JPH0547196B2 - - Google Patents
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- JPH0547196B2 JPH0547196B2 JP59113217A JP11321784A JPH0547196B2 JP H0547196 B2 JPH0547196 B2 JP H0547196B2 JP 59113217 A JP59113217 A JP 59113217A JP 11321784 A JP11321784 A JP 11321784A JP H0547196 B2 JPH0547196 B2 JP H0547196B2
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- isoleucine
- hdase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
（産業上の利用分野）
本発明は発酵法によるＬ−スレオニン及び／又
はＬ−イソロイシンの製造法に関し、詳しくは組
換えプラスミドを有するコリネホルム細菌を用い
た発酵法によるＬ−スレオニン及び又はＬ−イソ
ロイシンの製造法に関する。 （従来の技術） 従来、発酵法によりＬ−スレオニンやＬ−イソ
ロイシンを製造する場合、微生物としては自然界
から分離した菌株または該菌株の人工変異株を用
いられている。Ｌ−スレオニンを生産する人工変
異株は数多く知られており、その多くはα−アミ
ン−β−ヒドロキシ吉草酸（以下、AHVと略記
する。）に耐性があり、ブレビバクテリウム属ま
たはコリネバクテリウム属に属している。これら
の微生物は収率10〜20％でＬ−スレオニンを生産
する。例えば、米国特許第3582471号明細書、同
第3580810号明細書及び特公昭47−34956号公報に
はAHV耐性を示し、ブレビバクテリウム属、エ
シエリヒア属及びコネリバクテリウム属に属する
変異株を用いたＬ−スレオニンの製造法が開示さ
れている。また、ブレビバクテリウム属及びコリ
ネバクテリウム属に属する変異株によるＬ−スレ
オニンの生産について特開昭51−54984号公報、
同53−101591号公報、同54−32693号公報、同54
−35285号公報、同54−35286号公報、同54−
35288号公報、同54−37886号公報及び同54−
92692号公報にも開示されている。 一方、米国特許第4278765号明細書、特開昭55
−131397号公報及び同56−15696号公報には組換
えプラスミドDNAを用いて形質転換されたエシ
エリヒア・コリを用いてＬ−スレオニンを製造す
る方法が示されている。 さらに、1982年５月10日に出願された米国特許
出願第376396号明細書にはAHVに対する耐性を
コントロールする染色体DNA断片が挿入されて
いるプラスミドを有するコリネ型細菌を使用する
Ｌ−スレオニンの生産について記載されている。 また、Ｌ−イソロイシンに関する状況もＬ−ス
レオニンの場合と酷似している。Ｌ−イソロイシ
ンを生産する微生物としてはイソロイシン吉草酸
塩に対して耐性を有するセラチアの変異株（特公
昭52−30593号公報）、その生育にＬ−ロイシンを
必要とするコリネバクテリウム・グルタミカムの
変異株（特公昭47−38995号公報）、AHVに耐性
を有するブレビバクテリウム属及びコリネバクテ
リウム属の変異株（特公昭40−2880号公報）、
AHVに耐性を有し、かつその生育にリジンを必
要とするブレビバクテリウム属の変異株（特公昭
51−6237号公報）、AHV及びｏ−メチルスレオ
ニンに耐性を有するブレビバクテリウム属の変異
株（特公昭51−21077号公報）、Ｓ−（２−アミノ
エチル）−システインに耐性を有するコリネバク
テリウム属の変異株（特公昭52−4629号公報）、
２−アミノ−３−メチルチオ酪酸に耐性を有する
エシエリヒア属の変異株（特開昭53−69881号公
報）、AHV及びトリクロロアラニンに耐性を有
するブレビバクテリウム属の変異株（特開昭54−
35287号公報）がある。 そのほか組換えプラスミドDNAを用いて形質
転換されたエシエリヒア・コリはアミノ酸の生産
能が高いことが開示されている（例えば米国特許
第4278765号明細書参照）。 しかしながら、エシエリヒア・コリに遺伝子組
換え技術を適用して商業的に有用なＬ−スレオニ
ンまたはＬ−イソロイシン生産菌株を作ることは
非常に困難である。その理由は、本来的にエシエ
リヒア・コリはＬ−スレオニンおよびＬ−イソロ
イシン生産能を有しておらず、しかもこのような
エシエリヒア・コリから得た組換え菌はいずれの
アミノ酸も大量には生産しないからである。 これに対してブレビバクテリウム属およびコリ
ネバクテリウム属にはＬ−スレオニン及びＬ−イ
ソロイシンを多量に生産する多くの菌株が存在す
る。したがつて、このブレビバクテリウム属およ
びコリネバクテリウム属の微生物は遺伝子組換え
技術によりＬ−スレオニン及びＬ−イソロイシン
の生産菌株を作るための原菌株として適してい
る。ところで、表現マーカーを有するブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属の菌株の中
にプラスミドが存在することは永い間知られてい
なかつた（ヨーロツパ特許公開公報第3391号公報
参照）。しかし、最近の研究ではスレオニンまた
はイソロイシンの生産をコントロールするプラス
ミドを有するコリネ型細菌の生成の可能性が実証
されている（1982年５月10日出願の米国特許出願
第376396号明細書及び1982年６月25日出願の米国
特許出願第392145号明細書参照）。さらに、1982
年６月10日出願の米国特許出願第386980号明細書
にはコリネ型細菌のグルタミン酸生産菌中に増殖
可能な複合プラスミドが開示されている。 （発明が解決しようとする問題点） スレオニンとイソロイシンの生合成経路は下記
の通りである。
はＬ−イソロイシンの製造法に関し、詳しくは組
換えプラスミドを有するコリネホルム細菌を用い
た発酵法によるＬ−スレオニン及び又はＬ−イソ
ロイシンの製造法に関する。 （従来の技術） 従来、発酵法によりＬ−スレオニンやＬ−イソ
ロイシンを製造する場合、微生物としては自然界
から分離した菌株または該菌株の人工変異株を用
いられている。Ｌ−スレオニンを生産する人工変
異株は数多く知られており、その多くはα−アミ
ン−β−ヒドロキシ吉草酸（以下、AHVと略記
する。）に耐性があり、ブレビバクテリウム属ま
たはコリネバクテリウム属に属している。これら
の微生物は収率10〜20％でＬ−スレオニンを生産
する。例えば、米国特許第3582471号明細書、同
第3580810号明細書及び特公昭47−34956号公報に
はAHV耐性を示し、ブレビバクテリウム属、エ
シエリヒア属及びコネリバクテリウム属に属する
変異株を用いたＬ−スレオニンの製造法が開示さ
れている。また、ブレビバクテリウム属及びコリ
ネバクテリウム属に属する変異株によるＬ−スレ
オニンの生産について特開昭51−54984号公報、
同53−101591号公報、同54−32693号公報、同54
−35285号公報、同54−35286号公報、同54−
35288号公報、同54−37886号公報及び同54−
92692号公報にも開示されている。 一方、米国特許第4278765号明細書、特開昭55
−131397号公報及び同56−15696号公報には組換
えプラスミドDNAを用いて形質転換されたエシ
エリヒア・コリを用いてＬ−スレオニンを製造す
る方法が示されている。 さらに、1982年５月10日に出願された米国特許
出願第376396号明細書にはAHVに対する耐性を
コントロールする染色体DNA断片が挿入されて
いるプラスミドを有するコリネ型細菌を使用する
Ｌ−スレオニンの生産について記載されている。 また、Ｌ−イソロイシンに関する状況もＬ−ス
レオニンの場合と酷似している。Ｌ−イソロイシ
ンを生産する微生物としてはイソロイシン吉草酸
塩に対して耐性を有するセラチアの変異株（特公
昭52−30593号公報）、その生育にＬ−ロイシンを
必要とするコリネバクテリウム・グルタミカムの
変異株（特公昭47−38995号公報）、AHVに耐性
を有するブレビバクテリウム属及びコリネバクテ
リウム属の変異株（特公昭40−2880号公報）、
AHVに耐性を有し、かつその生育にリジンを必
要とするブレビバクテリウム属の変異株（特公昭
51−6237号公報）、AHV及びｏ−メチルスレオ
ニンに耐性を有するブレビバクテリウム属の変異
株（特公昭51−21077号公報）、Ｓ−（２−アミノ
エチル）−システインに耐性を有するコリネバク
テリウム属の変異株（特公昭52−4629号公報）、
