JPH0529432B2

JPH0529432B2 -

Info

Publication number: JPH0529432B2
Application number: JP9154090A
Authority: JP
Inventors: Yoshihide Kawamura; Mitsunori Itoyama; Masaaki Shinonaga; Masaki Mihashi
Original assignee: Fuji Spinning Co Ltd
Current assignee: Fujibo Holdings Inc
Priority date: 1990-04-06
Filing date: 1990-04-06
Publication date: 1993-04-30
Also published as: JPH03290188A

Description

【発明の詳細な説明】

〓産業上の利用分野〓本発明は、脱水乾燥時の担体の収縮率を小さく
し、又、該担体に高い圧縮強度を付与させた、酵
素もしくは微生物を固定化するのに優れた性能を
具備した担体の製造方法に関するものである。〓従来の技術〓多糖類系の担体はその優れた多孔性と親水性能
により固定化用担体、クロマトグラフイー用担体
として好適であるが、反面、物理的強度が低く、
又、含水率が高いので脱水乾燥前後の担体の容積
変化が極めて大きいものであつた。本発明者等
は、特公昭63−54286号、特開昭63−28453号及び
特開昭63−205144号で開示した如く、キトサンの
多孔質成形物を酵素の固定化用担体として使用す
るために各種の架橋剤で官能基を導入することを
研究してきたが、水溶液中で酵素を固定化し、そ
のまま水溶液中で酵素反応を行う際には極めて優
れた性能を発揮するが、有機溶剤中で酵素反応を
行う場合には酵素固定化用担体の脱水乾燥操作が
必須であり、脱水乾燥を行う場合には担体の収縮
が著しく、酵素の発現活性は極めて低いものであ
つた。又、特願平１−45781号で出願した微生物
の固定化用担体は、酵母や糸状菌の如き比較的大
きな微生物を固定化させるのに好適な細孔を多孔
質キトサン成形物が具備しているが、担体の空隙
率が高く流動層型リアクターでは優れた性能を発
揮するが、カラム充填の固定層型リアクターでは
圧縮強度の点で未だ不充分であつた。〓発明が解決しようとする課題〓有機溶剤中での酵素反応の特徴は、脱水縮合反
応を行う酵素の平衡関係を生成物側に移動させる
ことで、反応液中の水分は厳格に制御されなけれ
ばならない。一方、酵素は有機溶剤に不溶である
ので、担体に酵素を固定化するためには酵素水溶
液中に担体を加えて酵素を担体に吸着固定化した
後、脱水乾燥をする操作が必要である。従つて、
固定化された酵素の充分なる発現活性を得るため
に、脱水乾燥時の担体の収縮を出来るだけ小さく
する必要がある。しかし、上述したキトサン系固
定化用担体は、多孔質で酵素や基質の拡散が良好
であるうえ親水性を具備しているので、吸着され
た酵素の変性が少なく発現活性が高いという特徴
をもつているが、担体が脱水乾燥されたとき壊れ
たり、また著しく収縮をする欠点があつた。又、
微生物固定化用担体として用いたときには、無機
質担体に比較して弾力性があるうえに比重が小さ
いことから流動性に富み、種々の撹拌操作に耐え
る優れた性能があるが、微生物が担体内部に入り
込める大きさの細孔径を具備させることで担体内
部の空隙率が高くなり、特に流動層型リアクター
では通液時に生ずる担体の圧密化が著しいもので
あつた。本発明は、脱水乾燥操作に対しての担体の収縮
率を小さくし、又、高い圧縮強度を有する如く改
善することを目的とするものである。〓課題を解決するための手段〓本発明は、低分子量キトサンの酸性水溶液を塩
基性水溶液中で凝固析出させ多孔質キトサン成形
物を得、次いで脂肪族ポリアルコールのグリシジ
ルエーテルを反応させ、更に官能基を導入する固
定化用担体の製造方法において、脂肪族ポリアル
コールのグリシジルエーテルを水酸化カリウムを
含むジオキサン中で反応させることを特徴とする
酵素もしくは微生物固定化用担体の製造方法であ
る。本発明においては、キトサンとして平均分子量
が10000〜230000の低分子量キトサンが用いられ、
