JPH0527395B2 - - Google Patents
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- JPH0527395B2 JPH0527395B2 JP59141475A JP14147584A JPH0527395B2 JP H0527395 B2 JPH0527395 B2 JP H0527395B2 JP 59141475 A JP59141475 A JP 59141475A JP 14147584 A JP14147584 A JP 14147584A JP H0527395 B2 JPH0527395 B2 JP H0527395B2
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- pseudomonas
- aca
- compound
- strain
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は７−アミノセフアロスポラン酸（以下
７−ACAと略す）及びその誘導体の酵素的手段
による製造法に関するものである。
７−ACAと略す）及びその誘導体の酵素的手段
による製造法に関するものである。
発酵生産によつて得られるセフアロスポリンＣ
は７位アミノ基に結合したアシル基を除去する反
応（以下、脱アシル化と略す）により、７−
ACAに誘導され、これを出発原料として種々の
セフアロスポリン系抗生物質が合成され、医薬品
として実用に供給に共されている。
は７位アミノ基に結合したアシル基を除去する反
応（以下、脱アシル化と略す）により、７−
ACAに誘導され、これを出発原料として種々の
セフアロスポリン系抗生物質が合成され、医薬品
として実用に供給に共されている。
セフアロスポリンＣの脱アシル化方法として
は、化学的方法及び酵素的方法があるが、化学的
脱アシル化法（例えば特公昭41−13862号及び特
公昭45−40899号の方法）は反応工程が多く、反
応に用いる試薬のコストが高いこと、反応の副産
物として大量の化合物が排出されることなど工業
的に欠点が多いことが知られている。
は、化学的方法及び酵素的方法があるが、化学的
脱アシル化法（例えば特公昭41−13862号及び特
公昭45−40899号の方法）は反応工程が多く、反
応に用いる試薬のコストが高いこと、反応の副産
物として大量の化合物が排出されることなど工業
的に欠点が多いことが知られている。
酵素的脱アシル方法としては、7β−（４−カル
ボキシブタンアミド）−セフアロスポラン酸を経
由する方法と特設脱アシル化する方法の２つがあ
る。前者は、セフアロスポリンＣの７位側鎖7β
−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンア
ミド）基のＤ−５−アミノ基に、グルオキシル酸
を作用させた化学的に脱アミノ反応を行う特公昭
55−12910の方法、あるいは微生物酵素を作用さ
せて脱アミノ反応を行う特公昭50−7158の方法な
どにより、セフアロスポリンＣを7β−（５−カル
ボキシ−５−オキソペンタンアミド）−セフアロ
スポラン酸に誘導し、ついで過酸化水素を作用さ
せることにより脱炭酸反応を行わせて、7β−（４
−カルボキシブタンアミド）−セフアロスポラン
酸に誘導しておき、更にシユードモナス属
（Pseeudomnas、以下同様）の細菌の生産する酵
素（Agriculture and Biological Chemistry 45
巻、1561頁、1981年）を作用させることにより脱
アシル化反応を行わせ、７−ACAへ誘導する方
法である。この方法は、化学的脱アシル化法の問
題点の多くを解決できる方法であるが、三段反応
であるため、より勝れた方法として酵素的な一段
反応の開発が望まれていた。
ボキシブタンアミド）−セフアロスポラン酸を経
由する方法と特設脱アシル化する方法の２つがあ
る。前者は、セフアロスポリンＣの７位側鎖7β
−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンア
ミド）基のＤ−５−アミノ基に、グルオキシル酸
を作用させた化学的に脱アミノ反応を行う特公昭
55−12910の方法、あるいは微生物酵素を作用さ
せて脱アミノ反応を行う特公昭50−7158の方法な
どにより、セフアロスポリンＣを7β−（５−カル
ボキシ−５−オキソペンタンアミド）−セフアロ
スポラン酸に誘導し、ついで過酸化水素を作用さ
せることにより脱炭酸反応を行わせて、7β−（４
−カルボキシブタンアミド）−セフアロスポラン
酸に誘導しておき、更にシユードモナス属
（Pseeudomnas、以下同様）の細菌の生産する酵
素（Agriculture and Biological Chemistry 45
巻、1561頁、1981年）を作用させることにより脱
アシル化反応を行わせ、７−ACAへ誘導する方
法である。この方法は、化学的脱アシル化法の問
題点の多くを解決できる方法であるが、三段反応
であるため、より勝れた方法として酵素的な一段
反応の開発が望まれていた。
セフアロスポリンＣを直接脱アシル化して７−
ACAを得る方法としては、アクロモパクター属
（Achromobcter）、ブレビバクテリウク属
（Brevibacterium）あるいはフラボバクテリウム
属（Flavobacterium）の細菌を用いるアメリカ
特許No.3239394（1966）の方法、アスペルギルス属
（Aspergillus）あるいはアルタナリア属
（Alternaria）の真菌を用いる特開昭52−143289
の方法、シユードモナス属の細菌の用いる特開昭
53−94093の方法及びペシロミセス属
（Pecilomsyces）の真菌を用いる特開昭59−
44392の方法がある。しかし、これらの方法の工
業的利用に成功した例は知られていない。
ACAを得る方法としては、アクロモパクター属
