JPH05503081A - タンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の精製方法 発明の技術分野 本発明は、実質的に純粋な状態においてタンパク質又はポリペプチドを回収する イムノアフィニティークロマトグラフィ一方法に関する。

発明の背景 微生物又は細胞系の培養物からのタンパク質又はポリペプチドの生産において、 この最終生産工程は対象の生成物の回収及び任意的にその濃縮である。これらの 細胞が増殖され、且つ分泌タンパク質及び特に対象の細胞内タンパク質を含んで いる細胞溶解物を含む培養培地は、他の夾雑物、例えば培地成分、核酸等とは別 に多かれ少なかれ細胞により生産されるその他のタンパク質も含む、従って精製 タンパク質生成物を得るためには、この対象のタンパク質を、該タンパク質を含 む粗材料中のその他のタンパク質及びポリペプチドから分離せしめることが必要 とされる。

このような分離を確実にする広く実用されている一つの方法は、不溶性の固定化 リガンドと可溶性タンパク質との特異的な相互作用を一般に包含するアフィニテ ィークロマトグラフィーである（Ａ、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅとＲ，Ｔｈｏｒｐｅ、 　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　１ｎＰｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ｂｌａｃｋ ｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

１９８７年、頁２０７−２４０を参照のこと）。このタンパク質はこのリガンド と相互作用することによって一時的に不溶性となり、そして可溶性の夾雑物が溶 出されている間にこのリガンドの固定化されている固相支持体上に保持され続け る。このリガンドへのこのタンパク質の結合は中性のｐＨの水性緩衝液中におい て通常起こる。このタンパク質をその後、溶出条件の変化、例えばｐＨを急に上 げること、温度を上げること、又は変性剤、有機溶媒もしくは塩の非生理学的な 高濃度による溶出により固定化リガンドから遊離せしめる。以上の処理の結果と して、このタンパク質はしばしば変性状態において回収され、従ってその生のコ ンホメーションにおいて得られるようにするために更なる処理にかける必要があ りうる。

通常利用されるリガンドの例は抗体、特により選択的となるように作られ且つ大 部分のその他の知られているリガンドよりも強く結合しうるモノクローナル抗体 であり、従ってこれは溶出タンパク質生成物のより高い純度をもたらすために好 適である。しかしながら十分な量において抗体を得るためには、精製すべきタン パク質は通常免疫処理のために実質的に純粋な状態において入手されるべきであ る。従ってこの問題を解決するための手法は、タンパク質回収の問題がその他の 手段によって既に解決されていることを含んでいる。

多数のタンパク質のアミノ酸配列、即ち一次構造はそれに対応する遺伝子のＤＮ Ａ配列からの推定によってまず得られる。この工程は通常このタンパク質生成物 自体が単離される前に行なわれる。タンパク質のアミノ酸配列を知ることは、そ のペプチドフラグメントの合成を例えば固相ペプチド合成技術によって可能とす る。従ってこのようなペプチドフラグメントは、この精製すべきタンパク質に対 する抗体を発生せしめるために利用されうる。しかしながら、これによって作製 される抗体はそれらを発生せしめた合成ペプチドフラグメントには反応性ではあ るが、このペプチドがフラグメントを構成する生のタンパク質とは反応性でない ことがしばしば見い出せる。この現象は立体障害又は合成ペプチドと生のタンパ ク質とのコンホメーションにおける相違に起因するものと考えられる。即ち、ペ プチドフラグメントはその側鎖が暴露されている高い柔軟性の構造を有するが、 しかるにタンパク質全体においてはこれと同一のフラグメントは柔軟性が低く、 そしてこのタンパク質の内部にかくれて多数の側鎖、特に疎水性側鎖を有する。

これが正しい説明であるか否かにかかわらず、いずれにせよ生のタンパク質の合 成ペプチドフラグメントに対して発生せしめた抗体は、完全な生のタンパク質に は結合しないことがよくある。同じような結果がイムノゲンとして変性タンパク 質を用いる場合にもしばしば得られる。