該低分子量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸、蟻酸
の単独又は混合物の水溶液に溶解させてキトサン
酸性水溶液とする。キトサン酸性水溶液中のキト
サンの濃度は２〜20％（重量）の範囲で自由に選
択できる。この際、キトサン酸性水溶液中に細孔
調節剤として水溶性高分子物質であるポリビニル
アルコール、ポリエチレングリコール等を単独又
は組合せ添加してもかまわない。該キトサン酸性
水溶液からキトサンを再生して多孔質キトサン成
形物を得るためには、例えば孔径0.1〜0.25mmφ
のノズルより圧力下で塩基性水溶液中に該キトサ
ン酸性水溶液を一定量づつ落下させ凝固再生させ
ることにより、多孔質キトサン成形物の粒状体が
得られる。塩基性凝固液中に加える塩基性物質と
しては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭
酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、エチ
レンジアミン等のアルカリ性物質が用いられ、塩
基性溶液とするには、水、又はメタノール、エタ
ノール等の極性を有するアルコール類又は水とア
ルコール類の混合物に上述の塩基性物質を加えて
使用する。得られた水を含有する多孔質キトサン
成形物は、成形物の表面に更に大きな直径の細気
孔を具現さすためには、必要に応じ特願平１−
45781号で開示した方法による表面処理を行つて
もよい。即ち、得られた多孔質キトサン成形物を
必要に応じメタノール、エタノール、イソプロピ
ルアルコール等のアルコール類やアクリロニトリ
ル等の極性溶媒を用いて水を置換して酸水溶液で
表面処理をする。この際用いられる酸としては酢
酸、蟻酸、プロピオン酸等の有機酸、又は塩酸、
硝酸等の鉱酸が用いられる。酸による表面処理
は、成形物に水が含まれていれば酸の水溶液を、
極性溶媒が含まれていれば該極性溶媒と酸の混合
液を用いることが好ましい。酸の濃度としては
0.5〜5.0％（重量）のものが用いられ、処理時間
は10秒〜５分間の短時間行われ、酸処理後は酸を
充分水洗する。次いで、最終生成物である担体の収縮率を小さ
くし、高い圧縮強度を持たせるために多孔質キト
サン成形物の水をジオキサンで置換し、水酸化カ
リウム水溶液を入れ、脂肪族ポリアルコールのグ
リシジルエーテルを加え、多孔質キトサン成形物
と等容積のジオキサン中で反応させる。この際の
水酸化カリウムは、濃度が0.01〜３規定のものを
ジオキサンに対し、1/100〜1/10の容量加える。本発明に用いられる脂肪族ポリアルコールのグ
リシジルエーテルとしては、エチレングリコール
ジグリシジルエーテル、トリエチレングリコール
ジグリシジルエーテル、トリメチレングリコール
ジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコー
ルジグリシジルエーテル、ヘキサメチレングリコ
ールジグリシジルエーテルなどが挙げられる。多
孔質キトサン成形物と脂肪族ポリアルコールのグ
リシジルエーテルとの反応は、20〜90℃好ましく
は25〜80℃の範囲で0.5〜48時間ゆるやかな撹拌
下で行われる。尚、本発明は、脂肪族ポリアルコールのグリシ
ジルエーテルを、水酸化カリウムを含むジオキサ
ン中で反応させることを特徴とするが、水酸化カ
リウムは他のアルカリ性物質に比べてジオキサン
との溶解性が優れており、また、水酸化カリウム
はキトサンＣ−６位の水酸基との反応性が良く、
脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルとの
架橋反応が促進されるという効果がある。反応終了後ジオキサンで洗浄した後、純水で中
性になるまで洗浄する。この様にして得られた多
孔質キトサン成形物に、更に酵素もしくは微生物
を固定化するのに適する種々の活性基を含む官能
基を導入する。その官能基の種類としては第１
級、第２級、第３級、第４級のアンモニウム基等
の陰イオン交換基；スルホン酸基、カルボン酸基
等の陽イオン交換基；イミノジ酢酸基、アミドオ
キシム基、チオール基、ジチオカルバミン基等の
キレート配位基；及び芳香族や脂肪族アルキル等
の疎水性基が挙げられる。これらをキトサンの残
存アミノ基もしくは水酸基に反応させるために用