（Achromobcter）、ブレビバクテリウク属
（Brevibacterium）あるいはフラボバクテリウム
属（Flavobacterium）の細菌を用いるアメリカ
特許No.3239394（1966）の方法、アスペルギルス属
（Aspergillus）あるいはアルタナリア属
（Alternaria）の真菌を用いる特開昭52−143289
の方法、シユードモナス属の細菌の用いる特開昭
53−94093の方法及びペシロミセス属
（Pecilomsyces）の真菌を用いる特開昭59−
44392の方法がある。しかし、これらの方法の工
業的利用に成功した例は知られていない。
一般に、微生物の培養物、その菌体処理物ある
いは抽出物の行う酵素反応を工業的に利用する為
には、これらの調整が容易であること、あるいは
これらの諸性質がすぐれていることなどの特長が
必要とされる。
いは抽出物の行う酵素反応を工業的に利用する為
には、これらの調整が容易であること、あるいは
これらの諸性質がすぐれていることなどの特長が
必要とされる。
そこで、本発明者らはセフアロスポリンＣを直
接脱アシル化して７−ACAを生成し、且つ上記
の特長を有する微生物由来の酵素を自然界から新
たに探索すべく研究を行つて来た。
接脱アシル化して７−ACAを生成し、且つ上記
の特長を有する微生物由来の酵素を自然界から新
たに探索すべく研究を行つて来た。
上記の問題点を解決した本発明は、一般式
（） （式中Ｒは、−OCOCH3、−Ｈ又は−OHである）
で表わされる化合物またはその塩に、土壌より新
たに分離された微生物SE−83株の培養物または
その処理物を水性媒体下で作用され、一般式
（） （式中Ｒは前記と同じ意味を有する）で表わされ
る化合物またはその塩を製造することを特徴とし
ている。尚、上記化合物の構造式中のＲは本法の
反応に関係せず且つ実質的に反応を妨げない基で
もよい。
（） （式中Ｒは、−OCOCH3、−Ｈ又は−OHである）
で表わされる化合物またはその塩に、土壌より新
たに分離された微生物SE−83株の培養物または
その処理物を水性媒体下で作用され、一般式
（） （式中Ｒは前記と同じ意味を有する）で表わされ
る化合物またはその塩を製造することを特徴とし
ている。尚、上記化合物の構造式中のＲは本法の
反応に関係せず且つ実質的に反応を妨げない基で
もよい。
本発明に使用する微生物は、北海道白老郡の土
壌より分離された細菌であつて、その菌学的性状
を示せば以下の通りである。
壌より分離された細菌であつて、その菌学的性状
を示せば以下の通りである。
() 形態的性能
肉汁寒天上で培養した細胞は0.5〜0.7×1.2〜
1.5ミクロンの桿菌であり、極毛性のベン毛で
運動する。胞子は作らず多形性も示さない。グ
ラム染色性は陰性である。
1.5ミクロンの桿菌であり、極毛性のベン毛で
運動する。胞子は作らず多形性も示さない。グ
ラム染色性は陰性である。
() 培養性質
(1) 肉汁寒天培養：菌体は黄白色を呈して増殖
する。拡散性色素の生産は認められない。粘
調性、遊走性ともに示さない。
する。拡散性色素の生産は認められない。粘
調性、遊走性ともに示さない。
(2) 肉汁液体培養：培地全体がかすかに濁る。
菌膜の形成は認められない。
菌膜の形成は認められない。
(3) ゼラチン液化穿刺培養：ゼラチンの液化は
認められない（25℃〜30℃、７日間） (4) リトマスミルク培養：カゼインの液化、色
調などに顕著な変化は認められない。
認められない（25℃〜30℃、７日間） (4) リトマスミルク培養：カゼインの液化、色
調などに顕著な変化は認められない。
() 生理学的性質
(1) 硝酸塩の還元：陰性
(2) 脱窒反応：陰性
(3) MRテスト：陰性
(4) VPテスト：陰性
(5) インドールの生成：陰性
(6) 硫化水素の生成：陰性
(7) デンプンの加水分解：陰性
(8) クエン酸の分解：陰性
(9) 無機窒素源の利用：アンモニウム塩を唯一
のＮ源として利用する。
のＮ源として利用する。
(10) 色素の生成：色素の生成は求められない。
(11) オキシダーゼ：陰性
(12) カタラーゼ：陰性
(13) 生育の範囲：25℃〜30℃で良く生育する。
５℃以下、37℃以上では生育しない。
５℃以下、37℃以上では生育しない。
(14) 酸素に対する態度：嫌気下での増殖は認め
られない。
られない。
(15) OFテスト（ヒユーレイフソン法）：流動パ
ラフインの有無に関係なく酸生成は認められ
ない。
ラフインの有無に関係なく酸生成は認められ
ない。
(16) 炭素利用性
(i) 利用する炭素源：リンゴ酸、クエン酸、
コハク酸、グルタミン酸、アスパラギン酸 (ii) 利用しない酸素源：グルコース、アラビ
ノース、キシロース、マンノース、ガラク
トース、フラクトース、マルトース、シユ
ークロース、トレハロース、ソルビツト、
マンニツト、イノシツト、グリセリン、デ
ンプン (17) 栄養要求性：パントテン酸、ニコチン酸ア
ミド及びビオチンを要求する。
コハク酸、グルタミン酸、アスパラギン酸 (ii) 利用しない酸素源：グルコース、アラビ
ノース、キシロース、マンノース、ガラク
トース、フラクトース、マルトース、シユ
ークロース、トレハロース、ソルビツト、
マンニツト、イノシツト、グリセリン、デ
ンプン (17) 栄養要求性：パントテン酸、ニコチン酸ア
ミド及びビオチンを要求する。
(18) アルギニンの分解：陰性
(19) リジンの脱炭酸反応：陰性
(20) オルニチンの脱炭酸反応：陰性
(21) エスキリンの分解：陰性
以上の菌学的性質をバージーズ・マニユアル・
オブ・デターミネイトテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bactericlgy）第８版（1974年）、及びマニユア
ル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー
（Manual of Clinical Microbiology）第３版