発明の概要 合成ペプチドフラグメント又は変性タンパク質に対する抗体が、固定化リガンド への吸着の条件と及び脱離の条件が逆である場合にそれらに対応する生のタンパ ク質の単離のために有用であることが驚くべきことにこの度見い出せた。

従って、本発明は対象のタンパク質又はポリペプチドを回収せしめる方法に関し 、該方法は、 （ａ）固相支持体上に、該タンパク質又はポリペプチドのフラグメントを少なく とも含んで成るペプチドに対して発生せしめた抗体を固定化せしめ、 （ｂ）対象のタンパク質又はポリペプチドの粗調製物を該固定化抗体と、該タン パク質又はポリペプチドの可逆性の部分的な変性をもたらす条件のもとて接触せ しめ、これによって該固定化抗体を発生せしめるの乙こ用いた配列に相当するそ のアミノ酸配列を暴露させ、そしてそれ故該抗体への該タンパク質又はポリペプ チドの結合を成し遂げ、そして（Ｃ）該タンパク質又はポリペプチドを生のコン ホメーションへと再生されている状態において回収せしめるために、該タンパク 質又はポリペプチドを非変性条件のもとで該固相支持体から溶出せしめることを 含んで成る。

発明の詳細な説明 本発明の方法において、タンパク質又はポリペプチドの粗調製物であって、通常 細胞の除去されている培養培地（分泌タンパク質のため）又は細胞断片の除去さ れている細胞溶解物（細胞内タンパク質のため）のいづれかであるものを、溶媒 例えば水性緩衝液中の固相支持体と、該タンパク質又はポリペプチドの部分変性 をもたらす条件を施す前後にて接触させる。しかしながらほとんどの場合におい て、該調製物を該固定化抗体に接触せしめる前にこのような条件にかけることが 好都合であろう。このことによって該タンパク質又はポリペプチドの構造は、該 固定化抗体を発生せしめたその抗原決定基が十分に暴露され、従ってこれらの決 定基が全長タンパク質上にある場合においてさえも認識されうる程度に迄はどけ るであろう。他方、該タンパク質又はポリペプチドを変性せしめるための条件は 、抗体の変性をもたらすことによってこの抗体の該タンパク質又はポリペプチド への結合の能力を損傷せしめるほどの極端なものであってはならない。

タンパク質又はポリペプチドの可逆的な部分変性をもたらす条件は、タンパク質 変性を引き起こす当業者に知られているいづれかでありうる。このような条件の 例には、温度の上昇、該タンパク質もしくはポリペプチドが機能的である自然の 環境のｐＨに対する該タンパク質もしくはポリペプチド調製物のｐＨの実質的な 上昇又は低下、該タンパク質もしくはポリペプチド調製物へのタンパク質変性剤 の添加、該タンパク質もしくはポリペプチド調製物への有機溶媒の添加、あるい は該タンパク質もしくはポリペプチド調製物における非生理学的に高い濃度の塩 、あるいは２以上のこれらの手段の組合せが含まれる。

各々の上昇は好都合には少なくとも３２°Ｃ２例えば約３７から約６０゛Ｃの間 の上昇でありうる。該調製物のｐＨにおける上昇は約８より高いｐＨへの上昇が 適当でありうる。ｐＨの上昇は該調製物に適当な有機又は無機塩基、例えばトリ ス、アンモニア、水酸化ナトリウムもしくは炭酸ナトリウムを加えることにより 得られる。該調製物のｐＨにおける低下は約６より低いｐｉ（への低下が適当で ありうる。ｐＨの低下は該調製物に適当な有機又は無機酸、例えば酢酸、塩酸、 硫酸もしくはリン酸を加えることにより得られる。

