JPS6314955B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕 本発明はバシルス属細菌の生産する新規なアミ
ラーゼによるマルトテトラオースの製造法に関す
るものである。 〔従来技術〕 澱粉をグルコースあるいはマルトースに分解す
るグルコアミラーゼ、β−アミラーゼやα−アミ
ラーゼは自然界に広く存在することが知られてい
るが、より分子量の大きい、例えば、マルトトリ
オース（G3）、マルトテトラオース（G4）、マル
トペンタオース（G5）、マルトヘキサオース
（G6）などのオリゴ糖単位で切断するアミラーゼ
についての報告は少ない。 注目されている。特に、G4〜G7の各オリゴ糖
は、診断用アミラーゼの活性測定用基質としても
注目されている。 〔目的及び効果〕 本発明者は、これらオリゴ糖の製法を確立する
ことを目的として、広く自然界より微生物の検索
を行つてきた結果、アミロース、アミロペクチ
ン、澱粉などのα−グルカンを特異的にマルトテ
トラオース（G4）に加水分解する新規なアミラ
ーゼがバシルス・サーキユランス（Bacillus
circulans）と同定した細菌により生産されるこ
とを認めた。 澱粉からマルトテトラオースを生成するアミラ
ーゼとしては、シユードモナス スツツエリ
（Sseudomonas stuzeri）の生産するアミラーゼ
が、アミロースやアミロペクチンの非還元性末端
からマルトテトラオース単位で加水分解すること
が知られている。 しかし、この酵素はアミロペクチンやグリコー
ゲンからは高分子量のリミツトデキストリンを残
すと報告されている。〔アーカイブ バイオケミ
ストリー アンド バイオフイジクス（Archive
Biochemistry and Biophysics）145巻105頁
（1971）〕。そして、この酵素による澱粉からのマ
ルトテトラオースの収量は約55％、アミロペクチ
ンからの収量は52％、と報告されている〔アメリ
カ合衆国特許USP3654082（1972）、アミラーゼ
シンポジウム、６巻、31頁（1971）〕。 しかるに、本発明のバシルス属組菌の生産する
アミラーゼは、澱粉から約65〜75％の極めて高い
収量でマルトテトラオースを生成することが認め
られた。マルトテトラオースの収量は、使用する
澱粉の種類、液化度（DE）、酵素量などにより影
響されるが、通常、グルコース１〜５％、マルト
ース５〜15％

〔構成〕

本発明は、澱粉からマルトテトラオースを主成
分として生成するアミラーゼG4を、澱粉、アミ
ロペクチン、グリコーゲンまたは、これらの部分
分解物に作用させて、マルトテトラオースを製造
するに際し、α−1.6グリコシダーゼの存在下で
糖化することを特徴とするマルトテトラオースの
製造方法に関するものである。 以下に、本発明の内容を更に、具体的に説明す
る。 本発明により生産される酵素は、下記の酵素的
性質を有する。 (1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンなどのα−グルカンをマルトテトラオー
スを主成分とする分解物に分解する。本酵素は
エンド型の分解様式を持つα−アミラーゼの一
種であり、液化澱粉に作用させるとき、約65〜
75％の収量でマルトテトラオースが得られる。 (2) 作用温度範囲及び最適作用温度；１％可溶性
澱粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き約75℃まで作用し、最適作用温度は約50℃で
ある。（第１図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適作用PH；約４〜約12の広
い範囲に作用する。最適作用PHは６〜8.5であ
る（0.05M酢酸またはリン酸緩衝液、１％可溶
性澱粉下で作用、第１図ｂ）。 (4) 熱安定性；0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）の下
で加熱した場合、50℃、10分間の加熱で約40％
矢活し、55℃、10分間の加熱で約85％失活した
〔第１図Ｃ〕。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下で、室温（25℃）
で３時間放置後、残存活性を測定した。その結
果、PH６〜９の範囲で安定であつた〔第１図
ｄ〕。 (6) 安定化；カルシウムイオンが存存するとき、
熱安定性の増加が認められた〔第１図Ｃの破
線〕。 (7) 阻害剤；本酵素は、５×10^-3MのHgCl₂、
CuSO₄、ZnSO₄、AgNO₃により、それぞれ、
約100％、約95％、約50％、約30％阻害された。 (8) 製精方法；本酵素は、液体培養物の遠心上澄
