JPH06102031B2

JPH06102031B2 - 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法

Info

Publication number: JPH06102031B2
Application number: JP59066880A
Authority: JP
Inventors: 和彦松井; 清志三輪; 茂中森; 孝之輔佐野
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1984-04-04
Filing date: 1984-04-04
Publication date: 1994-12-14
Anticipated expiration: 2009-12-14
Also published as: JPS60210993A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は発酵法によるL-フェニルアラニンの製造法に関
する。

発酵法によりL-フェニルアラニンを製造しようとする場
合、野性株は殆んど菌体外にL-フェニルアラニンを生産
しないので、野性株に人工的に突然変異を生起せしめて
L-フェニルアラニン生産能を付与する方法がとられてい
る。従来知られているL-フェニルアラニン生産能を有す
る人工変異株としては、ブレビバクテリウム又はコリネ
バクテリウム属のフェニルアラニンアンタゴニストに耐
性を有する変異株（米国特許3,660,235）、コリネバク
テリウム属のチロシンを要求し、フェニルアラニンアン
タゴニストに耐性を有する変異株（米国特許3,759,79
0）、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属の
フェニルアラニンアンタゴニストに耐性を有し、デコイ
ニンに感受性を有する変異株（特開昭56-64793）等が知
られている。

一方、最近上述のような人工変異による育種と異なると
ころの遺伝子組換え技術をL-フェニルアラニン生産菌の
育種に利用する試みが報告されている。即ち、特開昭56
-1890には、フェニルアラニン合成に関与するエシェリ
ヒア属の染色体DNAフラグメントを組込んだプラスミド
を含有するエシェリヒア・コリの変異株がL-フェニルア
ラニンを生産したことが記載されている。また、特開昭
58-134994にはバチルス属の組換えDNA技術により育成さ
れたフェニルアラニン生産株が開示されている。

本発明者らは、叙上のような従来の発酵法によるL-フェ
ニルアラニンの製造法に対し、コリネホルム・グリタミ
ン酸生産菌に属するDNA供与菌より得られ、コリネホル
ム・グルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベク
タープラスミドに接続されたL-フェニルアラニンによる
フィードバック阻害が野生型のものに比し3,000倍以上
解除されたプレフェン酸デヒドラターゼをコードするDN
A断片が、コリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体内
で自律複製できるベクタープラスミドに接続されて、コ
リネホルム・グルタミン酸生産菌に属するDNA受容菌に
導入されて得られるL-フェニルアラニン生産能を有する
微生物を、培養することにより、高い収率でL-フェニル
アラニンを生産できることを知った。

即ち本願発明は、コリネホルム・グルタミン酸生産菌に
属するDNA供与菌より得られ、L-フェニルアラニンによ
るフィードバック阻害が野生型のものに比し3,000倍以
上解除されたプレフェン酸デヒドラターゼをコードする
DNA断片が、コリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体
内で自律複製できるベクタープラスミドに接続されて、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属するDNA受容菌
に導入されて得られるL-フェニルアラニン生産能を有す
る微生物を培養し、培養液中に蓄積されたL-フェニルア
ラニンを採取することを特徴とするＬ−フェニルアラニ
ンの製造法である。

プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子を含むDNA断片はコ
リネホルム・グルタミン酸生産菌の染色体DNAより得る
ことができる（プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子を含
むDNA断片を与えるものをDNA供与菌と称する）。

本発明のコリネホルム・グルタミン酸生産菌は、コリネ
ホルム・バクテリアに属し、大量のL-グルタミン酸を生
産する野性株又はそれより誘導されたL-グルタミン酸生
産能を有し又は有しない変異株を含む。

コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽性桿菌で
あり、非抗酸性でバーヂース・マニュアル・オブ・デタ
ーミネイティブバクテオロジー第８版599頁（1974）に
記載されている。

コリネホルム・グルタミン酸生産菌の野性株の例として
は次のようなものがあげられる。

ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタムATCC 1386
9 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354 DNA供与菌としては、フェニルアラニンアンタゴニスト
耐性などの変異を付与することにより、フェニルアラニ
ンまたはその前駆体の生合成活性が高まったような変異
株を用いれば更によい。