（1980年）の記載と比較し次の結論を得た。
オブ・デターミネイトテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bactericlgy）第８版（1974年）、及びマニユア
ル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー
（Manual of Clinical Microbiology）第３版
（1980年）の記載と比較し次の結論を得た。
グラム陰性桿菌で胞子を作らず極毛によつて運
動するという形態的性質を有し、絶対好気性でグ
ルコース発酵能を持たないことから本菌株はシユ
ードモナス属に所属すると同定できる。
動するという形態的性質を有し、絶対好気性でグ
ルコース発酵能を持たないことから本菌株はシユ
ードモナス属に所属すると同定できる。
上記の性質に加えて、本菌株はグルコース酸化
能を持たず、オキシダーゼ陰性である。以上の性
質を示すものは、マニユアル・オブ・クリニカ
ル・マイクロバイオロジー第３版の記載によれ
ば、シユードモナス アルコリゲネス
（Pseudomonas alcaligenes、以下同様）、シユー
ドモナス シユードアルカリゲネス
（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、シユード
モナス テストステロニイ（Peudomnas
testosteroni）、シユードモナス デミニユータ
（Pseudomonas diminuta、以下同様）、及びシユ
ードモナス ベシキユラリス（Pseudomonas
vesicularis、以下同様）である。さらに、単極毛
であり、フラクトース酸化陰性、エスクリン分解
陰性及び硝酸塩還元陰性の性質を示すものは、シ
ユードモナス アルカリゲネスとシユードモナス
デミニユータに限定される。
能を持たず、オキシダーゼ陰性である。以上の性
質を示すものは、マニユアル・オブ・クリニカ
ル・マイクロバイオロジー第３版の記載によれ
ば、シユードモナス アルコリゲネス
（Pseudomonas alcaligenes、以下同様）、シユー
ドモナス シユードアルカリゲネス
（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、シユード
モナス テストステロニイ（Peudomnas
testosteroni）、シユードモナス デミニユータ
（Pseudomonas diminuta、以下同様）、及びシユ
ードモナス ベシキユラリス（Pseudomonas
vesicularis、以下同様）である。さらに、単極毛
であり、フラクトース酸化陰性、エスクリン分解
陰性及び硝酸塩還元陰性の性質を示すものは、シ
ユードモナス アルカリゲネスとシユードモナス
デミニユータに限定される。
また、SE−83株は前記の如く栄養要求性を有
する。バージーズ・マニユアル・オブ・デタミネ
イテイブ・バクテリオロジー第８版の記載によれ
ばユードモナス属で栄養要求性を示す種は、シユ
ードモナス マルトフイリア（Pseudomonas
maltophilia）、シユードモナス ベシキユラリス
及びシユードモナス デミニユータである。
する。バージーズ・マニユアル・オブ・デタミネ
イテイブ・バクテリオロジー第８版の記載によれ
ばユードモナス属で栄養要求性を示す種は、シユ
ードモナス マルトフイリア（Pseudomonas
maltophilia）、シユードモナス ベシキユラリス
及びシユードモナス デミニユータである。
従つて、SE−83株はシユードモナス属に属す
るが、シユードモナス デミユータ以外の既知の
種とはその菌学的性状が異なることは明白であ
る。
るが、シユードモナス デミユータ以外の既知の
種とはその菌学的性状が異なることは明白であ
る。
そこで、本発明者らはSE−83株とシユードモ
ナス デミニユータIFO12697株の菌学的性状を
比較試験した。その結果、次に示す差異が認めら
れた。
ナス デミニユータIFO12697株の菌学的性状を
比較試験した。その結果、次に示す差異が認めら
れた。
(1) SE−83株はパントテン酸、ニコチン酸アミ
ド及びビオチンを要求するがシユードモナス
デミニユータIFO12697は株はパージーズ・マ
ニユアル・オブ・デタミネイテイブ・バクテリ
オロジーの記載通りパントテン酸、ビオチン、
ビタミンB12及びシスチンを要求する。
ド及びビオチンを要求するがシユードモナス
デミニユータIFO12697は株はパージーズ・マ
ニユアル・オブ・デタミネイテイブ・バクテリ
オロジーの記載通りパントテン酸、ビオチン、
ビタミンB12及びシスチンを要求する。
(2) SE−83株はクエン酸及びリング酸を資化す
るが、シユードモナス デミニユータ
IFO12697株は資化しない。また、ジヤーナ
ル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオロジー
（Journal of General Microbiology）53巻349
頁（1968年）によれば、シユードモナス デミ
ニユータは一般にクエン酸及びリンゴ酸を資化
しないことが知られている。
るが、シユードモナス デミニユータ
IFO12697株は資化しない。また、ジヤーナ
ル・オブ・ジエネラル・マイクロバイオロジー
（Journal of General Microbiology）53巻349
頁（1968年）によれば、シユードモナス デミ
ニユータは一般にクエン酸及びリンゴ酸を資化
しないことが知られている。
以上の結果より、SE−83株はシユードモナス
デミニユータとは明らかに異なる種であること
がわかる。従つて、SE−83株はシユードモナス
属に属するが、シユードモナス属の既知の種のい
づれにも該当せず、新種であるの判定できる。
デミニユータとは明らかに異なる種であること
がわかる。従つて、SE−83株はシユードモナス