本発明の方法乙こおいて有用でありうるタンパク質変性剤の例は、ウレア、チオ ウレア、塩酸グアニジン、カオトロピック剤例えば、チオシアネート塩、例えば ＫＳＣＮもしくはＮＨ，ＳＣＮ、又は洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、 デオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルコール（例えばＢｒ１ｊ シリーズ）、オクトキシノール（例えばトリトンシリーズ）、ツイーン２０、又 は糖脂質、例えばデカノイルメチルグルコシドである。タンパク質変性剤が洗浄 剤である場合、該タンパク質又はポリペプチド調製物の０．０１−１０重量％、 好ましくは０．０１−１重量％において加えることが好適でありうる。タンパク 譬変性剤が洗浄前以外である場合、０．　５＋−６Ｍ、好ましくは１−３Ｍの濃 度迄加えることができうる。

適切な有機溶媒はメタノール、エタノール、プロパツール、２−プロパツール、 ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ポリエチレングリコール、グリコール 、グリセロール、フェノール又は１．４−ブタンジオールである。有機溶媒はこ の溶媒の種類に依存して最大９５重世％の量において加えることができ、アルコ ール（例えば１．４−ブタンジオール）は最も高い溶媒濃度が許容される緩かな 溶媒である。

該タンパク質又はポリペプチド調製物に塩類を加える場合、０．５６Ｍ、好まし くは１−３Ｍの濃度迄加えることが適当でありうる。本目的のために有用な塩類 の例にはＮａ　Ｃｌ。

ＭｇＣ１，及び（ＮＨ４）２Ｓｏ、、Ｎａ０Ａｃ、に２ＳＯ４。

ＫＯＡｃ、リン酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウムがある。

本発明の方法の工程（ａ）に利用する抗体は、前記の条件のもとて対象のタンパ ク質又はポリペプチドと結合することができるあらゆる抗体でありうる。従って 、該抗体は変性状態におけるタンパク質もしくはポリペプチド又はそのフラグメ ントであって、問題のタンパク質もしくはポリペプチドの少なくとも１つの抗原 決定基を含んで成るものに対して、あるいは該タンパク質もしくはポリペプチド の部分アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する合成ペプチドに対して発生 せしめた抗体でありうる。この部分配列は抗原決定基を提供するために少なくと も６個のアミノ酸を含んで成るべきである。この合成ペプチドはペプチド合成の 分野において確立された標準的な方法、例えばＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ、　 ５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅチ」工聾且詐ユ＋第２版、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。

１１１ｉｎｏｉｓ、　ＵＳＡに詳細の通りに従って製造されうる。

本発明の方法において利用される抗体はポリクローナル抗体でありうる。ポリク ローナル抗体は適当な動物（例えばウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ニワ トリ、ラント及びギニアピノグ）を問題のペプチドにより免疫化せしめ、そして 抗体を周知の方法（Ａ、　Ｊｏｈｎｓ　ｔｏｎｅとＲ，Ｔｈｏｒｐｅ＋前述、頁 ３０−３４と４８−５５を参照）において血清から単離せしめることにより調製 されうる。しかしながら、通常はモノクローナル抗体を利用することが好ましく 、その理由はそれらは容易に大量、且つ高い度合の純度において生産されるから である、更に、それらは大いなる均一性を示す。他方、モノクローナル抗体のフ ラグメント、例えばＦａｂ’又はＦ　（ａｂ’　）ｚフラグメントを利用するこ とができる。モノクローナル抗体は抗体を生産する細胞と確立されている細胞系 のミエローマ細胞とを融合せしめ、これにより得られるハイブリドーマ細胞を選 別且つクローニングせしめ、そしてそれらを適当な培地中で増殖せしめて抗体を 生産させ、そしてこの培養物から該抗体を単離せしめることによる、Ａ、　Ｊｏ ｈｎｓ　ｔｏｎｅとＲ，Ｔｈｏｒｐｅ（前記、頁３５−４３）に詳細の通りに製 造されうる。