フェニルアラニンアンタゴニストの例としてはo-フルオ
ロフェニルアラニン、m-フルオロフェニルアラニン、p-
フルオロフェニルアラニン、β‐3-チエニルアラニン、
5-メチルトリプトファン等がある。ここにいうフェニル
アラニンの前駆体とは3-デオキシ‐D-アラビノ‐ヘペプ
ツロン酸‐7-リン酸、3-デヒドロキナ酸、3-デヒドロシ
キミ酸、シキミ酸、シキミ酸‐3-リン酸、5-エノールピ
ルビンシキミ酸‐3-リン酸、コリズミン酸、プレフェン
酸、フェニルピルビン酸などをいう。

このような変異株の例としては先に述べた米国特許3,66
0,235、米国特許3,759,970、特開昭56-64793等に記載さ
れている。

プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子を得るには、DNA供
与菌より染色体DNAを分離後、適当にこれを切断し、得
られた染色体DNA断片を適当なベクタープラスミドに挿
入した後、この組換えプラスミドをコリネホルム・グル
タミン酸生産菌のプレフェン酸デヒドラターゼ欠損株に
導入し、プレフェン酸デヒドラターゼ生産能を獲得した
形質転換株を採取することにより、得られる。

プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子をコリネホルム・グ
ルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタープ
ラスミド上に挿入してコリネホルム・グルタミン酸生産
菌に属するDNA受容菌に導入すれば、フェニルアラニン
生産能の向上した株を得ることができる。

プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子として、野性型のも
のを用いることができるし、更に変異型の遺伝子を用い
ることもできる。変異型遺伝子として、フェニルアラニ
ンによるフィードバック阻害の程度が軽減されたプレフ
ェン酸デヒドラターゼをコードするように変異されたも
のが特に好ましい。

最も好ましいものは、L-フェニルアラニンによるフィー
ドバック阻害が野生型のものに比し3,000倍以上解除さ
れたプレフェン酸デヒドラターゼをコードするものであ
る。

本願にいう、プレフェン酸デヒドラターゼのL-フェニル
アラニンによるフィードバック阻害の解除は、その酵素
活性が50％に阻害される時のL-フェニルアラニンの存在
量によって比較される。

変異型の遺伝子を得るには、DNA供与菌を変異処理して
もよいが、プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子をベクタ
ープラスミドに挿入後、得られた組換えDNAをDNA受容菌
に導入し得られた形質転換株を変異処理した方が変異型
遺伝子が得られる可能性が高い。更に上記組換えDNA自
体を生体外で変異処理すれば、変異型遺伝子が得られる
効率が最も高い。

フェニルアラニンによるフィードバック阻害の程度がよ
り転減されたプレフェン酸デヒドラターゼをコードする
変異型遺伝子を選別する方法は、DNA供与菌及び上記組
換えDNAが導入された形質転換株のいずれの場合も、組
換えDNAを変異処理したときは、変異処理した組換えDNA
をDNA受容菌に導入して形質転換株を得た後、フェニル
アラニンアンタゴニストに耐性を獲得したDNA供与菌又
は形質転換株を選別すればよい。フェニルアラニンアン
タゴニストに耐性を獲得したDNA供与菌又は形質転換株
がフェニルアラニンによるフィードバック阻害の程度が
より軽減されたプレフェン酸デヒドラターゼをコードす
る変異型遺伝子を有するものであることを確認するため
には、フェニルアラニンアンタゴニストに耐性を獲得し
たDNA供与菌又は形質転換株より適宜酵素液を調製し、
プレフェン酸を基質として種々の濃度のL-フェニルアラ
ニンの存在下に上記酵素液によるフェニルピルビン酸の
生成量を測定する。高濃度のL-フェニルアラニンの存在
下でもフェニルピルビン酸の生成活性が高い酵素液がフ
ェニルアラニンによるフィードバック阻害の程度がより
軽減されたプレフェン酸デヒドラターゼを含有する。