属に属するが、シユードモナス属の既知の種のい
づれにも該当せず、新種であるの判定できる。
尚、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、シユードモナス・エスピー
（Pseudomonassp.）SE−83（微工研菌寄第7649
号）として寄託されている。
所に、シユードモナス・エスピー
（Pseudomonassp.）SE−83（微工研菌寄第7649
号）として寄託されている。
本菌株が触媒する反応の基質特異性に関して、
本菌株はセフアロスポリンＣから７−ACAを生
成する能力を有するばかりではく、３位側鎖がヒ
ドロキシメチル基であるデアセチルセフアロスポ
リンＣを初め一般式(1)で表わされる化合物にも作
用を示し、対応する７−ACA誘導体を生成する
能力を有することが見出された。
本菌株はセフアロスポリンＣから７−ACAを生
成する能力を有するばかりではく、３位側鎖がヒ
ドロキシメチル基であるデアセチルセフアロスポ
リンＣを初め一般式(1)で表わされる化合物にも作
用を示し、対応する７−ACA誘導体を生成する
能力を有することが見出された。
また、本菌株がう触媒する反応の機構に関して
は、セフアロスポリンＣを基質として反応を行う
と、７−ACAと同時に7β−（５−カルボキシ−５
−オキソペンタンアミド）−セフアロスポラン酸
及び7β−（４−カルボキシブタンアミド）−セフ
アロスポラン酸が副生することが示された。つい
で、セフアロスポリンＣを7β−（５−カルボキシ
−５−オキソペンタンアミド）−セフアロスポラ
ン酸に変換する酸化酵素の存在と、7β−（４−カ
ルボキスブタンアミド）−セフアロスポラン酸を
脱アシル化して７−ACAに変換する２種類の酵
素（アシレース型及びアシレース型）の存在
が示された。興味あることに、アシレース型
は、セフアロスポリンＣを直接脱アシル化して７
−ACAを生成する能力も有していることが判明
した。
は、セフアロスポリンＣを基質として反応を行う
と、７−ACAと同時に7β−（５−カルボキシ−５
−オキソペンタンアミド）−セフアロスポラン酸
及び7β−（４−カルボキシブタンアミド）−セフ
アロスポラン酸が副生することが示された。つい
で、セフアロスポリンＣを7β−（５−カルボキシ
−５−オキソペンタンアミド）−セフアロスポラ
ン酸に変換する酸化酵素の存在と、7β−（４−カ
ルボキスブタンアミド）−セフアロスポラン酸を
脱アシル化して７−ACAに変換する２種類の酵
素（アシレース型及びアシレース型）の存在
が示された。興味あることに、アシレース型
は、セフアロスポリンＣを直接脱アシル化して７
−ACAを生成する能力も有していることが判明
した。
従つて、本菌株はセフアロスポリンＣから中間
体を経由して７−ACAを生成する酵素反応経路
と、セフアロスポリンＣから直接７−ACAを発
生する酵素反応経路の２つの経路を持つことがわ
かつた。尚、セフアロスポリンＣ以外の化合物
（）から化合物（）が生成する場合にも、こ
れらの反応経路が機能していることが判明した。
体を経由して７−ACAを生成する酵素反応経路
と、セフアロスポリンＣから直接７−ACAを発
生する酵素反応経路の２つの経路を持つことがわ
かつた。尚、セフアロスポリンＣ以外の化合物
（）から化合物（）が生成する場合にも、こ
れらの反応経路が機能していることが判明した。
本菌株は培養は、発酵工業における通常の培養
法に準じて行うことができる。培地成分としては
一般微生物の栄養源として公知のものが使用さ
れ、例えば炭素源として種々の有機酸類、窒素源
として大豆粉、小豆胚芽、肉エキス、ペプトン、
コーンステイープリカー、酵母エキス等を使用し
うる。その他必要に応じてマグネシウム塩、リン
酸塩、カルシウム塩などの塩類のほか、菌の生育
と活性発現に必要な添加物を適宜組合せて使用す
ることができる。培養方法としては好気的な液体
培養法が適している。培養温度は25〜32℃の範囲
で選べばよく、培養時間は培養条件によつて異な
るが通常２〜４日を要する。
法に準じて行うことができる。培地成分としては
一般微生物の栄養源として公知のものが使用さ
れ、例えば炭素源として種々の有機酸類、窒素源
として大豆粉、小豆胚芽、肉エキス、ペプトン、
コーンステイープリカー、酵母エキス等を使用し
うる。その他必要に応じてマグネシウム塩、リン
酸塩、カルシウム塩などの塩類のほか、菌の生育
と活性発現に必要な添加物を適宜組合せて使用す
ることができる。培養方法としては好気的な液体
培養法が適している。培養温度は25〜32℃の範囲
で選べばよく、培養時間は培養条件によつて異な
るが通常２〜４日を要する。
化合物（）から化合物（）を製造するにあ
たつては、該酵素活性は通常は大部分が細胞内に
存在するので、本菌の培養物から遠心分離などの
手段で集菌された菌体に物理的あるいは化学的処
理、例えば超音波処理、有機培養処理などの処理
を加え、酵素活性を促進させる形にした菌体処理
物の使用が望ましい。また、菌体処理物から得ら
れる酵素抽出液または部分精製酵素の形で使用す
るこもできる。
たつては、該酵素活性は通常は大部分が細胞内に
存在するので、本菌の培養物から遠心分離などの
手段で集菌された菌体に物理的あるいは化学的処
理、例えば超音波処理、有機培養処理などの処理
を加え、酵素活性を促進させる形にした菌体処理
物の使用が望ましい。また、菌体処理物から得ら
れる酵素抽出液または部分精製酵素の形で使用す
るこもできる。
このように調整された菌体処理物または酵素を
用いて、化合物（）を製造する反応は水性媒体
中で行なわれる。反応時のPHは7.0〜8.0を維持す
ることが好ましい。反応温度は20〜40℃で行なう
ことができるが、25〜37℃が好ましい。本発明の
反応は、化合物（）を含む溶液中に菌体処理物
または酵素を分散させ、懸濁液の形で実施させる
ことができる。あるいは固定化菌体処理物または
固定化酵素の形にして一旦カラムに充填し、適当