いられる試薬としては、上述の官能基を含むハロ
ゲン化アルキル、エポキシド、イソシアネート、
酸無水物、アルデヒド、ケトン、及びカルボン
酸、スルホン酸の酸ハロゲン化物等が挙げられ
る。〓実施例〓以下、本発明を実施例によつて詳細に説明する
が、本発明は実施例記載の範囲に限定されるもの
ではない。尚、圧縮弾性率、比表面積、細孔径、
脱水乾燥後の乾燥担体容積は次の方法により測定
した。圧縮弾性率レオメーターNRM−2010J−CW（不動工業(株)
製）を用いて直径6.0mmφ、深さ10mmのサンプル
アダプターに試料を詰め、直径5.5mmφの棒を２
cm／minの速度で４mm押し込んだときの圧縮弾性
率を測定した。比表面積試料を液体窒素中で急冷し−50℃、10^-7トール
の真空度下で凍結乾燥後、比表面積測定装置を用
いてBET法で測定した。細孔径試料を液体窒素中で急冷し−50℃、10^-7トール
の真空度下で凍詰乾燥後、走査型電子顕微鏡で測
定した。脱水乾燥後の乾燥担体容積試料10mlが含有する水をアセトンで置換し、デ
シケータ中で自然乾燥後の容積で示した。実施例１脱アセチル化度80％、平均分子量52000のキト
サン350ｇを3.5％酢酸水溶液4650ｇに溶解した。
該溶液を、８％水酸化ナトリウム、20％エタノー
ル、72％水よりなる混合溶液中に孔径0.25mmφノ
ズルから一定量づつ落下させ凝固再生させた後、
中性になるまで充分水洗して、平均粒径約1.2mm
φ、圧縮弾性率1.1×10⁶dyn／cm²、比表面積70
m²／ｇ、細孔径0.2μの多孔質キトサン粒状体５
（湿潤）（試料Ａ）を得た。得られた多孔質キトサン粒状体１（湿潤）を
採取し、これに含まれている水をジオキサンで充
分置換した後、900mlのジオキサンに0.5N−水酸
化カリウム100mlを加えた溶液を加え撹拌した。
更にエチレングリコールジグリシジルエーテル
33.0ｇを加え、70℃で３時間反応させた。反応終
了後、充分水洗し圧縮弾性率7.0×10⁶dyn／cm²、
比表面積82m²／ｇ、細孔径0.1μの容積510ml（湿
潤）の担体（試料Ｂ）を得た。得られた試料Ｂについて以下に記述する、
及びの方法により官能基の導入を行つた。試料Ｂの100ml（湿潤）に15％水酸化ナトリ
ウム水溶液を100ml加え、室温で１時間撹拌し
た。液を除去した後、ジオキサン100mlと塩酸
２−クロルトリエチルアミン12.9ｇとトリエチ
ルアミン7.6ｇを加え、80℃で３時間ゆるやか
に撹拌しながら反応させ、終了後純水で充分水
洗し、容積101ml（湿潤）の担体（試料１）を
得た。試料Ｂの100ml（湿潤）に含まれる水をジメ
チルホルムアミドで充分置換後、ヘキサメチレ
ンジイソシアナート８ｇを加え、室温で２時間
反応させ、終了後ジメチルホルムアミドで未反
応のヘキサメチレンジイソシアナートを除去
し、イオン交換水で充分水洗し、容積99ml（湿
潤）の担体（試料２）を得た。試料Ｂの100ml（湿潤）に含まれる水をジメ
チルホルムアミドで充分置換後、４，4′−ジフ
エニルメタンジイソシアナート８ｇを加え、室
温で１時間反応させた。反応終了後ジメチルホ
ルムアミドで未反応の４，4′−ジフエニルメタ
ンジイソシアナートを除去し、イオン交換水で
充分水洗し、容積98ml（湿潤）の担体（試料
３）を得た。試料１、２、３の夫々について圧縮弾性率、比
表面積、細孔径、脱水乾燥後の乾燥担体容積を測
定し、その結果を第１表に示した。比較例１実施例１と同様の操作で得られた試料Ａの１
（湿潤）に含まれる水をジオキサンで充分置換後、
１のジオキサンを加え、水酸化カリウムを全く
添加することなしに、エチレングリコールジグリ
シジルエーテル33.0ｇを加え、70℃で３時間反応
させた。反応終了後充分水洗し圧縮弾性率2.8×
10⁶dyn／cm²、比表面積80m²／ｇ、細孔径0.2μの容
積690ml（湿潤）の担体（試料Ｃ）を得た。得ら
れた試料Ｃについて夫々100ml（湿潤）を３本採
取し夫々について実施例１に記述した、及び
の官能基の導入処理を行い、夫々容積101ml
（湿潤）（試料４）、容積95ml（湿潤）（試料５）、
容積95ml（湿潤）（試料６）を得た。得られた試
料４、５、６について圧縮弾性率、比表面積、細
孔径、脱水乾燥後の担体容積を測定し、その結果
を第１表に示した。

