JPH0573392B2 - - Google Patents

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JPH0573392B2
JPH0573392B2 JP61122723A JP12272386A JPH0573392B2 JP H0573392 B2 JPH0573392 B2 JP H0573392B2 JP 61122723 A JP61122723 A JP 61122723A JP 12272386 A JP12272386 A JP 12272386A JP H0573392 B2 JPH0573392 B2 JP H0573392B2
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trna synthetase
enzyme
immobilized
kinase
reaction
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Munehiko Donho
Isao Tomioka
Kazutsugu Kitahata
Hiroshi Nakajima
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Unitika Ltd
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Unitika Ltd
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Publication date
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Priority to DE8787304628T priority patent/DE3771577D1/de
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93Ligases (6)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28N-glycosides
    • C12P19/30Nucleotides
    • C12P19/36Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
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    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832Bacillus

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  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】 産業䞊の利甚分野 本発明は、医薬品又はその原料ずしお有甚なゞ
アデノシン四リン酞又はその誘導䜓の補造方法に
関するものである。
埓来の技術 ゞアデノシン四リン酞又はその誘導䜓は、G1
阻害を起こしたBHK现胞に察するDNA合成の促
進䜜甚〔゚フ・グルムトF.Grummtプロシヌ
デむング・オブ・ナシペナル・アカデミツク・サ
む゚ンスPro.N.A.S.75、3711978〕、リン
酞化の阻害䜜甚〔ピヌ・゚フ・マネスP.F.
Manessら、ゞダヌナル・オブ・バむオロゞカ
ル・ケミストリヌJ.biol.Chem.258、4055
1983〕、血小板凝集阻害䜜甚〔゚ム・ゞ゚む・
ハリ゜ンM.J.Harrisonら、プブス レタ
ヌズFEBS Letters54、571975〕などの生
理䜜甚を有し、医薬品及び医薬品原料ずしおの利
甚が期埅されおいる物質である。
このゞアデノシン四リン酞又はその誘導䜓以
例Np4Nずいう。を埗る方法ずしおは、ペヌロ
ピアン・ゞダヌナル・オブ・バむオケミストリヌ