液から、硫安分画、DEAE−セフアロース
（Sepharose）カラム クロマトグラフイーと
バイオゲル（Biogel）A0.5ｍカラム クロマ
トグラフイー及び同ゲルによる再クロマトグラ
フイーにより電気泳動的に均一まで精製するこ
とができる。 (9) 分子量；バイオゲル（Biogel）A0.5ｍを用
いたゲル濾過法により測定した分子量は約１万
であつた。 (10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に
溶解させた２％可溶性澱粉0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし、40℃で反応させ
る。この条件で１分間に1μモルのグルコース
に相当する還元力を生成する酸素量を１単位と
した。 以上の酵素的性質について、本発明以前に知ら
れている、シユードモナス スツツエリのマルト
テトラオース生成アミラーゼと比較すると、(1)最
適作用PHは、本発明の酵素はPH６〜8.5の広いPH
範囲にあるのに対し、シユードモナス スツツエ
リの酵素はPH８付近にあること、(2)本発明の酵素
を澱粉に作用させたとき、約65〜75％の収量でマ
ルトテトラオースが得られるのに対し、シユード
モナス スツツエリの酵素の場合は約55％である
こと、(3)本発明の酵素の分子量は１万前後にある
のに対し、シユードモナス スツツエリの酵素
は、48000と58000にある〔バイオケミストリー
アンド バイオフイジクス アクタ
（Biochemistry and Biophysics Acta）566巻、
88頁（1979）〕など、本発明の酵素とシユードモ
ナス スツツエリの酵素とは、澱粉からのマルト
テトラオースの収量、最適作用PH、分子量などの
性質において、顕著な違いのあるものであり、新
規な酵素ということができる。 本発明の酵素による糖化反応において使用され
る、α−1.6−グルコシダーゼとは、アミロペク
チン、グリコーゲンあるいは、プルランなどに存
在するα−1.6−グルコシド結合を分解する酵素
であり、種々の細菌、放線菌、酵母などにより生
産される。基質特異性の差により、イソアミラー
ゼ、プルラナーゼなどと呼ばれることがあるが、
総称して枝切り酵素（debranching enzyme）、
α−1.6−グルコシダーゼなどと呼ばれる。本発
明のアミラーゼG4は、いずれのα−1.6−グルコ
シダーゼを用いても、効率よくマルトテトラオー
スの収量を増加することができる。たとえば、澱
粉を基質として、アミラーゼG4単独の場合、マ
ルトテトラオースの収量は約65％であつたもの
が、プルラナーゼの共存下で糖化反応を行うと約
74％まであげることができた。 本発明の酵素を生産する例示菌として、バシル
ス・サーキユランスＧ−４（Bacillus circulans）
Ｇ−４を挙げる。本菌の菌学的性質は下記に示す
通りであり、微工研条寄第820号として、工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態；桿菌、巾0.5〜１×５〜6μ、運動性な
し、グラム陰性。 (2) 胞子；通常、末端近くに１個、胞子嚢のふく
らみは認められない。 (3) 肉汁；混濁、沈降する。 (4) 肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及
び表面凹凸あり。 (5) グルコース肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐
色。 (6) グルコース硝酸寒天；生育悪い。 (7) ポテト；生育良好、乳白色に生育。 (8) グルコース・アスパラギン寒天；生育あまり
良くない。淡黄〜黄褐色。 (9) チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐
色。 (10) ミルク；ゆつくり凝固、ペプトン化。 (11) インドール；生成しない。 (12) カタラーゼ；生成する。 (13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。 (14) 硫化水素；生成しない。 (15) クエン酸；利用する。 (16) 硝酸塩の還元；陰性。 (17) クエン酸；利用する。 (18) 食塩肉汁；８％食塩含有培地までよく生育
し、10％食塩でも少し生育する。 (19) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−リボース、マルトース、シユークロー
ス、澱粉などから酸を生成するが、ガスの生成