【表】第１表の結果より明らかな如く、脂肪族ポリア
ルコールのグリシジルエーテルを反応さす際に、
水酸化カリウムを使用しなかつた試料４、５、６
については圧縮弾性率、乾燥担体容積（乾燥時の
担体の収縮を防止する）が本願発明の方法によつ
て得られたものよりも劣つていることが明らかで
ある。実施例２脱アセチル化度78％、平均分子量12000のキト
サン700ｇと、ポリエチレングリコール（分子量
29000和光純薬工業(株)製）100ｇを、総量が10に
なる如く３％酢酸水溶液に溶解した。該溶液を、
2.5％アンモニア、20％エタノール、77.5％水か
らなる混合溶液中に孔径0.25mmφノズルから一定
量づつ落下させ凝固再生させた後、中性になるま
で充分水洗して平均粒径約1.2mmφの多孔質キト
サン粒状体10（湿潤容積）を得た。得られた多
孔質キトサン粒状体５（湿潤）を採取し、これ
に含まれている水を吸引濾過で除去後、0.5％酢
酸水溶液５中に25℃で30秒間浸漬処理した後、
直ちに中性になるまで水洗を行い、圧縮弾性率
0.6×10⁶dyn／cm²、比表面積20.5m²／ｇ、細孔径
20μの多孔質キトサン粒状体3900ml（湿潤容積）
（試料Ｄ）を得た。得られた多孔質キトサン粒状
体１（湿潤）を採取し、これに含まれている水
をジオキサンで充分置換した後、900mlのジオキ
サンに0.5N−水酸化カリウム100mlを加えた溶液
を加え、撹拌した。更にエチレングリコールジグ
リシジルエーテル28ｇを加え、70℃で３時間反応
させた。反応終了後、充分水洗し圧縮弾性率1.5
×10⁶dyn／cm²、比表面積26m²／ｇ、細孔径16μの
担体600ml（湿潤容積）（試料Ｅ）を得た。得られた試料Ｅについて夫々100ml（湿潤）を
３本採取し実施例１に記述した、及びの方
法により官能基の導入を行い、の処理で容積
100ml（湿潤）の担体（試料７）、の処理で容積
99ml（湿潤）の担体（試料８）及びの処理で容
積98ml（湿潤）担体（試料９）を得た。試料７、
８、９の夫々について圧縮弾性率、比表面積、細
孔径、脱水乾燥後の乾燥担体容積を測定し、その
結果を第２表に示した。比較例２実施例２と同様の操作で得られた試料Ｄの１
（湿潤）に含まれる水をジオキサンで充分置換後、
１のジオキサンを加え、水酸化カリウムを全く
添加することなしに、エチレングリコールジグリ
シジルエーテル28ｇを加え、70℃で３時間反応さ
せた。反応終了後充分水洗し、圧縮弾性率3.2×
10⁶dyn／cm²、比表面積30m²／ｇ、細孔径19μの容
積810ml（湿潤）の担体（試料Ｆ）を得た。得られた試料Ｆについて夫々100ml（湿潤）を
３本採取し、夫々について実施例１に記述した
、及びの官能基の導入処理を行い、夫々容
積100ml（湿潤）（試料10）、容積99ml（湿潤）（試
料11）、容積96ml（湿潤）（試料12）を得た。得られた試料10、11、12について、圧縮弾性
率、表面積、細孔径、脱水乾燥後の乾燥担体容積
を測定し、その結果を第２表に示した。

【表】第２表の結果から明らかな如く、細孔径が第１
表の数値より大きいにも拘らず実施例２の本発明
の方法による担体は高い圧縮弾性率を有し、乾燥
担体容積においても優れていることが明らかであ
る。〓発明の効果〓本発明の製造方法による酵素もしくは微生物固
定化用担体は、カラム充填時の充填圧や担体の乾
燥操作に対し高い安定性を具備しており、非水系
での酵素反応用固定化担体として極めて優れた性
能を発揮する。又、酵母や糸状菌等の微生物を固
定化するのに適した大きな細孔径を具備させても
圧縮に対する高い強度があり、固定化微生物の流
動層型リアクターとしての反復繰り返し使用や長
期連続使用、更には充填型リアクターへの利用に
も極めて優れた固定化用担体である。

Claims

【特許請求の範囲】

１低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性水溶
液中で凝固析出させ多孔質キトサン成形物を得、
次いで脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテ
ルを反応させ、更に官能基を導入する固定化用担
体の製造方法において、脂肪族ポリアルコールの
グリシジルエーテルを水酸化カリウムを含むジオ
キサン中で反応させることを特徴とする酵素もし
くは微生物固定化用担体の製造方法。