な緩衝液に溶解した化合物（）をこのカラム内
を通過させる形で実施することもできる。反応時
間は化合物（）の濃度と使用条件などで決定さ
れるが、通常２〜15時間である。
用いて、化合物（）を製造する反応は水性媒体
中で行なわれる。反応時のPHは7.0〜8.0を維持す
ることが好ましい。反応温度は20〜40℃で行なう
ことができるが、25〜37℃が好ましい。本発明の
反応は、化合物（）を含む溶液中に菌体処理物
または酵素を分散させ、懸濁液の形で実施させる
ことができる。あるいは固定化菌体処理物または
固定化酵素の形にして一旦カラムに充填し、適当
な緩衝液に溶解した化合物（）をこのカラム内
を通過させる形で実施することもできる。反応時
間は化合物（）の濃度と使用条件などで決定さ
れるが、通常２〜15時間である。
以上のごとくして生成した化合物（）は既知
の方法、例えばカラムクロマトグラフ法、等電点
沈でん法などを使用して反応液から分離精製する
ことができる。
の方法、例えばカラムクロマトグラフ法、等電点
沈でん法などを使用して反応液から分離精製する
ことができる。
尚、生成した化合物（）の定量方法は次の通
りである。
りである。
７−ACAの定量には高速液体クロマグラムを
用いた。カラムはμ−Bondapak C18（ウオータ
ーズ社製）を用い、移動相としては５％酢酸アン
モニウム98容とアセトニトリル２容の混合液を用
いた。検出は260nmで行つた。
用いた。カラムはμ−Bondapak C18（ウオータ
ーズ社製）を用い、移動相としては５％酢酸アン
モニウム98容とアセトニトリル２容の混合液を用
いた。検出は260nmで行つた。
７−ACA以外の化合物（）はＮ−フエニル
アセチル化物に誘導し定量した。即ち、化合物
（）を含む一定量の水溶液に重曹を加えアルカ
リ性に保つ、これに１／10容のアセトンと大過剰
モルのフエニルアセチルクロライドを添加し、室
温で反応させる。30分後、１／２容のエーテルー
で抽出し、過剰のフエニルアセチルクロライドを
除去する。水層をPH２に調節し、通容の酢酸エチ
ルで２回抽出し、酢酸エチル層を合せて減圧乾固
する。残査を一定量のメタノールに溶解し、生成
したＮ−フエニルアセチル化物を高速液体クロマ
トグラムで分析し、製品と比較定量した。カラム
はμ−Bondapak C18を用い、移動相としては
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）とメタノールの混
合液を適宜用いた。検出は260nｍで行つた。生
成したＮ−フエニルアセチル化物の定量値、およ
び既知濃度の化合物（）を用いた対照実験で得
られた回収率から化合物（）の量を計算した。
アセチル化物に誘導し定量した。即ち、化合物
（）を含む一定量の水溶液に重曹を加えアルカ
リ性に保つ、これに１／10容のアセトンと大過剰
モルのフエニルアセチルクロライドを添加し、室
温で反応させる。30分後、１／２容のエーテルー
で抽出し、過剰のフエニルアセチルクロライドを
除去する。水層をPH２に調節し、通容の酢酸エチ
ルで２回抽出し、酢酸エチル層を合せて減圧乾固
する。残査を一定量のメタノールに溶解し、生成
したＮ−フエニルアセチル化物を高速液体クロマ
トグラムで分析し、製品と比較定量した。カラム
はμ−Bondapak C18を用い、移動相としては
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）とメタノールの混
合液を適宜用いた。検出は260nｍで行つた。生
成したＮ−フエニルアセチル化物の定量値、およ
び既知濃度の化合物（）を用いた対照実験で得
られた回収率から化合物（）の量を計算した。
実施例 １
肉エキス0.2％、酵母エキス0.2％、ペプトン0.5
％、グルタミン酸ソーダ0.5％、硫酸マグネシウ
ム0.005％の組成からなる培地（PH7.0）15を30
容量ジヤーフアーメンターに仕込み、120℃、
30分殺菌後、予め同培地で前培養したシユードモ
ナス・エスピーSE−83を２％になるように植菌
した。25℃で48時間培養後、菌体を遠心分離によ
り集め湿菌体52ｇを得た。この湿菌体10ｇを
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）200mlに懸濁し、ク
ロロホルム２mlを添加し32℃で30分間振盪後、セ
フアロスポリンＣ（純度70％）を1.4ｇ添加し、37
℃で４時間反応を行つた。反応終了液中の７−
ACAの生成率は８％であつた。
％、グルタミン酸ソーダ0.5％、硫酸マグネシウ
ム0.005％の組成からなる培地（PH7.0）15を30
容量ジヤーフアーメンターに仕込み、120℃、
30分殺菌後、予め同培地で前培養したシユードモ
ナス・エスピーSE−83を２％になるように植菌
した。25℃で48時間培養後、菌体を遠心分離によ
り集め湿菌体52ｇを得た。この湿菌体10ｇを
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）200mlに懸濁し、ク
ロロホルム２mlを添加し32℃で30分間振盪後、セ
フアロスポリンＣ（純度70％）を1.4ｇ添加し、37
℃で４時間反応を行つた。反応終了液中の７−
ACAの生成率は８％であつた。
反応液から菌体を除き、水で３倍に希釈し、
400mlのDEAEセフデツクスＡ−25（Cl-型、フア
ルマシア社製）のカラムに通した。約600mlの水
で洗い、次に0.05Mの食塩水を通すと７−ACA
が溶出された。７−ACA画分を集め、PH7.0に調
節して減圧濃縮後、予め0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で洗つたダイヤイオンPH−20（三菱化成製）
100mlのカラムを通過させ、次に脱イオン水で充
分カラムを水洗した後、50％メタノール水で溶出
した。７−ACA溶出画分を集め、減圧濃縮後、
PH3.0に調節し、冷所に放置したところ、７−