Eur.J.Biochem.126、1351982には、゚シ
゚リキア コリ由来のリゞル−tRNA合成酵玠、
ヒスチゞル−tRNA合成酵玠、プニルアラニル
−tRNA合成酵玠、酵母由来のリゞル−tRNA合
成酵玠、プニルアラニル−tRNA合成酵母、フ
ザリりム由来のプニルアラニル−tRNA合成酵
玠、矊肝现胞由来のプニルアラニル−tRNA合
成酵玠などの皮々のアミノアシル−tRNA合成酵
玠によりアデノシン−5′−䞉リン酞以䞋ATP
ずいう。からゞアデノシン四リン酞が、たた、
ATPの誘導䜓である2′−デオキシアデノシン−
5′−䞉リン酞からゞアデノシン四リン酞の誘導䜓
であるゞデオキシアデノシン四リン酞が合成され
るこずが報告されおいる。
䞀方、特開昭58−146539号公報には、アミノ酞
からペプチド又はペプチド誘導䜓を合成するに際
し、瞮合剀ずしおアミノアシル−tRNA合成酵玠
を甚いるこずが、たた、特開昭59−106296号公報
には、AMPをアデノシン−5′−二リン酞以䞋
ADPずいう。に倉換する酵玠ず、ADPをATP
に倉換する酵玠ずを組み合わせおAMPからATP
を生成させ、生成させたATPを甚いお生理掻性
物質を合成すこずが提案されおいるが、これら
は、ゞアデノシン四リン酞又はその誘導䜓を合成
するものではない。
発明が解決しようずする問題点 埓来の方法、すなわち、ATP又はその誘導䜓
以䞋NTPずいう。ずアミノ酞ずを原料ずしお
アミノアシル−tRNA合成酵玠の存圚䞋で反応を
行うず、目的物であるNp4Nず共にゞアデノシン
䞉リン酞又はその誘導䜓以䞋Np3Nずいう。、
ADP又はその誘導䜓以䞋NDPずいう。及び
AMP又はその誘導䜓以䞋NMPずいう。が副
生し、原料であるずころの高䟡なNTPを無駄に
消費し、Np4Nの収率の䜎䞋を招くばかりでな
く、Np3Nがあるず反応生成物から目的物である
Np4Nを分離するこずは極めお困難になるずいう
欠点がある。
問題点を解決するための手段 そこで、本発明者らは、䞊蚘の欠点を改良する
ために鋭意研究を重ねた結果、反応をADPを
ATPに倉換する酵玠の存圚䞋で行うず、Np3N
及びNDPが副生せず、しかも、極めお高い収率
でNp4Nが補造できるこずを芋い出し、本発明を
完成するに至぀た。
すなわち、本発明はアミノアシル−tRNA合成
酵玠の觊媒䜜甚により、アデノシン−5′−䞉リン
酞又はその誘導䜓ずアミノ酞ずを反応させおゞア
デノシン四リン酞又はその誘導䜓を補造するに際
し、該反応をアデノシン−5′−二リン酞をアデノ
シン−5′−䞉リン酞に倉換する酵玠の存圚䞋で行
うこずを特城ずするゞアデノシン四リン酞又はそ
の誘導䜓の補造方法を芁旚ずするものである。
本発明の最倧の特城は、アミノアシル−tRNA
合成酵玠の觊媒䜜甚によりNTPずアミノ酞ずを
反応させるに際し、反応をADPをATPに倉換す
る酵玠の存圚䞋で行うこずにあり、特に、AMP
をADPに倉換する酵玠ずADPをATPに倉換する
酵玠の存圚䞋で行うこずが奜たしい。このずき、
埌者の反応系にはNMPが副生しないので、
NMPを分離する操䜜が䞍芁ずなる。
本発明でいうゞアデノシン四リン酞の誘導䜓ず
は、ゞアデノシン四リン酞の構造を基本骚栌ずし
お有する化合物であ぀お、その構成成分であるア
デノシン䞉リン酞誘導䜓よりアミノアシル−
tRNA合成酵玠の䜜甚により倉換できる化合物を
いう。このようなゞアデノシン四リン酞の誘導䜓
ずしおは、アデニン環のN6䜍アルキル化、カル
ボキシアルキル化、ベンゟむル化、カルボキシベ
ンゟむル化誘導䜓、アデニン環のハロゲン化誘導
䜓、ヒドロキシ誘導䜓、デアミノ誘導䜓、リボヌ
スの2′−デオキシ誘導䜓、3′−デオキシ誘導䜓、
2′3′−ゞデオキシ誘導䜓、デオキシアミノ誘導
䜓、デオキシハロ誘導䜓などがあげられ、N6
N6−ゞカルボキシメチルアデノシン四リン酞、
N6N6−ゞカルボキシ゚チルアデノシン四リン
酞、N6N6−−ゞカルボキシベンゟむル
アデノシン四リン酞、ゞ−ブロムアデノシン四
