JPH05506661A

JPH05506661A - 正の過剰電荷を有するリポソーム

Info

Publication number: JPH05506661A
Application number: JP91508158A
Authority: JP
Inventors: アイブル，ハンスイェルク; カウフマン―コレ，ペトラ; ウンガー，クレメンス
Original assignee: マックス―プランク―ゲゼルシャフト　ツール　フェルデルング　デル　ヴィッセンシャフテン　エー　ファウ
Priority date: 1990-04-27
Filing date: 1991-04-25
Publication date: 1993-09-30
Also published as: EP0526531B1; CA2081119A1; IE911427A1; ES2056648T3; DK0526531T3; AU7770291A; AU643282B2; PT97500B; PT97500A; DE59102030D1; EP0526531A1; DE4013632A1; ATE107503T1; WO1991016880A1; IE62548B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】正の過剰電荷を有するリポソーム本発明は、肝臓病の治療における有効物質担体として使用され得る正の過剰電荷を有するリポソームに関する。

夏　リポソームは水性内部空間を有する単−又は数層の脂質二重層よりなる球形の構造体である（脂質小胞）。このような小嚢は、水性媒体中での燐脂質（例えばレシチン）の機械的超微細分配により製造される。

パンハム（Ｂａｎｇｈａｓ）等著、ジャーナル・オブ・モレキュラー、バイオロジイ（１，３１ｏｌ、　Ｒｉａｌ、）　１３巻（１９６５年）２３８〜２５２頁によれば、燐脂質が水の存在で被覆構造を形成することが認められた。物理的パラメーター、例えば圧力、温度及びイオン濃度ｉ　に依り、ミセルは単層もしくは多重層リポソーム又はｌ　同様に一枚の脂質二重層を形成する（リポソームス（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）　：フロム・フィジカル・ストラフチャー・ツー・テラビーティブク・アプリケイジョン（Ｆｒｏｍｐｈｙｓｉｃａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｔｏ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（１９８１年）、ナイト（Ｋｎｆｇｈｔ）　、Ｃ，Ｇ、（版）、エルゼビール（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ノース・ホーランド・バイオメディカル・プレス（Ｎｏｒｔｈ　１ｉｏｌｌａｎｄ　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ）　、２章：Ｈ，エイプル（Ｅｉｂｌ）　、ホスホリピド・シンセーンス（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１９〜５０頁、３章＋Ｆ　スゾカ（５ｚｏｋａ）及びＤバパハジョポウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）　、リポソームス（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）　・プレバレージョン・アンド・キャラクテリゼイ／ヨン（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）　、５１〜１０４頁参照）。小車ラメラリポソームは直径２０〜２００ｎｍを有する球形の構造体である（バレンホルツ（Ｂａｒｅｎｈｏｌｔｚ）　等ＩＦ、Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ｌｅｔｔ、９９巻　（１９７９年）２１０〜２１４頁参照）。その内容は、脂質二重層によって外とは区別されている水より成る。親油性又は親水性に依り、作用物質はリポソームの脂質二重層中又は水性の内容物中に含有されかつ体液を経て生体内に移送されかつ分配され得る。

リポソームは、その構造に基づき生化学及び分子生物学で膜モデルとして用いられる。近年では、更にリポソームの特性及び薬剤担体としてのその使用についての多数の研究が公表されている（例えばＨ，シュライナー（５ｃｈｒｅｉｎｅｒ）及びＭ、レーダー−シッフＪＬｔ（Ｒａｅｄｅｒ−３ｃｈｉｋｏｒｒ）　、ファルマチー・イン・ウンゼレル・ツアイト（Ｐｈａｒ＋＋ａｚｉｅ　ｉｎ　ｕｎｓｅｒｅｒ　ｚｅｉｔ）　１１巻（１９８２年）９７〜１０８頁参照）。従来公表された動物実験は、一般に、肝臓及び肝臓はリポソームの受容に関して他の臓器を支配することを示している。リポソームの約８％は、１時間後に、かつ約１５％は、２４時間後に肝臓中に見出される。中性であるか又は１０％の負の過剰電荷を有するものであるかのリポソームの間の、臓器分配における、かつ臓器富化における差異は、実際に僅少である。

薬剤中でのリポソームの可能な使用は、実際には病気の選択的治療を目的としている。リポソーム中に包含された作用物質の所望の作用は促進されねばならず、それに反して不所望の作用は減少されねばならない（治療指数の改善）。そのような考え方は、特定の臓器に限定されている単独の疾患の治療において確信できることであり、この際、肝臓病がこの場合に特に重要である。封入された作用物質が独占的に肝臓に到達するが、非特異的に全組織には分配されない限り、疾病臓器の治療は充分に特異的であろう。内科学からの次の２例は、この考えを明らかにし、かつこの原則の実際的な意味を証明する：例１：悪性の肝臓疾患悪性腫瘍の転移の際に、例えば乳癌の場合又は胃−腸一城の腫瘍の際に、肝臓は主要転移部位でありうる。しかしながら、肝臓は、例えば、後に肝臓転移に至る手術された大腸癌における唯一の転移臓器でもありうる。それに反して、原発性肝臓細胞癌は、肝臓にだけ限定されている。

例２・炎症性肝臓疾患慢性のウィルス−肝炎の治療の際に効果が期待されている空買群を、インターフェロン（Ｉｆｎ）と共に初めて使用する。リポソーム中のＨｎの封入及び罹病肝臓へのその定量的移送は、ｒｆｎ−特異的副作用の著しい減少を期待させる。更に、Ｉｆｎの適用のための時間間隔を実質的に延長することができ、多分週４回から週１回の適用に減少することができる。

従って本発明の課題は、臓器特異性の作用物質移送の前記問題がそれで解明され得てかつリポソーム中に包含された作用物質の治療指数の改善を達成することがそれで可能であるリポソームの調製である。

この課題は本発明で解明される。

本発明の目的は、新規のリポソーム−構造体であり、これは、それが正の過剰電荷を有する、一般式（１）［式中Ｒ８は各々１４〜１８個のＣ−原子を有するアルコイル又はアルキル、オレオイル又はオレイルを表わし、Ｒ２はＲ３と同じ意味を有しくしかしＲ□はＲ２と同一であってはならない）、かつ更にＰＮＮを表わしてよく、ここで、Ａ＝−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋Ｈ２ＣＨ３、−Ｎ”Ｈ（ＣＨ３）２　、Ｎ”（ＣＨｓ）ｓを表ワシ、Ｒ３＝−０−Ｒ１、−０−ＰＮＮ、−０−Ｇ１７、Ｎ”Ｒ３、Ｎ”Ｈ２ＣＲ３、Ｎ”Ｈ（ＣＨａ）２又はＮ　”（ＣＨａ）ｓを表わし、ＲはＲ１、Ｒ２又はＲ６に挙げた意味の１つを有し、かつｎは０〜３の整数、かつ殊に０を表わすが、分子は正の電荷を有する前記の基の１個を含有することを条件とする］の化合初歩なくとも１モル％を含有することを特徴とする。