２−アミノ−３−メチルチオ酪酸に耐性を有する
エシエリヒア属の変異株（特開昭53−69881号公
報）、AHV及びトリクロロアラニンに耐性を有
するブレビバクテリウム属の変異株（特開昭54−
35287号公報）がある。 そのほか組換えプラスミドDNAを用いて形質
転換されたエシエリヒア・コリはアミノ酸の生産
能が高いことが開示されている（例えば米国特許
第4278765号明細書参照）。 しかしながら、エシエリヒア・コリに遺伝子組
換え技術を適用して商業的に有用なＬ−スレオニ
ンまたはＬ−イソロイシン生産菌株を作ることは
非常に困難である。その理由は、本来的にエシエ
リヒア・コリはＬ−スレオニンおよびＬ−イソロ
イシン生産能を有しておらず、しかもこのような
エシエリヒア・コリから得た組換え菌はいずれの
アミノ酸も大量には生産しないからである。 これに対してブレビバクテリウム属およびコリ
ネバクテリウム属にはＬ−スレオニン及びＬ−イ
ソロイシンを多量に生産する多くの菌株が存在す
る。したがつて、このブレビバクテリウム属およ
びコリネバクテリウム属の微生物は遺伝子組換え
技術によりＬ−スレオニン及びＬ−イソロイシン
の生産菌株を作るための原菌株として適してい
る。ところで、表現マーカーを有するブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属の菌株の中
にプラスミドが存在することは永い間知られてい
なかつた（ヨーロツパ特許公開公報第3391号公報
参照）。しかし、最近の研究ではスレオニンまた
はイソロイシンの生産をコントロールするプラス
ミドを有するコリネ型細菌の生成の可能性が実証
されている（1982年５月10日出願の米国特許出願
第376396号明細書及び1982年６月25日出願の米国
特許出願第392145号明細書参照）。さらに、1982
年６月10日出願の米国特許出願第386980号明細書
にはコリネ型細菌のグルタミン酸生産菌中に増殖
可能な複合プラスミドが開示されている。 （発明が解決しようとする問題点） スレオニンとイソロイシンの生合成経路は下記
の通りである。
【表】
↓
イソロイシン
上記生合成経路にはリジンの生合成経路の部分
も示されている。スレオニンとイソロイシンへの
経路の第一の枝はアスパルテートセミアルデヒド
につながつており、これら２種のアミノ酸に導く
酵素はホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下、
HDaseと略記する。）であり、一方リジンに導く
酵素はジヒドロジピコリネートシンセターゼ（以
下、DHDPシンセターゼと略記する。）である。 コリネバクテリウム属の変異株における
HDase活性とAHV耐性との関係は、椎尾ら、生
化学会誌、68、859（1970）；中森ら、農芸化学会
誌、37、653（1973）及び戸坂ら、同誌、43、265
（1979）に開示されている。 また、リジンの生合成経路の数種の遺伝子を含
むハイブリツドプラスミドを有するエシエリヒ
ア・コリ株が最近開示されたことも注目すべきで
ある。また、リジンのオーバープロデユーサー
（TOC R21）が形質転換され、リジンの合成は
種種の菌株で研究された（Le−Reverendら、
European Journal of Applied Microbiology
and Biotechnology、15、227〜231（1982）及び
フランス特許公告第2511032号明細書参照）。これ
ら文献から明らかなように、dap Ａ遺伝子
（DHDPシンセターゼをコードしている）を含む
プラスミドのみがリジンの生産を増加する。この
反応はリジンのオーバープロデユーサー（アスパ
ラギン酸キナーゼ反応を変える突然変異を有す
る）における限られた生合成の段階である。この
遺伝子の増幅方法は代謝産物を過剰生産する微生
物の改質に利用しうると著者らは述べている。し
かしながら、これら文献にはコリネ型細菌あるい
はリジン以外の生成物に対して該作用を拡張しう
ることを示唆する記載は全くない。したがつて、
コリネ型細菌によりＬ−スレオニン及びＬ−イソ
ロイシンを発酵生産する改良された、かつ能率的
方法についての要求は依然として存在している。 本発明者らは、HDaseに対する遺伝情報がコ
リネ型細菌において複製可能な特定のベクターに
結合して生成した該遺伝情報を有するハイブリツ
ドベクターが特定のコリネ型細菌ホストまたは受
容株中に複製されると、このようにして形質転換
されたコリネ型細菌はＬ−スレオニン及び／又は
Ｌ−イソロイシンのすぐれた生産菌株であること
を見出した。本発明ではコリネ型細菌のうちＬ−
スレオニン及び／又はＬ−チソロイシンを多量に
生産するブレビバクテリウム属及びコリネバクテ
リウム属の多くの菌株がホストとして利用できる
点が興味深い。 （発明の構成） 本発明はブレビバクテリウム属由来のホモセリ
ンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挿入さ
れていてウブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属のコリネ型細菌体内で増殖できるプラ
スミドベクターを有し、かつＬ−スレオニン及
び／又はＬ−イソロイシン生産能を有するブレビ
バクテリウム属又はコリネバクテリウ属のコリネ
型細菌を培養し、培地中に生成蓄積されたＬ−ス
レオニン及び／又はＬ−イソロイシンを採取する
ことを特徴とするＬ−スレオニン及び／又はＬ−
イソロイシンの製造法を提供するものである。 前記生合成経路において、HDaseはメチオニ
ンに向う経路とスレオニン及びイソロイシンに向
う経路の間の分岐点に存在している。HDaseコ
ードの十分な遺伝情報を含むDNAは適当なDNA
ドナーから得ることができる。このドナーは
HDaseにおいて変異したものであつてもHDase
において野生のものであつてもよい。好ましく
は、このドナーはコリネホルム細菌であり、より
好ましくはブレビバクテリウム・ラクトフアーメ
ンタム（Brevibacterium lactofermentum）で
ある。最も好適なドナーはＬ−スレオニンによる
フイードバツク阻害に対して感応しない（耐性
の）HDaseを有する。かかるドナーは通常、
AHV耐性である。HDaseコードの遺伝情報はド
ナーからのDNAの部分切断、特定プラスミドへ
の遺伝子配列の導入、HDaseを欠失したコリネ
型細菌及び引続きホモセリン栄養要求株
（HDase-）のその結果得られる複数の組換え型
DNAの混合物による形質転換ならびにホモセリ
ンを要求しない形質転換株の分離によつて得るこ
とができる。 特に、遺伝子配列を含むHDase遺伝情報はブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ11188（FERM Ｐ−4190）から得られ、この菌
株ではHDaseはＬ−スレオニンによるフイード
バツク阻害に対して耐性である。HDase遺伝子
からなる遺伝子情報は分子量が2.24メガダルトン
（Md）で、２個のPstI制限エンドヌクレアーゼ切
断個所を持ち、２個のPstの切断個所によりフラ
ンクされているDNA断片中に見出すことができ
る。このDNA断片は３つの部分を有しており、
これら３つの部分のサイズ（２個のPstI切断個所
によりフランクされ、分割されている）は
0.7Md、0.44Md及び1.10Mdである。 形質転換に有用なホストまたは受容株は、いわ
ゆるコリネ型細菌である。これら細菌は好気性、
グラム陽性桿菌であり、非抗酸性であり、バージ
ーズ・マニユアル・オブ・デイターミナテイブ・
バクテリオロジー、第８版、599頁（1974）に記
載されている。本発明におけるホストとして有用
なコリネ型細菌の野生株の例は次の通りである。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
（Brevibacterium divaricatum） ATCC14020 ブレビバクテリウム・サツカロリチクム（B.
saccharolyticum） ATCC14066 ブレビバクテリウム・イマリオフイルム（B.
immariophilum） ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
（B.lactofermentum） ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム（B.roseum）
ATCC13825 ブレビバクテリウム・フラバム（B.flavum）
ATCC13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（B.
