JPH0535159B2 - - Google Patents
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- JPH0535159B2 JPH0535159B2 JP59255863A JP25586384A JPH0535159B2 JP H0535159 B2 JPH0535159 B2 JP H0535159B2 JP 59255863 A JP59255863 A JP 59255863A JP 25586384 A JP25586384 A JP 25586384A JP H0535159 B2 JPH0535159 B2 JP H0535159B2
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Description
＜産業上の利用分野＞
本発明は、原料物質例えば抗血友病因子（以後
“AHF”と略記する）を含有する血漿あるいは低
温型沈殿物からの凝血促進性因子：Ｃの精製に
関する。 ＜従来の技術＞ 血漿から得られたその天然のまゝの形のAHF
は因子：Ｒ及び因子：Ｃと呼ばれている二種
の分子実在物のアグリゲート（集塊）より成ると
この分野では一般に考えられている。因子：Ｃ
は血友病Ａの凝固不全の治療上で生物学的に活性
である。因子：Ｒは因子：WF（フオン・ヴ
イレブラント因子）としても知られており、フオ
ン・ヴイレブランド病、血小板凝集障害、の凝固
不全の治療上で生物学的に活性である。因子：
Ｒ及び特にフイブロネクチン及びフイブリノーゲ
ンを含む、通常因子：Ｃと共に見出される別の
血漿蛋白質に関して、因子：Ｃを精製出来るこ
とが極めて望ましい。 因子：Ｃの精製のためにこれ迄知られている
諸方法では、収率及び／又は純度を減少するがこ
れは今迄大目にみられていた。本発明は先行技術
では示唆されていない方法で、活性低下も無く、
高度の精製と収率を達成するものである。 ブリテイシユ・ジヤーナル・オブ・ヘマトロジ
ー（British Journal of Hematology）1979年、
（第43巻）第669−674頁中の、デー・イー・ジ
ー・オーステン（D.E.G.Austen）”ザ・クロマト
グラフイツク・セパレーシヨン・オブ・フアクタ
ーオン・アミノヘキシル・セフアロース（The
Chromatographic Separation of Factor
on Aminohexyl Sepharose）”は、ヒト又は豚
の第因子濃縮物を６−アミノ−ｎ−ヘキシル置
換されたアガロースのカラムを通過させたクロマ
トグラフ的分離法を記載している。カラム及びす
べての溶離液は5.5のPHであつた。因子：Ｒか
らの因子：Ｃの高度の分離、その他の蛋白質か
らの因子：Ｃの高度精製が達成された。 然し、ヒトの因子：Ｃの総括回収率は僅か35
−40％であり、そして豚の因子：Ｃでは僅か24
−30％であつた。著者は、（約5.2のPHへの）緩衝
液のより酸性のPH値が第因子のより高度の精製
にとつて好都合であり、そして収率を余りにも低
くすることなく可能な限り環境を酸性にするため
に5.5のPHを著者は故意に選定したと指摘した。
従つてより高い（即ち、より酸性の少い）PH値に
ついての教示は全く無い。 より最近のいくつかの刊行物ではクロマトグラ
フのカラムを酸性のPHに維持してゆくことが固執
されている。モルゲンターレル
（Morgenthaler）、“クロマトグラフイー・オブ・
アンチヘモフイリツク・フアクター・オン・ジア
ミノアルカン−アンド・アミノアルカン−デリバ
タイズド・セフアロース（Chromatography of
Antihemophilic Factor on Diaminoalkane−
and Aminoalkane−Derivatized Sepharose）”
スロムブ．ハエモスタツス．（Thromb.
Haemostas.）第47巻(2)号第124−127頁（1982年）
は、6.0、6.5及び7.0のPH値でセフアロース CL
−2B アガロース・ゲル上でAHFをクロマト分
別した場合、因子：Ｃと因子：Ｒの際立つた
分離が得られないことを見出した。5.5のPHでの
AHFのクロマトグラフイーは因子：Ｃと因子
：Ｒとの間に顕著な分離をつくり出していた。
フアウレ（Faure）等に依る最近の文献、ノート
“インプルーブド・バツフアー・フオー・ザ・ク
ロマトグラフイツク・セパレーシヨン・オブ・フ
アクターコアギユラント（Improved buffen
for the chromatographic separation of
Factor coagulant）”ジヤーナル・オブ・
クロマトグラフイー（J.Chromatography）第
257巻（1983年）第387−391頁は、オーステン
（Austen）に依つて指摘された5.5のPH値を守り、
緩衝液に化合物を添加することに依つてそのクロ
マトグラフ的方法の効率改善を企図している。そ
して、オーステン（Austen）は上述の彼の報文
中で得られている結果を改善する意図で、5.5の
PHで操作することを続けて、約40％の因子：Ｃ
の収率を達成している、オーステン（Austen）
等、“フアクターフラクシヨネーシヨン・オ
ン・アミノヘキシル・セフアロース・ウイズ・ポ
シブル・レダクシヨン・イン・ヘパテイテイス
Ｂ アンチゲン（Factor Fractionation
on Aminohexyl Sepharose with Possible
Reduction in Hepatitis Ｂ Antigen）”スロム
ブ．ハエモスタシイス（Thromb.Haemostasis）
第48巻（１号）第46−48頁（1982年）。 知られているところによると、因子：Ｒ及
び、フイブロネクチン及びフイブリノーゲンを含
めた多数のそれ以外の汚染物質が既に因子：Ｃ
から分離されている場合だけ、因子：Ｃを中性
に近いPHのカラムで使用している。特に、米国特
許第4361509号中ではチインマーマン
（Zimmerman）等は、因子：Ｒについて超精
製されている因子：Ｃの希薄溶液を回収するた
めに因子：Ｒに対する単クローン性抗体をつけ
たカラムを使用する。超精製された因子：Ｃは
緩衝液に依つてPHを6.8に調節し、溶液をアミノ
ヘキシル・アガロースのカラムにかけて、そして
次のカラムから因子：Ｃを溶離させることによ
つて濃縮される。この濃縮工程は、原料物質の約