西ドイツ国特許（ＤＥ−Ａ）第２７５２５５３号明細書から、燐脂質含有化合物及びその製法が公知であり、それは、式中の基Ｒ，Ｒ１、Ｒ２又はＲ３の１つがＰＮＮを表わす前記式（Ｉ）と匹敵しつる構造を有する。

ところで、意外にも、一般式（Ｉ）の化合物の少なくとも３モル％を含有する脂質混合物よりなるリポソームが、薬剤担体としての臓器特異的挙動を示すことが判明した。殊に、本発明によるリポソームは、一般式（１）の化合物の１〜３０モル％、及び特に５〜１５モル％を含有し、この際、リポソームは１種又は数種の一般式（１）の化合物よりなる混合物を含有していてもよい。

次の第１表は、［３Ｈ］−イヌリンに関して標識された本発明によるリポソームが正の過剰電荷を有する一般式（１）の化合物を含有し、血中の［３Ｈ］−イヌリン含量が１時間後にすでに１％よりも少量に減少していることを示している。

それに反して肝臓中には、［３Ｈ］−イヌリンの著しく高いパーセント率が存在する。１時間後６７％、２４時間ｉ＆５４％及び７２時間後に常に４５％。臓器、例えば肺臓、腎臓、心臓及び脳中には、イヌリンは検出され得ない。従ってこれらの臓器は、第１表中に挙げられていない。食細胞系の一部としてリポソームを通例良好に取り込む肺臓中ですら、リポソームは意外にも見出されない。このことは、次の第２表で明らかにされ、表中には、新鮮重量１ｇ当りの血液、肝臓及び膵臓の［８Ｈ］−イヌリン−取り込みが記載されている。

第１表種々異なる表面電荷のリポソーム中の包含後及び遊離［３Ｈ］−イヌリンの投与後の［３Ｈ］−イヌリン取り込みの比較脂　質　時間　血液　肝臓　肺臓（Ｍｏｌ／Ｍｏ１）　（Ｓｔｄ、　）　（投与量の％）ＰＰＧＰＣ／Ｃｈｏｌ　１　５９　１１　３ＰＰＧＰＣ／ＰＰＧＰＧ／Ｃｈｏｌ　１　６４　７　１ＰＰＧＰＣ／Ｎ”／Ｃｈｏｌ　１−　１　６７　２遊離［３Ｈ］−イヌリン　１　０．６　０　０臓器中の分配率は、イヌリンの投与量の％で記載されている。大きい用量範囲（体重１＆ｖ当り１■Ｍｏｌまで）では、ＮＭＲ−Ｉマウスでの［３Ｈ］−イヌリンの取り込みは、殆んど直線的である。遊離のイヌリンは、血液循環系を１時間後にすでに離れかつ完全に腎臓を経て排泄される。種々の略語は次のものを意味する：Ｓｔｄ、＝時間：ＰＰＧＰＣ＝１．２−ジＩくルミトイルーｓｎ−グリセロー３−ホスホコリン：　Ｃｈｏｌ＝コレステリ：／；ＰＰＧＰＧ＝１．２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホ−５ｎ−１−グリセリン、Ｎａ”−塩：Ｎ＋＝一般式（Ｉ）よりなる正の２鎖状脂第２表新鮮重量１ｇ当りのリポソーム中への封入後の［３Ｈ］−イヌリン取り込み率（％）の比較（全ての他の記載は第１表中のそれに相応する）脂　質　時間　血液　肝臓　膵臓（Ｍｏｌ／Ｍｏ１）　（Ｓｔｄ、）　（新鮮重量１ｇ当りの投与量の％）ＰＰＧＰＣ／Ｃｈｏｌ　ｌ　２６　８　１９ＰＰＧＰＣ／ＰＰＧＰＧ／Ｃｈｏｌ　１　３５　６　１１ＰＰＧＰＣ／Ｎ’／Ｃｈｏｌ　１　０　３７　１１遊離の［３■ ］−イヌリン　１　０．６　０　０前記の第１表及び第２表中に挙げた値から、正の過剰電荷を有する一般式（Ｉ）の化合物を含有する２鎖状の親油性構造よりなる本発明によるリポソームで、肝臓での作用物質の独占的富化が可能であることが明白である。この意外な事実は、肝臓疾患の治療に利用され得る。

従って本発明の池の目的は、リポソーム中に封入されている肝臓における病気に対する１種又は数種の作用物質を含有する肝臓疾患の治療のための薬剤調製物でもあり、それは、リポソームが正の過剰電荷を有する前記一般式（Ｉ）［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ及びｎは前記のものである］の化合物少なくとも１モル％、殊に１〜３０モル％、特に５〜１５モル％を含有することを特徴とする。封入される作用物質量は、水溶性薬剤のための水中の作用物質の溶解性によって上位限定されている。

また他の目的は、肝臓範囲における疾患に対する１種又は数種の作用物質をリポソーム中に封入して含有する肝臓疾患治療のための薬剤（この中でリポソームは式（Ｉ）の化合物少なくとも１モル％を含有する）を製造するための一般式（Ｉ）の化合物の使用である。

肝臓中での富化のための本発明によるリポソームを製造するために使用され得る本発明による一般式（Ｉ）の脂質は、３群に分類される：Ａ）天然には産出しない基ＰＮＮを含有する燐脂質様構造：Ｂ）完全に天然構成要素から構成され得てかつ基Ｇｌｙを含有するグリセリドのグリシンエステル及びＣ）式中（ＤＲｓｔ）＜、−０−Ｒ，、−０−ＰＮＮ及び −０−Ｇｌｙを除いた、一般式（Ｉ）に関する前記の意味を有する、ジアシル− 又はジアルキル−ω−アミノ塩酸塩、殊にジアシル−又はジアルキル−プロパンジオール−（１，２）−アミノ塩酸塩。