thiogenitalis） ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
（Corynebacterium acetoacidophilum）
ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（C.
acetoglutamicum） ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ（C.callunae）
ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム（C.
glutamicum） ATCC13032、13060 コリネバクテリウム・リリウム（C.lilium）
ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ（C.
melassecola） ATCC17965 他 コリネ型細菌をホストとして使用するに先立
ち、既知の方法で制限酵素活性を低下せしめる変
異を施せば好適な結果が得られる。 コリネ型細菌がHDase挿入を有するベクター
を用いて形質転換される際に該コリネ型細菌は外
来遺伝子によつて保持された遺伝情報を発現す
る。 特に興味深いホストは、HDaseの欠損株また
はその非欠損株である。後者の場合、ホスト自体
がＬ−スレオニンとＬ−イソロイシンを生産す
る。とりわけ、マルチコピープラスミド中に
HDaseをコードする遺伝子を挿入することによ
りこの酵素の遺伝子コピーの数が著しく増加し、
また最終アミノ酸類の生産が非常に増大する。事
実、HDase非欠損株性（HDase+）ホスト中に
HDaseを有するマルチコピープラスミドを使用
することにより非常に高濃度のＬ−スレオニン及
びＬ−イソロイシンが得られる。HDaseの欠損
株は通常、HDase遺伝子を保有するベクターの
選択及び分離のためのホストとして用いられる。
このようにして分離されたベクターをHDaseの
非欠損株の形質転換に使用すると良い結果が得ら
れる。 アスパラギン酸キナーゼ野生ホストまたはアス
パラギン酸キナーゼ反応を変えることにより変異
させたホストのいずれかを使用することもまた興
味深いことである。ホストがスレオニン及び／又
はイソロイシンを過剰生産するようにアスパラギ
ン酸キナーゼ反応を変異されているホストにおい
ては、該アスパラギン酸キナーゼ反応は最早や速
度に制限がない。したがつて、最大の効果はこの
ように変異されたホストを用いることにより得ら
れる。 さらに、AHV耐性のないホストは形質転換に
利用することができる。Ｌ−メチオニン、Ｌ−リ
ジン及び／またはＬ−ロイシンの欠損株は好適な
ホストである。最も好ましいホストはAHV耐性
を有し、かつＬ−スレオニンによるフイードバツ
ク阻害に対してHDase耐性を有するものである。 コリネ型細菌において複製可能な、どのような
ベクターもホストへHDaseを持込み、その形質
転換に使用するために利用することができる。プ
ラスミド、フアージ、その他のベクター等の種種
のベクターを利用することができ、特に重要なも
のは米国特許願第386980号明細書（1982年６月10
日出願）に記載されている複合プラスミドであ
る。これらのプラスミドは、コリネ型細菌のグル
タミン酸生産菌中で生殖可能なプラスミドａから
得られるドライブユニツト領域Ａ及びエシエリヒ
ア・コリまたはバチルス・ズブチリス中で生殖可
能であり、かつ少なくとも薬物耐性を示す領域を
有するプラスミドｂから得られる１個または複数
の遺伝子断片Ｂからなつている。遺伝子断片がさ
らにプラスミドｂのドライブユニツト領域を保持
している場合、複合プラスミドはエシエリヒア・
コリまたはバチルス・ズブチリス中で生殖可能に
なり、かくして該複合プラスミドをエシエリヒ
ア・コリまたはバチルス・ズブチリス中で篩別ま
たは増幅することができる。 ここで「薬物耐性」とはホスト細胞の生育を阻
止する抗生物質のような薬剤に対する耐性を意味
する。このような抗生物質の例としてはペニシリ
ン、カナマイシン、クロラムフエニコール、エリ
スロマイシン、アクチノマイシン等がある。 コリネ型細菌中で生殖可能なマルチコピープラ
スミドａの具体例は前述の米国特許願第380980号
明細書に開示されており、かつブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムATCC13869から分離
され、分子量3.0MdのpAM330（第１図に示した
制限地図参照）、ブレビバクテリウム・フラバム
B107FERM Ｐ−54から分離され、分子量3.0Md
のpAM286（第２図に示した制限地図参照）及び
ブレビバクテリウム・グルタミクムATCC13058
から分離され、分子量1.8MdのpHM1519（第３図
に示した制限地図参照）が含まれる。 エシエリヒア・コリ中で生殖可能なプラスミド
ｂはマルチコピープラスミドであり、薬物耐性の
遺伝情報を有している。これらには例えば
pAC105、pBR322、pBR324、pBR325等がある。
バチルス・ズブチリス中で生殖可能で、薬物耐性
の遺伝情報を有するプラスミドｂは好ましくはマ
ルチコピーであり、pT127、pC194、pC221、
pC223、pUB110等が含まれる。 これらプラスミドａ及びｂから複合プラスミド
を作るには、制限酵素による切断、リガーゼによ
る連結のような定法を用いることができる。 連結反応後、所望の複合プラスミドをコリネ型
細菌中に生殖可能なプラスミドを分離することに
より篩別し、これを用いてコリネ型細菌を薬物耐
性に形質転換することができる。プラスミドａか
ら得られるドライブユニツト領域とプラスミドｂ
から得られる他のドライブユニツト領域を有し、
プラスミドｂの薬物耐性遺伝子を有する複合プラ
スミドは、コリネ型細菌及びエシエリヒア・コリ
またはバチルス・ズブチリス中に生殖可能であ
り、(1)コリネ型細菌または(2)エシエリヒア・コリ
（プラスミドがエシエリヒア・コリ中に生殖可能
なものを使用する場合）またはバチルス・ズブチ
リス（プラスミドがバチルス・ズブチリス中に生
殖可能なものを使用する場合）を形質転換するこ
とが可能であり、かつ薬物耐性を有するプラスミ
ド類の中に見出すことができる。 本発明に有用な複合プラスミドの例の中には適
当な国際寄託機関に寄託されている下記のホスト
中に存在するプラスミドがある。 pAJ655：エシエリヒア・コリAJ11882、FERM
BP−136（FERM Ｐ−6517） コリネバクテリウム・グルタミクムSR8201、
ATCC39135（第４図に示した制限地図参照） pAJ611：エシエリヒア・コリAJ11884、FERM
BP−138（FERM Ｐ−6519）（第５図に示した
制限地図参照） pAJ1844：エシエリヒア・コリAJ11883、FERM
BP−137（FERM Ｐ−6518） コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC39136（第６図に示した制限地図参照） pAJ440：バチルス・ズブチリスAJ11901、
FERM BP−140（第７図に示した制限地図参
照） pAJ3148：コリネバクテリウム・グルタミクム
SR8203、ATCC39137（第８図に示した制限地
図参照） 複合プラスミドは寄託微生物の細胞から、リゾ
チウム及びSDSを用いて対数増殖期後期に予め集
めた細胞を溶菌し、溶菌物から遠心分離（30000
×ｇ）して得た上澄液にポリエチレングリコール
を添加し、沈でんしたDNAをセシウムクロライ
ド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離
により分画して精製することにより得ることがで
きる。この複合プラスミドは寄託微生物から損傷
を与えずに自然消失、すなわち「キユアリング」
（バクテリオロジカル レビユーズ、36、361〜
405（1972））によりホスト菌株を得るために追い
出すことができる。 適当な複製ベクターの１つにHDase遺伝子を
挿入するには、適当な制限エンドヌクレアーゼに
より複製ベクターを切断し、常法によりその中へ
適当な遺伝子配列を連結することによつて行なう
ことができる。 HDase遺伝子を有するベクターをコリネ型細
菌のホストに取込むには、DNA受容株の細菌を
塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増加
すること（Mandell、Ｍらによるエシエリヒア・
コリＫ−12に関する報告、ジヤーナル、・オブ・
モレキユラー・バイオロジー、53、159（1970））
または細胞がDNAを取込めるようになる特定の
生長段階で取込ませること（Duncan、C.H.らに
よるバチルス・ズブチリスに関する報告、ジー
ン、153（1977））によつて行なうことができる。
バチルス・ズブチリス、アクチノミセス及び酵母
について知られており、Chang、S.ら、Molec.