リン酞及びこれらの化合物の2′−デオキシ誘導
䜓、3′−デシオキ誘導䜓、2′3′−デオキシ誘導
䜓などが具䜓䟋ずしおあげられる。
本発明に甚いられるアミノアシル−tRNA合成
酵玠ずしおは、Np4Nを合成する胜力を有するも
のであればいかなるものでもよいが、゚シ゚リキ
ア コリ由来のリゞル−tRNA合成酵玠、ヒスチ
ゞル−tRNA合成酵玠、プニルアラニル−
tRNA合成酵玠、酵母由来のリゞル−tRNA合成
酵玠、プニルアラニル−tRNA合成酵玠、フザ
リりム由来のプニルアラニル−tRNA合成酵
玠、バチルス ステアロサヌモフむルスなどの耐
熱性现菌由来のロむシル−tRNA合成酵玠、矊肝
现胞由来のプニルアラニル−tRNA合成酵玠な
どが具䜓䟋ずしおあげるこずができる。たた、ア
ミノ酞ずしおは、䟋えば、チロシン、アラニン、
ロむシン、む゜ロむシン、プニルアラニン、メ
チオニン、リゞン、セリン、バリン、アスパラギ
ン、アスパラギン酞、グリシン、グルタミン、グ
ルタミン酞、システむン、トレオニン、トリプト
フアン、ヒスチゞン、プロリン、アルギニンなど
のα−アミノ酞があげられ、䜓、䜓のいずれ
でもよい。
このずき、アミノアシル−tRNA合成酵玠は、
アミノ酞に特異性のあるものが甚いられ、䟋え
ば、ロむシンに特異性のあるものずしおは、ロむ
シル−tRNA合成酵玠が甚いられる。
本発明に甚いられるAMPをADPに倉換する酵
玠ずしおは、䟋えばアデニル酞キナヌれが䜿甚さ
れ、この際、NMPぞのリン酞䟛䞎䜓ずしおは
NTPが䜿甚される。たた、ADPをATPに倉換す
る酵玠ずしおは、酢酞キナヌれ、カルバミン酞キ
ナヌれ、クレアチンキナヌれ、−ホスホグリセ
リン酞キナヌれ、ピルビン酞キナヌれ、ポリリン
酞キナヌれなど倚くのものが䜿甚できるが、酵玠
の入手の容易さなどを勘案するず、酢酞キナヌれ
を䜿甚するのが最も有利であり、この際、リン酞
䟛䞎䜓ずしおはアセチルリン酞が䜿甚される。ア
セチルリン酞は、アンモニりム塩、カリりム・リ
チりム塩、ナトリりム塩などの塩ずしお䜿甚する
こずができるが、入手のしやすさから二ナトリり
ム塩を甚いるこずが奜たしい。このように、アデ
ニル酞キナヌれず酢酞キナヌれを䜿甚するに際し
お、各酵玠のリン酞䟛䞎䜓ずしおはNTPずアセ
チルリン酞を䜿甚するこずになるが、リン酞䟛䞎
䜓ずしおのNTPは、最終倉換物であるNTPを埪
環䜿甚するこずができるので、結局リン酞䟛䞎䜓
ずしおはアセチルリン酞だけを䟛絊すればよいこ
ずになる。
これらの酵玠は、最適生育枩床が50℃ないし85
℃である埮生物の産生する酵玠であるこずが望た
しい。このような埮生物ずしおは、バチルス・ス
テアロサヌモフむルス、バチルス・プレビス、バ
チルス・コアギナランス、バチルス・サヌモプロ
テオリテむクス、バチルス・アシドカルダリりス
などのバチルス属の埮生物、クロストリゞりム属
の埮生物、サヌモアクチノマむセス属の埮生物、
アクロモバクタヌ属の埮生物、ストレプトマむセ
ス属の埮生物、ミクロポリスポラ属の埮生物、サ
ヌマス・アクアテむクス、サヌマス・サヌモフむ
ルス、サヌマス・フラプスなどのサヌマス属の埮
生物、サヌモミクロビりム属の埮生物、カルデリ
ア属の埮生物などがあげられる。たた、これら埮
生物の遺䌝子を導入した垞枩生育埮生物も含たれ
る。これら埮生物の䞭でも、アデニル酞キナヌ
れ、酢酞キナヌれの産生に特に適したものは、バ
チルス・ステアロサヌモフむルスである。
本発明でNp4Nを補造するには、䟋えば、同䞀
の反応噚の䞭にNTP、アミノ酞、アミノアシル
−tRNA合成酵玠、ADPをATPに倉換する酵玠
を共存させお反応させればよい。このずきに甚い
られる反応噚ずしおは、反応をスムヌズに進行さ
せうるものであればいかなるものでもよく、各々
の酵玠量、基質液の濃床、PH及び䟛絊速床、反応
枩床などによ぀お反応噚の倧きさ及び圢状を遞定
すればよい。その反応噚の圢状ずしおは、䟋え
ば、膜型の反応噚、カラム型反応噚を䜿甚するこ
ずができる。この䞭でも膜型反応噚は、反応生成
物が䜎分子であるので、特に有効に䜿甚できる。