1000倍も純粋な物質から始めるので、若しもかな
りの量の：Ｒが存在している様な場合の結果に
ついては従つて何も示唆しておらず、実際に、こ
の特許を読んだ人が因子：Ｃ及び：Ｒをいず
れも有する原料物質を持つている場合には、因子
：Ｒを除去するために極めて有効な単一クロー
ン性抗体一カラム分離方法を使用するであろう。
従つてアミノヘキシル・アガロース・カラムの使
用条件に関する米国特許第4361509号の教示は、
上述の文献の教示と矛盾したりあるいはそれを改
変するものではない。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ 本発明の方法は、先行技術によつては全く予期
されておらず、そして実際上不都合とされていた
諸条件下で、収率及び精製度の好都合な（極めて
有利な）組合わせを達成するものである。 ＜問題点を解決するための手段＞ とりわけ、本発明は、因子：Ｃ及び：Ｒを
含有する原料物質から高い収率で因子：Ｃを精
製するための方法であつて、 (a) 5.5より大で約8.0迄のPH、約25ｍＳ／cm乃至
35ｍＳ／cmの電気伝導率を有する該原料物質の
水溶液を調製し、 (b) 因子：Ｃ及び因子：Ｒを該溶液から、該
水溶液のPHに平衡化されているアミノヘキシ
ル・アガロース上に吸着させ、 (c) 因子：Ｒをアミノヘキシル・アガロースか
ら溶離し、そして次に (d) 因子：Ｃをアミノヘキシル・アガロースか
ら溶離し、それに依つて、原料物質に関して精
製されている因子：Ｃの溶液を与える因子
：Ｃの精製方法である。 本発明での使用に適した原料物質は一種又はそ
れ以上の他の血漿蛋白質と共に因子：Ｃを含有
している物質が包含される。特定の例は、第因
子、即ち因子：Ｃ及び：Ｒ複合体を含有する
物質、例えば血漿、市販の第因子濃縮物、及び
血漿から得られた低温型沈殿物並びに周知のコー
ン分別方法の製品フラクシヨン及びさもなければ
捨てられてしまう副生フラクシヨンがある。ヒト
からの原料物質並びに牛及び豚のものが処理出来
る。因子：Ｒ以外に存在しても良い蛋白質に
は、フイブリノーゲン、フイブロネクチン及びア
ルブミンがある。 低温型沈殿物が原料物質の場合には、当業者に
広く知られている方法で、水性緩衝液中で再構成
する必要があるが、本発明によつて守られている
べき新規なPH範囲とイオン強度とを守る必要があ
る。血漿及び血漿濃縮物はそれ以外の点では既に
カラムに加えるのに適した状態であるが、これも
水性緩衝液によつてそのPHとイオン強度とを適切
に調節する必要がある。 得られた溶液のPHを6.5から7.2の所望の範囲内
に緩衝し、そして因子：Ｃの活性をそこなわな
い化合物の水溶液を添加してPHを調節出来る。多
くのかゝる溶液が当業者には知られており、一つ
の例は20ｍＭのイミダゾール、0.1Mのリシン、
及び0.02％のアジド化ナトリウムを含有し、約
6.8にPHを緩衝する緩衝溶液（以下“緩衝液Ａ”
と称す）である。別の例は、10ｍＭのヒスチジ
ン、0.1Mのリシン、及び0.02wt％のアジド化ナ
トリウムを含有する。 伝導率は単に充分量の塩化ナトリウムを添加し
て、存在する他のイオンと共に、総括伝導率を約
25ｍＳ／cmから約35ｍＳ／cm（ミリ−シーメン
ス／cm、10-3ｍho／cm相当）の間にすることによ
つて調節出来る。塩化ナトリウムは固体であるい
は水溶液で、緩衝液にあるいは直接に因子：Ｃ
源溶得に加えることが出来る。伝導率が高過ぎる
かあるいは低過ぎると、結合能が失なわれ、そし
て低過ぎる場合には生成物の純度も害なわれる。 カラムに使用される吸着剤物質はアミノヘキシ
ル・アガロースである。これは、当業界周知の如
く、オメガ−（ω）側鎖を有するアガロースであ
る。所望の精製が実施出来る様に充分な側鎖がな
ければならぬ。好ましくは、アガロース１ｇ当り
少くとも約10ミリモルのアミノヘキシル側鎖がな
ければならず、そしてより好ましくは少くとも約
15ミリモル／ｇのアミノヘキシル側鎖がなければ
ならぬ。 本明細書の吸着剤の量は、フイルター・ケーキ
が割れる点迄吸引過してある物質の重量として
定義する、湿潤重量として示されている。満足す
べきアミノヘキシル・アガロースはフアルマシ
ア・フアイン・ケミカルズ・カンパニー
（Pharmacia Fine Chemicals Company）から
販売され、物質１ｇ当り約12ミリモルのアミノヘ
キシル鎖を有する商品名“アミノヘキシル・セフ
アロース（Aminohexyl Sepharose）”で市場で
入手出来る。 吸着剤はそれを平衡化させる、即ちそれを約
5.5を越え約8.0迄の、好ましくは6.0から7.5、及
びより好ましくは6.5から7.2のPHをそれに与える
緩衝液中で洗浄することに依つて調製される。吸
着剤に対する原料物質の割合は吸着剤樹脂の能力
を越してはならず、その能力はクロマトグラフ分
離になれている人にとつては容易に計算出来る値
である。一般的に、能力は低温型沈殿物を用いた
場合には樹脂グラム当り５−10：Ｃ単位であ
り、そしてより精製された原料物質を用いた時は
数倍高い。吸着はバツチ形式又はカラム中で実施
することが出来、いずれの場合もこの形式のクロ
マトグラフ的分離をこの分野で用いる時に常用さ
れている方法と装置が使用される。 別にあらかじめ吸着剤と同じPHに調節してある
原料物質を吸着剤に加えて、所望の蛋白質−吸着
剤の相互作用を起させるために充分な接触時間を
与える。カラム形式の場合は、典型的な満足のゆ
く流速は毎時約５カラム容積だが、カラムを圧固
したり分離させる程高くない様にする。この工程
で先ずカラムを通過した物質は因子：Ｃが無く
なつており、因子：Ｃが因子：Ｒと複合化し
て原料物質中に存在している場合には因子：Ｒ
も無くなつている。非吸着性物質の除去は緩衝溶
液例えば0.3MのNaClを含有する緩衝液Ａを用い
てカラムを洗浄することによつて促進出来る。 （溶離液の280nｍの吸光度が１又はそれ以下
であることに依つて示される様に）大部分の非吸
着性物質がカラムから洗い去られた後で、0.3M
のNaCl及び10ｍＭのCaCl2を含有する緩衝液Ａ
を用いて洗浄を続ける。CaCl2は因子：Ｃを安
定化することが当業界では知られている、しか
し、樹脂上へのフイブリン・クロツト及び因子
：Ｃの潜在的劣化を招く、クロツテング因子活
性化の危険のために早期に使用することは出来な
い。樹脂の洗浄はフイブロネクチン、フイブリノ