Gen.Genet.、168、111（1979）、Bibbら、
Nature、274、398（1978）、Hinnen、Ａら、
PNAS USA、75、1929（1978）に報告されてい
るように、プラスミドDNAを容易に取込むDNA
受容株のプロトプラストあるいはスフエロプラス
トを形成することによりプラスミドを該受容株に
取込ませることもできる。 複合プラスミドはコリネ型細菌を薬物耐性菌に
形質転換するので、HDase遺伝子を挿入したプ
ラスミドを含む形質転換株はその薬物耐性を試験
することによつて容易に同定することができる。
HDaseを挿入したベクターを有する形質転換株
は生育のためのホモセリン要求性を試験すること
によりホスト細胞から容易に区別することができ
るので、遺伝標識を持たないベクターを組換え
DNAの製造に用いる場合、HDaseの欠損株はホ
ストとして好適である。 複合プラスミドに挿入されたHDase遺伝子は、
必要に応じて常法により他のベクターへ容易に転
移することができる。 このようにして得られたＬ−スレオニン及び／
又はＬ−イソロイシン生産菌を培養する方法は常
法で良く、既知のスレオニン及び／又はイソロイ
シン生産菌の培養方法と同様である。培地は炭素
源、窒素源および有機イオン、さらに必要に応じ
てビタミン類、アミノ酸類などの有機栄養源の少
量を含有する通常の培地を使用することができ
る。適当な炭素源の例としてはグルコース、シユ
ークロース、ラクトース、でん粉加水分解物、廃
糖蜜などがある。窒素源としてはガス状アンモニ
ア、液状アンモニア、アンモニウム塩及び他の窒
素含有物質を用いることができる。 HDase遺伝子を有するベクターを含む形質転
換された微生物の培養は好気的条件下に行ない、
培養液のPHと温度を適当な水準に調整し、Ｌ−ス
レオニン及び／又はＬ−イソロイシンの生成が止
むまで培養を続ける。 培養液に蓄積されたアミノ酸は常法によつて回
収することができる。 （本発明の効果） 本発明の方法によれば、ブレビバクテリウムや
コリネバクテリウムの人工変異株を使用する既知
の方法よりも高い収率でＬ−スレオニン及び／又
はＬ−イソロイシンを製造することができる。 （実施例） 次に、本発明を実施例により説明するが、本発
明はこれらにより制限されるものではない。 実施例 １ (1) Ｌ−スレオニンによるフイードバツク阻害に
対して耐性のHDase（AHV耐性）を有するＬ
−スレオニン生産菌、ブレビバクテリウム・ラ
クトフアーメンタムAJ11188（FERM Ｐ−
4190）（戸坂ら、Agric.Biol.Chem.、43、265
（1979））をDNAドナーとして使用した。 AJ11188菌を１のCMG培地（ペプトン10
ｇ、酵母エキス10ｇ、NaCl5ｇ、グルコース５
ｇ、蒸留水1000ml）（PH7.0、NaOHで調整）で
30℃にて10時間培養し、対数増殖期に遠心分離
にて細胞を集めた。この細胞から常法のフエノ
ール法によりDNA約3.6mgを抽出した。 (2) プラスミドpAJ1844は、プラスミド
pHM1519とpBR325から作られた複合プラス
ミドである。プラスミドpHM1519及び
pAJ1844の制限地図は米国特許願第386980号明
細書に示されている。 プラスミドpAJ1844は下記の方法にて調製し
た。 pAJ1844を保有するエシエリヒア・コリ
AJ11883の細胞を対数増殖期に遠心分離により
集め、リゾチウム及びSDSにより溶菌した。溶
解物の上清からエタノール沈でんによつて
pAJ1844のDNA約80μｇを得た。 (3) 染色体DNA試料4μｇを制限酵素PstI（ボーリ
ンガー・マンハイムより購入）0.124ユニツト
にて30℃で120分処理して部分的に切断した。
上記(2)で得たプラスミドpAJ1844DNA（2.0μ
ｇ）も制限酵素PstI5.0ユニツトにて30℃で120
分処理して切断した。切断したこれらのDNA
を混合し、T4フアージDNAリガーゼ0.2ユニ
ツトを用いて22℃で15時間処理して連結し、組
換えDNAの混合物を得た。 (4) ホモセリン栄養要求株であるブレビバクテリ
ウム・ラクトフアーメンタムAJ12019（NRRL
Ｂ−15346）を５mlのCMG培地に培養し、その
初期対数増殖期に培養液にペニシリンG0.6ユ
ニツト／mlを加え、さらに培養を1.5時間続け
た。細胞を遠心分離により集め、シユークロー
ス0.5モル、マレイン酸20ミリモル、MgCl220
ミリモル及び3.5％「ペンアツセイ ブロス」
（デイフコ社製）（PH6.5）からなるSMMP培地
0.5mlを用いて洗浄した。この細胞をSMMP培
地中でリゾチーム10mg／mlにて30℃で20時間処
理し（次いで6000×ｇ、10分間の遠心分離）、
SMMP培地にて洗浄し、SMMP培地0.5mlに再
懸濁することによりプロトプラストを調製し
た。 このようにして得たプロトプラストを上記の
組換え体DNA10μと混合し、混合物に30％
ポリエチレングリコールを加え、室温で２分間
保持してDNAをプロトプラストに導入した。
SMMP培地１mlで洗浄した後、プロトプラス
トをSMMP培地１mlに再懸濁し、30℃で３時
間培養した。 得られた培養液を「プロトプラスト再生培
地」（PH7.0、蒸留水１当りトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン12ｇ、KCl0.5ｇ、グ
ルコース10ｇ、MgCl2・6H2O8.1ｇ、CaCl2・
2H2O2.2ｇ、ペプトン４ｇ、酵母エキス４ｇ、
「カザミノ酸」（デイフコ社製）１ｇ、
K2HPO40.2ｇ、コハク酸ナトリウム135ｇ、寒
天18ｇおよびクロラムフエニコール3μｇ／ml
を含む）上に展開した。30℃で培養して10日後
に現れた５個のコロニーの中から形質転換株
AJ12020（FERM BP−269）をさらに実験する
ための材料として選択した。 受容株AJ12019はその生育にＬ−ホモセリン
を要求し、一方形質転換株AJ12020はその生育
にＬ−ホモセリンを必要としない。この受容株
はクロラムフエニコール3μｇ／mlを補充した
CMG培地には生育しないが、形質転換株はク
ロラムフエニコール３あるいは10μｇ／mlを加
えたCMG培地に生育できた。受容株はプラス
ミドを持つていないが、形質転換株はpAJ210
と呼ばれるプラスミドを有していた。 プラスミドpAJ210のDNAはAJ12020の細胞
溶解物から以下の方法により分離した。 CMG培地で培養後得たAJ12020の細胞を常
法（田中ら、J.Bacteriol.、121、354（1979））
により溶菌し、溶解物をアガロースゲルに支持
して電気泳動（Sharpら、Biochemistry、12、
3055（1973））を行ない、このプラスミドの分子
量が7.6Mdであると決定した。 これらの事実は染色体DNAの2.24Mdの断片
はプラスミドpAJ1844のPstI切断個所にクロー
ンされたことを示している。この2.24Md断片
はさらにPstIで切断され、この切断により
1.1Md、0.7Md及び0.44Mdの３断片が得られ、
2.24Mdの断片は２個のPstI切断個所を有する
ことを示している。 (5) 形質転換株によるＬ−スレオニン生産 第１表はAJ12020によるＬ−スレオニンの発
酵生産の実験結果を示している。 発酵培地PM−１は蒸留水１当りグルコー
ス100ｇ、（NH4）2SO430ｇ、KH2PO41ｇ、
MgSO4・7H2O 0.4ｇ「味液」（大豆蛋白の加
水分解物）10ml、ビオチン200μｇ、サイアミ
ン塩酸塩300μｇ、CaCO850ｇ、FeSO4・
7H2O10mg及びMnSO4・5H2O10mgを含んでい
る。この培地のPHをKOHで7.0に調整した。こ
の培地のバツチ20mlを500ml容フラスコに入れ、
AJ12020を接種し、30℃で７時間振とうした。
得られたＬ−スレオニン量をロイコノストツ
ク・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）によるミクロバイオアツセイ
で測定した。受容株AJ12019を、前記培地にＬ
−ホモセリン800mgを加えたこと以外は同様の
方法により培養した。 第１表 菌株 Ｌ−スレオニン生産量（ｇ／） AJ12020 1.10 AJ12019 0.001 実施例 ２ ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ11188（HDase+）を実施例１(4)で得たプラスミ
ドpAJ210DNA形質転換し、実施例１(4)に示した
方法と同様の方法によりクロラムフエニコール耐
性形質転換株AJ12021（FERM BP−270）を選抜
した。 これらの形質転換株はpAJ210と同じ分子量を
もつハーバープラスミドであることが確認され
た。 培地（PM−１）にＬ−イソロイシン300mg及
びＬ−ロイシン300mgを加えたこと以外は実施例
１(5)と同様の方法により該形質転換株を培養して
Ｌ−スレオニンを生産した。 第２表はAJ12021によるＬ−スレオニンの発酵
生産の結果を示している。なお、AJ11188を用い