抗体が固定化される固相支持体はクロマトグラフィー処理に好適に利用される任 意の支持材料を含んで成りうる。従って、該固相支持体は、ポリマー、例えば樹 脂、例えばアクリル樹脂、シリカヘース、又は多糖類例えばアガロース、デキス トランもしくはセルロースをヘースとするポリマーであって、該抗体の該支持体 への共有結合を促進せしめる目的のために付与せしめる官能基によって任意的に 修飾されているものを典型的に含んで成る。有用な官能基の例は、アミノ、シア ノ、チオ、エポキシ、イミド、ヒドロキシル、ケト、カルボキシル、アミド、エ ステルもしくはアシル基、又はハロゲン化Ｔｈヲ含む基、又はエチレンスルホン 例えばビニルスルホンである。該支持体は、クロマトグラフィーの分野において 周知の方法においてカラムに充填されうるビーズもしくは粒子の状態であること が適切であり、又は該支持体はハツチ処理において利用されうる。

本発明の方法により単離するタンパク質又はポリペプチドは、本方法において好 適に処理されうる任意のタンパク質又はポリペプチド、特にあらゆる常用の精製 処理によっては十分に精製せしめることが困難であることが見い出されているタ ンパク質又はポリペプチドでありうる。本明細書において「ポリペプチド」なる 語は、タンパク質のフラグメント、あるタンパク質と他との融合体、又はそのフ ラグメント、又は少なくとも２種類のタンパク質フラグメントのバイブリドを意 味することにより「タンパク質」と区別し、しかるに「タンパク質」なる語は全 長もしくは生のアミノ酸配列又はその誘導体を意味する。本発明の方法により適 切に処理されうるタンパク質又はポリペプチドの例は成長ホルモン、因子■、因 子■、組織プラスミノーゲンアクチヘーター、インターロイキン−２、インター フェロン、成長因子及び膜タンパク質、例えば成長因子リセプター、インスリン リセブター又はグルカゴンリセプターである。

対象のタンパク質又はポリペプチドの該固相支持体からの脱離は、該タンパク質 又はポリペプチドが部分変性となる、即ち、タンパク質構造のはときのために重 要な（複数の）因子の存在下における条件を変えることによって成し遂げられる 。一般にこの脱離は中性緩衝剤、特に水性緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、トリス 緩衝剤、Ｈｅｐｅｓ緩衝剤、重炭酸塩緩衝剤を加えることにより成し遂げられる 。これは該タンパク質又はポリペプチドをその生のコンホメーションに再生せし めることをもたらし、従ってこれはもはや抗体に結合していることがなくなり、 そしてその結果として溶出する。この溶出タンパク質又はポリペプチドは、所望 するならば、周知の方法において沈殿、超遠心又は凍結乾燥により濃縮してよい 。

生のタンパク質の回収のための合成ペプチド又はタンパク質フラグメントに対し て発生せしめた抗体の利用を可能にすることとは別に、本発明の方法は再生され た、そしてそれ故常用のイムノアフィニティークロマトグラフィー処理よりもた らされる変性タンパク質よりもはるかに安定なタンパク質生成物の回収をもたら す更なる利点を有する。更に、該タンパク質又はポリペプチドは中性緩衝液によ り溶出されるため、この純粋な生成物から変性剤（又は塩もしくは有機溶媒）を 除去せしめる必要がない。

精製され且つ生物学的に活性なタンパク質を、該タンパク質を変性且つその後再 生せしめることによって得ることは既に提案されてきた。例えばＵＳ　４，６７ ７、−１９６号、ＥＰ　１９６１４６号、ＬＩＳ　４，７０５，８４８号、ＷＯ ８８１０８８４９号及び匈０８８１０８８５０号を参照のこと。しかしながらこ れらの公開物は生物学的に活性なタンパク質を得るために組換微生物においてし ばしば得られるタンパク質集合体（細胞封入体と呼ばれる）の可溶化の必要性と いう異なる問題に注目している。あるケースにおいて、タンパク質を変性／再生 処理の前に精製することが提案されており（Ｗｏ　８８１０８８５０号を参照） 、そしてその他においては、再生せしめた可溶化タンパク質をクロマトグラフィ ーではなく透析によって濃縮せしめている（ＵＳ　４，６５６，２５５号を参照 ）。変性及び再生をクロマトグラフィー処理に組合せている場合においてさえも 、変性及び再生はこのような精製処理の一部を成しておらず、単なる可溶化状態 におけるタンパク質を提供する手段にすぎなかった。クロマトグラフィーによる タンパク質精製はいつもこの再生段階を、本方法のように精製と実質的に同時に 行うよりもむしろ後に行っていた。この理由の１つは、従来の詳細されている方 法はアフィニティークロマトグラフィーを全く利用しておらず、適切に折りたた まれた生物学的に活性な生成物を得るための処理と、純粋な生成物を得るための 処理を組合せることができなかったからであろう。従って本発明は、クロマトグ ラフィーのために固定化抗体を回収すべき生成物の逐次的な変性及び再生と組合 せて利用することに基づく、従来提案されてきたタンパク質回収方法よりも便利 なタンパク質の単離方法を提供する。