ーゲン及び大部分の汚染蛋白質の除去に有効であ
る。 因子：Ｃが因子：Ｒと複合化している場合
には、洗浄によつて溶離しないでカラム上に残つ
ている大部分の因子：Ｒを脱着させるのに有効
な溶離液を用いて、次にカラムを溶出させるのが
有利である。この工程で若干の因子：Ｃはたし
かに溶離するであろうが、然しこの事は、この工
程で溶出しなかつた因子：Ｃは、実際上の因子
によつて先行技術の方法をそれでも圧倒する収率
で、より高度に精製された形で回収されるという
事実によつて償われている。因子：Ｒはその中
に0.4MのNaCl及び10ｍＭのCaCl2を溶解させて
含有している先述の緩衝液Ａより成る溶離液を用
いて溶離出来る。溶出したフラクシヨンは集め
て、因子：Ｒに富んだ源となる。この溶出工程
は、際めて高い収率（例えば少くとも80％から90
％）が望まれて、そして溶出した因子：Ｃ生成
物中の因子：Ｒの共存が許容出来る場合には省
略出来る。 吸着剤上に残つている因子：Ｃは、その生物
学的活性を減少させること無く因子：Ｃを脱着
出来る条件で次に溶離させる。この条件を満足す
る溶離液はその中に溶解した0.3Mから0.5Mの
CaCl2、好ましくは0.5MのCaCl2を含有する先述
の緩衝液Ａより成る。第二のものは1MのNaClを
含有する緩衝液Ａである。溶出したフラクシヨン
を集めて、それを更に処理するかあるいはそれ自
身を治療目的に対して因子：Ｃ源として使用す
ることも出来る。 血漿が原料物質の場合には、少量だが然し有効
量の蛋白質分解劣化（デグラデーシヨン）の抑制
剤例えばベンズアミジン、膵臓のトリプシン抑制
剤、あるいはヒルジンを添加して上記の諸工程を
実施する必要がある。原料物質が低温型沈殿物あ
るいは高い因子：Ｃ純度の物質の場合にはかゝ
る抑制剤は必要無い。 本発明を更に以下の実施例中で示す。 実施例 １ この実施例は、本発明で特許請求された方法と
関連した公刊された諸方法とによる、ヒトの低温
型沈殿物からの抗血友病因子の精製法の結果を比
較している。方法はすべて室温で実施した。 ａ 本発明の方法による精製 振動式ミキサーを用いて、ヒトの低温型沈殿
物（３ｇ）を0.3MのNaClを含有する緩衝液Ａ
（20ｍＭイミダゾール、0.1Mリシン、0.02％ア
ジド、PH6.8）10mlに再懸濁させた。ピタミン
Ｋ依存性プロテアーゼは水酸化アルミニウム・
ゲル〔レソルプター（登録商標）
（RehsorptarR）、アーマー・フアルマキユーテ
イカル・カンパニー（Armour
Pharmaceutical Co.）〕を用いて処理すること
に依つて除去した。溶液を1/30容積のレソルプ
ターと10分間撹拌して、10000×ｇで５分間遠
心分離し、そして同一量のレソルプターに10分
間再吸着させた。遠心分離（10000×ｇ、５分
間）後、溶液を２層のチーズクロスを通した。
得られた溶液は32ｍＳ／cmの伝導率を有してい
た。この溶液の2.5mlを、0.3MのNaClを含有す
る緩衝液Ａ中で平衡化したAH−セフアロース
（フアルマシア）の10mlカラム（10×0.55cm）
を12ml／ｈの流速で通した。溶離後の280nｍ
の吸光度が0.1以下となる迄、カラムを平衡緩
衝液（0.3MNaCl含有緩衝液Ａ）で洗浄した。
カラムを更に0.3MNaCl及び10ｍMCaCl2含有
緩衝液Ａで洗浄し、ついで、先ず0.4MNaCl及
び10ｍMCaCl2含有緩衝液Ａを用いて、次に
0.5MCaCl2含有緩衝液Ａを用いて溶離させた。
“AHF”と略記する）を含有する血漿あるいは低
温型沈殿物からの凝血促進性因子：Ｃの精製に
関する。 ＜従来の技術＞ 血漿から得られたその天然のまゝの形のAHF
は因子：Ｒ及び因子：Ｃと呼ばれている二種
の分子実在物のアグリゲート（集塊）より成ると
この分野では一般に考えられている。因子：Ｃ
は血友病Ａの凝固不全の治療上で生物学的に活性
である。因子：Ｒは因子：WF（フオン・ヴ
イレブラント因子）としても知られており、フオ
ン・ヴイレブランド病、血小板凝集障害、の凝固
不全の治療上で生物学的に活性である。因子：
Ｒ及び特にフイブロネクチン及びフイブリノーゲ
ンを含む、通常因子：Ｃと共に見出される別の
血漿蛋白質に関して、因子：Ｃを精製出来るこ
とが極めて望ましい。 因子：Ｃの精製のためにこれ迄知られている
諸方法では、収率及び／又は純度を減少するがこ
れは今迄大目にみられていた。本発明は先行技術
では示唆されていない方法で、活性低下も無く、
高度の精製と収率を達成するものである。 ブリテイシユ・ジヤーナル・オブ・ヘマトロジ
ー（British Journal of Hematology）1979年、
（第43巻）第669−674頁中の、デー・イー・ジ
ー・オーステン（D.E.G.Austen）”ザ・クロマト
グラフイツク・セパレーシヨン・オブ・フアクタ
ーオン・アミノヘキシル・セフアロース（The
Chromatographic Separation of Factor
on Aminohexyl Sepharose）”は、ヒト又は豚
の第因子濃縮物を６−アミノ−ｎ−ヘキシル置
換されたアガロースのカラムを通過させたクロマ
トグラフ的分離法を記載している。カラム及びす
べての溶離液は5.5のPHであつた。因子：Ｒか
らの因子：Ｃの高度の分離、その他の蛋白質か
らの因子：Ｃの高度精製が達成された。 然し、ヒトの因子：Ｃの総括回収率は僅か35
−40％であり、そして豚の因子：Ｃでは僅か24
−30％であつた。著者は、（約5.2のPHへの）緩衝
液のより酸性のPH値が第因子のより高度の精製
にとつて好都合であり、そして収率を余りにも低
くすることなく可能な限り環境を酸性にするため
に5.5のPHを著者は故意に選定したと指摘した。
従つてより高い（即ち、より酸性の少い）PH値に
ついての教示は全く無い。 より最近のいくつかの刊行物ではクロマトグラ
フのカラムを酸性のPHに維持してゆくことが固執
されている。モルゲンターレル
（Morgenthaler）、“クロマトグラフイー・オブ・
アンチヘモフイリツク・フアクター・オン・ジア
ミノアルカン−アンド・アミノアルカン−デリバ
タイズド・セフアロース（Chromatography of
Antihemophilic Factor on Diaminoalkane−
and Aminoalkane−Derivatized Sepharose）”
スロムブ．ハエモスタツス．（Thromb.