た場合の結果も併記した。 第２表 菌株 Ｌ−スレオニン生産量（ｇ／） AJ12021 17.80 AJ11188 10.90 形質転換株AJ12021のHDase活性を宮島らの方
法（J.Biochemistry、68、311（1970））により測
定した。その結果、AJ12021のHDase活性は
AJ11188のHDase活性の約２倍であつた。 実施例 ３ コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13287（ホモセリン栄養素要求変異株）を実
施例１(4)で得たプラスミドpAJ210 DNAで形質
転換し、実施例１(4)と同様の方法によりクロラム
フエニコール耐性のプロトトロフ型形質転換株
SR8301（NRRLB−15348）を選抜した。この形
質転換株を培養し、生産されたＬ−スレオニン量
をペーパークロマトグラフイーとニンヒドリン反
応により測定した。 第３表はSR8301によるＬ−スレオニン生産の
結果を示している。また、培地にＬ−ホモセリン
800mg／を加えて受容株ATCC13287を培養し
た。 第３表 Ｌ−スレオニン生産量菌株 （ｇ／） SR8301（形質転換株） 1.5 ATCC13287（受容株） 0.0 実施例 ４ 実施例１(4)で得た形質転換株ブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムAJ12020はＬ−イソロ
イシンを生産した。第４表は実施例１(5)で得た培
養液の分析結果を示している。 生産されたＬ−イソロイシン量をロイコノスト
ツク・メセンテロイデスによるミクロバイオアツ
セイで測定した。 第４表 Ｌ−イソロイシン菌株
生産量（ｇ／） AJ12020（形質転換株）
3.10 AJ12019（受容株）
0.01 AJ11188（ドナー）
0.00 実施例 ５ ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12028（FERM BP−272）はＬ−イソロイシン
生産菌であり、Ｓ−（２−アミノエチル）−システ
イン、AHV及びβ−ヒドロキシロイシン耐性
で、ロイシン栄養要求株として選抜されたもので
ある。この菌株を実施例１(4)で得たプラスミド
pAJ210 DNAで形質転換し、実施例１(4)と同様
の方法によりクロラムフエニコール耐性形質転換
株AJ12027（FERM BP−271）を選抜した。 培地にＬ−ロイシン300mg／mlを加えたこと以
外は実施例１(5)の方法により形質転換株を培養
し、生産されたＬ−イソロイシン量を実施例４と
同様の方法により測定した。 第５表菌株 Ｌ−イソロシン生産量（ｇ／） AJ12027 10.20 AJ12028 7.60 AJ11188 0.00 実施例 ６ 第６表は実施例３で得たコリネバクテリウム・
グルタミクムSR8301（NRRL15348）及び受容株
としてATCC13287によるＬ−イソロイシンの発
酵生産の結果を示すものである。Ｌ−イソロイシ
ンの生産量はペーパークロマトグラフイーにより
測定した。 第６表菌株 Ｌ−イソロイシン生産量(ｇ/) NRRL15348 1.0 ATCC13287 0.0
イソロイシン
上記生合成経路にはリジンの生合成経路の部分
も示されている。スレオニンとイソロイシンへの
経路の第一の枝はアスパルテートセミアルデヒド
につながつており、これら２種のアミノ酸に導く
酵素はホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下、
HDaseと略記する。）であり、一方リジンに導く
酵素はジヒドロジピコリネートシンセターゼ（以
下、DHDPシンセターゼと略記する。）である。 コリネバクテリウム属の変異株における
HDase活性とAHV耐性との関係は、椎尾ら、生
化学会誌、68、859（1970）；中森ら、農芸化学会
誌、37、653（1973）及び戸坂ら、同誌、43、265
（1979）に開示されている。 また、リジンの生合成経路の数種の遺伝子を含
むハイブリツドプラスミドを有するエシエリヒ
ア・コリ株が最近開示されたことも注目すべきで
ある。また、リジンのオーバープロデユーサー
（TOC R21）が形質転換され、リジンの合成は
種種の菌株で研究された（Le−Reverendら、
European Journal of Applied Microbiology
and Biotechnology、15、227〜231（1982）及び
フランス特許公告第2511032号明細書参照）。これ
ら文献から明らかなように、dap Ａ遺伝子
（DHDPシンセターゼをコードしている）を含む
プラスミドのみがリジンの生産を増加する。この
反応はリジンのオーバープロデユーサー（アスパ
ラギン酸キナーゼ反応を変える突然変異を有す
る）における限られた生合成の段階である。この
遺伝子の増幅方法は代謝産物を過剰生産する微生
物の改質に利用しうると著者らは述べている。し
かしながら、これら文献にはコリネ型細菌あるい
はリジン以外の生成物に対して該作用を拡張しう
ることを示唆する記載は全くない。したがつて、
コリネ型細菌によりＬ−スレオニン及びＬ−イソ
ロイシンを発酵生産する改良された、かつ能率的
方法についての要求は依然として存在している。 本発明者らは、HDaseに対する遺伝情報がコ
リネ型細菌において複製可能な特定のベクターに
結合して生成した該遺伝情報を有するハイブリツ
ドベクターが特定のコリネ型細菌ホストまたは受
容株中に複製されると、このようにして形質転換
されたコリネ型細菌はＬ−スレオニン及び／又は
Ｌ−イソロイシンのすぐれた生産菌株であること
を見出した。本発明ではコリネ型細菌のうちＬ−
スレオニン及び／又はＬ−チソロイシンを多量に
生産するブレビバクテリウム属及びコリネバクテ
リウム属の多くの菌株がホストとして利用できる
点が興味深い。 （発明の構成） 本発明はブレビバクテリウム属由来のホモセリ
ンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挿入さ
れていてウブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属のコリネ型細菌体内で増殖できるプラ
スミドベクターを有し、かつＬ−スレオニン及
び／又はＬ−イソロイシン生産能を有するブレビ
バクテリウム属又はコリネバクテリウ属のコリネ
型細菌を培養し、培地中に生成蓄積されたＬ−ス
レオニン及び／又はＬ−イソロイシンを採取する
ことを特徴とするＬ−スレオニン及び／又はＬ−
イソロイシンの製造法を提供するものである。 前記生合成経路において、HDaseはメチオニ
ンに向う経路とスレオニン及びイソロイシンに向
う経路の間の分岐点に存在している。HDaseコ
ードの十分な遺伝情報を含むDNAは適当なDNA
ドナーから得ることができる。このドナーは
HDaseにおいて変異したものであつてもHDase
において野生のものであつてもよい。好ましく
は、このドナーはコリネホルム細菌であり、より
好ましくはブレビバクテリウム・ラクトフアーメ
ンタム（Brevibacterium lactofermentum）で
ある。最も好適なドナーはＬ−スレオニンによる
フイードバツク阻害に対して感応しない（耐性
の）HDaseを有する。かかるドナーは通常、
AHV耐性である。HDaseコードの遺伝情報はド
ナーからのDNAの部分切断、特定プラスミドへ
の遺伝子配列の導入、HDaseを欠失したコリネ
型細菌及び引続きホモセリン栄養要求株
（HDase-）のその結果得られる複数の組換え型
DNAの混合物による形質転換ならびにホモセリ
ンを要求しない形質転換株の分離によつて得るこ
とができる。 特に、遺伝子配列を含むHDase遺伝情報はブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ11188（FERM Ｐ−4190）から得られ、この菌
株ではHDaseはＬ−スレオニンによるフイード
バツク阻害に対して耐性である。HDase遺伝子
からなる遺伝子情報は分子量が2.24メガダルトン
（Md）で、２個のPstI制限エンドヌクレアーゼ切
断個所を持ち、２個のPstの切断個所によりフラ
ンクされているDNA断片中に見出すことができ
る。このDNA断片は３つの部分を有しており、
これら３つの部分のサイズ（２個のPstI切断個所
によりフランクされ、分割されている）は
0.7Md、0.44Md及び1.10Mdである。 形質転換に有用なホストまたは受容株は、いわ
ゆるコリネ型細菌である。これら細菌は好気性、
グラム陽性桿菌であり、非抗酸性であり、バージ
ーズ・マニユアル・オブ・デイターミナテイブ・
バクテリオロジー、第８版、599頁（1974）に記
載されている。本発明におけるホストとして有用
なコリネ型細菌の野生株の例は次の通りである。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
（Brevibacterium divaricatum） ATCC14020 ブレビバクテリウム・サツカロリチクム（B.