遊離な脂質は次のものである：脂質Ａ：　１．２−ＭＭ−５ｎ−Ｇ−３−ＰＮＮ、１、　２−ＰＰ−５ｎ−Ｇ− ３−ＰＮＮ、１．　２−３Ｓ　−５ｎ−Ｇ−３−ＰＮＮ、１．　２−ＴｅＴｅ− ５ｎ−Ｇ−３−ＰＮＮ、１．　２−ＨｅＨｅ−５ｎ−Ｇ−３−ＰＮＮ及び２．２ −ＯｃＯｃ−ｓｎ−Ｇ−３−ＰＮＮ；又は出発物質としての１．３−ジアシル− 又は１，３−ジアルキルグリセリンを基礎とする相応する燐脂質脂質Ｂ：　式中のＲ１及びＲ２がＲ１に関して前記の基を表わし、かつ特に群Ａで挙げたような意味Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔｅ、Ｈｅ、Ｏｃ、オレイル及び／又はオレオイルを表わし、かつＲ３は基Ｇｌｙであり、かつ殊にＲ１及びＲ２は同じ基を表わす、式（Ｉ）の化合物：並びに出発物質としての相応する１、３−ジアシル−又は１．３−ジアルキルグリセリンから誘導される、式中のＲ１及びＲ３がＲ１に関して前記したものであり、かつＲ２が基Ｇｌｙをを表わす式（Ｉ）の化合物；脂質Ｃ：式中のＲ１及びＲ２が脂質Ｂに前記したものであり、ｎ＝ｏであり、かつＲ３は一〇 −Ｒ１、−０−ＰＮＮ及び−〇−Ｇｌｙを除く、一般式（Ｉ）に関して前記したものである、一般式（Ｉ）のメチル化形を包含する、１．２−ジヒドロキシプロピルアミンのエステル及びエーテル。

一般式（Ｉ）の脂質は公知であるか又は類似構造を有する公知の脂質と同様に自体公知の反応工程の使用下に製造され得る。

脂質群Ａの化合物は、例えばこの種の化合物に関して西ドイツ国特許（ＤＥ−Ａ）第２７５２５５３号明細書に挙げられた方法により製造され得る。

脂質群Ｂの化合物は、相応して置換されたグリセリン誘導体（例えば１．２−シアルコイル−５ｎ−グリセリン）を、保護基で置換されたグリセリン、殊にＮ− α−Ｚ−グリセリンでアシル化し、保護基を離脱させ、特に触媒的にＺ−保護基を離脱させかつ場合により次にアミノ基をメチル化することによって得られる脂質群Ｃの化合物の製造のために、先ず、３−ハロゲンー１．２−プロパンジオール、殊に３−ブロム−１，２−プロパンジオールから出発して、相応する１、２ −ジエステル又はジエーテルを製造しくこれは自体公知のエステル化−又はエーテル化法により実施されつる）、こうして得られる１、２−ジアルキル−又は− ジアシル誘導体を、次いでアンモニア又は相応するＮ−メチルアミノ−１Ｎ、Ｎ −ジメチルアミノ−又はＮ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアミノ−塩酸塩と反応させることによって製造される。

一般式（Ｉ）の化合物に関する前記の製法では、殊に本発明による化合物の製造のためのウラに挙げられた一般的な方法で、かつそこに挙げられた反応条件下で作業する。

正の過剰電荷を有する本発明によるリポソームの製造のために、個々のリポソーム−成分、例えばＰＰＧＰ　Ｃ、Ｃｈｏｌ及びＮ”（この際Ｎ４は１個又は数個の本発明による一般式（１）の脂質である）を、成分の均質な混合を達成するために適当な溶剤中に、殊に加熱下で溶かす。溶剤を真空中で除去しかつ細分された脂質薄膜に、緩衝水溶液（緩衝水溶液として全ての生理学的に使用可能な溶液を使用することができる）を加える。引続き混合物を穏和な撹拌下で約１時間、一般に脂質の主変換温度よりも約５℃高い温度に、例えば約５０℃で保つ。

この予備加熱された脂質懸濁液を次いでフレンチ−ブレス（Ｆｒｅｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓ）　（アミコ社（Ｆｉｒｍａ＾ｍ１ｃａ）、シルバー・スプリング（Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ）　、Ｕ　Ｓ　Ａ）の圧力セル（Ｄｒｕｃｋｚｅｌｌｅ）に移す。フレンチ−ブレスは、水圧機及び最大充填容量４０ｍ１を有する鋼製の標準圧力セル（Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｒｕｃｋｚｅｌｌｅ）より成る。圧力セルの密閉後に圧力を２００００　ｐｓｉに高め、リポソーム分散液を一定の圧力下で狭い排出口を通して圧縮する。この工程を少なくとも３回繰り返す。リポソーム分散液の遠心分離（ツルバール）　（５ｏｒｂａｌｌ）ＲＣ−５Ｂ　：　５ ℃、２７０００９で３０分間）後に、上澄液を沈殿から取り去る。この時に、種々の使用及び試験、例えば本発明による薬剤調製物（作用物質を含有するリポソーム）の製造のために使用されるリポソームが得られる。本発明によるリポソームは他の方法によっても同様に製造され得る。

従って本発明の目的は、正の過剰電荷を有する一般式（Ｉ）［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ及びｎは前記のものである］の化合物少なくとも３モル％を含有する本発明によるリポソームの製法でもあり、これは、一般式（Ｉ）の化合物少なくとも３モル％を、他のリポソーム−成分と一緒に、一般式（１）の化合物と一緒に１００モル％になる量で、脂質懸濁液に変え、脂質懸濁液を予備加熱しかつこのように予備加熱した脂質懸濁液を、次いで圧縮及び遠心分離により自体公知の方法でリポソームに変えることを特徴とする。

この際、本発明による式（Ｉ）の化合物は、殊に１〜３０モル％の量で、かつ特に５〜１５モル％の量で（総すポソーム＝１００モル％）使用される。

本発明によるリポソーム中に封入されている１種又は数種の作用物質を含有する薬剤調製物の製造のために（作用物質含有のリポソームの製造）、次のように処置する：水に不溶性の物質の封入のために、作用物質を脂質と共に塩化メチレン又はクロロホルム中に溶かす：次いで本発明による空リポソーム（Ｌｅｅｒ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｎ）の製造のための前記の方法により作業する。

水溶性物質の封入のために、空リポソームの製造のための前記のように、脂質薄膜に（今は水溶性の作用物質を含有する）緩衝液を加える。引続き空リポソームの製造の際に記載されたように、更に処置する。遠心分離後の上澄みは充填されたリポソームに付加的に封入されなかった水溶性の作用物質も含有する。この遊離の作用物質骨は、リポソーム中に封入された分からゲルクロマトグラフィーによって分離されつる（リポソーム中（ＬｉｐｏｓｏＩａｅｓ）　：フロム・フィジカル・ストラフチャー・ツー・テラピーチツク・アプリケイショ　ン　（Ｆｒｏｍ　ｐｈｙｓｉｃａｌ、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｔｏ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）　（１９８１）　、１．　Ｃ，参照）。リポソームの濃縮は限外濾過によって殊に行なわれる（アミコン社（Ｆｉｒｍａ　Ａ＋Ｉｆｃｏｎ）又はサルトリウス社（５ａｒｔｏｒｉｕｓ）。リポソームの使用前に膜濾過器で滅菌濾過を有利に実施する（サルトリウス社（ＦｉｒｍａＳａｒｔｏｒｉｕｓ）　、孔径０．２μｍ）。

