JPH0555116B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は発酵法によるＬ−トリプトフアン（以
下、トリプトフアンと記す）の製造法に関するも
のである。トリプトフアンは飼料添加物などとし
て有用なアミノ酸である。 （従来の技術） 従来トリプトフアンの製造法としては、トリプ
トフアンの前駆物質であるアントラニル酸、イン
ドール或いは３−インドールピルビン酸よりトリ
プトフアンを製造する方法が知られている。これ
に対し、本発明者たちは５−メチルトリプトフア
ン、５−フロロトリプトフアン等のトリプトフア
ンアナログに耐性を有するブレビバクテリウム
属、コリネバクテリウム属、バチルス属の微生物
を用いて糖類等の炭素源から直接発酵法によりト
リプトフアンを製造する方法を開発した（特公昭
48−18828、フランス特許公開2059715号、特公昭
53−39517）。またこれらの菌株にフエニルアラニ
ン、チロシン等の栄養要求性、フエニルアラニン
又はチロシンのアナログに対する耐性を付与する
ことにより（特公昭48−18828）、セリンアナログ
に対する耐性を付与することにより（特開昭57−
174096）、又はサルフアグアニジンに対する耐性
を付与することにより（特開昭59−192096、特開
昭60−137298）トリプトフアンの蓄積量が増加す
ることも明らかにした。 （本発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は従来技術に
よるトリプトフアンの発酵製造法により更に安価
な方法を開発するところにある。 （問題点を解決するための手段） 本発明者たちは上記問題点を解決すべく研究を
行つた結果ブレビバクテリウム属の従来知られて
いるトリプトフアン生産菌よりピルビン酸キナー
ゼ活性の低下又は欠失した変異株を誘導したとこ
ろ、従来のトリプトフアン生産菌より大量にトリ
プトフアンを生産することを見い出した。この発
明はこの知見に基づいて更に研究の結果完成され
たものである。 本発明のトリプトフアン製造法において用いら
れる微生物はブレビバクテリウム属に属しピルビ
ン酸キナーゼを低下又は欠失し、かつトリプトフ
アン生産能を有する変異株である。ピルビン酸キ
ナーゼ低下・欠失の他に更にフエニルアラニンア
ナログ、チロシンアナログ、アザセリン、サルフ
アグアニジン、インドールマイシン、デコイニン
等に対する薬剤耐性、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ
−チロシン、Ｌ−メチオニン等の栄養要求性を付
与せしめた菌株を用いることによりトリプトフア
ンの蓄積を増大させることができる。 本発明の変異株の元株は、いわゆるＬ−グルタ
ミン酸生産菌として知られているブレビバクテリ
ウム属の微生物である。例えば、ブレビバクテリ
ウム（スペース）フラバムATCC14067、ブレビ
バクテリウム（スペース）デイバリカタム
ATCC14020、ブレビバクテリウム（スペース）
ラクトフアーメンタムATCC13869、ブレビバク
テリウム（スペース）ロゼウムATCC13825等が
ある。本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株
を親株として変異操作を施してトリプトフアン生
成に必要な性質、例えば５−メチルトリプトフア
ン耐性及びピルビン酸キナーゼ活性低下又は欠失
を付与することにより得られる。この場合両性質
の付与の順序は任意に行なえば良い。なお変異操
作は通常の方法、例え紫外線照射或いはＮ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以
下NGと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理によつ
て行なうことができる。 以下に本発明の使用菌株の一例ブレビバクテリ
ウム（スペース）フラバムAJ12294（FERM Ｐ−
8740）の具体的誘導方法とそのピルビン酸キナー
ゼ活性を示す実験例を示す。 ブレビバクテリウム（スペース）フラバムAJ
−12293（FERM Ｐ−8739、５−フロロトリプト
フアン耐性、メタフロロフエニルアラニン耐性）
を親株として用いた。完全培地（酵母エキス10
ｇ／、ポリペプトン10ｇ／、塩化ナトリウム
５ｇ／、グルコース５ｇ／を含み、PH7.0）
で30℃、16時間培養した菌体を集め、0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）で洗滌後、同緩衝液に懸濁し
た。この懸濁液にNGを最終濃度が750μｇ／mlと
なるように加え、30℃15分間保持して変異処理を
行なつた（生残率13％）。この変異処理菌体を同