はない。Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｌ
−ソルボースの利用性は良くない。 (20) 最適生育温度；26℃前後。 (21) 最高生育温度；約60℃ (22) 死滅温度；100℃で30分間加熱しても死滅
しない。 以上の菌学的性質について、バージエイス マ
ニユアル オブ デタミネーテイブ バクテリオ
ロジー（Bergey′s Mannual of Determinative
Bacteriology）の第７版及び第８版〔ザ ウイ
リアムス アンド ウイルキンス カンパニー
（The Williams and Wilkins Company）、
（1957年及び1974年）を参照し、本菌をバシルス
サーキユランス（Bacillus circulans）の種と
同定し、バシルス サーキユランスＧ−４と命名
した。 本発明によるアミラーゼG4を生産するための
培養は、窒素源として肉エキス、ペプトン、酵母
エキス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカ
ー、大豆粕など、通常、微生物の培養に対し良く
用いられる有機窒素源が使用され、炭素源として
は、澱粉、デキストリン、マルトーズ、グルコー
ス、シユークロースなどが使用される。そして、
これに補足する栄養源として、無機窒素源、リン
酸塩、マグネシウム塩と各種金属塩を含む培地が
使用される。培養はPH５〜９、温度20〜60℃で好
気的に行われる。 アミラーゼG4は、菌体外に生産される酵素で
あるので、培養終了後濾過または遠心分離により
除菌し、上澄液を回収する。必要により濃縮し、
硫安、硫酸ナトリウムによる塩析によるか、また
は、アセトン、インプロパノール、エタノール、
メタノールなどの有機溶媒を加えて、酵素を沈澱
物として収得し、乾燥、保存する。 アミラーゼG4を用いて、澱粉を糖化する反応
は、次のようにして行う。澱粉は、酸またはα−
アミラーゼにより液化される。液化度はマルトテ
トラオースの収量に影響するので、望ましくは
DE20以下の液化澱粉が使用される（DEは固形分
中の還元力をグルコースとして表した百分率）。
基質濃度は、通常、５〜40％で行われる。反応PH
は、通常５〜９、温度は40〜60℃である。本酵素
はカルシウムイオンの存在により、著しく熱安定
化されるので、糖化反応に際して、５×10^-4〜２
×10^-2M程度のカルシウム塩が添加される。 次に、実施例により本発明の詳細を説明する。 実施例 １ ポリペプトン１％、リン酸２カリ0.3％、硫酸
マグネシウム（７水塩）0.1％、可溶性澱粉１％
からなる培地30mlを200ml容三角フラスコに入れ、
120℃で10分間殺菌したのち、バチルス・サーキ
ユランスG4（微工研条寄第820号）を接種し、30
℃で４日間振盪培養（160rpm）した。 培養後、遠心分離して得た上澄液について生産
されたアミラーゼG4を測定した結果、培地１ml
当たり6.4単位であつた。 実施例 ２ 実施例１で得られた酵素液を使用して、澱粉の
糖化を行つた。 基質としては、DE4.2の液化澱粉100mg（固形
分）に、塩化カルシウム５×10^-3Mとアミラーゼ
G4を、基質１ｇ当たり２単位加えたもの、及び
これにクレブシラ（Klebsiella）属のプルラナー
ゼ（ナガセ生化学製）を基質１ｇ当たり、２単位
または５単位加え、水で全量１mlとして、50℃で
反応させた。反応開始後、20時間目と44時間目に
一定量を採り、生成したマルトテトラオースを高
速液体クロマトグラフ法により定量した。結果を
第２表に示す。

【表】 表から明らかなように、アミラーゼG4を用い
て、澱粉を糖化する反応において、プルラナーゼ
を共存させて糖化反応を行うと、糖化反応が促進
され、アミラーゼG4の単独の場合よりも、マル
トテトラオース含量の高い糖化物が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂ，ｃとｄはそれぞれ、アミラーゼ
G4の最適作用温度、最適作用PH、熱安定性とPH
安定性を示す。第２図は、高速液体クロマトグラ
フにより分離した糖化物の糖組成を示す。１；グ
ルコース、２；マルトース、３；マルトトリオー
ス、４；マルトテトラオース。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 澱粉からマルトテトラオースを主成分として
   生成するアミラーゼG4を、澱粉、アミロペクチ
   ン、グリコーゲンまたは、これらの部分分解物に
   作用させて、マルトテトラオースを製造するに際
   し、α−1.6−グルコシダーゼの存在下で糖化す
   ることを特徴とするマルトテトラオースの製造方
   法。