DNA供与菌、形質転換株又は組換えDNAに変異を与えるに
は、N-メチル‐N-ニトロ‐N-ニトロソグアニジン又は亜
硫酸等の変異誘起剤にDNA供与菌、形質転換株又は組換
えDNAを晒すかあるいはDNA供与菌、形質転換株又は組換
えDNAにX-線、紫外線、γ‐線等を照射する等の方法が
ある。

尚、このような遺伝子に変異を与える方法は、プレフェ
ン酸デヒドラターゼ以外のいかなる遺伝子についても効
率よい変異方法として利用できる。また、宿主かコリネ
ホルム・グルタミン酸生産菌以外の例えばエシェリヒア
・コリ、バチルス・ズプチリス等であっても、上記の遺
伝子に変異を与える方法は、利用できる。

プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子の複数の遺伝子を同
一のベクタープラスミド上に挿入するか、共存しうる複
数のベクター上に別々に挿入したのち受容菌に導入すれ
ばよりよい結果を与える場合がある。又プレフェン酸デ
ヒドラターゼ遺伝子以外のフェニルアラニンの生合成に
関与する遺伝子を同一のベクタープラスミド上に挿入す
るか共存しうる複数のベクター上に別々に挿入したのち
DNA受容菌に導入すれば更によい結果が得られることが
多い。

DNA受容菌として用いるコリネホルム・グルタミン酸生
産菌に属する菌としては、前述したような各種の菌株を
用いうる。受容菌としてプレフェン酸デヒドラターゼが
欠損した菌株をもつ菌株を用いれば、プレフェン酸デヒ
ドラターゼを獲得した形質転換株を選ぶことにより、プ
レフェン酸デヒドラターゼ遺伝子の導入された形質転換
株を選択することができる。より高いフェニルアラニン
生産能をもつ形質転換株を得るためには、フェニルアラ
ニンアンタゴニスト耐性、栄養要求性などの変異を付与
することによってフェニルアラニンまたはその前駆体の
生合成活性が高まったような変異株を受容菌として用い
るとよい。

更に、フェニルアラニンの菌体外への透過性が改善され
た変異株、フェニルアラニンの分解性の低下した変異
株、グルタミン、ホスホエノールピルビン酸などフェニ
ルアラニン生合成に素材として供給される代謝産物の生
合成能が高まったような変異株または組換え体も当然良
い結果を生む場合がある。

使用するベクターとしてはコリネホルム・グルタミン酸
生産菌の中で自律複製できるプラスミドであればいかな
るものでもよい。

例として以下のものがあげられる。

（１）pAM 330:特開昭58-67699参照（２）pHM1519:特開昭58-77895参照（３）pAJ 655:特開昭58-192900参照（４）pAJ 611:特開昭58-192900参照（５）pAJ1844:特開昭58-192900参照コリネホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で自律複製可
能なプラスミドのその他の例としてはpCG 1（特開昭57-
134500）、pCG 2（特開昭58-35197）、pCG 4,pCG 11
（特開昭57-183799）があり、これらはいずれも当然使
用可能であろう。

DNA供与菌の染色体DNA及び、ベクターDNAは通常の方法
により抽出することができる。

染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限酵素を用いて
切断する。ベクターDNAの開裂は当該ベクターDNAを一ケ
所で切断する制限酵素を用いて切断するか、複数部位切
断する制限酵素を部分的に作用させることにより達せら
れる。染色体DNAについては、制限エンドヌクレアーゼ
による切断が部分的に行われるように反応条件を調節す
れば、多くの種類の制限酵素が使用できる。

かくして得られた染色体DNA断片と、切断されたベクタ
ーDNAとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる通常
の方法が使用できる。

一方、ターミナルトランスフェラーゼを用いて、染色体
DNA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシアデニル酸
とデオキシチミジル酸、または、デオキシグアニル酸と
デオキシチミジル酸をそれぞれ付加し、混合したのち、
アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる。