従って本発明の目的は、本発明によるリポソーム中に封入されている１種又は数種の作用物質を含有する薬剤調製物の製法でもあり、これは、一般式（Ｉ）の化合物少なくとも３モル％を含有する本発明によるリポソームの製法により作業しかつ水に不溶性の作用物質の封入のために、作用物質を脂質と一緒に溶解し、かつ水溶性の作用物質の封入のために脂質薄膜に水溶性の作用物質を含有する水性緩衝液を加えることを特徴とする。

殊に作用物質は肝臓に移送されなければならない。

殊に１個又は数個の作用物質は、例えば、静細胞剤（Ｚｙｔｏｓｔａｔｉｋａ）　（ヘキサデシルホスホコリン、１−オクタデシル−２−メチル−ラセミ（ｒ　ａ　ｃ）−グリピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）　、アドリアマイシン（＾ｄｒｉａＢｃｉｎ）　、シス−白金錯体、ノパントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎ）　）の群から、免疫ｍｍ物質（イン９−フエロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）　ａ、ＭＡＦ＝７クロフアージ・アクチペイティング・ファクター（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）　）の群から、抗真菌性作用物質（アムホテリシン（＾膳ｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）　Ｂ　）及び原虫疾患（マラリア、トリパノゾーマー及びライシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉｅｎ）−感染）に対する作用物質から選択される。

次の例で本発明を詳説するが、本発明は、これらに限定されるものではない。

他の記載のない限り、「量」及び「パーセント」表示は重量により、温度表示はセラ氏による。

燃脂質群Ａの本発明による化合物の製造の例ニ一般的方法：この化合物の製造のために、ａ）　式中のＲ３がＯＨ−基を表わす一般式（Ｉ）の化合物（次に一般式（ＩＩ）の化合物として表示する）を、ＰＯＣＩｓと自体公知の方法で反応させ、ｂ）　段階ａ）の反応生成物を、自体公知の方法で、一般式（■）：ＨＯ−＾Ｌｋ　−ｆｌａｔ　（ｍ　）［式中１１ａｌはＣ１、Ｂｒ又はＩを表わす］の化合物と反応させ、Ｃ）　段階ｂ）の反応生成物を、一般式（■）：の化合物と反応させる。

一般式（ｍ）の化合物では、臭素含有のものが有利である。

段階ａ）におけるオキシ塩化燐と一般式（ｎ）との反応は、殊に不活性の有機溶剤中で実施する。好適な溶剤の例は、ハロゲン化炭化水素、例えばクロロホルム及び四塩化炭素、芳香族炭化水素、例えばペンゾール又はドルオール及び脂肪族炭化水素、例えば石油エーテル及び同様のものである。環状有機溶剤、例えばテトラヒドロフランが同様に好適である。トリクロルエチレン及びテトラヒドロフランが有利であり、それというのもその場合に生成する塩、例えばトリエチルアミン−塩酸塩は、極めて僅少な溶解度を有しかつ従って沈殿しかつ濾過によって容易に分離されうるからである。反応はできるだけ水分を遮断して実施されなければならない。好適な温度は一１０〜５０’Ｃの範囲で、殊に１０〜３０℃である。しかしながら使用される物質及び溶剤に応じて、殆んどの場合に、それ以上 −及びそれ以下にある温度も使用される。

反応は、不活性有機塩基、例えばトリエチルアミン、ピリジン又はキノリンの存在で実施するのが有利である。

有利に、オキシ塩化燐を不活性溶剤中に溶がしかつ塩基を加える。次いで有利に同様に不活性溶剤中に溶かした一般式（ｎ）の化合物を添加する。これは殊に撹拌下で滴下によって行なう。反応は、円滑にかつ明白に進行するので、反応が滴下直後に終了するように、温度を、その場その場で選択することができ、このことは薄層クロマトグラフィーによる検査によって容易に確かめることができる。

段階ａ）の生成物を一般式（Ｉ［［）の化合物と混合すれば、段階ｂ）は円滑に進行する。有利に、このために、反応混合物に有機塩基、例えばトリエチルアミンの存在で一般式（ＩＩＩ）の化合物の溶液を加える。反応は、溶剤としてのテトラヒドロフランの使用下で２０〜６０℃の温度で有利に行なわれる。使用条件に応じて、反応時間は一般に約２０〜１２０分間である。

有利な条件下で、塩基のハロゲン化水素酸塩が沈殿しかつ除去される。最良の収率の達成のために、塩酸塩を後洗浄し、かつ洗浄液を反応溶液に再び添加する。

次いで溶剤を除去する。次いで残渣を場合によりテトラヒドロフラン中に溶かし、かつ弱アルカリ性水溶液、例えば水中の重炭酸ナトリウムで加水分解し、その際、殊にｐＨ−値５〜７を保つ。次いで有機溶剤、例えばジイソプロピルエーテル又はクロロホルムで抽出する。こうしてアルキルホスファチド酸のナトリウム塩が得られ、それは良好に再結晶することができる段階Ｃ）における反応、即ち、段階ｂ）の生成物とアミノ塩基との反応は、同様に一般に極性溶剤、例えばクロロホルム、−級、二級又は三級のアルコール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ニトロメタン又は水もしくはその混合物中で行なう。反応には使用出発物質の感受性に応じて、使用溶剤もしくは溶剤混合物の固化点及び沸点の間の範囲にある全ての温度が考えられる。反応は室温及び溶剤の沸点の間の温度で有利に行なわれる。例えば、反応は、５０℃で通例２〜８時間後に終了する。引続き反応生成物を単離しかつ再結晶させることができる。クロマトグラフィーによる精製も可能である。収率は一般に、出発生成物としてのジグリセリドに対して、理論値の５０％以上である。

所望の生成物の達成された高い収率は、驚異的である。それというのも反応成分中の多くの官能基では所望の方向での反応の円滑な経過は予期され得なかったからである。

前記の方法段階ａ）　、ｂ）及びＣ）は次のように実施するのが有利である：段階　ａ）トリクロルエチレン１０＊ｌ及びＰＯＣｌ３　６．６ｇ（０，０４４モル）に水浴中で０〜５℃で、トリクロルエチレン４０ｍ１及びトリエチルアミン９ｇ中に溶かした一般式（ｎ）のアルコール０．０４モルを加える。

アルコールがジアシルグリセリンである場合には、アシル移動の回避のためにアシル化混合物に順番にトリクロルエチレン１０冨ｌ中のトリエチルアミン９ｇ及び次いで直ちにトリクロルエチレン３０ＩＩｌ中のジアシルグリセリンを加える。ドルオール２５ｍ１を後洗浄に使用する。水浴を２０℃で水浴に代える。反応は２０℃で２０分間後にすでに終了する。