この際、酵玠は高分子物質であるので、各酵玠は
そのたた反応噚の䞭にずどた぀た状態で䜿甚する
こずができる。
たた、カラム型反応噚の堎合には、䜿甚する酵
玠を適圓な担䜓、䟋えばセルロヌス、デキストラ
ン、アガロヌスなどのような倚糖類の誘導䜓、ポ
リスチレン、゚チレン−マレむン酞共重合䜓、架
橋ポリアクリルアミドなどのようなビニルポリマ
ヌの誘導䜓、−アラニン、−グルタミン酞共
重合䜓、ポリアスパラギン酞などのようなポリア
ミノ酞又はアミドの誘導䜓、ガラス、アルミナ、
ヒドロキシアパタむトなどのような無機物の誘導
䜓などに結合、包括あるいは吞着させお、いわゆ
る固定化酵玠ずしおカラムに充填しお䜿甚すれば
よい。
䞊述の反応噚は、連続的に操䜜するこずを前提
ずしお説明したものであるが、このような思想に
基づいお他の反応噚を甚いるこずもできるし、堎
合によ぀おは、バツチ匏の反応噚を䜿甚しおバツ
チ匏に操䜜しお反応させるこずもできる。
次に、バツチ匏の反応噚でNp4Nを補造する堎
合を䟋にずり、反応条件に぀いお説明するず、
NTPは10ÎŒM以䞊、特に以䞊、さらに10
以䞊、アミノ酞は1ÎŒM以䞊、特に10ÎŒM以䞊、さ
らに0.1以䞊、アセチルリン酞はNTPの濃床
に察しお10ないし102圓量、特にないし1/1
圓量、さらにないし1/2圓量の濃床で添加する
のが望たしく、その添加方法は特に限定されるも
のではなく、反応スタヌト時に䞀括しお添加しお
もよいし、分割しお添加しおもよい。たた、反応
をスムヌズに進めるためにピロホスフアタヌれを
添加したり、マグネシりムむオン、マンガンむオ
ン、カルシりムむオン、コバルトむオン、カドミ
りムむオンなどの金属むオンを添加するこずもで
きる。反応のPHずしおは、酵玠によ぀お異なる
が、おおむね䞭性付近、すなわち、PH〜11、奜
たしくはPH〜の範囲が䜿甚され、緩衝液で調
敎するこずができる。この緩衝液ずしおは、これ
らのPHに適した通垞のものを䜿甚するこずができ
る。たた、反応の枩床ずしおは、酵玠の倱掻が起
こらず、反応がスムヌズに進行する範囲であれば
特に限定されるものではないが、20℃から50℃の
範囲が奜たしい。
このようにしお埗た反応生成物は、Np3Nが生
じおいないので、むオン亀換クロマトグラフむヌ
など䞀般に広く甚いられる粟補法により容易に
Np4Nを単離するこずができる。
実斜䟋 次に、本発明を実斜䟋により具䜓的に説明す
る。
参考䟋  バチルス・ステアロサヌモフむルスUK788埮
工研菌寄 第5141号の菌䜓のKgを倍量の
100トリス・塩酞緩衝液PH7.5に懞濁し、
ダむノミルを甚いお现胞を砎砕した埌、遠心分離
により䞍溶物を陀去し、ロむシンに特異的なロむ
シル−tRNA合成酵玠を含む粗抜出液を埗た。あ
らかじめメルカプト゚タノヌル、゚
チレンゞアミン四酢酞ナトリりム及び0.1ホ
スホプニルスルホニルフルオリドを含む50
トリス緩衝液PH7.5で平衡化したマヌトレツ
クスゲルブルヌアミコン瀟補を充填したカ
ラムに䞊蚘の粗抜出液をずおし、塩化カリりムを
䞊蚘緩衝液で加えた溶液で、線速床60cm・h-1溶
出せしめるず、ロむシル−tRNA合成酵玠が溶出
した。この区分を集め、濃瞮、脱塩を行぀た結
果、玄70の収率でロむシンに特異的なロむシル
−tRNA合成酵玠を含む粗酵玠液を埗た。䞊蚘操
䜜をすべお℃で行぀た。
参考䟋  ゚シ゚リキア コリK12株の菌䜓Kgを倍量
の100トリス・塩酞緩衝液PH7.5に懞濁
し、ダむノミルを甚いお现胞を砎砕した埌、遠心
分離により䞍溶物を陀去し、リゞンに特異的なリ
ゞル−tRNA合成酵玠を含む粗抜出液を埗た。あ
らかじめメルカプト゚タノヌル、゚
チレンゞアミン四酢酞ナトリりムを含む50ト
リス緩衝液PH7.5で平衡化したマヌトレツク
スゲルブルヌアミコン瀟補を充填したカラ
ムに䞊蚘の粗抜出液をずおし、塩化カリりムを䞊
蚘緩衝液に加えた溶液で、線速床60cm・h-1で溶
出せしめるず、リゞル−tRNA合成酵玠が溶出し
た。この区分を集め、濃瞮、脱塩を行぀た結果、