本発明を、以下の本発明の範囲を何ら限定するものとは考えていない実施例にお いて更に説明する。

■ ＨＩＲ−α　３９−７５　−ＮＨ，の入Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ− Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−八ｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｐｈｅ− Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａ　Ｉ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｌ ｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成：シュ リンレセプターα−サブユニットのアミノ酸残基３９−７５から成る断片を、ス チュワードおよびヤング（Ｓｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＳｙｎ　ｔｌｌｅｓ　ｉｓ　 ＋　第２　版、ピルセケミカルカンパニー、ロックフォールド、イリノイス、１ 〜５０頁）により記載された固相方法によりＣ−末端アミドとして合成した。

利用した樹脂は、いわゆるｒＭＢＨＡ、型であり、これは、Ｇ、Ｒ，マツエダお よびＪ、　Ｍ、　、２．チュワート（ＰＥＰＴ　ＩＤＥＳ　。

２　（１９８１年）、４５〜５０頁）に記載されており、アプライドバイオシス テム（Ｕ、Ｓ、Ａ、　ａｒｔ　Ｎｏ、４００２２９）から得られる。

次の化学的に入手できるアミノ酸誘導体を合成において用いた：Ｂｏｃ−Ａｒｇ −（Ｔｏｓ）−０Ｈ，Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−０ Ｈ。

Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）−０Ｈ，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｂｏｃ−１１ｅ−Ｏ Ｈ，Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ。

Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ＋　Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）− ０Ｈ，Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−（ＯＢｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｍｅｔ（０）−０Ｈ，Ｂ ｏｃ−Ｌｙｓ（２−ＣＩ−Ｚ）−０Ｈ，ａｎｄ　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ ）　−ＯＨ。

アミノ酸誘導体を、対称無水物として結合させたが、但しＢｏｃ−Ａｒｇ−（Ｔ ｏｓ）−ＯＨはＨＯＢ　ｔエステルとしで結合させた。

ペプチド鎖の組立は、自動ペプチド合成機（アプライドバイオシステム　型４３ ０Ａ）を用いて連続的に行った。

ペプチド鎖の構築が完結した後、末端Ｂｏｃ基を除去した。

樹脂に結合したペプチドを塩化メチレンで洗浄し、乾燥させた。次いで８００ｍ ｇの樹脂結合ペプチドを、タム等（Ｊ、ＡＩ’ｌ。

ＣＨＥＭ、ＳＯＣ，、１０５，６４４２〜５５頁（１９８３年））に記載された ’　Ｌｏｗ−ＨｉｇＪ方法を用い、フッ化水素により分解および保護解除に委ね た。

フン化水素が最終的に蒸発した後、分離したペプチドを沈殿させ次いでジエチル エーテルで数回洗浄した。沈殿したペプチドを５０％酢酸２０ｍ１に溶解し、セ ファデンクスＧ−２５（ファルマシアの登録商標、アブザラ、スウェーデン）の カラムを用いゲル濾過に委ね、次いで１５％の２−プロパツールを有する１０％ 酢酸で溶出せしめた。ペプチド含有分画を集め、次いでペプチドを、水酸化アン モニウム溶液を用いｐＨ７，０に調節して再沈殿させた。沈殿物を遠心により単 離し、水で数回洗い、乾燥した。収率：粗製ペプチド１５９ｇｅ ヌクレオジル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　（登録商標）Ｃ１８（マーチェリーナゲ ル（ドレン、ＦＧＧ）から購入）のカラムを用い、更に溶離液として０．１％三 フッ化酢酸を用い、４０％から６０％のアセトニトリルに至るアセトニトリル線 状グレーディエンド法により３０分にわたってＨＰＬＣによりペプチドを精製し た。カラムから溶出されたペプチドを、アセトニトリルの真空蒸発により溶液か ら回収し、次いで凍結乾燥した。