ACAが析出した。沈でん物を集め、真空乾燥し
て、46mgの７−ACAを得た。この純度は80％で
あつた。
400mlのDEAEセフデツクスＡ−25（Cl-型、フア
ルマシア社製）のカラムに通した。約600mlの水
で洗い、次に0.05Mの食塩水を通すと７−ACA
が溶出された。７−ACA画分を集め、PH7.0に調
節して減圧濃縮後、予め0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で洗つたダイヤイオンPH−20（三菱化成製）
100mlのカラムを通過させ、次に脱イオン水で充
分カラムを水洗した後、50％メタノール水で溶出
した。７−ACA溶出画分を集め、減圧濃縮後、
PH3.0に調節し、冷所に放置したところ、７−
ACAが析出した。沈でん物を集め、真空乾燥し
て、46mgの７−ACAを得た。この純度は80％で
あつた。
実施例 ２
実施例１と同様にして得られた湿菌体１ｇを
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）20mlに懸濁し、５℃
で超音波細胞破砕処理を行つた後、これにセフア
ロスポリンＣ（純度70％）を100mg添加し30℃で10
時間反応を行つた。反応終了液中の７−ACA生
成率は5.5％であつた。
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）20mlに懸濁し、５℃
で超音波細胞破砕処理を行つた後、これにセフア
ロスポリンＣ（純度70％）を100mg添加し30℃で10
時間反応を行つた。反応終了液中の７−ACA生
成率は5.5％であつた。
実施例 ３
実施例１と同様にして得られた湿菌体１ｇを
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）20mlに分散させ、ト
ルエン0.5mlを添加し５℃で30分間振盪後、デア
セチルセフアロスポリンＣ（純度65％）50mgを加
え、25℃で８時間反応させた。反応終了液中の７
−アミノ−デアセチルセフアロスポラン酸の生成
率は4.5％であつた。
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）20mlに分散させ、ト
ルエン0.5mlを添加し５℃で30分間振盪後、デア
セチルセフアロスポリンＣ（純度65％）50mgを加
え、25℃で８時間反応させた。反応終了液中の７
−アミノ−デアセチルセフアロスポラン酸の生成
率は4.5％であつた。
実施例 ４
実施例１と同様にして得られた湿菌体20ｇを
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）100mlに懸濁し、５
℃で超音波細胞破砕処理後、固型物を除去し無細
胞酵素液を調製した。ついで本酵素液について硫
安分画を行つた。即ち、５℃で冷却下で硫酸アン
モニウムを30％飽和濃度まで撹拌しながら除々に
添加し、生成した沈でん物を除去した。上清画分
に硫酸アンモニウムを60％飽和濃度まで添加し、
１時間撹拌後、沈澱画分を集め、0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.0）50mlに溶かした。この酵素液を、
同緩衝液に対し５℃で一晩透析した後、あらかじ
め同緩衝液で平衝化したDEAEセフアデツクスＡ
−50（フアルマシア社製）を充填したカラムに通
すと活性は吸着された。活性の溶出は、塩濃度を
連続的に上昇させてゆく濃度勾配溶出法によつ
た。即ち、溶出液としてカラム容量の５倍量の
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）を使用し、食塩濃度
を最終濃度0.3Mまで直線的に上昇させた。溶出
された活性画分を集め、限外過装置（旭化成
製）を用いて５mlに濃縮した。これにセフアロス
ポリンＣ（純度70％）30mgを加え、30℃で12時間
反応させたところ、７−ACA生成率は10％であ
つた。
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）100mlに懸濁し、５
℃で超音波細胞破砕処理後、固型物を除去し無細
胞酵素液を調製した。ついで本酵素液について硫
安分画を行つた。即ち、５℃で冷却下で硫酸アン
モニウムを30％飽和濃度まで撹拌しながら除々に
添加し、生成した沈でん物を除去した。上清画分
に硫酸アンモニウムを60％飽和濃度まで添加し、
１時間撹拌後、沈澱画分を集め、0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.0）50mlに溶かした。この酵素液を、
同緩衝液に対し５℃で一晩透析した後、あらかじ
め同緩衝液で平衝化したDEAEセフアデツクスＡ
−50（フアルマシア社製）を充填したカラムに通
すと活性は吸着された。活性の溶出は、塩濃度を
連続的に上昇させてゆく濃度勾配溶出法によつ
た。即ち、溶出液としてカラム容量の５倍量の
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）を使用し、食塩濃度
を最終濃度0.3Mまで直線的に上昇させた。溶出
された活性画分を集め、限外過装置（旭化成
製）を用いて５mlに濃縮した。これにセフアロス
ポリンＣ（純度70％）30mgを加え、30℃で12時間
反応させたところ、７−ACA生成率は10％であ
つた。
本発明者らは、化合物（）から化合物（）
への変換を触媒する能力を有する微生物を探索
し、一細菌SE−83株を発見した。本菌は、分類
学的研究の結果、シユードモナス属の新種に属す
ることが判明した。また、上記反応の機構につい
て研究し、本菌が化合物（）を直接脱アシル化
して化合物（）を生成する酵素を生産している
ことを確認した。
への変換を触媒する能力を有する微生物を探索
し、一細菌SE−83株を発見した。本菌は、分類
学的研究の結果、シユードモナス属の新種に属す