Haemostas.）第47巻(2)号第124−127頁（1982年）
は、6.0、6.5及び7.0のPH値でセフアロース CL
−2B アガロース・ゲル上でAHFをクロマト分
別した場合、因子：Ｃと因子：Ｒの際立つた
分離が得られないことを見出した。5.5のPHでの
AHFのクロマトグラフイーは因子：Ｃと因子
：Ｒとの間に顕著な分離をつくり出していた。
フアウレ（Faure）等に依る最近の文献、ノート
“インプルーブド・バツフアー・フオー・ザ・ク
ロマトグラフイツク・セパレーシヨン・オブ・フ
アクターコアギユラント（Improved buffen
for the chromatographic separation of
Factor coagulant）”ジヤーナル・オブ・
クロマトグラフイー（J.Chromatography）第
257巻（1983年）第387−391頁は、オーステン
（Austen）に依つて指摘された5.5のPH値を守り、
緩衝液に化合物を添加することに依つてそのクロ
マトグラフ的方法の効率改善を企図している。そ
して、オーステン（Austen）は上述の彼の報文
中で得られている結果を改善する意図で、5.5の
PHで操作することを続けて、約40％の因子：Ｃ
の収率を達成している、オーステン（Austen）
等、“フアクターフラクシヨネーシヨン・オ
ン・アミノヘキシル・セフアロース・ウイズ・ポ
シブル・レダクシヨン・イン・ヘパテイテイス
Ｂ アンチゲン（Factor Fractionation
on Aminohexyl Sepharose with Possible
Reduction in Hepatitis Ｂ Antigen）”スロム
ブ．ハエモスタシイス（Thromb.Haemostasis）
第48巻（１号）第46−48頁（1982年）。 知られているところによると、因子：Ｒ及
び、フイブロネクチン及びフイブリノーゲンを含
めた多数のそれ以外の汚染物質が既に因子：Ｃ
から分離されている場合だけ、因子：Ｃを中性
に近いPHのカラムで使用している。特に、米国特
許第4361509号中ではチインマーマン
（Zimmerman）等は、因子：Ｒについて超精
製されている因子：Ｃの希薄溶液を回収するた
めに因子：Ｒに対する単クローン性抗体をつけ
たカラムを使用する。超精製された因子：Ｃは
緩衝液に依つてPHを6.8に調節し、溶液をアミノ
ヘキシル・アガロースのカラムにかけて、そして
次のカラムから因子：Ｃを溶離させることによ
つて濃縮される。この濃縮工程は、原料物質の約
1000倍も純粋な物質から始めるので、若しもかな
りの量の：Ｒが存在している様な場合の結果に
ついては従つて何も示唆しておらず、実際に、こ
の特許を読んだ人が因子：Ｃ及び：Ｒをいず
れも有する原料物質を持つている場合には、因子
：Ｒを除去するために極めて有効な単一クロー
ン性抗体一カラム分離方法を使用するであろう。
従つてアミノヘキシル・アガロース・カラムの使
用条件に関する米国特許第4361509号の教示は、
上述の文献の教示と矛盾したりあるいはそれを改
変するものではない。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ 本発明の方法は、先行技術によつては全く予期
されておらず、そして実際上不都合とされていた
諸条件下で、収率及び精製度の好都合な（極めて
有利な）組合わせを達成するものである。 ＜問題点を解決するための手段＞ とりわけ、本発明は、因子：Ｃ及び：Ｒを
含有する原料物質から高い収率で因子：Ｃを精
製するための方法であつて、 (a) 5.5より大で約8.0迄のPH、約25ｍＳ／cm乃至
35ｍＳ／cmの電気伝導率を有する該原料物質の
水溶液を調製し、 (b) 因子：Ｃ及び因子：Ｒを該溶液から、該
水溶液のPHに平衡化されているアミノヘキシ
ル・アガロース上に吸着させ、 (c) 因子：Ｒをアミノヘキシル・アガロースか
ら溶離し、そして次に (d) 因子：Ｃをアミノヘキシル・アガロースか
ら溶離し、それに依つて、原料物質に関して精
製されている因子：Ｃの溶液を与える因子
：Ｃの精製方法である。 本発明での使用に適した原料物質は一種又はそ
れ以上の他の血漿蛋白質と共に因子：Ｃを含有
している物質が包含される。特定の例は、第因
子、即ち因子：Ｃ及び：Ｒ複合体を含有する
物質、例えば血漿、市販の第因子濃縮物、及び
血漿から得られた低温型沈殿物並びに周知のコー
ン分別方法の製品フラクシヨン及びさもなければ
捨てられてしまう副生フラクシヨンがある。ヒト
からの原料物質並びに牛及び豚のものが処理出来
る。因子：Ｒ以外に存在しても良い蛋白質に
は、フイブリノーゲン、フイブロネクチン及びア
ルブミンがある。 低温型沈殿物が原料物質の場合には、当業者に
広く知られている方法で、水性緩衝液中で再構成
する必要があるが、本発明によつて守られている
べき新規なPH範囲とイオン強度とを守る必要があ
る。血漿及び血漿濃縮物はそれ以外の点では既に
カラムに加えるのに適した状態であるが、これも
水性緩衝液によつてそのPHとイオン強度とを適切
に調節する必要がある。 得られた溶液のPHを6.5から7.2の所望の範囲内
に緩衝し、そして因子：Ｃの活性をそこなわな
い化合物の水溶液を添加してPHを調節出来る。多
くのかゝる溶液が当業者には知られており、一つ
の例は20ｍＭのイミダゾール、0.1Mのリシン、
及び0.02％のアジド化ナトリウムを含有し、約
6.8にPHを緩衝する緩衝溶液（以下“緩衝液Ａ”
と称す）である。別の例は、10ｍＭのヒスチジ
ン、0.1Mのリシン、及び0.02wt％のアジド化ナ
トリウムを含有する。 伝導率は単に充分量の塩化ナトリウムを添加し
て、存在する他のイオンと共に、総括伝導率を約
25ｍＳ／cmから約35ｍＳ／cm（ミリ−シーメン
ス／cm、10-3ｍho／cm相当）の間にすることによ
つて調節出来る。塩化ナトリウムは固体であるい
は水溶液で、緩衝液にあるいは直接に因子：Ｃ
源溶得に加えることが出来る。伝導率が高過ぎる
かあるいは低過ぎると、結合能が失なわれ、そし
て低過ぎる場合には生成物の純度も害なわれる。 カラムに使用される吸着剤物質はアミノヘキシ
ル・アガロースである。これは、当業界周知の如
く、オメガ−（ω）側鎖を有するアガロースであ
る。所望の精製が実施出来る様に充分な側鎖がな
ければならぬ。好ましくは、アガロース１ｇ当り
少くとも約10ミリモルのアミノヘキシル側鎖がな
ければならず、そしてより好ましくは少くとも約
15ミリモル／ｇのアミノヘキシル側鎖がなければ
ならぬ。 本明細書の吸着剤の量は、フイルター・ケーキ
が割れる点迄吸引過してある物質の重量として
定義する、湿潤重量として示されている。満足す
べきアミノヘキシル・アガロースはフアルマシ
ア・フアイン・ケミカルズ・カンパニー
（Pharmacia Fine Chemicals Company）から
販売され、物質１ｇ当り約12ミリモルのアミノヘ
キシル鎖を有する商品名“アミノヘキシル・セフ
アロース（Aminohexyl Sepharose）”で市場で
入手出来る。 吸着剤はそれを平衡化させる、即ちそれを約
5.5を越え約8.0迄の、好ましくは6.0から7.5、及
びより好ましくは6.5から7.2のPHをそれに与える
緩衝液中で洗浄することに依つて調製される。吸
着剤に対する原料物質の割合は吸着剤樹脂の能力