段階　ｂ）２０℃で、段階ａ）の反応混合物に、例えばテトラヒドロフラン７５糞！及びトリエチルアミン１３ｇ中に溶かした化合物（Ｉ［［）０．０４８モルを加え、かつ後洗浄のためにテトラヒドロフラン２５ｇ／を使用する。

３５℃で２０分間後に反応は終了する。濾過し、ドルオール５０■ｌ中で洗浄しかつ濃縮させる。加水分解は順番に氷水３０ｔＬ２分間後の１Ｍ酢酸ナトリウム３０■ｌ及びもう２分間後のテトラヒドロフラン９０重１の添加によって行なう。１２時間後に加水分解は終了する。実際に生成物だけが生ずる。

段階　Ｃ）Ｂ０段段階）の生成物（β−ブロムエチルエステル）０．０４モルをＣＨＣｌ３９０凋ｌ中に溶かし、イソプロパツール１５０ｆｆｉｌ並びに水中の４０％Ｎ、Ｎ、Ｎ。

Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン２００１１１を加える前記の方法で次の化合物Ｎ０９１〜８が得られる：１）１．２−シミリストイル−５ｎ−グリセロ−３ −ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’、Ｎ’、Ｎ’−トリメチルー二チルアンモニオ］）−エチルアンモニウムクロリドＣ４０Ｈ８２ＣＩＮ２０８Ｐ　（７８５，５）１．２−ジパルミトイル−誘導体とのＤＣ−比較により検出（物質２参照）２）１．２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３＝ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’、Ｎ’、Ｎ’−トリメチル一二チルアンモニオ］）−エチルアンモニウムクロリドＣ４４Ｈ９゜ＣｌＮ２０８Ｐ　（８４１，６）計算値（％）：　Ｃ６２，７９；　Ｈ１０，７８；　Ｎ　３．３３；　Ｐ　３．６８実測値（％）：　６２．５４；　１０．７１；　３．２１：　３．６７３）１．２−ジステアロイル−５ｎ− グリセロ−３−ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’、Ｎ’、Ｎ’−トリメチルーエチルアンモニオ］）−エチルアンモニウムクロリドＣ４８Ｈ（１８ＣＩＮ２０８Ｆ　（８９７，８）１．２−ジパルミトイル誘導体とのＤＣ−比較により検出（物質２参照）４）１．２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’　、Ｎ’　−ジメチル一二チルアミノ］）−エチルアンモニウムＣ４３Ｈ８フＮ２０８Ｐ　（７９１，２）計算値（％）：　Ｃ６５，２８：　Ｈ１１，０９；　Ｎ　３．５４；　Ｐ　３．９２実測値（％）：　６５．１１；　１１．０２；　３．４７；　３．８８５）１．２−ジヘキサデシルーｓｎ−グリセロー３＝ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’、Ｎ’、Ｎ’−トリメチル −エチルアンモニオ］）−エチルアンモニウムクロリドＣ４４Ｈｇ４ＣＩＮＣ４４Ｈ（８１３，７）１．２−ジパルミトイル誘導体とのＤＣ−比較により検出（物質２参照）６）１．２−ジオレイル−ラセミ（ｒ　ａ　ｃ）−グリセロ−３−ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’　。

Ｎ’、Ｎ’−１−リメチルーエチルアミノコ）−エチルアンモニウムクロリドＣ４６Ｈ９６ＣＩＮ２０ｓＰ　（８６５，８）計算値（％’）Ｉ　Ｃ６６，５９；　Ｈ１１，４１；　Ｎ　３．２４：　Ｐ　３．５ｇ実測値（％）＋　６６．４１：　１１．３５：　３．１９；　３．４５７）１．３−ジヘキサデシルーグリセロー２−ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’　、Ｎ’　、Ｎ’　−トＣ４４Ｈｇ４ＣＩＮＣ４４Ｈ（８１３，７）計算値（％）：　Ｃ６４，９５；　Ｈ１１，６５，Ｎ　３．４４；　Ｐ　３．８１実測値（％）・　６４．７９；　］、１．５９．　３．４２；　３．６９釦　１，３−ジオレオイル−ラセミ　（ｒａｃ）−グリセロ−３−ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’、Ｎ’、Ｎ’ −トリメチルアミノ］）−エチルアンモニウムクロリド計算値（％）：　Ｃ６６，５９；　Ｈ１１，４１；　Ｎ　３．２４；　Ｐ　３．５ｇ実測値（％）：　６６．５５：　１１．４０：　３．１１：　３．５５脂質群Ｂの化合物の製造：これら化合物の製造のために、Ｎ−保護されたグリシン誘導体（Ｎ−Ｚ又はＮ− ＢＯＣ）をＤＣＣ及びジメチルアミノピリジンの存在下に、ジアシルグリセリン又はジアルキルグリセリンでエステル化する。保護基を触媒的に水素で（Ｚ−誘導体にはＰｄ／Ｃ）又は酸性条件下で（ＢＯＣ−誘導体のために）除去する。

こうして製造したアミンをＮ、Ｎ−ジメチル誘導体又はＮ、Ｎ、Ｎ−トリメチル誘導体に変換することができる（Ｎ、Ｎ−ジメチル誘導体には：蟻酸の存在でホルムアルデヒド、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル誘導体には・硫酸ツメチルでベルメチル化によって）。

１．２−ジパルミトイル−５ｎ−３−グリセリン誘導体の製造の例で、製法を次に実例で詳説する：アンル化、　１，２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロン（０，１モル）及びＮ−α−Ｚ−グリセリン（０，１２モル）をＣＨ２Ｃｌ２　２００ｍ１中に溶かす。

２０〜２５℃で強力な撹拌下にＣＨ２Ｃｌ２２００翼！中のジシクロへキシルカルボジイミド（０，１２モル）及び４−ジメチル−アミノ−ピリジン（０，０２モル）よりなる溶液を滴下する。反応は２時間後に終了する。沈殿（ジシクロヘキシル尿素）を濾別しかつ濾液を回転蒸発させる。残渣を珪酸ゲル６０（メルク（Ｍｅｒｃｋ）０．２−０．５１．）のクロマトグラフィーにかける。溶離剤系としてヘキサン／ジイソプロピルエーテル１０：１．５：１．２：１及び１：１よりなる混合物が有効であった。１，２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３ −グリシンエステル−塩酸塩の収率は７５〜８５％であった。

１．２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−（Ｎ−α−Ｚ）−グリシンエステルＣ４！１Ｈ７７ＮＯ８（７６０，１１）計算値（蔦）：　Ｃ７１，１１：　Ｈ１０，２１：　Ｎ　１．８４；　０１６．８４実測値（％）：　７０．９９：　１０．１５；　１．７１１１Ｚ−保護基の触媒的離脱：１．２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−（Ｎ−α−Ｚ）−グリシンエステル（０，５モル）を、ＣＨＣＩｓ　／ＣＨｓＯＨ／氷酢酸　３００　：　８０　：　２０（Ｖ　／　Ｖ　）よりなる混合物４００　ｍｌ中に溶かす。５％のＰｄ／Ｃ−触媒５ｇの添加後に、Ｈ２の存在で、Ｈ２−吸収が止むまで撹拌する（　Ｈ２約１．２１の吸収）。

