特許請求の範囲第２項記載のDNA断片。 ４ 下式の制限酵素地図中Bglの位置に挿入断
   片を有するか、あるいは有さないコリネ型細菌由
   来のシキミ酸キナーゼ遺伝子含有DNA断片が挿
   入されたプラスミド。 ５ 下式の制限酵素切断パターンを有し３−デヒ
   ドロキナ酸シンターゼ遺伝子を含むコリネ型細菌
   由来のシキミ酸キナーゼ遺伝子含有DNA断片が
   挿入された特許請求の範囲第４項記載のプラスミ
   ド。 ６ 下式の制限酵素切断パターンを有し３−デヒ
   ドロキナ酸シンターゼ遺伝子を含むコリネ型細菌
   由来のシキミ酸キナーゼ遺伝子含有DNA断片を
   内部に含有し、約8.35kbであり両端に制限酵素
   Pst部位を有しシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝
   子を含むコリネ型細菌由来のDNA断片が挿入さ
   れた特許請求の範囲第５項記載のプラスミド。 ７ 下式の制限酵素地図中Bglの位置に挿入断
   片を有するか、あるいは有さないコリネ型細菌由
   来のシキミ酸キナーゼ遺伝子含有DNA断片が挿
   入されたプラスミドを保持するコリネ型細菌。 ８ 下式の制限酵素切断パターンを有し３−デヒ
   ドロキナ酸シンターゼ遺伝子を含むコリネ型細菌
   由来のシキミ酸キナーゼ遺伝子含有DNA断片が
   挿入されたプラスミドを保持する特許請求の範囲
   第７項記載のコリネ型細菌。 ９ 下式の制限酵素切断パターンを有し３−デヒ
   ドロキナ酸シンターゼ遺伝子を含むコリネ型細菌
   由来のシキミ酸キナーゼ遺伝子含有DNA断片を
   内部に含有し、約8.35kbであり両端に制限酵素
   Pst部位を有しシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝
   子を含むコリネ型細菌由来のDNA断片が挿入さ
   れたプラスミドを保持する特許請求の範囲第８項
   記載のコリネ型細菌。