を越してはならず、その能力はクロマトグラフ分
離になれている人にとつては容易に計算出来る値
である。一般的に、能力は低温型沈殿物を用いた
場合には樹脂グラム当り５−10：Ｃ単位であ
り、そしてより精製された原料物質を用いた時は
数倍高い。吸着はバツチ形式又はカラム中で実施
することが出来、いずれの場合もこの形式のクロ
マトグラフ的分離をこの分野で用いる時に常用さ
れている方法と装置が使用される。 別にあらかじめ吸着剤と同じPHに調節してある
原料物質を吸着剤に加えて、所望の蛋白質−吸着
剤の相互作用を起させるために充分な接触時間を
与える。カラム形式の場合は、典型的な満足のゆ
く流速は毎時約５カラム容積だが、カラムを圧固
したり分離させる程高くない様にする。この工程
で先ずカラムを通過した物質は因子：Ｃが無く
なつており、因子：Ｃが因子：Ｒと複合化し
て原料物質中に存在している場合には因子：Ｒ
も無くなつている。非吸着性物質の除去は緩衝溶
液例えば0.3MのNaClを含有する緩衝液Ａを用い
てカラムを洗浄することによつて促進出来る。 （溶離液の280nｍの吸光度が１又はそれ以下
であることに依つて示される様に）大部分の非吸
着性物質がカラムから洗い去られた後で、0.3M
のNaCl及び10ｍＭのCaCl2を含有する緩衝液Ａ
を用いて洗浄を続ける。CaCl2は因子：Ｃを安
定化することが当業界では知られている、しか
し、樹脂上へのフイブリン・クロツト及び因子
：Ｃの潜在的劣化を招く、クロツテング因子活
性化の危険のために早期に使用することは出来な
い。樹脂の洗浄はフイブロネクチン、フイブリノ
ーゲン及び大部分の汚染蛋白質の除去に有効であ
る。 因子：Ｃが因子：Ｒと複合化している場合
には、洗浄によつて溶離しないでカラム上に残つ
ている大部分の因子：Ｒを脱着させるのに有効
な溶離液を用いて、次にカラムを溶出させるのが
有利である。この工程で若干の因子：Ｃはたし
かに溶離するであろうが、然しこの事は、この工
程で溶出しなかつた因子：Ｃは、実際上の因子
によつて先行技術の方法をそれでも圧倒する収率
で、より高度に精製された形で回収されるという
事実によつて償われている。因子：Ｒはその中
に0.4MのNaCl及び10ｍＭのCaCl2を溶解させて
含有している先述の緩衝液Ａより成る溶離液を用
いて溶離出来る。溶出したフラクシヨンは集め
て、因子：Ｒに富んだ源となる。この溶出工程
は、際めて高い収率（例えば少くとも80％から90
％）が望まれて、そして溶出した因子：Ｃ生成
物中の因子：Ｒの共存が許容出来る場合には省
略出来る。 吸着剤上に残つている因子：Ｃは、その生物
学的活性を減少させること無く因子：Ｃを脱着
出来る条件で次に溶離させる。この条件を満足す
る溶離液はその中に溶解した0.3Mから0.5Mの
CaCl2、好ましくは0.5MのCaCl2を含有する先述
の緩衝液Ａより成る。第二のものは1MのNaClを
含有する緩衝液Ａである。溶出したフラクシヨン
を集めて、それを更に処理するかあるいはそれ自
身を治療目的に対して因子：Ｃ源として使用す
ることも出来る。 血漿が原料物質の場合には、少量だが然し有効
量の蛋白質分解劣化（デグラデーシヨン）の抑制
剤例えばベンズアミジン、膵臓のトリプシン抑制
剤、あるいはヒルジンを添加して上記の諸工程を
実施する必要がある。原料物質が低温型沈殿物あ
るいは高い因子：Ｃ純度の物質の場合にはかゝ
る抑制剤は必要無い。 本発明を更に以下の実施例中で示す。 実施例 １ この実施例は、本発明で特許請求された方法と
関連した公刊された諸方法とによる、ヒトの低温
型沈殿物からの抗血友病因子の精製法の結果を比
較している。方法はすべて室温で実施した。 ａ 本発明の方法による精製 振動式ミキサーを用いて、ヒトの低温型沈殿
物（３ｇ）を0.3MのNaClを含有する緩衝液Ａ
（20ｍＭイミダゾール、0.1Mリシン、0.02％ア
ジド、PH6.8）10mlに再懸濁させた。ピタミン
Ｋ依存性プロテアーゼは水酸化アルミニウム・
ゲル〔レソルプター（登録商標）
（RehsorptarR）、アーマー・フアルマキユーテ
イカル・カンパニー（Armour
Pharmaceutical Co.）〕を用いて処理すること
に依つて除去した。溶液を1/30容積のレソルプ
ターと10分間撹拌して、10000×ｇで５分間遠
心分離し、そして同一量のレソルプターに10分
間再吸着させた。遠心分離（10000×ｇ、５分
間）後、溶液を２層のチーズクロスを通した。
得られた溶液は32ｍＳ／cmの伝導率を有してい
た。この溶液の2.5mlを、0.3MのNaClを含有す
る緩衝液Ａ中で平衡化したAH−セフアロース
（フアルマシア）の10mlカラム（10×0.55cm）
を12ml／ｈの流速で通した。溶離後の280nｍ
の吸光度が0.1以下となる迄、カラムを平衡緩
衝液（0.3MNaCl含有緩衝液Ａ）で洗浄した。
カラムを更に0.3MNaCl及び10ｍMCaCl2含有
緩衝液Ａで洗浄し、ついで、先ず0.4MNaCl及
び10ｍMCaCl2含有緩衝液Ａを用いて、次に
0.5MCaCl2含有緩衝液Ａを用いて溶離させた。
【表】
因子：Ｃの顕著な活性を含有する二つのフ
ラクシヨンのプールは使用された因子：Ｃの
90％を占め、16倍の精製度の3.9U／mgの比活
性であつた。 ｂ オーステンの方法に依る精製 振動式ミキサーを用いて、2.5ｇのヒトの低
温型沈殿物を緩衝液Ｂ（0.1Mリシン、0.1M酢
酸ナトリウム、PH5.5）715ml中に再懸濁させ、
レソルプターを用いて(a)と同様に２回吸着させ
た。この点で溶液のPHが6.5であることが判明
し、良く撹拌しつつ10％酢酸を徐々に添加して
5.5に下げた。重い、ゲル状沈殿物を遠心分離
（10000×ｇ、20分間）で除き、２層のチーズク
ロスを通した。透明な低温型沈殿物溶液の3.5
mlを、緩衝液Ｂ中で平衡化したAH−セフアロ
ース（フアルマシア）の10mlカラム（10×0.55
cm）に12ml／ｈの流速でかけた。溶離液の
280nｍの吸光度が0.1以下となる迄、カラムを
緩衝液Ｂで洗浄し、次に0.2MNaCl含有緩衝液
Ｂ、そして最後に1MNaCl含有緩衝液Ｂで洗浄
した。
ラクシヨンのプールは使用された因子：Ｃの
90％を占め、16倍の精製度の3.9U／mgの比活
性であつた。 ｂ オーステンの方法に依る精製 振動式ミキサーを用いて、2.5ｇのヒトの低
温型沈殿物を緩衝液Ｂ（0.1Mリシン、0.1M酢
酸ナトリウム、PH5.5）715ml中に再懸濁させ、
レソルプターを用いて(a)と同様に２回吸着させ
た。この点で溶液のPHが6.5であることが判明
し、良く撹拌しつつ10％酢酸を徐々に添加して
5.5に下げた。重い、ゲル状沈殿物を遠心分離
（10000×ｇ、20分間）で除き、２層のチーズク
ロスを通した。透明な低温型沈殿物溶液の3.5
mlを、緩衝液Ｂ中で平衡化したAH−セフアロ
ース（フアルマシア）の10mlカラム（10×0.55
cm）に12ml／ｈの流速でかけた。溶離液の
280nｍの吸光度が0.1以下となる迄、カラムを
緩衝液Ｂで洗浄し、次に0.2MNaCl含有緩衝液
Ｂ、そして最後に1MNaCl含有緩衝液Ｂで洗浄
した。
【表】
ｃ フアウレ等の方法に依る精製
振動式ミキサーを用いて、3.8ｇのヒトの低
温型沈殿物を11mlの緩衝液Ｃ（１％スクロース、
１％ヒトの血清アルブミン、0.1Mリシン、