水に対して抽出し、かつクロロホルム相を溶剤から除去する。残渣をアセトンの添加により結晶させる。結晶を吸引濾過しかつ乾燥させる。出発生成物としての１．３−ジアシルグリセリンを用いて、１，３−誘導体を得ることができる。

相応して、ジアルキル化合物の製造時にも処置する。この際、出発生成物は１．２−ジアルキルグリセリン及び１，３−ジアルキルグリセリンである。

アミノ基のメチル化：　相応するグリシンエステル塩酸塩（０，０５モル）をジオキサン４００　ｍｌ及びアミノ酸１００ｍｒ中に溶かす。バラホルムアルデヒド（１モル）を加えかつ撹拌及び還流下で２時間加熱する。

溶剤を真空中で除去しかつ残渣をアセトンで沈殿させる。１．２−ジパルミトイル−５ｎ−３−（Ｎ、Ｎ　−ツメチル）−グリシンエステル−塩酸塩が約８５〜９５％の収率で得られる。

アミノ基のベルメチル化：　相応するグリシンエステル−塩酸塩（０，０５モル）を２−プロパツール３００ｍ１及びＣＨ２Ｃｌ２１００ｍ１中に溶かす。硫酸ジメチル（０，２モル）を加えかつ撹拌下に３０〜４０℃でＨ２Ｏ２００薦ｌ中のに２ＣＯ３（０，２モル）の溶液を滴下する。滴下後に３０℃でなお６０分間更に撹拌する。ＣＨＣｌ５　５００ｍｌ、　Ｈ２Ｏ５００ｍｌ及びＣＨｓＯＨ６００ｍｌを加える。強力な振盪後にクロロホルム相から溶剤を除去しかつ残渣にアセトンを加える。白色の結晶塊を吸引濾過しかつ乾燥させる。例えば１，２− ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−（Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル）−グリシンエステル−塩酸塩の収率は９０〜９５％である。

この方法により次に挙げる化合物Ｎｏ、　９〜１４を製造する。

９）１．２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−グリシンエステル、塩酸塩Ｃ３□Ｈ７２ＣＩＮＯ６（６６２，４）計算値（％）：Ｃ６７，０９；　Ｈ１０，９６；　Ｎ　２．１２実測値（％）：　６６、９８：　ｔｏ、　９３；　２．１４１０）１．２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−Ｎ、Ｎ−ジメチル− グリシンエステル、塩酸塩Ｃ３９Ｈフ、ＣｌＮ０．（６９０，５）計算値（％）：Ｃ６７，８４；　Ｈ１１，１０；　Ｎ　２．０３実測値（％）：　６７．７１．　１０．９５：　２．０２１１）　１．　２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−Ｎ、Ｎ、Ｎ−１−ツメチルーグリシンエステル、クロリドＣ４ＱＨ７ｇＣＩＮＯ８（７０４，５）計算値（％）：Ｃ６８，１９；　Ｈ１１，１６；　Ｎ　１．９９実測値（％）：　６ｇ、０７：　１１．１０；　１．８７１２）１．２−ジヘキサデシルーｓｎ−グリセロ−３−Ｎ、Ｎ、Ｎ−１−ツメチルーグリノンエステル、クロリドＣ４０Ｈ８２ＣＩＮＯ４（６７６，６）計算値（％）：Ｃ７１，０１；　Ｈ１２，２２；　Ｎ　２．０７実測値（％）：　７０．８９：　１２．１４；　２．０７１３）１．２−ジオレイル−グリセロ−２−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルーグリシンエステル、クロリドＣ４４Ｈ８６ＣＩＮＯ４（７２８，６）計算値（％）・Ｃ７２，５３：　Ｈ１１，９０；　Ｎ　１．９２実測値（％）：　７２．３９；　１１．８５＋　１．８４１４）　１．　３−ジオレオイル−グリセロ−２−Ｎ、Ｎ。

Ｎ−トリメチル−グリシンエステル、クロリドＣ４４Ｈ８２ＣＩＮ０６（７５６，５９４）計算値（％’Ｉ：Ｃ６９，８５；　Ｈ１０，９３；　Ｎ　１．８５実測値（％）＋　６９．７８：　１０．８２：　１．８１脂質群Ｃの化合物の製法：脂質を、３−ブロム−プロパンジオール−（１，２）からアシル化によって相応するジアシル化合物に変換しかつその後にアミノ化する。相応する１、３−化合物は１．３−ジアシルグリセリンから２段階で（メシル化、アミノ化）自体公知の方法で得られる。ニーチル鎖を有する化合物は、有利に自体公知の方法で、１．２−ジアルキル−又は１，３−シアルコイル−グリセリンを経て得られる；この際、同様に反応は２段階でメシル化及びアミノ化を経て行なわれる。

１．２−ジパルミトイル−誘導体の製造のために、例えば次のように処置するニジアルコイル化合物：　３−ブロム−１，２−ブ０パンジオール（０，１モル）、油酸（０，１２モル）及び４−ジメチル−アミノピリジン（０，０２モル）をテトラヒドロフラン２００８１中に溶かす。１０〜２０℃で強力な撹拌下に、ＣＨ２Ｃｌ２２００８１中のジシクロへキシルカルボジイミド（０，１２モル）の溶液を滴下する。２時間後にアシル化は終了する。生じたジシクロヘキシル尿素を濾別し、溶剤を真空中で除去する。生成物をクロマトグラフィーによって精製する（それについて群Ｂの化合物、アシル化参照）。３−ブロム−ジパルミトイル−プロパンジオール−（１，２）が８５〜９５％の収率で得られる。

Ｃｓ５ＨａフＢｒ０４　（６３１，８２１）計算値（％）：　Ｃ６６，５４；　Ｈ１０，６９実測値（％）：　６６．４６；　１０．６１アミノ化合物：　３− ブロム−ジパルミトイル−プロパンジオール−（１，２）（０，１モル）を溶剤混合物、ＣＨＣｌ５／２−プロパツール／２５％アンモニア水溶液　１００　：　４００　：　１００　（ｖ／ｖ）５００ｍｌ中で２４時間５０℃に加熱する。