ることが判明した。また、上記反応の機構につい
て研究し、本菌が化合物（）を直接脱アシル化
して化合物（）を生成する酵素を生産している
ことを確認した。
これらの発見に基づき、実施例に示す如く、化
合物（）から化合物（）を製造する新規な方
法が確立された。
合物（）から化合物（）を製造する新規な方
法が確立された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式（） （式中Ｒは−OCOCH3、−Ｈまたは−OHである）
で表わされる化合物またその塩にシユードモナス
属の新種に属する微生物、シユードモナス・エス
ピー（Pseudomonas SP.）SE−83（微工研菌寄
第7649号）の培養物またはその処理物を水性媒体
下で作用させることを特徴とする一般式（） （式中Ｒは前記と同じ意味を有する）で表わされ
る化合物またはその塩の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59141475A JPS6121097A (ja) | 1984-07-10 | 1984-07-10 | ７−アミノセフアロスポラン酸及びその誘導体の製造法 |
| ES544986A ES8604648A1 (es) | 1984-07-10 | 1985-07-09 | Procedimiento para la fabricacion de un compuesto del acido 7-aminocefalosporanico. |
| US06/753,008 US4774179A (en) | 1984-07-10 | 1985-07-09 | Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound |
| IT21501/85A IT1186749B (it) | 1984-07-10 | 1985-07-10 | Procedimento di preparazione di un composto dell'acido 7-amminocefalosporanico |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59141475A JPS6121097A (ja) | 1984-07-10 | 1984-07-10 | ７−アミノセフアロスポラン酸及びその誘導体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6121097A JPS6121097A (ja) | 1986-01-29 |
| JPH0527395B2 true JPH0527395B2 (ja) | 1993-04-21 |
Family
ID=15292750
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59141475A Granted JPS6121097A (ja) | 1984-07-10 | 1984-07-10 | ７−アミノセフアロスポラン酸及びその誘導体の製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4774179A (ja) |
| JP (1) | JPS6121097A (ja) |
| ES (1) | ES8604648A1 (ja) |
| IT (1) | IT1186749B (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4981789A (en) * | 1987-03-18 | 1991-01-01 | Merck & Co., Inc. | One-step enzymatic conversion of cephalosporin C and derivatives to 7-aminocephalosporanic acid and derivatives |
| DE3743323A1 (de) * | 1987-12-21 | 1989-06-29 | Hoechst Ag | Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von (alpha)-aminoadipinyl-monoaminoverbindungen |
| JPH04504362A (ja) * | 1989-04-04 | 1992-08-06 | バイオピユア・コーポレーシヨン | 酵素による７―アミノセフアロスポラン酸の製造 |
| US5229274A (en) * | 1989-06-27 | 1993-07-20 | Merck & Co., Inc. | Gene encoding one step cephalosporin C amidase and expression thereof in recombinant bacillus |
| US5104800A (en) * | 1989-06-27 | 1992-04-14 | Merck & Co., Inc. | One-step cephalosporin c amidase enzyme |
| ATE167520T1 (de) * | 1990-04-18 | 1998-07-15 | Gist Brocades Nv | Mutierte beta-lactamacylasegene |
| ES2020792A6 (es) * | 1990-08-03 | 1991-09-16 | Antibioticos Sa | Un procedimiento enzimatico para la presentacion de acido 7-amino-cefa-losporanico y un procedimiento para expresar la enzima 7b (4-carboxibutanamido) cefalosporinacilasa. |