0.1M酢酸ナトリウム、PH5.5）に溶解させ、(a)
と同様にレソルプターを用いて２回吸着させ
た。この点で6.4であつた溶液のPHを撹拌しつ
つ10％酢酸を徐々に加えて、5.5に下げた。透
明な低温型沈殿物溶液の3.5mlを、緩衝液Ｃ中
で平衡化したAH−セフアロース（フアルマシ
ア）の10mlカラム（10×0.55cm）に、12ml／ｈ
の流速でかけた。溶離液の吸光度が0.1以下と
なる迄カラムを緩衝液Ｃを用いて洗浄し、
0.2MNaCl含有緩衝液Ｃ及び最後に1MNaCl含
有緩衝液Ｃを用いて溶離させた。 因子：Ｃ 収率フラクシヨン （総単位） （％） 低温型沈殿物溶液 24.7 100 未結合 ０ ０ 緩衝液Ｃ＋0.2M NaCl洗浄 3.9 16 緩衝液Ｃ＋1M NaCl洗浄 7.0 28 すべてのフラクシヨンに高濃度（10mg／ml）
のアルブミンが存在するため、この実施例の比
活性も精製度も意義あるものでは無い。 実施例 ２ この実施例は、本発明の方法に依る、ヒトの低
温型沈殿物からの因子：Ｃの精製で、関係の深
い他の蛋白質−フイブロネクチン、フオン・ヴイ
レブラント因子（因子：Ｒ）及びフイブリノー
ゲンの分布を示す。 精製方法は実施例１(a)に記載したものと同じで
あつた。以下に示す各フラクシヨン中の回収率は
樹脂に通したその蛋白質の量の百分率で示してあ
る。
温型沈殿物を11mlの緩衝液Ｃ（１％スクロース、
１％ヒトの血清アルブミン、0.1Mリシン、
0.1M酢酸ナトリウム、PH5.5）に溶解させ、(a)
と同様にレソルプターを用いて２回吸着させ
た。この点で6.4であつた溶液のPHを撹拌しつ
つ10％酢酸を徐々に加えて、5.5に下げた。透
明な低温型沈殿物溶液の3.5mlを、緩衝液Ｃ中
で平衡化したAH−セフアロース（フアルマシ
ア）の10mlカラム（10×0.55cm）に、12ml／ｈ
の流速でかけた。溶離液の吸光度が0.1以下と
なる迄カラムを緩衝液Ｃを用いて洗浄し、
0.2MNaCl含有緩衝液Ｃ及び最後に1MNaCl含
有緩衝液Ｃを用いて溶離させた。 因子：Ｃ 収率フラクシヨン （総単位） （％） 低温型沈殿物溶液 24.7 100 未結合 ０ ０ 緩衝液Ｃ＋0.2M NaCl洗浄 3.9 16 緩衝液Ｃ＋1M NaCl洗浄 7.0 28 すべてのフラクシヨンに高濃度（10mg／ml）
のアルブミンが存在するため、この実施例の比
活性も精製度も意義あるものでは無い。 実施例 ２ この実施例は、本発明の方法に依る、ヒトの低
温型沈殿物からの因子：Ｃの精製で、関係の深
い他の蛋白質−フイブロネクチン、フオン・ヴイ
レブラント因子（因子：Ｒ）及びフイブリノー
ゲンの分布を示す。 精製方法は実施例１(a)に記載したものと同じで
あつた。以下に示す各フラクシヨン中の回収率は
樹脂に通したその蛋白質の量の百分率で示してあ
る。
【表】
＋測定せず、然し通した蛋白質の96％はカラム
から溶離させられており、そして低温型沈殿物中
にはフイブロネクチンとフイブリノーゲンが高い
濃度で存在しているので、これらの蛋白質はこの
フラクシヨン中に大部分溶出しているに相違いな
い。 実施例 ３ この実施例では、本発明の方法に依りヒトの低
温型沈殿物から精製した因子：Ｃのフイブロネ
クチン及びフイブリノーゲン含量を市販の高純度
因子：Ｃ〔フアクトレート（登録商標）
（FactorateR）ジエネレーシヨン（Generation）
Ｂ、アーマー・フアルマキユーテイカル
（Armour Pharmaceutical）〕と比較した。 精製方法は実施例１(a)に記載したものと同じで
あつた。
から溶離させられており、そして低温型沈殿物中
にはフイブロネクチンとフイブリノーゲンが高い
濃度で存在しているので、これらの蛋白質はこの
フラクシヨン中に大部分溶出しているに相違いな
い。 実施例 ３ この実施例では、本発明の方法に依りヒトの低
温型沈殿物から精製した因子：Ｃのフイブロネ
クチン及びフイブリノーゲン含量を市販の高純度
因子：Ｃ〔フアクトレート（登録商標）
（FactorateR）ジエネレーシヨン（Generation）
Ｂ、アーマー・フアルマキユーテイカル
（Armour Pharmaceutical）〕と比較した。 精製方法は実施例１(a)に記載したものと同じで
あつた。
【表】
【表】
プール
実施例 ４ 本実施例は本発明の方法をヒトの血漿からの因
子：Ｃの精製に使用した場合を示しており、
又、この精製法での因子：Ｃの収率の改善に、
蛋白質分解抑制剤特にトロンビン抑制剤例えばヒ
ルジンの有効性を示している。 伝導率を30−35ｍＳ／cmに上げるためにヒトの
血漿に固体のNaClを加えた。第一の実験では抑
制剤を使用せずにカラムに通した。第二の実験で
は、ベンズアミジン（0.5M）及び膵臓のトリプ
シン抑制剤〔トラシルロール（登録商標）
（TrasylolR）１mg／ml）を添加してそれぞれ１ｍ
Ｍ及び0.01mg／mlの最終濃度とした。第三の実験
では、ヒルジン〔カルビオケミ・カンパニー
（Calbi−ochem Co）25U／ml〕をその代りに加
えて１単位／mlの最終濃度とした。血漿の５ml
を、0.3MNaCl含有の緩衝液Ａ（20ｍＭイミダゾ
ール、0.1Mリシン、0.02％アジド、PH6.8）中で
平衡してあるAH−セフアロース（フアルマシ
ア）の４ml（４×0.55cm）カラムに12ml／ｈの流
速で通した。血漿に蛋白質分解抑制剤を添加して
ある場合には、カラムを通す緩衝液にもそれを添
加した。280nｍの吸光度が0.02以下となる迄、カ
ラムを平衡緩衝液（実施例１参照）を用いて洗浄
し、次に緩衝液Ａに0.5MCaCl2を用いて溶離させ
た。
実施例 ４ 本実施例は本発明の方法をヒトの血漿からの因
子：Ｃの精製に使用した場合を示しており、
又、この精製法での因子：Ｃの収率の改善に、
蛋白質分解抑制剤特にトロンビン抑制剤例えばヒ
ルジンの有効性を示している。 伝導率を30−35ｍＳ／cmに上げるためにヒトの
血漿に固体のNaClを加えた。第一の実験では抑
制剤を使用せずにカラムに通した。第二の実験で
は、ベンズアミジン（0.5M）及び膵臓のトリプ
シン抑制剤〔トラシルロール（登録商標）
（TrasylolR）１mg／ml）を添加してそれぞれ１ｍ
Ｍ及び0.01mg／mlの最終濃度とした。第三の実験
では、ヒルジン〔カルビオケミ・カンパニー
（Calbi−ochem Co）25U／ml〕をその代りに加
えて１単位／mlの最終濃度とした。血漿の５ml
を、0.3MNaCl含有の緩衝液Ａ（20ｍＭイミダゾ
ール、0.1Mリシン、0.02％アジド、PH6.8）中で
平衡してあるAH−セフアロース（フアルマシ
ア）の４ml（４×0.55cm）カラムに12ml／ｈの流
速で通した。血漿に蛋白質分解抑制剤を添加して
ある場合には、カラムを通す緩衝液にもそれを添
加した。280nｍの吸光度が0.02以下となる迄、カ
ラムを平衡緩衝液（実施例１参照）を用いて洗浄
し、次に緩衝液Ａに0.5MCaCl2を用いて溶離させ
た。
【表】
抑制剤無しでも、本発明の方法は優に10倍以上
に、即ち捕集する特定のフラクシヨンに応じて、
20倍、25倍、30倍又はそれ以上の倍率で因子：
Ｃを有効に精製することが判明する。抑制剤を用
いると精製倍率はさらに高く、40倍（40：１）を
越すことが出来る。如何なる精製度においても、
収率、即ち精製した製品として回収される本方法