箄65の収率でリゞン特異的なリゞル−tRNA合
成酵玠を含む粗酵玠液を埗た。䞊蚘操䜜をすべお
℃で行぀た。
実斜䟋  参考䟋で埗たロむシル−tRNA合成酵玠及び
バチルス・ステアロサヌモフむルス由来の酢酞キ
ナヌれずアデニル酞キナヌれ生化孊工業販売
を甚いお、バツチ法でAp4Aの合成を行぀た。
このずき、ATP12.7、ロむシン10、
塩化マグネシりム氎和物20、ピロホスフア
タヌれベヌリンガヌマンハむム瀟補ナニツ
トml、酢酞キナヌれ30ナニツトml、アデニル
酞キナヌれ46ナニツトml、ロむシル−tRNA合
成酵玠0.25ナニツトml、ぞペス緩衝液PH7.5
100からなる反応溶液に、アセチルリン酞を
反応スタヌト時に圓り14mol添加し、40℃
で時間反応させた埌、圓り4.6molを远
加し、時間反応させた埌、さらに圓り4.6
mol加えた埌、時間反応させた。
埗られた反応生成物を、ノバパツクC18りオヌ
タヌズ瀟補カラムを甚いお高速液䜓クロマトグ
ラフむヌで分析したずころ、5.1収率玄80
のAp4Aが生成しおいた。反応生成物が
Ap4Aであるこずをリン栞磁気共鳎スペクトルに
より同定した。このずき、Ap3A、AMP、ADP
は怜出されなか぀た。
比范䟋  酢酞キナヌれ、アデニル酞キナヌれ、アセチル
リン酞を加えなか぀た以倖は、実斜䟋ず同様に
しお反応させた。
埗られた反応生成物を高速液䜓クロマトグラフ
むヌで分析したずころ、Ap4A3.1収率玄49
ず共に、AMP2.3、ADP0.6、
Ap3A2が副生しおいた。
実斜䟋  バチルス・ステアロサヌモフむルス由来の酢酞
キナヌれずアデニル酞キナヌれ生化孊工業販
売、参考䟋で埗たロむシル−tRNA合成酵玠
及びピロフオスフアタヌれベヌリンガヌマンハ
むム瀟補を、それぞれCN−Br−掻性化セフア
ロヌス4Bフアルマシア瀟補に固定化した。固
定化酢酞キナヌれ300ナニツト、固定化アデニル
酞キナヌれ400ナニツト、固定化ロむシル−
tRNA合成酵玠ナニツト及び固定化ピロホスフ
アタヌれ20ナニツトを぀のカラムカラム容量
mlに充填した。
次に、10の塩化マグネシりムを含む100
ぞペス緩衝液PH7.0に溶解した10の
ATP、のアセチルリン酞、10ÎŒMのロむシ
ンからなる原料を、固定化酵玠充填カラムの䞊端
からmlhrの流速で䟛絊し、カラムの䞋端から
反応生成物を連続的に抜き取぀た。
埗られた反応生成物を実斜䟋ず同じ方法によ
り分析したずころ、4.8収率玄96の
Ap4Aが生成しおおり、Ap3A、AMP、ADPは怜
出されなか぀た。以埌、24時間にわたり安定に
Ap4Aが生成した。
比范䟋  固定化した酢酞キナヌれ及びアデニル酞キナヌ
れを充填せずに、しかも、カラムに䟛絊する溶液
䞭にアセチルリン酞を加えなか぀た以倖は、実斜
䟋ず同様にしお反応させた。
埗られた反応生成物を実斜䟋ず同様に分析し
たずころ、2.0収率玄40のAp4Aず共に、
1.8のAp3A、1.5のAMP、0.8の
ADPが怜出された。
実斜䟋  バチルス・ステアロサヌモフむルス由来の酢酞
キナヌれずアデニル酞キナヌれ生化孊工業販
売、参考䟋で埗たリゞル−tRNA合成酵玠及
びピロホスフアタヌれベヌリンガヌマンハむム
瀟補を、それぞれCN−Br−掻性化セフアロヌ
ス4Bフアルマシア瀟補に固定化した。固定化
酢酞キナヌれ250ナニツト、固定化アデニル酞キ
ナヌれ350ナニツト、固定化リゞル−tRNA合成
酵玠ナニツト及び固定化ピロホスフアタヌれ20
ナニツトを぀のカラムカラム容量mlに充
填した。
次に、10の塩化マグネシりムを含む100
ぞペス緩衝液PH6.5に溶解した10の
ATP、のアセチルリン酞、50ÎŒMのリゞン
からなる原料を、固定化酵玠充填カラムの䞊端か
らmlhrの流速で䟛絊し、カラムの䞋端から反
応生成物を連続的に抜き取぀た。
埗られた反応生成物を実斜䟋ず同じ方法によ
り分析したずころ、4.2収率玄84の
Ap4Aが生成しおおり、Ap3A、AMP、ADPは怜
出されなか぀た。以埌、15時間にわたり安定に
