JPH0134037B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕 本発明は、バシルス属細菌による新規なアミラ
ーゼの製造方法に関するものである。 〔従来技術〕 澱粉を加水分解する酵素として、分解様式や生
成する糖により、種々のアミラーゼのあることが
知られている。澱粉をマルトース単位に分解する
酵素としては、大豆、麦芽や小麦などの植物起源
のβ−アミラーゼ｛酵素研究法、第２巻、120頁、
朝倉書店（昭和30年）｝とバシルス属細菌の生産
するβ−アミラーゼ（アミラーゼシンポジウム、
６巻、39頁（1971）、アグリカルチヤーバイオロ
ジカルケミストリー（Agriculture Biological
Chemistry）38巻、1023（1974）、同40巻、1515頁
（1976）など｝が知られている。これらの酵素は、
α−１，４−グルカンの非還元末端より、厳密に
マルトース単位で加水分解し、生成マルトースは
β−型である。 最近、H.OuttrupとB.E.Normanは、バシルス
ステアロサーモフイラス（Bacillus
stearothermophilus）の生産する新規なマルトー
ス生成酵素について報告している｛第35回デトモ
ルドスターチコンベンシヨン（35th Detmold
Starch Convention1984年４月25日〜27日）｝。こ
の酵素は、澱粉の非還元性未端からエキソ型でマ
ルトースを生成するが、生成マルトースはα−型
であること、植物β−アミラーゼのように、厳密
にマルトース単位で加水分解するものではなく、
反応初期には、マルトテトラオース（G4）、マル
トトリオース（G3）とマルトース（G2）の他
に、少量のマルトペンタオース（G5）やマルト
ヘキサオース（G6）も生成すること、シヤーデ
インガー（Shardinger）デキストリンをマルト
ースとグルコースに分解すること、及びマルトト
リオースをマルトースとグルコースに分解すると
報告されている。このため、この酵素による澱粉
分解物中には６〜８％のグルコースが含まれる。 〔目的及び効果〕 本発明者は、澱粉からマルトースを特異的に生
成するアミラーゼ生産菌を求めて、広く微生物の
検索を行つてきた結果、土壌中より分離し、バシ
ルスメガテリウム（Bacillus megaterium）と同
定した細菌が新規で、且つ耐熱性のマルトース生
成酵素を生産することを認めた。本酵素は、澱粉
を、その非還元性末端からマルトース単位で加水
分解すると考えられるが、生成糖はα−型である
ことを、生成物の変旋光及びガスクロマトグラフ
による分析により確認した。本酵素はアミロペク
チンのα−１，６−グルコシド結合を分解するこ
とができないため、リミツトデキストリンを残す
が、アミロペクチンのマルトースへの分解率は、
β−アミラーゼの場合に比べて、２〜３％高く、
より分岐結合（α−１，６−グリコシド結合）を
近くまで分解できるものと考えられる。また、反
応初期には、マルトース以外の生成物は観察され
ず、マルトトリオースに対する親和性が小さいた
め、最終反応物中には、グルコースは殆んど存在
しないなど、新規な酵素と考えられた。本発明者
は、この酵素をアミラーゼG2と命名した。本発
明はこの知見にもとずいてなされたものである。 〔構 成〕 本発明は、バシルス属に属しアミラーゼG2を
生産する菌株を培養し、培養物からアミラーゼ
G2を採取することを特徴とするバシルス属アミ
ラーゼG2の製造方法に関するものである。 以下に、本発明の内容を更に詳明に説明する。 本発明で製造されるアミラーゼG2の酵素的性
質は次のとおりである。 (1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンのα−１，４−グルコシド結合を、その
非還元性末端からマルトース単位で加水分解す
る。生成糖はα−マルトースであることからα
−アミラーゼの一種と考えられるが、エンド型
の分解作用を示さず、アミロペクチン、グリコ
ーゲンからはリミツトデキストリンを残す。サ
イクロデキストリンを分解せず、またマルトト
リオースの分解力も弱い。生成糖がα−型であ
ることを除けば、植物や細菌のβ−アミラーゼ
に似ているが、アミロペクチンやこれを含む澱
粉に対する分解限度は２〜３％高い。 (2) 作用温度範囲及び最適温度；１％可溶性澱
粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適温度は約60℃であ
る（第１図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適PH；約３〜約11の広いPH
範囲に作用する。最適PHは約７〜7.5である
（0.05Mリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉の下で
作用、（第１図ｂ）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