で使用した因子：Ｃの量は、同一精製度で先行
技術の諸方法を用いて到達出来るものより高い。
抑制剤無しでも30％を越す収率が達成出来、そし
て抑制剤を用いて50％を越える、そして70−90％
と高い、収率が達成出来る。精製度と収率とのこ
の組合わせは極めて有利なものであり、そして今
迄に明かにされていなかつたものである。
に、即ち捕集する特定のフラクシヨンに応じて、
20倍、25倍、30倍又はそれ以上の倍率で因子：
Ｃを有効に精製することが判明する。抑制剤を用
いると精製倍率はさらに高く、40倍（40：１）を
越すことが出来る。如何なる精製度においても、
収率、即ち精製した製品として回収される本方法
で使用した因子：Ｃの量は、同一精製度で先行
技術の諸方法を用いて到達出来るものより高い。
抑制剤無しでも30％を越す収率が達成出来、そし
て抑制剤を用いて50％を越える、そして70−90％
と高い、収率が達成出来る。精製度と収率とのこ
の組合わせは極めて有利なものであり、そして今
迄に明かにされていなかつたものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 因子：Ｃ及び因子：Ｒを含有する原料物
質からの因子：Ｃの精製方法であつて、 (a) 5.5より大で約8.0迄のPHと約25ｍＳ／cm乃至
35ｍＳ／cmの電気伝導率を有する該原料物質の
水溶液を調製し、 (b) 因子：Ｃ及び因子：Ｒを該溶液から、該
水溶液のPHに平衡化されているアミノヘキシ
ル・アガロースに吸着させ、 (c) 因子：Ｒをアミノヘキシル・アガロースか
ら溶離し、そして次に (d) 因子：Ｃをアミノヘキシル・アガロースか
ら溶離する諸工程よりなることを特徴とする因
子：Ｃの精製方法。 ２ 該原料物質のPHが6.0乃至7.5である特許許請
の範囲第１項記載の方法。 ３ 該原料物質のPHが6.5乃至7.2である特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ４ アミノヘキシル・アガロースが１ｇ当り少く
とも約10ミリモルのアミノヘキシル鎖を含有して
いる特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
に記載の方法。 ５ 原料物質がAHFを含有する血漿、血漿濃縮
物あるいは低温型沈殿物である特許請求の範囲第
１項乃至第４項のいずれかに記載の方法。 ６ 原料物質がフイブロネクチン及び／又はフイ
ブリノーゲンも含有し、そしてフイブロネクチン
及び／又はフイブリノーゲンを因子：Ｒと共溶
離する特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれ
かに記載の方法。 ７ 少量だが因子：Ｃの蛋白質分解を抑制する
有効量の蛋白質分解抑制剤を工程(a)、(b)、(c)及び
(d)中に存在させる特許請求の範囲第１項乃至第６
項のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US557805 | 1983-12-05 | ||
| US06/557,805 US4508709A (en) | 1983-12-05 | 1983-12-05 | Process for purifying factor VIII:C |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60136518A JPS60136518A (ja) | 1985-07-20 |
| JPH0535159B2 true JPH0535159B2 (ja) | 1993-05-25 |
Family
ID=24226953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59255863A Granted JPS60136518A (ja) | 1983-12-05 | 1984-12-05 | 因子８：ｃの精製方法 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4508709A (ja) |
| EP (1) | EP0144957B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60136518A (ja) |
| KR (1) | KR850004593A (ja) |
| AT (1) | ATE60996T1 (ja) |
| AU (1) | AU569129B2 (ja) |
| CA (1) | CA1248449A (ja) |
| DE (1) | DE3484179D1 (ja) |
| DK (1) | DK162896C (ja) |
| ES (1) | ES8600690A1 (ja) |
| FI (1) | FI844804L (ja) |
| IE (1) | IE57644B1 (ja) |
| IL (1) | IL73734A (ja) |
| IN (1) | IN162586B (ja) |
| MX (1) | MX7552E (ja) |
| NO (1) | NO167627C (ja) |
| NZ (1) | NZ210427A (ja) |
| SG (1) | SG14992G (ja) |
| ZA (1) | ZA849434B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US4614795A (en) * | 1982-08-05 | 1986-09-30 | University Of Rochester | Deglycosylated Human Factor VIII:C |
| US4650858A (en) * | 1983-03-21 | 1987-03-17 | Nordisk Gentofte A/S | Concentrate of the antihemophilic factor VIII and a process for producing it |
| ZA852099B (en) * | 1984-03-26 | 1985-12-24 | Meloy Lab | Recombinant factor viii-c. |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| DE3432083A1 (de) * | 1984-08-31 | 1986-03-06 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Pasteurisierte, isoagglutininfreie faktor viii-praeparation und verfahren zu ihrer herstellung |
| US5043428A (en) * | 1984-08-31 | 1991-08-27 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Pasteurized, isoagglutinin-free factor VIII preparation and a process for its production |