Ap4Aが生成した。
比范䟋  固定化した酢酞キナヌれ及びアデニル酞キナヌ
れを充填せずに、しかも、カラムに䟛絊する溶液
䞭にアセチルリン酞を加えなか぀た以倖は、実斜
䟋ず同様にしお反応させた。
埗られた反応生成物を実斜䟋ず同様に分析し
たずころ、1.8収率玄36のAp4Aず共に、
1.8のAp3A、1.6のAMP、1.1の
ADPが怜出された。
実斜䟋  バチルス・ステアロサヌモフむルス由来の酢酞
キナヌれ生化孊工業販売ず参考䟋で埗たリ
ゞル−tRNA合成酵玠及びピロホスフアタヌれ
ベヌリンガヌマンハむム瀟補を、それぞれ
CN−Br−掻性化セフアロヌス4Bフアルマシア
瀟補に固定化した。固定化酢酞キナヌれ250ナ
ニツト、固定化リゞル−tRNA合成酵玠ナニツ
ト及び固定化ピロホスフアタヌれ20ナニツトを
぀のカラムカラム容量mlに充填した。
次に、10の塩化マグネシりムを含む100
ぞペス緩衝液PH6.5に溶解した10の
ATP、のアセチルリン酞、50ÎŒMのリゞン
からなる原料を、固定化酵玠充填カラムの䞊端か
らmlhrの流速で䟛絊し、カラムの䞋端から反
応生成物を連続的に抜き取぀た。
埗られた反応生成物を実斜䟋ず同じ方法によ
り分析したずころ、3.7収率玄74の
Ap4A及び1.5のAMPが生成しおいた。
これを酢酞キナヌれを加えない比范䟋の結果
ず比べるず、副生成物であるAp3A、ADPの生成
は認められず、酢酞キナヌれのみを甚いるこずに
よ぀おも副生物の生成が抑えられるこずがわか
る。
実斜䟋  バチルス・ステアロサヌモフむルス由来の酢酞
キナヌれずアデニル酞キナヌれ生化孊工業販
売、参考䟋で埗たロむシル−tRNA合成酵玠
及びピロホスフアタヌれベヌリンガヌマンハむ
ム瀟補を、それぞれCN−Br−掻性化セフアロ
ヌス4Bフアルマシア瀟補に固定化した。固定
化酢酞キナヌれ300ナニツト、固定化アデニル酞
キナヌれ400ナニツト、固定化ロむシル−tRNA
合成酵玠10ナニツト及び固定化ピロホスフアタヌ
れ20ナニツトを぀のカラムカラム容量ml
に充填した。
次に、10の塩化マグネシりムを含む100
ぞペス緩衝液PH7.0に溶解した10のN6
−カルボキシ゚チルATP、のアセチルリ
ン酞、10ÎŒMのロむシンからなる原料を、固定化
酵玠充填カラムの䞊端からmlhrの流速で䟛絊
し、カラムの䞋端から反応生成物を連続的に抜き
取぀た。
埗られた反応生成物を実斜䟋ず同じ方法によ
り分析したずころ、2.6収率玄52のN6
N6−ゞカルボキシ゚チルアデノシン四リン酞が
生成しおいた。
比范䟋  固定化した酢酞キナヌれ及びアデニル酞キナヌ
れを充填せずに、しかも、カラムに䟛絊する溶液
䞭にアセチルリン酞を加えなか぀た以倖は、実斜
䟋ず同様にしお反応させた。
埗られた反応生成物を実斜䟋ず同様に分析し
たずころ、1.2収率玄24のN6N6−ゞ
カルボキシ゚チルアデノシン四リン酞ず共に、
1.0のN6−カルボキシ゚チルアデノシン䞉リ
ン酞、0.7のN6−カルボキシ゚チルAMP、
0.8のN6−カルボキシ゚チルADPが怜出され
た。
発明の効果 本発明によれば、Np3N、NDP又はNMPが副
生せず、しかも、極めお高い収率でNp4Nが補造
できる。

Claims (1)

    【特蚱請求の範囲】
  1.  アミノアシル−tRNA合成酵玠の觊媒䜜甚に
    より、アデノシン−5′−䞉リン酞又はその誘導䜓
    ずアミノ酞ずを反応させおゞアデノシン四リン酞
    又はその誘導䜓を補造するに際し、該反応をアデ
    ノシン−5′−二リン酞をアデノシン−5′−䞉リン
    酞に倉換する酵玠の存圚䞋で行うこずを特城ずす
    るゞアデノシン四リン酞又はその誘導䜓の補造方
    法。
JP61122723A 1986-05-28 1986-05-28 ゞアデノシン四リン酞又はその誘導䜓の補造方法 Granted JPS62278992A (ja)

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