下で加熱した場合、50℃、10分間の加熱までは
失活が認められない。60℃10分間の加熱で約10
％失活し、65℃10分間の加熱で約70％失活し、
そして、60℃10分間の加熱で90％以上失活した
（第１図ｃ）。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下、室温（30℃）
で３時間放置後、残存活性を測定した。その結
果、PH4.5〜８の範囲で安定であつた（第１図
ｄ）。 (6) 安定化；カルシウムイオンによる熱安定性の
増加は認められなかつた。 (7) 阻害剤；本酵素は、１×10^-3MのHgCl₂、
AgNO₃、CuSO₄、NiSO₄により、それぞれ約
85％、約75％、約70％、約60％阻害された。ま
た、１×10^-3Mのｐ−クロロマーキユリベンゾ
エートにより約70％阻害された。 (8) 精製方法；本酵素は、液体培養液の上澄か
ら、硫安分画、DEAE−セフアロースカラムク
ロマトグラフイー、同カラムによる再クロマト
グラフイーとバイオゲルA0.5mによるカラムク
ロマトグラフイーにより、デイスク電気泳動的
に均一まで精製することができる。 (9) 分子量；セフアデツクスＧ−200により測定
した分子量は約60000であつた。 (10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液に溶解させ
た２％可溶性澱粉0.5mlに、適量の酵素を加え、
水で全量１mlとし、40℃で反応させる。この条
件で、１分間に1μモルのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位とした。 以上の酵素的性質について、アミラーゼG2を
本発明以前に知られている、植物起源のβ−アミ
ラーゼ、バシルス属細菌のβ−アミラーゼ及びバ
シルスステアロサーモフイラスのマルトース生成
アミラーゼと比較した結果は、第１表に示す通り
である。 すなわち、植物系β−アミラーゼ及びバシルス
属のβ−アミラーゼはβ−マルトースのみを生成
するのに対し、アミラーゼG2はα−マルトース
のみを生成する。バシルスステアロサーモフイラ
スのアミラーゼは、アミラーゼG2と同様α−マ
ルトースを生成するが、反応初期には、マルトテ
トラオースやマルトトリオース及び微量のマルト
ヘキサオースやマルトペンタオースを生成すると
報告されている。従つて、これら酵素はアミラー
ゼG2とは本質的に異なつている。また、最適PH、
最適温度、分子量などの酵素的性質においても差
が認めらめることから、アミラーゼG2は新規な
酵素ということができる。 アミラーゼG2を生産する例示菌として、バシ
ルスメガテリウム（Bacillus megaterium）を挙
げる。本菌の菌学的性質は下記に示す通りであ
り、微工研菌寄第7978号として、工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態；巾0.7〜1.3×2.4〜5.0μ、通常、２個以
上連なり、短鎖状に生成する。グラム陰性。 (2) 胞子；両末端近くに２個。胞子をもつ細胞の
ふくらみは殆んど認められない。 (3) 生育；好気的に生育。嫌気下では殆んど生育
は認められない。 (4) 肉汁；混濁、沈降する。 (5) 肉汁寒天；生育良好、表面なめらか、淡褐色
を示すが、色素の生成なし。 (6) グルコース肉汁寒天；肉汁培地よりよく生育
する。

【表】 (7) グルコース硝酸塩寒天；よく生育する。表面
なめらか。淡褐色を示す。 (8) チロシン寒天；褐色色素を生成する。 (9) グルコース・アスパラギン寒天；かなりよく
生育する。 (10) ポテト；生育良好、表面なめらかで、淡褐色
を示す。培地中に褐色色素を生成する。 (11) クエン酸の利用；陽性。 (12) 澱粉の加水分解；陽性。 (13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。 (14) ゼラチン；分解する。 (15) ミルク；凝固し、ペプトン化する。 (16) 硝酸塩の還元；陽性。 (17) カタラーゼ；陽性。 (18) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトー
ル、Ｄ−ソルビトール、マルトース、蔗糖など
を利用し、いずれもガスを生成することなく生
産する。 (19) 最適生育温度；40℃前後。 (20) 最高生育温度；約50℃。 (21) 死滅温度；100℃、20分間の加熱でも死滅
しない。 以上の菌学的性質について、バージエイス マ
ニユアル オブ デタミネーテイブ バクテリオ
ロジー（Bergey'sMannual of Determinative
Bacteriology）の第７版及び第８版（ザ ウイ
リアムス アンド ウイルキンス カンパニー
（The Williams and Wilkins Company）、1957