収率：精製ペプチド３０ｍｇ、アミノ酸分析により、表題化合物の組成に一致し た。

ＨＩＲ−α　３９−７５　−ＮＨに・するモノクローナｙ坑生■１１ フロインドアジュバントに溶解した５０μｇのＨＩＲ−α（３９−７５）−ＮＨ ，を用い、マウスを４週間１週おきに免疫した。マウスを殺し、次いで肺臓細胞 を単離し、更にＡ。

ヤンストンおよびＲ，トロプ（同上、３７〜３９頁）に記載される如く、非−免 疫グロブリン生産マウス骨髄腫細胞系の細胞を用いて融合させた。

このようにして得られた抗体−生産ハイブリドーマを選択し、次いで制限希釈法 （Ａ、　ヤーンストンおよびＲ，トロープ、同上、３９〜４２頁）によりクロー ン化した。

抗体−生産ハイブリドーマのためのスクリーニングは、ＥＬＩＳＡ分析法（Ａ、 　ヤーンストンおよびＲ，トロープ、同上、２５７〜２６０頁）を用いて行った が、この方法において、ＨＩＲ−α（３９−７５）−ＮＨ，ペプチド抗原を用い 、マイクロタイターエリザプレートのウェルにコートした（ウェル当たり０．１ Ｈｇ）。

合計１４個のクローンを得た。全ての１４個のクローンからの抗体は、ペプチド 抗原と反応し次いで変性ヒトインシュリンレセプターと反応した。１４個の抗原 のいずれも、生のヒトインシュリンレセプターと反応しなかった。従って、抗原 はＳＤＳゲル電気泳動および免疫ブロンティング後ヒトインシュリンレセプター およびそのα−サブユニットを認識するが、しかし、例えばＨＥＰ　Ｇ２細胞に 暴露する如く、生のインシュリンレセプターとは反応しない。

最高の力価を生産するクローン、Ｆ２６を１１細胞培養で増殖させた。ｐＨ８， ５のＯ，ＩＭのトリス緩衝液中の蛋白質Ａセファロース６Ｂ（ファルマシア（ウ パサラ、スウェーデン）の登録商標）を充てんした５Ｘ１０ｃｍカラムに吸着さ せ、同緩衝液で洗い次いでｐＨ３，ｏの０，１Ｍシトレート緩衝液で溶出せしめ ることにより抗体を精製した。抗体含有分画を集め、７０ｍ１の溶離液中２５Ｂ のＦ２６抗体を得た。最後にＰＢＳ　（ホスフェート緩衝食塩水）に対して透析 により緩衝液を交換した。抗体Ｆ２６は、Ｉ　ｇＧ−２ｂクラスに属する。

Ｆ２６の 蛋白質Ａ精製Ｆ２６抗体２６１を、２４時間後に緩衝液を交換して４８時間０． １ＭのＮａＨ（Ｃｏｘ）緩衝液（ｐＨ８，５）１１に対し透析した。透析物を１ ０ａｌのミニリーク（Ｍｉｎｉｌｅａｋ：登録商標）ゲル懸濁液（これはジビニ ルスルホン活性化アガロースを基材とするマトリックス（ＫｅｌＩ＋−Ｅｎ−Ｔ ｅｃバイオテクノロジー社（コペンハーゲン、デンマーク）から購入））と混合 する。