溶剤を真空中で留去し、かつ残渣にＣＨＣｌ５３００■ｌ、０．５Ｎ　ＨＣＩ３００ｍｊ及びメタノール４００　ｍｌを加える。十分に振盪し、下相を分離する。溶剤の除去後に、珪酸ゲル６０（メルク、０．２−０．５ｍｇ）のクロマトグラフィーにかける。クロマトグラフィーのために次の溶剤混合物を使用する・ＣＨＣ’ｌｓ／　ＣＨ２０Ｈ／　Ｈ２０５００・５００・４０　（ｖ／ｖ）。１，２−ジパルミトイル−プロパンジオール−（１，２）−３−アミノ−塩酸塩の収率は、３−ブロモ−誘導体に対して約６０％である。

相応して、出発化合物０．１モルをＣＨＣｌ５／２−プロパツール／４０％のメチルアミン−、ジメチルアミン−又はトリメチルアミン−水溶液１００：４００：　１００　（ｖ／ｖ）よりなる混合物６００菖！中で５０℃に２４時間加熱することによって、Ｎ−メチルアミノ塩酸塩、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ塩酸塩、Ｎ、Ｎ。

Ｎ−トリノチルアンモニオクロリドを製造する。後処理はアンモニアとの反応のために記載したように行なう。

この溶剤混合物中で、他のアミンを相応する正に荷電された脂質、例えばジメチルアミノエタノール等に変換することもできる（このために同様に表示された物質のリストを参照）。

前記の方法により次の化合物Ｎｏ、　１５〜２２を製造した。

１５）　１．　２−ジパルミトイル−プロパンジオール−（１，２）−３−アミノ塩酸塩Ｃｓ５Ｈ７ｏＣＩＮＯ４（６０４，４）計算値（％）：Ｃ６９，５５＋　Ｈ１１，６７：　Ｎ　２．３２実測値（％）：　６９．４１；　１１．６３；　２．２６１６）　１．　２−ジオレオイル−プロパンジオール−（１，２）−３−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル−アンモニウム−クロリドＣ４２Ｈ８０ＣＩＮＯ４（６９８，６）計算値（％）ＩＣ？２．２２；　Ｈ１１，５４；　Ｎ　２．０１実測値（％）：　７２．０３：　１１．４８＋　１．８９１７）　１．　２−ジヘキサデシループロバンジオール−（１，２）−３−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル−アンモニウム−クロリドＣｓ５ＨｓｏＣＩＮＯ２（６１８，５）計算値（％）：Ｃ７３，７９；　Ｈ１３，０４；　Ｎ　２．２７実測値（％）＋　７３．６５；　１３．０１；　２．１５１ｇ）１．２−ジパルミトイル−プロパンジオール−（１，２）−３−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル−アンモニウム−クロリドＣ３１ＳＨ？６ＣＩＮＯ４（６４６，５）計算値（％）：Ｃ７０，６０；　Ｈ１１，８５；　Ｎ　２．１？実測値（％）：　７０．３８；　１１．７６：　２．１１１９）　１．　２−ジパルミトイル−プロパンジオール−（１，２）−３− Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ−塩酸塩Ｃ３７Ｈ７４ＣＩＮＯ４（６３２，５）計算値（％）：Ｃ７０，２７；　Ｈ１１，７９＋　Ｎ　２．２２実測値（％）：　７０．２１；　１１．７２；　２．１９２０）１．２−ジヘキサデソループロバンジオール−（１，２）−３−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−アンモニウム−クロリドＣ３９Ｈ８゜ＣｌＮ０ｓ（６４８，５）計算値（％）：Ｃ７２，２３；　Ｈ１２，７５；　Ｎ　２．１６実測値（％）　：　７２．１１　：　１２．６６　；　２゜０９２１）１．２−ジオレオイル−プロパンジオール−（１，２）−３−Ｎ、Ｎ−ツメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム−クロリドＣ４３Ｈ８゜ＣｌＮ０５（７２８，６）計算値（％）：Ｃ７０，８９；　Ｈ１１，３５：　Ｎ　１．９２実測値（％）：　７０．６４＋　１１．３１：　１．８９２２）　１．　２−ジオレイル−プロパンジオール＝（１゜３）−３−Ｎ、Ｎ −ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム−クロリドＣ４８８８８ＣＩＮＯ８（７００，６）計算値（％）：Ｃ７３，７２：　Ｈ１２，３７；　Ｎ　２．００実測値（％）・　７３．６８　；　１２．２５　；　２．０２本発明による空リポソームの製造第１表中に挙げた本発明によるリポソームＰＰＧＰＣ／Ｎ”　／Ｃｈｏｌ　（５０／　１０／　４０）を製造する。

ＰＰＧＰＣ（５ミリモル）、１，２−ジヘキサデシルーラセミ（ｒａｃ）−グリセロ−３−ホスホ−（Ｎ、　Ｎ−ジメチル−Ｎ−［Ｎ’、Ｎ’、Ｎ’　−トリメチルエチル−アミノ］）−エチル−アンモニウムクロリド（１ミリモル）及びコレステリン（４ミリモル）を、３種の成分に均質な混合を達成するために、ＣＨ２Ｃｌ２５０１１又はＣＨＣｌ３５０ｇ／中に加熱下に溶解する。

溶剤を真空中で除去し、微分配の脂質薄膜に水性緩衝液（全ての生理学的に使用可能な溶剤を使用することができる）２５０ｉ／を加える。引続き混合物を徐々の回転下で６０分間５０℃で保つ（一般に脂質の主変換温度の約５℃以上）。

ところで予備加熱した脂質懸濁液をフレンチ−プレス（アミコ社、シルバー・スプリング、ＵＳＡ）の圧力セルに移す。フレンチ−ブレスは水圧機及び最大充填容量４０ｍ１を有する鋼製の標準圧力セルより成る。

圧力セルの密閉後に圧力を２００００　ｐｓｉに高め、リポソーム分散液を一定の圧力下で狭い排出口を通して圧縮する。工程は少なくとも３回繰り返えされる。リポソーム分散液の遠心分離（ツルバール、ＲＣ−５８：５℃、２７０００ｇで３０分Ｍ）後に上澄を沈殿から取り去る。この時に、種々の試験に使用されるリポソームが得られる。

肝臓に移送されるべき水溶性作用物質を有する本発明によるリポソームの製造ＰＰＧＰＣ（５ミリモル）、１．２−ジヘキサデシルーラセミ（ｒａｃ）−グリセロ−３−ホスホ−（Ｎ、Ｎ−ジメチル−［Ｎ’、Ｎ’、Ｎ’　−トリメチルエチルーアミノ］）−エチル−アンモニウムクロリド（１ミリモル）及びコレステリン（４ミリモル）を、３種成分の均質な混合を達成するために、ＣＨＣＨ２Ｃｌ２５Ｏ又はＣＨＣ１ａ５０ｍＡ’中に加熱下で溶解する。溶剤を真空中で除去しかつ微分配の脂質薄膜に水性緩衝液（全ての生理学的に使用可能な溶剤を使用することができる）２５０＋＋７を加える。引続き混合物を徐々の回転下で６０分間５０℃で保つ（一般に脂質の主変換温度の約５℃以上）。ところで予備加熱した脂質懸濁液をフレンチ−ブレス（アミコ社、シルバー・スプリング、ＵＳＡ）の圧力セルに移す。フレンチ−プレスは水圧機及び最大充填容量４０ｍ１を有する鋼製の標準受圧器より成る。圧力セルの密閉後に圧力を２００００ｐＳｉに高め、リポソーム分散液を一定の圧力下で狭い排出口を通して圧縮する。工程は少な（とも３回繰り返される。リポソーム分散液の遠心分離（ツルバール、ＲＣ −５Ｂ　；　５℃、２７０００ｇで３０分間）後、上澄を沈殿から取り去る。この時に種々の試験に使用されるリポソームを得る。