年及び1974年）を参照し、本菌をバシルス メガ
テリウム（Bacillus megaterium）G2と命名し
た。なお、アミラーゼG2を生産するバシルス
メガデリウムG2は、β−アミラーゼを生産しな
い。 バシルス メガテリウムG2を培養して、アミ
ラーゼG2を生産するための一般的培養は、次の
ようにして行われる。 培養は、通常、液体培地による通気、撹拌培養
により行われる。窒素源としては、肉エキス、ペ
プトン、酵母エキス、カゼイン、コーンステイプ
リカー、大豆粕など、通常、微生物の培養に際
し、よく用いられる有機窒素源、あるいはこれに
補足する窒素源として、塩化アンモン、リン酸ア
ンモン、硝酸塩などの無機窒素源が用いられる。
炭素源としては、澱粉、デキストリン、マルトー
ス、グルコース、シユークロスなどが使用され
る。培養はPH５〜９、温度20〜60℃で好気的に行
われる。 アミラーゼG2は、菌体外に生産される酵素で
あるので、培養終了後、濾過または遠心分離によ
り除菌し、上澄液を回収する。 培養上澄液は、必要により濃縮し、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析による
か、または、アセトン、イソプロパノール、エタ
ノール、メタノールなどの有機溶媒を加えて、酵
素を沈澱物として収得し、乾燥、保存する。 アミラーゼG2を用いて、澱粉を糖化する反応
は、次のようにして行う。 澱粉は、先ず、酸または澱粉液化酵素α−アミ
ラーゼにより液化される。澱粉の液化度（DE）
は、マルトースの収量に著しく影響し、液化度の
小さい液化澱粉を使用する方が収量よくマルトー
スが得られる。（DEは固形分中の還元力をグルコ
ースとして表わした百分率）。基質濃度は、通常、
５〜40％、反応PHは５〜８、温度は50〜60℃で行
われる。 本酵素はアミロペクチンのα−１，６−グルコ
シド結合を分解することができないので、アミロ
ペクチン、あるいはこれを含む澱粉又はその派生
物を基質として用いるときには、α−１，６−グ
ルコシド結合を分解するイソアミラーゼやプルラ
ナーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼの存在
下で反応を行うと、糖化反応を促進し、収量よく
マルトースを製造することができる。 次に、実施例により、本発明の詳細を説明す
る。 実施例 １ 大豆タンパク２％、米ぬか２％、K₂HPO₄0.3
％、MgSO₄・7H₂O0.1％、可溶性澱粉２％、
CaCl₂1×10^-3M、MnCl₂1×10^-4M、CuSO₄2.5×
10^-5M、FeCl₂2.5×10^-5M、ラウリル硫酸ナトリ
ウム2.5×10^-2％からなる培地（PH7.0）30mlを200
ml容三角フラスコに入れ、120℃で15分殺菌後、
バシルス メガテリウム（微工研菌寄第7978号）
を接種し、30℃で３日間振盪培養（160rpm）し
た。培養後、遠心分離して得た上澄液について、
生産されたアミラーゼG2活性を測定した結果、
培地１ml当り、9.0単位であつた。 実施例 ２ 実施例１で得られた培養上澄液に、硫安を80％
飽和になるように添加し、生成した沈澱物を遠心
分離機により回収し、水に溶解し、１×10^-3Mの
Ｌ−システインを含む蒸留水に対し、一夜透析し
たものを澱粉糖化用酵素液とした（酵素の回収率
は約82％であつた）。 可溶性澱粉、短鎖アミロース（DP17）、アミロ
ペクチン（トウモロコシ製）、グリコーゲン（カ
キ製）各20mgに、アミラーゼを６×10^-3単位加
え、全量２mlとし、PH７、40℃で、３日間反応を
おこなつた。反応後、糖化液の糖組成を液体クロ
マトグラフ法により測定した結果は、第２表に示
す通りであつた。

【表】 実施例 ３ DE5.81の液化ポテト澱粉各100mgに、トリス緩
衝液（PH7.0）0.04M、アミラーゼG2または麦芽
β−アミラーゼを液化澱粉固形分ｇ当り、それぞ
れ１、３、５、10、15、20、30単位を加え、60℃
で３日間反応を行つた。反応後、糖化液の糖組成
を分析した結果は、第２図に示す通りであり、β
−アミラーゼ（黒丸）に比べアミラーゼG2（白
丸）は分解力が優れ、約２％マルトースの収量が
高かつた。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂ，ｃとｄは、それぞれアミラーゼ
G2の最適温度、最適PH、熱安定性とPH安定性を
示している。第２図は、DE5.81の液化ポテト澱
粉をアミラーゼG2と麦芽β−アミラーゼで糖化
したとき酵素量とマルトース生成率の関係を示し
ている。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バシルス属に属し、アミラーゼG2を生産す
   る菌株を培養し、培養物からアミラーゼG2を採
   取することを特徴とするバシルス属アミラーゼ
   G2の製造方法。