ｐＨを８．８に調節し、ゲルを懸濁状態に保つためゆっくり回転しつつ、４０° Ｃで２４時間固定化反応を行う。ゲルを沈でん法により単離し、洗浄し、過剰反 応部位を、０．１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８，５）１５ｍ＋１を添加し、ゆっ くり回転させてゲルを懸濁状態に更に２４時間４℃で保持することによりブロッ クした。最後に、ゲルを１．５ｃｍ径のカラムに充てんし、３．５ｃｍの床高と し、次いでＳＤＳ　（ナトリウムドデシルスルフニー））０．１％（Ｗ／Ｖ）を 含有する０、ＩＭＦリス緩衝液で平衡化した。

可゛　ノアフィニーイ　りロマトグーフィー変性ヒトインシュリンレセプターの α−サブユニットを結合するためのＦ２６抗体／ミニ−リークカラムの能力およ びそれがその天然のコンホメーションに再生された場合、その解放能力を、ヒト インシュリンレセプターの分泌可能な可溶性分画、５ＩＲ（これはヒトインシュ リンレセプターであり、これから４２９個のアミノ酸としてのエフトドメインが β−サブユニットから欠落している、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、　２６３．３ ０６３〜３０６６頁（１９８８年））を用いて、実証した。

ヒトインシュリンレセプターの可溶性フラグメント（ＳＩＲ）はダイマー（α２ β２′）であり、ここにおいて、α置換基は、α−サブユニットの全配列を含ん でなり、β′−サブユニットはβ−ザブユニットの最初の１９４個のアミノ酸を 含んでなる。

ヤマグチ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５８．５０４５　５０４９．（１９８ ３年））に従い、固定化小麦胚種アグルティニンおよびインシュリンを含有する カラムを連続的に用い、アフィニティクロマトグラフィー法によりＳＩＲを精製 した。ラクトペプチダーゼ法（ホロラン等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅａ＋、Ａｃｔａ　 ４５．　１５３〜１５７頁（１９７３年））を用い、３１８分子を１２５１で放 射活性にラベルした。

＋２５Ｉ−ラベル化ＳＩＲ分子（約１００μｇおよび約１０、ＯＯ０ｃｐａ＋） を、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ含有の０．　ＩＭＦリス緩衝液（ｐＨ７、０）　 １　ｍｌに溶解した。溶液をＦ２６抗体カラムに適用し、次いでカラムを、４１ ／時の速度で同じ緩衝液２０ｏ＋１を用いて洗浄した。ｐＨ７，８の０．ＩＭＦ リス緩衝液（これはＳＤＳを有しない）により、吸収に対してと同様の溶出速度 およびフランクジョンサイズを用い３１８分子を溶出させた。ＳＩＲ含有分画は 、Ｔ−計数管によって同定した。結果を表１に示す。８３％の放射能が第２の緩 衝液と共に放出されていることが明らかである。

対照実験において、ヒトインシュリンと結合し得るモノクローナル抗体を、Ｆ２ ６抗体に対して先に記載したと同様に固定化し、次いでＦ２６抗体に対し先に記 載した条件と同じ条件を用いて３１８分子に結合する能力を試験した。結果を表 １に示す。この抗体を用い、９７％の＋２Ｊ−ラベル化ＳＩＲが第１の緩衝液（ ＳＤＳ含有緩衝液）と共に溶出する。