緩衝液で洗滌後、前記完全培地の寒天平板に接種
し、30℃にて５日間培養し、現われたコロニー約
28000個をレプリカ法により第１表に示すグルコ
ース最少寒天培地及びリボース最少寒天培地に接
種し、30℃にて２日間培養後前者には親株と同程
度生育するが後者には生育しないか生育の遅い株
40株分離した。これらのうちリボース最少寒天培
地にピルビン酸ナトリウム５ｇ／を添加した培
地に生育する株39株を見い出した。これらについ
てピルビン酸キナーゼ活性を測定することにより
ピルビン酸キナーゼの低下又は欠失した株４株分
離した。なおピルビン酸キナーゼ活性の測定は以
下に述べる方法によつた。第２表に示す培地で30
℃24時間振とう培養した菌体を0.2％塩化カリウ
ム水溶液で洗滌する。0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（PH7.5）に懸濁後20分間超音波処理で菌体を破砕
した。遠心分離により不溶性残渣を除去し上清を
0.05Mトリス−塩酸緩衝液で平衡化したセフアデ
ツクスＧ−25カラムでゲル濾過し粗酵素液を得
た。次いで第３表に示す組成の酵素反応液を20−
25℃に保持し、酵素添加による反応開始後の
340nmにおける吸光度減少の初速度を測定して、
ピルビン酸キナーゼ活性を求めた。なおアデノシ
ン−5′−ニリン酸を除いて同様の反応を行ない、
これを対照とした。活性は親株の値を100とした
相対値で表示した。AJ12294株のピルビン酸キナ
ーゼ活性と最少培地での生育を第４表に示す。 トリプトフアン生産用の培養培地は特に制限す
るところはなく、炭素源、窒素源、無機塩及び必
要ならば有機微量栄養素を含有する通常の培地で
ある。炭素源としては炭水化物（グルコース、フ
ラクトース或いはデンプン、セルロース等の加水
分解物、糖蜜等）、有機酸（酢酸、クエン酸等）、
アルコール（グリセリン、エタノール等）、或い
は炭化水素（ノルマルパラフイン等）が使用でき
る。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、アンモニアガス、その他を、無機塩と
してはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、鉄塩、マンガン塩、その他微量金属塩等を必
要に応じて使用する。有機微量栄養素としては、
栄養要求性のある場合には該当するアミノ酸、ビ
タミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量添加
し、必要に応じて更に生育促進物質としてアミノ
酸、ビタミン、未液（登録商標、大豆加水分解
物）、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等が使
用できる。 培養条件は通常の方法でPH５ないし９、温度は
20ないし40℃で好気的条件下に24ないし72時間培
養すれば良い。培養中にPHが下がる場合には炭酸
カルシウムを別殺菌して加えるか又はアンモニア
水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。又
有機酸を炭素源とする場合はPHの上昇を鉱酸又は
有機酸で中和する。 トリプトフアンの単離採取は常法によつて行い
うる。得られたものはペーパークロマトグラム上
のR_f値、エーリツヒ試薬によるトリプトフアン
特異反応、或いは微生物定量法による生物活性値
により、トリプトフアン標品のそれらと一致する
ことを確めトリプトフアンと同定した。 トリプトフアンの定量はロイコノストツク（ス
ペース）メセンテロイデス（ATCC8042）を用い
る微生物定量法によつて行なつた。 以下実施例にて説明する。 実施例 １ 第５表に示した組成のトリプトフアン生産用培
地20mlを500ml容のフラスコに分注し、これを第
６表に示す微生物をそれぞれ１白金耳量植えつけ
30℃で72時間振とう培養した。それぞれの培養液
中のトリプトフアン生成量は第６表のごとくであ
つた。

【表】

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【表】

【表】

【表】

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Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キ
   ナーゼ活性が低下又は欠失しかつＬ−トリプトフ
   アン生産能を有する微生物を液体培地中に好気的
   に培養し、培養液中にＬ−トリプトフアンを生成
   蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ
   −トリプトフアンの製造法。