saccharolyticum） ATCC14066 ブレビバクテリウム・イマリオフイルム（B.
immariophilum） ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
（B.lactofermentum） ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム（B.roseum）
ATCC13825 ブレビバクテリウム・フラバム（B.flavum）
ATCC13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（B.
thiogenitalis） ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
（Corynebacterium acetoacidophilum）
ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（C.
acetoglutamicum） ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ（C.callunae）
ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム（C.
glutamicum） ATCC13032、13060 コリネバクテリウム・リリウム（C.lilium）
ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ（C.
melassecola） ATCC17965 他 コリネ型細菌をホストとして使用するに先立
ち、既知の方法で制限酵素活性を低下せしめる変
異を施せば好適な結果が得られる。 コリネ型細菌がHDase挿入を有するベクター
を用いて形質転換される際に該コリネ型細菌は外
来遺伝子によつて保持された遺伝情報を発現す
る。 特に興味深いホストは、HDaseの欠損株また
はその非欠損株である。後者の場合、ホスト自体
がＬ−スレオニンとＬ−イソロイシンを生産す
る。とりわけ、マルチコピープラスミド中に
HDaseをコードする遺伝子を挿入することによ
りこの酵素の遺伝子コピーの数が著しく増加し、
また最終アミノ酸類の生産が非常に増大する。事
実、HDase非欠損株性（HDase+）ホスト中に
HDaseを有するマルチコピープラスミドを使用
することにより非常に高濃度のＬ−スレオニン及
びＬ−イソロイシンが得られる。HDaseの欠損
株は通常、HDase遺伝子を保有するベクターの
選択及び分離のためのホストとして用いられる。
このようにして分離されたベクターをHDaseの
非欠損株の形質転換に使用すると良い結果が得ら
れる。 アスパラギン酸キナーゼ野生ホストまたはアス
パラギン酸キナーゼ反応を変えることにより変異
させたホストのいずれかを使用することもまた興
味深いことである。ホストがスレオニン及び／又
はイソロイシンを過剰生産するようにアスパラギ
ン酸キナーゼ反応を変異されているホストにおい
ては、該アスパラギン酸キナーゼ反応は最早や速
度に制限がない。したがつて、最大の効果はこの
ように変異されたホストを用いることにより得ら
れる。 さらに、AHV耐性のないホストは形質転換に
利用することができる。Ｌ−メチオニン、Ｌ−リ
ジン及び／またはＬ−ロイシンの欠損株は好適な
ホストである。最も好ましいホストはAHV耐性
を有し、かつＬ−スレオニンによるフイードバツ
ク阻害に対してHDase耐性を有するものである。 コリネ型細菌において複製可能な、どのような
ベクターもホストへHDaseを持込み、その形質
転換に使用するために利用することができる。プ
ラスミド、フアージ、その他のベクター等の種種
のベクターを利用することができ、特に重要なも
のは米国特許願第386980号明細書（1982年６月10
日出願）に記載されている複合プラスミドであ
る。これらのプラスミドは、コリネ型細菌のグル
タミン酸生産菌中で生殖可能なプラスミドａから
得られるドライブユニツト領域Ａ及びエシエリヒ
ア・コリまたはバチルス・ズブチリス中で生殖可
能であり、かつ少なくとも薬物耐性を示す領域を
有するプラスミドｂから得られる１個または複数
の遺伝子断片Ｂからなつている。遺伝子断片がさ
らにプラスミドｂのドライブユニツト領域を保持
している場合、複合プラスミドはエシエリヒア・
コリまたはバチルス・ズブチリス中で生殖可能に
なり、かくして該複合プラスミドをエシエリヒ
ア・コリまたはバチルス・ズブチリス中で篩別ま
たは増幅することができる。 ここで「薬物耐性」とはホスト細胞の生育を阻
止する抗生物質のような薬剤に対する耐性を意味
する。このような抗生物質の例としてはペニシリ
ン、カナマイシン、クロラムフエニコール、エリ
スロマイシン、アクチノマイシン等がある。 コリネ型細菌中で生殖可能なマルチコピープラ
スミドａの具体例は前述の米国特許願第380980号
明細書に開示されており、かつブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムATCC13869から分離
され、分子量3.0MdのpAM330（第１図に示した
制限地図参照）、ブレビバクテリウム・フラバム
B107FERM Ｐ−54から分離され、分子量3.0Md
のpAM286（第２図に示した制限地図参照）及び
ブレビバクテリウム・グルタミクムATCC13058
から分離され、分子量1.8MdのpHM1519（第３図
に示した制限地図参照）が含まれる。 エシエリヒア・コリ中で生殖可能なプラスミド
ｂはマルチコピープラスミドであり、薬物耐性の
遺伝情報を有している。これらには例えば
pAC105、pBR322、pBR324、pBR325等がある。
バチルス・ズブチリス中で生殖可能で、薬物耐性
の遺伝情報を有するプラスミドｂは好ましくはマ
ルチコピーであり、pT127、pC194、pC221、
pC223、pUB110等が含まれる。 これらプラスミドａ及びｂから複合プラスミド
を作るには、制限酵素による切断、リガーゼによ
る連結のような定法を用いることができる。 連結反応後、所望の複合プラスミドをコリネ型
細菌中に生殖可能なプラスミドを分離することに
より篩別し、これを用いてコリネ型細菌を薬物耐
性に形質転換することができる。プラスミドａか
ら得られるドライブユニツト領域とプラスミドｂ
から得られる他のドライブユニツト領域を有し、
プラスミドｂの薬物耐性遺伝子を有する複合プラ
スミドは、コリネ型細菌及びエシエリヒア・コリ
またはバチルス・ズブチリス中に生殖可能であ
り、(1)コリネ型細菌または(2)エシエリヒア・コリ
（プラスミドがエシエリヒア・コリ中に生殖可能
なものを使用する場合）またはバチルス・ズブチ
リス（プラスミドがバチルス・ズブチリス中に生
殖可能なものを使用する場合）を形質転換するこ
とが可能であり、かつ薬物耐性を有するプラスミ
ド類の中に見出すことができる。 本発明に有用な複合プラスミドの例の中には適
当な国際寄託機関に寄託されている下記のホスト
中に存在するプラスミドがある。 pAJ655：エシエリヒア・コリAJ11882、FERM
BP−136（FERM Ｐ−6517） コリネバクテリウム・グルタミクムSR8201、
ATCC39135（第４図に示した制限地図参照） pAJ611：エシエリヒア・コリAJ11884、FERM
BP−138（FERM Ｐ−6519）（第５図に示した
制限地図参照） pAJ1844：エシエリヒア・コリAJ11883、FERM
BP−137（FERM Ｐ−6518） コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC39136（第６図に示した制限地図参照） pAJ440：バチルス・ズブチリスAJ11901、
FERM BP−140（第７図に示した制限地図参
照） pAJ3148：コリネバクテリウム・グルタミクム
SR8203、ATCC39137（第８図に示した制限地
図参照） 複合プラスミドは寄託微生物の細胞から、リゾ
チウム及びSDSを用いて対数増殖期後期に予め集
めた細胞を溶菌し、溶菌物から遠心分離（30000
×ｇ）して得た上澄液にポリエチレングリコール
を添加し、沈でんしたDNAをセシウムクロライ
ド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離
により分画して精製することにより得ることがで
きる。この複合プラスミドは寄託微生物から損傷
を与えずに自然消失、すなわち「キユアリング」
（バクテリオロジカル レビユーズ、36、361〜
405（1972））によりホスト菌株を得るために追い
出すことができる。 適当な複製ベクターの１つにHDase遺伝子を
挿入するには、適当な制限エンドヌクレアーゼに
より複製ベクターを切断し、常法によりその中へ
適当な遺伝子配列を連結することによつて行なう
ことができる。 HDase遺伝子を有するベクターをコリネ型細
菌のホストに取込むには、DNA受容株の細菌を
塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増加
すること（Mandell、Ｍらによるエシエリヒア・
コリＫ−12に関する報告、ジヤーナル、・オブ・
モレキユラー・バイオロジー、53、159（1970））
または細胞がDNAを取込めるようになる特定の
生長段階で取込ませること（Duncan、C.H.らに
よるバチルス・ズブチリスに関する報告、ジー
ン、153（1977））によつて行なうことができる。
バチルス・ズブチリス、アクチノミセス及び酵母
について知られており、Chang、S.ら、Molec.