| IT1250698B (it) * | 1991-07-24 | 1995-04-21 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Processo per la preparazione enzimatica di acidi 7-ammino-cefalosporanici. |
| UA47385C2 (uk) * | 1991-10-15 | 2002-07-15 | Гіст-Брокейдс Б.В. | Спосіб одержання 7-амінодеацетилцефалоспоранової кислоти, спосіб одержання 7-аміноцефалоспоранової кислоти, вектор експресії рекомбінантної днк (варіанти), клітина-хазяїн penicillium chrysogenum (варіанти), спосіб культивування рекомбінантної клітини-хазяїна penicillium chrysogenum (варіанти) |
| KR100345994B1 (ko) * | 1994-06-22 | 2002-12-16 | 제일제당주식회사 | 7-아미노세팔로스포란산의효소적제조방법 |
| AU3346295A (en) * | 1994-08-12 | 1996-03-07 | Gist-Brocades B.V. | Mutated penicillin g acylase genes |
| GB9423212D0 (en) | 1994-11-17 | 1995-01-04 | Glaxo Group Ltd | Industrial enzymes |
| CA2270400C (en) | 1996-11-05 | 2010-09-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Mutant penicillin g acylases |
| ES2252302T3 (es) * | 2000-09-22 | 2006-05-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Amidasa de glutaril cefalosporina a partir de pseudomonas diminuta bs-203. |
| KR20040014498A (ko) * | 2001-04-19 | 2004-02-14 | 바이오퍼마 무르시아, 에스.에이. | 세팔로스포린 유도체의 제조 방법 |
| KR100530299B1 (ko) * | 2003-08-11 | 2005-11-22 | 산도즈 게엠베하 | 변이 세팔로스포린 ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ａｃａ 제조방법 |
| EP1694835A2 (en) * | 2003-12-05 | 2006-08-30 | Stichting Voor De Technische Wetenschappen | Glutaryl amidases and their uses |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3239394A (en) * | 1964-06-15 | 1966-03-08 | Merck & Co Inc | Process for producing 7-amino-cephalosporanic acid |
| JPS5417030B2 (ja) * | 1972-12-06 | 1979-06-27 | ||
| JPS5417032B2 (ja) * | 1974-01-23 | 1979-06-27 | ||
| JPS52143289A (en) * | 1976-05-24 | 1977-11-29 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Production of 7-amino-cephem derivatives by filamentous fungi |
| JPS60995B2 (ja) * | 1977-01-27 | 1985-01-11 | 明治製菓株式会社 | ７−アミノ−セフアロスポラン酸およびその誘導体の新規製造法 |
-
1984
- 1984-07-10 JP JP59141475A patent/JPS6121097A/ja active Granted
-
1985
- 1985-07-09 US US06/753,008 patent/US4774179A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-09 ES ES544986A patent/ES8604648A1/es not_active Expired
- 1985-07-10 IT IT21501/85A patent/IT1186749B/it active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT8521501A0 (it) | 1985-07-10 |
| IT1186749B (it) | 1987-12-16 |
| ES8604648A1 (es) | 1986-02-01 |
| ES544986A0 (es) | 1986-02-01 |
| US4774179A (en) | 1988-09-27 |
| JPS6121097A (ja) | 1986-01-29 |
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