| US4952675A (en) * | 1985-02-01 | 1990-08-28 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4743680A (en) * | 1985-02-01 | 1988-05-10 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| GB2178533B (en) * | 1985-07-22 | 1989-07-19 | Asahi Chemical Ind | Analytical method of enzyme precursors and device therefor |
| JPS63108000A (ja) * | 1986-05-15 | 1988-05-12 | Green Cross Corp:The | 第８因子の精製方法 |
| JPH0789951B2 (ja) * | 1986-06-18 | 1995-10-04 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 遺伝子発現産物の精製法 |
| US4795806A (en) * | 1987-07-16 | 1989-01-03 | Miles Laboratories, Inc. | Phospholipid affinity purification of Factor VIII:C |
| NL8701915A (nl) * | 1987-08-14 | 1989-03-01 | Waander Riethorst | Adsorbensmateriaal en toepassing daarvan voor het isoleren van stollingsfaktoren. |
| FR2632309B1 (fr) * | 1988-06-07 | 1990-08-24 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de purification par voie chromatographique de proteines, notamment de facteur viii, et les produits obtenus |
| DE3826792C1 (ja) * | 1988-08-06 | 1989-07-06 | Biotest Pharma Gmbh, 6072 Dreieich, De | |
| DE3878245D1 (de) * | 1988-11-05 | 1993-03-18 | Octapharma Ag | Verfahren zur herstellung eines hochreinen, nicht infektioesen antihaemophiliefaktors mittels chromatographie. |
| FR2644064B1 (fr) * | 1989-02-17 | 1994-05-27 | Aquitaine Dev Transf Sanguine | Procede de fabrication du facteur antihemophilique fviiic ayant une tres haute purete et facteur antihemophilique fviiic ainsi obtenu, ainsi que composition pharmaceutique le contenant |
| FR2665449B1 (fr) * | 1990-08-02 | 1995-04-14 | Aquitaine Developp Transf Sang | Procede de fabrication de facteur von willebrand ayant une tres haute purete, depourvu en majeure partie de facteur antihemophilique (fviiic), et facteur von willebrand ainsi obtenu, ainsi qu'une composition pharmaceutique le contenant. |
| GB8913183D0 (en) * | 1989-06-08 | 1989-07-26 | Central Blood Lab Authority | Chemical products |
| DE3939346A1 (de) * | 1989-11-29 | 1991-06-06 | Behringwerke Ag | Arzneimitel zur subkutanen oder intramuskulaeren applikation enthaltend polypeptide |
| JPH0427865A (ja) * | 1989-12-21 | 1992-01-30 | Kurita Water Ind Ltd | 血液凝固因子用分離剤およびその製造方法 |
| FR2681867B1 (fr) * | 1991-09-26 | 1993-12-31 | Pasteur Merieux Serums Vaccins | Procede de purification du facteur viii et preparations obtenues. |
| US5278289A (en) * | 1991-11-12 | 1994-01-11 | Johnson Alan J | Antihemophilic factor stabilization |
| WO1995003332A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Baxter International Inc. | Activated human factor viii and method of preparation |
| US5576291A (en) * | 1993-09-13 | 1996-11-19 | Baxter International Inc. | Activated factor VIII as a therapeutic agent and method of treating factor VIII deficiency |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
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|---|---|---|---|---|
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| US4397841A (en) * | 1982-06-28 | 1983-08-09 | Monsanto Company | Production of blood coagulation factor VIII:C |
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1983
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1984
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