従って、ＳＤＳ含有緩衝液中固定化Ｆ２６抗体に対する３１８分子の結合能力は 特異的であることが判明する。

全体の抗ＨＩＲ−α　全体の抗ヒトイン固定化抗体　（３９−７５）−ＮＨ，（ ％）　シュリン（％）第２の溶出液中の放射能　８３０ （０，１Ｍトリス、ｐＨ７，８） カラムに関する損失　１５３ 国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．対象のタンパク質又はポリペプチドを回収せしめる方法であって、 （ａ）固相支持体上に、該タンパク質又はポリペプチドのフラグメントを少なく とも含んで成るペプチドに対して発生せしめた抗体を固定化せしめ、 （ｂ）対象のタンパク質又はポリペプチドの粗調製物を該固定化抗体と、該タン パク質又はポリペプチドの可逆性の部分的な変性をもたらす条件のもとで接触せ しめ、これによって該固定化抗体を発生せしめるのに用いた配列に相当するその アミノ酸配列を暴露させ、そしてそれによって該抗体への該タンパク質又はポリ ペプチドの結合を成し遂げ、次いで（ｃ）該タンパク質又はポリペプチドを非変 性条件のもとで該固相支持体から溶出せしめ、該タンパク質又はポリペプチドを 生のコンホメーションヘと再生される状態において回収する、前記方法。
2. ２．工程（ｂ）における蛋白質もしくはポリペプチドの部分、可逆的変性をもた らす条件が、温度増加、蛋白質もしくはポリペプチドが機能的であるｐＨに対し て蛋白質もしくはポリペプチド調製物のｐＨの実質的増加もしくは減少、蛋白質 もしくはポリペプチド調製物への蛋白質変性剤の添加、蛋白質もしくはポリペプ チドヘの有機溶剤の添加、又は蛋白質もしくはポリペプチド調製物中での未生理 学的に高濃度の塩、またはこれらの方法の２種以上の組合せを含んでなる、請求 の範囲第１項記載の方法。
3. ３．温度増加が、少なくとも３２℃まで例えば３７〜６０℃までの増加である、 請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．調製物のｐＨが８よりも高い、請求の範囲第２項記載の方法。
5. ５．調製物のｐＨが６よりも低い、請求の範囲第２項記載の方法。
6. ６．蛋白質変性剤が、尿素、チオ尿素、グアニジン塩酸塩、カオトロピック剤、 例えばチオシアネート塩、例えばＫＳＣＮまたはＮＨ４ＳＣＮ、又は洗剤例えば ドデシルスルホン酸ナトリウム、ナトリウムドデシルコレート、プロピレンエチ レンアルコール（例えばブリジシリーズ）、オクトキシノール（例えば、トリト ンシリーズ）、ツィーン２０、又は糖脂質例えばドデシルメチルグリコシドから 成る群から選ばれる、請求の範囲第２項記載の方法。
7. ７．洗剤が、０．１０〜１０％量、好ましくは調製物の０．０１〜１容量％添加 されている、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．蛋白質（洗剤以外）が、０．５〜６Ｍ、好ましくは１〜３Ｍの濃度に添加さ れている、請求の範囲第６項記載の方法。
9. ９．調製物中の塩の濃度が、０．５〜６Ｍ、好ましくは１〜３Ｍである、請求の 範囲第２項記載の方法。
10. １０．塩が、ＮａＣｌ，ＭｇＣ１２および（ＮＨ４）２ＳＯ４，ＮａＯＡｃ，Ｋ ２ＳＯ４，ＫＯＡｃ、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムから成る群か ら選ばれる、請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．工程（ａ）で用いられる抗体が、変性形で対象の蛋白質もしくはポリペプ チド、または対象の蛋白質もしくはポリペプチドの少なくとも１種の抗原決定基 を含んでなるそのフラグメントに対して発生しているか、又は対象の蛋白質もし くはポリペプチドの部分アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する合成ペプ チドに対して発生している、請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．抗体がモノクローナル抗体又はそのフラグメントである、請求の範囲第１ １項記載の方法。
13. １３．抗体が工程（ａ）において固定化される支持体が、アガロース、デキスト ランもしくはセルロース、シリカまたはアクリルアミドに基づくものである、請 求の範囲第１項記載の方法。
14. １４．対象の蛋白質もしくはポリペプチド、成長ホルモン、ＶＩＩ因子、ＶＩＩ Ｉ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン−２、インターフ ェロン、成長因子および膜蛋白質、例えば成長因子レセプター、インシュリンレ セプター又はグルカゴンレセプターから成る群から選ばれる、請求の範囲第１項 記載の方法。
15. １５．工程（ｃ）における非変性条件が、ホスフェート緩衝液、トリス緩衝液、 へベス緩衝液およびボレート緩衝液から成る群から選ばれる中性緩衝液の使用を 含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。