このようにして得られた、染色体DNAとベクタープラス
ミドとの連結物のコリネホルム・グルタミン酸生産菌に
属する受容菌への導入は、エシェリヒア・コリK-12につ
いて報告されている様な（Mandel,M.and Higa,A..J.Mo
l.Biol.,53,159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法、またはバチルス・
ズブチリスについて報告されている様に（Duncan.C.H.,
Wilson,G.A.and Young,F.E,Gene,1,153（1977））細胞
がDNAを取り込み得る様になる増殖段階（いわゆるコン
ビテントセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母につ
いて知られている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c.Gen.Genet.,168,111（1979）;Bibb,M.J.,Ward,J.M.an
d Hopwood,O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen,A.,Hi
cks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 19
29（1978））、DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取
り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにしてプ
ラスミドをDNA受容菌に導入することも可能である。

プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスの方
法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭57-1
83799に記載されたコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属のプロトプラストにポリエチレングリコ
ールまたはポリビニルアルコールと二価金属イオンとの
存在下にDNAをとり込ませる方法も当然利用できる。ポ
リエチレングリコールまたはポリビニルアルコールのか
わりに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、
フィコール、プルロニックF68（セルバ社）などの添加
によってDNAのとり込みを促進させる方法でも同等の結
果が得られる。

フェニルアラニン生合成系遺伝子がベクタープラスミド
に接続されて、導入された形質転換株の選択は、フェニ
ルアラニン要求株を受容菌とした場合にはフェニルアラ
ニン要求性を失なった株を選ぶことにより、フェニルア
ラニンアンタゴニスト感受性菌を受容菌としてフェニル
アラニンアンタゴニスト耐性に与るフェニルアラニン生
合成系遺伝子を導入する場合は該アンタゴニスト耐性と
なった株を選ぶことにより、容易に達せられるが、フェ
ニルアラニン生産性の向上を指標として選択することも
可能である。ベクターに薬剤耐性などの遺伝マーカーが
存在する場合にはこの形質を併せて選択に用いれば、よ
り容易に形質転換株を選ぶことができる。

得られたL-フェニルアラニン生産菌を培養する方法は、
従来のL-フェニルアラニン生産菌の培養方法と特に変ら
ない。即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオ
ン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄
養素を含有する通常のものである。炭素源としては、グ
ルコース、シュークロース、ラクトース等及びこれらを
含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、
アンモニウム塩その他が使用できる。

培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にL-フェニルアラニンの生産蓄積が停止する
まで行なわれる。

かくして培養液中には著量のL-フェニルアラニンが生成
蓄積される。培養液よりL-フェニルアラニンを採取する
には、通常の方法が適用できる。

実施例１（１）染色体の調製ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ 11225
（FERM-P4370,FERM BP-1219）を１のCMG培地（ペプト
ン1g/dl、酵母エキス1g/dl、グルコース0.5g/dl及びNaC
l0.5g/dlを含み、pH7.2に調整したもの）に植菌し、30
℃で約３時間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集
めた。この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたのち、
通常のフェノール処理法により、染色体DNAを抽出精製
し、最終的に3.5mgのDNAを得た。

（２）ベクターDNAの調製ベクターとしてpAJ1844（Escherichia coli AJ11883FER
M-BP137として寄託されている。）（分子量5.4メガダル
トン）を用い、そのDNAを次の様にして調製した。

まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブレビバクテ
リウム・ラクトフェルメンタムAJ 12037（FERM-P7234,F
ERM BP-577）を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対数増
殖期後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理により
溶菌させ、30,000×g,30分の超遠心により上清を得た。
フェノール処理ののち、２容のエタノールを加えてDNA
を沈澱回収した。これを少量のTEN緩衝液（20mMトリス
塩酸塩、20mM NaCl,1mM EDTA（pH8.0）溶解後、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAJ1844プ
ラスミドDNA約15μｇを得た。

（３）染色体DNA断片のベクターへの挿入（１）で得た染色体DNA10μｇと（２）で得たプラスミ
ドDNA5μｇとを制限エンドヌクレアーゼPst Iでそれぞ
れを37℃に１時間保持し、完全に切断した。65℃に10分
間加熱した後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレ
イトール存在下、T₄ファージ由来のDNAリガーゼによっ
て10℃に24時間保持しDNA鎖を連結せしめた。ついで反
応液を、65℃にて５分間加熱し、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結されたDNAの沈澱を採取した。