Gen.Genet.、168、111（1979）、Bibbら、
Nature、274、398（1978）、Hinnen、Ａら、
PNAS USA、75、1929（1978）に報告されてい
るように、プラスミドDNAを容易に取込むDNA
受容株のプロトプラストあるいはスフエロプラス
トを形成することによりプラスミドを該受容株に
取込ませることもできる。 複合プラスミドはコリネ型細菌を薬物耐性菌に
形質転換するので、HDase遺伝子を挿入したプ
ラスミドを含む形質転換株はその薬物耐性を試験
することによつて容易に同定することができる。
HDaseを挿入したベクターを有する形質転換株
は生育のためのホモセリン要求性を試験すること
によりホスト細胞から容易に区別することができ
るので、遺伝標識を持たないベクターを組換え
DNAの製造に用いる場合、HDaseの欠損株はホ
ストとして好適である。 複合プラスミドに挿入されたHDase遺伝子は、
必要に応じて常法により他のベクターへ容易に転
移することができる。 このようにして得られたＬ−スレオニン及び／
又はＬ−イソロイシン生産菌を培養する方法は常
法で良く、既知のスレオニン及び／又はイソロイ
シン生産菌の培養方法と同様である。培地は炭素
源、窒素源および有機イオン、さらに必要に応じ
てビタミン類、アミノ酸類などの有機栄養源の少
量を含有する通常の培地を使用することができ
る。適当な炭素源の例としてはグルコース、シユ
ークロース、ラクトース、でん粉加水分解物、廃
糖蜜などがある。窒素源としてはガス状アンモニ
ア、液状アンモニア、アンモニウム塩及び他の窒
素含有物質を用いることができる。 HDase遺伝子を有するベクターを含む形質転
換された微生物の培養は好気的条件下に行ない、
培養液のPHと温度を適当な水準に調整し、Ｌ−ス
レオニン及び／又はＬ−イソロイシンの生成が止
むまで培養を続ける。 培養液に蓄積されたアミノ酸は常法によつて回
収することができる。 （本発明の効果） 本発明の方法によれば、ブレビバクテリウムや
コリネバクテリウムの人工変異株を使用する既知
の方法よりも高い収率でＬ−スレオニン及び／又
はＬ−イソロイシンを製造することができる。 （実施例） 次に、本発明を実施例により説明するが、本発
明はこれらにより制限されるものではない。 実施例 １ (1) Ｌ−スレオニンによるフイードバツク阻害に
対して耐性のHDase（AHV耐性）を有するＬ
−スレオニン生産菌、ブレビバクテリウム・ラ
クトフアーメンタムAJ11188（FERM Ｐ−
4190）（戸坂ら、Agric.Biol.Chem.、43、265
（1979））をDNAドナーとして使用した。 AJ11188菌を１のCMG培地（ペプトン10
ｇ、酵母エキス10ｇ、NaCl5ｇ、グルコース５
ｇ、蒸留水1000ml）（PH7.0、NaOHで調整）で
30℃にて10時間培養し、対数増殖期に遠心分離
にて細胞を集めた。この細胞から常法のフエノ
ール法によりDNA約3.6mgを抽出した。 (2) プラスミドpAJ1844は、プラスミド
pHM1519とpBR325から作られた複合プラス
ミドである。プラスミドpHM1519及び
pAJ1844の制限地図は米国特許願第386980号明
細書に示されている。 プラスミドpAJ1844は下記の方法にて調製し
た。 pAJ1844を保有するエシエリヒア・コリ
AJ11883の細胞を対数増殖期に遠心分離により
集め、リゾチウム及びSDSにより溶菌した。溶
解物の上清からエタノール沈でんによつて
pAJ1844のDNA約80μｇを得た。 (3) 染色体DNA試料4μｇを制限酵素PstI（ボーリ
ンガー・マンハイムより購入）0.124ユニツト
にて30℃で120分処理して部分的に切断した。
上記(2)で得たプラスミドpAJ1844DNA（2.0μ
ｇ）も制限酵素PstI5.0ユニツトにて30℃で120
分処理して切断した。切断したこれらのDNA
を混合し、T4フアージDNAリガーゼ0.2ユニ
ツトを用いて22℃で15時間処理して連結し、組
換えDNAの混合物を得た。 (4) ホモセリン栄養要求株であるブレビバクテリ
ウム・ラクトフアーメンタムAJ12019（NRRL
Ｂ−15346）を５mlのCMG培地に培養し、その
初期対数増殖期に培養液にペニシリンG0.6ユ
ニツト／mlを加え、さらに培養を1.5時間続け
た。細胞を遠心分離により集め、シユークロー
ス0.5モル、マレイン酸20ミリモル、MgCl220
ミリモル及び3.5％「ペンアツセイ ブロス」
（デイフコ社製）（PH6.5）からなるSMMP培地
0.5mlを用いて洗浄した。この細胞をSMMP培
地中でリゾチーム10mg／mlにて30℃で20時間処
理し（次いで6000×ｇ、10分間の遠心分離）、
SMMP培地にて洗浄し、SMMP培地0.5mlに再
懸濁することによりプロトプラストを調製し
た。 このようにして得たプロトプラストを上記の
組換え体DNA10μと混合し、混合物に30％
ポリエチレングリコールを加え、室温で２分間
保持してDNAをプロトプラストに導入した。
SMMP培地１mlで洗浄した後、プロトプラス
トをSMMP培地１mlに再懸濁し、30℃で３時
間培養した。 得られた培養液を「プロトプラスト再生培
地」（PH7.0、蒸留水１当りトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン12ｇ、KCl0.5ｇ、グ
ルコース10ｇ、MgCl2・6H2O8.1ｇ、CaCl2・
2H2O2.2ｇ、ペプトン４ｇ、酵母エキス４ｇ、
「カザミノ酸」（デイフコ社製）１ｇ、
K2HPO40.2ｇ、コハク酸ナトリウム135ｇ、寒
天18ｇおよびクロラムフエニコール3μｇ／ml
を含む）上に展開した。30℃で培養して10日後
に現れた５個のコロニーの中から形質転換株
AJ12020（FERM BP−269）をさらに実験する
ための材料として選択した。 受容株AJ12019はその生育にＬ−ホモセリン
を要求し、一方形質転換株AJ12020はその生育
にＬ−ホモセリンを必要としない。この受容株
はクロラムフエニコール3μｇ／mlを補充した
CMG培地には生育しないが、形質転換株はク
ロラムフエニコール３あるいは10μｇ／mlを加
えたCMG培地に生育できた。受容株はプラス
ミドを持つていないが、形質転換株はpAJ210
と呼ばれるプラスミドを有していた。 プラスミドpAJ210のDNAはAJ12020の細胞
溶解物から以下の方法により分離した。 CMG培地で培養後得たAJ12020の細胞を常
法（田中ら、J.Bacteriol.、121、354（1979））
により溶菌し、溶解物をアガロースゲルに支持
して電気泳動（Sharpら、Biochemistry、12、
3055（1973））を行ない、このプラスミドの分子
量が7.6Mdであると決定した。 これらの事実は染色体DNAの2.24Mdの断片
はプラスミドpAJ1844のPstI切断個所にクロー
ンされたことを示している。この2.24Md断片
はさらにPstIで切断され、この切断により
1.1Md、0.7Md及び0.44Mdの３断片が得られ、
2.24Mdの断片は２個のPstI切断個所を有する
ことを示している。 (5) 形質転換株によるＬ−スレオニン生産 第１表はAJ12020によるＬ−スレオニンの発
酵生産の実験結果を示している。 発酵培地PM−１は蒸留水１当りグルコー
ス100ｇ、（NH4）2SO430ｇ、KH2PO41ｇ、
MgSO4・7H2O 0.4ｇ「味液」（大豆蛋白の加
水分解物）10ml、ビオチン200μｇ、サイアミ
ン塩酸塩300μｇ、CaCO850ｇ、FeSO4・
7H2O10mg及びMnSO4・5H2O10mgを含んでい
る。この培地のPHをKOHで7.0に調整した。こ
の培地のバツチ20mlを500ml容フラスコに入れ、
AJ12020を接種し、30℃で７時間振とうした。
得られたＬ−スレオニン量をロイコノストツ
ク・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）によるミクロバイオアツセイ
で測定した。受容株AJ12019を、前記培地にＬ
−ホモセリン800mgを加えたこと以外は同様の