この脂質懸濁液に、ＭＡＦ　（マクロファージ・アクチベイティング・ファクター（ｌｌａｋｒｏｐｈａｇｅ　ＡｃｔｉｖａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ）を７０μｇ／ｍｅの蛋白質濃度で含有する塩化ナトリウムの０．９％の溶液５Ｑｍ／を加える。この混合物を空リポソームの製造と同様にして圧力セル中で処置する。引続いての遠心分離後に上澄を沈殿から取り去り、セフ７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｃ１−４８（Ｌ　ＫＢ−ファルマシア（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）　、ゲル末技７０　ｃｍ）のゲルクロマトグラフィーにかける。それによって本発明によるリポソーム中に封入されないＭＡＦは封入されたＭＡＦからきれいに分離される。

後者はリポソームの大きさに基づき封入されなかったＭＡＦよりも明らかに僅少な溶離液量を必要とする（ＭＷ３００００）。リポソームは、使用のために濃縮されかつ滅菌濾過される。

要　約　書新規のリポソーム構造体が記載されており、これは、それが、一般式（Ｉ）：［式中Ｒ１は各々１４〜１８個のＣ−原子を有するアルコイル又はアルキル、オレオイル又はオレイルを表わし、Ｒ２はＲ１と同じ意味を有しくしかしＲ１はＲ２と同一であってはならない）、かつ更にＰＮＮを表わしてよく、ここで、Ａ＝ −Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋Ｈ２ＣＨ３、Ｎ　”Ｈ（ＣＨ１１）２　、Ｎ　”（ＣＨｓ）ｓを表わし、Ｒｓ　＝−０−Ｒ１、ＯＰＮＮ。

−０−Ｇ　Ｉ　Ｙ、Ｎ＋Ｈ８、Ｎ＋Ｈ，ＣＨ３、Ｎ　”Ｈ（ＣＨＳ）２又はＮ” （ＣＨｓ）ｓを表わし、ＲはＲ１、Ｒ２又はＲ３のために挙げた意味の１つを有し、かつｎは０〜３の整数、かつ殊に０を表わすが、分子は正の電荷を有する前記の基の１つを含有することを条件とする］の正の過剰電荷を有する化合物受なくとも１モル％を含有することを特徴とする本発明によるリポソームは、その臓器特異性の挙動に基づき、１種又は数種の肝臓活性の作用物質を本発明によるリポソーム中に封入して含有する臓器肝臓における疾患の治療のための薬剤調製物中の薬物担体として極めて好適である。

閏腔揖審磐失１ｍｓ＋ｗｋｎａｌ　Ａ□２にπ／肝９１１００７９６国際調査報告ＥＰ　９１００７９６ＳＡ　４６Ｂ２２

Claims

【特許請求の範囲】

１．一般式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中Ｒ１は各々１４〜１８個のＣ− 原子を有するアルコイル又はアルキル、オレオイル又はオレイルを表わし、Ｒ２はＲ１と同一の意味を有し（しかしＲ１はＲ２と同一であってはならない）かつ、更にＰＮＮ ▲数式、化学式、表等があります▼ 又は▲数式、化学式、表等があります▼を表わしてよく、ここで、Ａ＝−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋Ｈ２ＣＨ３、−Ｎ＋Ｈ（ＣＨ３）２、Ｎ＋（ＣＨ３）３を表わし、Ｒ３＝−Ｏ−Ｒ１、−Ｏ−ＰＮＮ、−Ｏ−Ｇｌｙ、Ｎ＋Ｈ３、Ｎ＋Ｈ２ＣＨ３、Ｎ＋Ｈ（ＣＨ３）２又はＮ＋（ＣＨ３）３を表わし、ＲはＲ１、Ｒ２又はＲ３のために挙げた意味の１つを有し、かつｎは０〜３の整数であるが、分子は正電荷を有する前記の基の１つを含有することを条件とする］の正の過剰電荷を有する化合物少なくとも１モル％を含有することを特徴とするリボソーム。
２．式（Ｉ）中のｎが０である、請求項１によるリボソーム。
３．それが、式（Ｉ）の化合物１〜３０モル％を含有する、請求項１又は２によるリポソ−ム。
４．それが、式（Ｉ）の化合物５〜１５モル％を含有する、請求項１〜３の１項によるリポソ−ム。
５．リボソームは、請求項１に記載の一般式（Ｉ）［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ及びｎは請求項１で挙げたものである］の正の過剰電荷を有する化合物少なくとも１モル％を含有する、肝臟に移送されるべきでありかつリボソーム中に封入されている１種又は数種の作用物質を含有する肝臓病の治療のための薬剤調製物。
６．式（Ｉ）中のｎが０である、請求項５に記載の薬剤調製物。
７．リボソームは、式（Ｉ）の化合物１〜３０モル％を含有する、請求項５又は６に記載の薬剤調製物。
８．リボソームは、式（Ｉ）の化合物５〜１５モル％を含有する、請求項５から７のいずれか１項に記載の薬剤調製物。
９．肝臓域の疾患の治療のための薬剤の製造のための、請求項１に記載の一般式（Ｉ）［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ及びｎは請求項１又は２に記載のものである］の化合物の使用。
１０．一般式（Ｉ）の化合物少なくとも１モル％を他のリボソ−ム成分と一緒に、一般式（Ｉ）の化合物と一緒に１００モル％になる量で、脂質懸濁液に変え、この脂質懸濁液を予備加熱し、かつこのように予備加熱された脂質懸濁液を、次いで圧縮及び遠心分離によって自体公知の方法でリボソームに変えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリボソームの製法。
１１．一般式（Ｉ）の化合物少なくとも１モル％を含有する本発明によるリボソームの製造のために請求項１０に記載の方法により作業し、かつ水に不溶性の作用物質の封入のために作用物質を脂質と一緒に溶解し、かつ水溶性の作用物質の封入のために脂質薄膜に水溶性の作用物質を含有する水性の緩衝液を加えることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか１項に記載の薬剤調製物の製法。