（４）プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子のクローニン
グプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子が欠損したブレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムAJ12124（ブレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムAJ 12036（FERM-BP7
34）を親株とし、N-メチル‐N-ニトロ‐N-ニトロソグア
ニジンにより変異処理することによりフェニルアラニン
を生育に要求する変異株として選択した。）を受容菌と
して用いた。

形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を5mlのCMG液体培
地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを0.6
ユニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分
離により菌体を集め、菌体を0.5Mシュークロース、20mM
マレイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナッセイ
ブロス（Difco社）からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで
洗浄した。次いで10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地
に懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図った。6000
×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄
し0.5mlのSMMPに再度懸濁した。この様にして得られた
プロトプラストと（３）で調製したDNA10μｇを5mM ED
TA存在下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度
が30％になる様に添加した後、DNAをプロトプラストに
取り込ませる為に室温に２分間放置した。このプロトプ
ラストをSMMP培地1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに再懸濁
し、形質発現の為、30℃で２時間培養した。この培養液
をpH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プロ
トプラスト再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グルコース10
g、MgCl₂・6H₂O8.1g、CaCl₂・2H₂O2.2g、ペプトン4g、粉
末酵母エキス4g、カザミノ酸（Difco社）1g、K₂HPO₄0.2
g、コハク酸ナトリウム135g、寒天8g及びクロラムフェ
ニコール３μg/mlを含む。

30℃で２週間培養後、約25000個のクロラムフェニコー
ル耐性コロニーが出現してきたのでこれを最少培地（２
％グルコース、１％硫酸アンモニウム、0.3％尿素、0.1
％りん酸二水素カリウム、0.04％硫酸マグネシウム７水
塩、2ppm鉄イオン、2ppmマンガンイオン、200μg/lサイ
アミン塩酸塩、50μg//lビオチン、クロラムフェニコー
ル10μg/ml、pH7.0、寒天1.8％）にレプリカし、クロラ
ムフェニコール耐性でかつフェニルアラニン要求性の消
失した３株を得た。

（５）形質転換株のプラスミド解析これらの株より（２）で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDN
Aを検出したところ、２株でベクターのpAJ1844よりも明
らかに大きなプラスミドが検出された。

これら２株をAJ12125（FERM-P 7546）及びAJ 12126と名
付けた。AJ 12125及びAJ 12126株のもつプラスミドを各
々pAJ16,pAJ19と名付け組換えに用いた制限酵素Pst Iで
切断するとAJ 12125株では7.6キロベースの、AJ 12126
株では7.6キロベース、1.7キロベース、1.2キロベース
のDNA断片が検出された。従ってプレフェン酸デヒドラ
ターゼ遺伝子は、7.6キロベースのPst I DNA断片上に存
在すると思われる。

（６）再トランスホーメーション（５）で検出された7.6キロベースのDNA断片を含む組換
えプラスミド上にプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子が
存在することを確認するためこのプラスミドDNA pAJ16
を用い、プレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ
12124を再度、形質転換した。

生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ10個を釣り上げフェニルアラニン要求性をテストした
ところ、これらのいずれも要求性が消失しており、上記
の組換えプラスミド上にプレフェン酸デヒドラターゼ遺
伝子が存在することが明らかとなった。

（７）形質転換株のプレフェン酸デヒドラターゼ活性被検株をフェニルアラニン生産培地（グルコース130g,
(NH₄)₂SO₄10g,KH₂PO₄1g,MgSO₄・7H₂O1g、フマル酸12g、
酢酸3ml、大豆蛋白酸加水分解液「味液」50ml,FeSO₄・7H
₂O10mg,MnSO₄・4H₂O10mg、ビオチン50μｇ、サイアミン
塩酸塩2000μｇ及びCaCO₃50gを水１に含む。pH7.0）2
0mlで30℃にて22時間培養した菌体より、超音波処理に
より、溶菌液を調製し、これを32000×g,20分間遠心分
離して上清を得た。この上清を粗酵素液として用い、50
mMリン酸緩衝液（pH7.2）、2mMプレフェン酸、から成る
酵素反応液を用いて、30℃で10分間反応を行ない、フェ
ニルピルビン酸の生成量を320nmにおける吸光度で測定
することによって定量した。第１表に測定結果を示す。