方法により培養した。 第１表 菌株 Ｌ−スレオニン生産量（ｇ／） AJ12020 1.10 AJ12019 0.001 実施例 ２ ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ11188（HDase+）を実施例１(4)で得たプラスミ
ドpAJ210DNA形質転換し、実施例１(4)に示した
方法と同様の方法によりクロラムフエニコール耐
性形質転換株AJ12021（FERM BP−270）を選抜
した。 これらの形質転換株はpAJ210と同じ分子量を
もつハーバープラスミドであることが確認され
た。 培地（PM−１）にＬ−イソロイシン300mg及
びＬ−ロイシン300mgを加えたこと以外は実施例
１(5)と同様の方法により該形質転換株を培養して
Ｌ−スレオニンを生産した。 第２表はAJ12021によるＬ−スレオニンの発酵
生産の結果を示している。なお、AJ11188を用い
た場合の結果も併記した。 第２表 菌株 Ｌ−スレオニン生産量（ｇ／） AJ12021 17.80 AJ11188 10.90 形質転換株AJ12021のHDase活性を宮島らの方
法（J.Biochemistry、68、311（1970））により測
定した。その結果、AJ12021のHDase活性は
AJ11188のHDase活性の約２倍であつた。 実施例 ３ コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13287（ホモセリン栄養素要求変異株）を実
施例１(4)で得たプラスミドpAJ210 DNAで形質
転換し、実施例１(4)と同様の方法によりクロラム
フエニコール耐性のプロトトロフ型形質転換株
SR8301（NRRLB−15348）を選抜した。この形
質転換株を培養し、生産されたＬ−スレオニン量
をペーパークロマトグラフイーとニンヒドリン反
応により測定した。 第３表はSR8301によるＬ−スレオニン生産の
結果を示している。また、培地にＬ−ホモセリン
800mg／を加えて受容株ATCC13287を培養し
た。 第３表 Ｌ−スレオニン生産量菌株 （ｇ／） SR8301（形質転換株） 1.5 ATCC13287（受容株） 0.0 実施例 ４ 実施例１(4)で得た形質転換株ブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムAJ12020はＬ−イソロ
イシンを生産した。第４表は実施例１(5)で得た培
養液の分析結果を示している。 生産されたＬ−イソロイシン量をロイコノスト
ツク・メセンテロイデスによるミクロバイオアツ
セイで測定した。 第４表 Ｌ−イソロイシン菌株
生産量（ｇ／） AJ12020（形質転換株）
3.10 AJ12019（受容株）
0.01 AJ11188（ドナー）
0.00 実施例 ５ ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12028（FERM BP−272）はＬ−イソロイシン
生産菌であり、Ｓ−（２−アミノエチル）−システ
イン、AHV及びβ−ヒドロキシロイシン耐性
で、ロイシン栄養要求株として選抜されたもので
ある。この菌株を実施例１(4)で得たプラスミド
pAJ210 DNAで形質転換し、実施例１(4)と同様
の方法によりクロラムフエニコール耐性形質転換
株AJ12027（FERM BP−271）を選抜した。 培地にＬ−ロイシン300mg／mlを加えたこと以
外は実施例１(5)の方法により形質転換株を培養
し、生産されたＬ−イソロイシン量を実施例４と
同様の方法により測定した。 第５表菌株 Ｌ−イソロシン生産量（ｇ／） AJ12027 10.20 AJ12028 7.60 AJ11188 0.00 実施例 ６ 第６表は実施例３で得たコリネバクテリウム・
グルタミクムSR8301（NRRL15348）及び受容株
としてATCC13287によるＬ−イソロイシンの発
酵生産の結果を示すものである。Ｌ−イソロイシ
ンの生産量はペーパークロマトグラフイーにより
測定した。 第６表菌株 Ｌ−イソロイシン生産量(ｇ/) NRRL15348 1.0 ATCC13287 0.0
第１図はプラスミドpAM330の制限地図、第２
図はプラスミドpAM286の制限地図、第３図は
pHM1519の制限地図、第４図は複合プラスミド
pAJ655の制限地図、第５図は複合プラスミド
pAJ611の制限地図、第６図は複合プラスミド
pAJ1844の制限地図、第７図は複合プラスミド
pAJ440の制限地図、第８図は複合プラスミド
pAJ3148の制限地図である。
図はプラスミドpAM286の制限地図、第３図は
pHM1519の制限地図、第４図は複合プラスミド
pAJ655の制限地図、第５図は複合プラスミド
pAJ611の制限地図、第６図は複合プラスミド
pAJ1844の制限地図、第７図は複合プラスミド
pAJ440の制限地図、第８図は複合プラスミド
pAJ3148の制限地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ブレビバクテリウム属由来のホモセリンデヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子が挿入されてい
てブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム
属のコリネ型細菌菌体内で増殖するプラスミドベ
クターを有し、かつＬ−スレオニン及び／又はＬ
−イソロイシン生産能を有するブレビバクテリウ
ム属又はコリネバクテリウム属のコリネ型細菌を
培養し、培地中に生成蓄積されたＬ−スレオニン
及び／又はＬ−イソロイシンを採取することを特
徴とする発酵法によるＬ−スレオニン及び／又は
Ｌ−イソロイシンの製造法。 ２ ブレビバクテリウム属由来のホモセリンデヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子が、分子量
2.24Mdであり、PstIによつて２個所において切
断され、PstIにより切断したときに0.7Md、
0.44Md及び1.10Mdの断片を生じるものである特
許請求の範囲第１項記載の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/504,471 US4601983A (en) | 1983-06-15 | 1983-06-15 | Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-threonine and L-isoleucine |
| US504471 | 1983-06-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6012995A JPS6012995A (ja) | 1985-01-23 |
| JPH0547196B2 true JPH0547196B2 (ja) | 1993-07-16 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59113217A Granted JPS6012995A (ja) | 1983-06-15 | 1984-06-04 | 発酵法によるｌ―スレオニン及び／又はｌ―イソロイシンの製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4601983A (ja) |
| EP (1) | EP0131171B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6012995A (ja) |
| DE (1) | DE3466894D1 (ja) |
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| JPS6062982A (ja) * | 1983-09-14 | 1985-04-11 | Ajinomoto Co Inc | 組換えｄνａ，該組換えｄνａを有する細菌及び該細菌を用いるｌ−スレオニン又はｌ−イソロイシンの製造法 |
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