（８）組換えプラスミド中のプレフェン酸デヒドラター
ゼ遺伝子がコードするプレフェン酸デヒドラターゼのフ
ェニルアラニンによるフィードバック阻害の解除（７）で述べた方法を用いて、酵素反応液に種々の濃度
のフェニルアラニンを添加して酵素活性を測定し、フェ
ニルアラニンによるプレフェン酸デヒドラターゼ活性の
50％阻害濃度を求めた。結果を第２表に示す。

第３表の結果、クローニングされたプレフェン酸デヒド
ラターゼ遺伝子がコードするプレフェン酸デヒドラター
ゼは、フェニルアラニンによるフィードバック阻害が解
除されていないことが明らかとなった。そこでフィード
バック阻害の解除を以下の方法で行なった。

（ｉ）プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子を含む7.6キ
ロベースのDNA断片をもつプラスミドpAJ16を保持するブ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ12125を5ml
のCMG培地で培養し、対数増殖期の菌体に250μg/mlのN-
メチル‐N-ニトロ‐N-ニトロソグアニジンの作用させ、
突然変異を誘起した。一晩４℃に放置した後、（２）で
述べた方法により溶菌液を調製し、プラスミドを分離し
た。ここで得たプラスミドを用いてブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンタムAJ12124を（４）で述べた方法
により形質転換し、クロラムフェニコール３μg/mlを含
む再生培地上に30℃、７日間培養後出現した約50000コ
ロニーをp-フルオロフェニルアラニン3000μg/mlを含む
最少培地にレプリカし、クロラムフェニコール耐性で、
かつp-フルオロフェニルアラニン抵抗性の２株を得た。

このうち代表株AJ12127が有するプラスミドをpAJ165と
名付け、（２）で述べた方法によりAJ12127株から約20
μｇのpAJ165を得た。ここで得たプラスミドpAJ165を用
いて再度、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム
AJ 12124を（４）で述べた方法により形質転換し、生じ
たクロラムフェニコール耐性コロニーのうち10個を釣り
上げp-オロフェニルアラニン抵抗性をテストしたとこ
ろ、これらいずれも抵抗性を獲得しており、上記の組換
えプラスミド上にp-フルオロフェニルアラニン抵抗性が
付与されたことが明らかとなった。次に先に述べた方法
により形質転換株のプレフェン酸デヒドラターゼ活性を
種々の濃度のフェニルアラニン存在下で測定し、50％阻
害濃度を求めた。結果を第３表に示す。

第３表の結果、pAJ165上のプレフェン酸デヒドラターゼ
遺伝子がコードするプレフェン酸デヒドラターゼはフェ
ニルアラニンによるフィードバック阻害に対してpAJ16
の約3000倍解除されており、この方法によりプラスミド
上の遺伝子の改良がなされたことが認められる。

（ii）上述のpAJ16 10μｇを0.4Mのヒドロキシルアミ
ン、1mM EDTAを含む0.05Mリン酸緩衝液（pH6.0）中で37
℃,30時間処理し塩基の修飾を施した後、４℃にて一晩T
EN緩衝液に対して透析した。２容のエタノールを加え、
沈澱を回収したのち、50μｌのTEN緩衝液に沈澱を溶解
した。この様にして得たDNAを用いてブレビバクテリウ
ム・ラクトフェルメンタムAJ12124を（４）で述べた方
法により形質転換した。30℃で７日間培養後再生プレー
ト上に出現した約40000コロニーをp-フルオロフェニル
アラニン3000μg/ml、クロラムフェニコール10μg/mlを
含む最少培地（グルコース20g、硫酸アンモニウム10g、
尿素3g、KH₂PO₄1g,MgSO₄・7H₂O0.4g,NaCl50mg、ビオチン
50μｇ、サイアミン塩酸塩200μg,FeSO₄・7H₂O10mg,MnSO
₄・4H₂O10mg、寒天20gを水１に含む。pH7.0）にレプリ
カし、クロラムフェニコール耐性でかつp-フルオロフェ
ニルアラニン抵抗性の１株を得た。この株AJ12123（FER
M-P 7545）有するプラスミドをpAJ1642と名付け、
（２）で述べた方法により約20μｇのpAJ1642を得た。
ここで得たpAJ1642を用いて、再度ブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンタムAJ 12124を（４）の方法により
形質転換した。生じたクロラムフェニコール耐性コロニ
ーのうち10個を釣り上げp-フルオロフェニルアラニン抵
抗性をテストしたところ、いずれも抵抗性を獲得してお
り、組換えプラスミド上にp-フルオロフェニルアラニン
抵抗性が付与されたことが明らかとなった。

次にフェニルアラニンによるプレフェン酸デヒドラター
ゼ活性の阻害の程度を調べた。（７）で用いた方法によ
りAJ 12123のプレフェン酸デヒドラターゼのフェニルア
ラニンによる50％阻害濃度を求めた。結果を第４表に示
した。

第４表の結果、プレフェン酸デヒドラターゼのフェニル
アラニンによる50％阻害濃度はpAJ1642ではpAJ16の約８
倍向上しただけであるがpAJ16が0.1mMのフェニルアラニ
ンの存在下ではフェニルアラニン無添加時の４％しか活
性が認められないのに対してpAJ1642では30mMのフェニ
ルアラニン存在下でもフェニルアラニン無添加時の33％
もの活性が存在した。したがってこの方法によってもプ
ラスミド上の遺伝子の改良がなされたことを認めた。

（９）各形質転換株のフェニルアラニン生産能上記のpAJ16及びpAJ165を用い、ブレビバクテリウム・
ラクトフェルメンタムAJ12036及びコリネバクテリウム
・グルタミカム（ATCC 13060）を（４）で述べた方法に
より形質転換し、クロラムフェニコール耐性を指標とし
て形質転換株を選択した。かくして得られたAJ 12122
（FERM-P7544）、AJ 12128（FERM-P7547）及びAJ 12129
（FERM-P7548）を培養しフェニルアラニン生産能を調べ
たところ第４表に示す結果を得た（AJ 12122及びAJ 121
29はpAJ165を有し、AJ 12128はpAJ16を有する）。

培養は（７）で述べたフェニルアラニン生産培地20mlを
500mlの肩付フラスコに入れたものに被検菌株を植えつ
け、30℃にて72時間、振盪下に行なった。培養後、遠心
上清中のL-フェニルアラニンを液体クロマトグラフィー
により定量した。

尚、AJ 12124を得るためには寄託されたAJ 12125より宿
主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プラスミドを除
去することが可能である。即ち、プラスミドは宿主より
自然に失なわれることもあるし、「除去」操作によって
除くこともできる（Bact.Rev.,36,p361-405（197
2））。他の除去操作の例は以下の通りである。AJ 1212
5をCMG液体培地に接種し、37℃で一晩培養（高温処理）
後、培養液を適当に希釈し、クロラムフェニコールを含
有し又は含有しないCMG寒天培地に塗布し、30℃で１〜
３日間培養する。かくしてクロラムフェニコール感受性
株として分離される株がAJ12124である。

又、AJ 12127はpAJ165を用いて、AJ 12124を実施例に記
載の方法で形質転換すれば得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属す
るDNA供与菌より得られ、Ｌ−フェニルアラニンによる
フィードバック阻害が野生型のものに比し3,000倍以上
解除されたプレフェン酸デヒドラターゼをコードするDN
A断片が、コリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体内
で自律複製できるベクタープラスミドに接続されて、コ
リネホルム・グルタミン酸生産菌に属するDNA受容菌に
導入されて得られるＬ−フェニルアラニン生産能を有す
る微生物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ−フェニル
アラニンを採取することを特徴とするＬ−フェニルアラ
ニンの製造法。