JPH0429354B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0429354B2 JPH0429354B2 JP25004184A JP25004184A JPH0429354B2 JP H0429354 B2 JPH0429354 B2 JP H0429354B2 JP 25004184 A JP25004184 A JP 25004184A JP 25004184 A JP25004184 A JP 25004184A JP H0429354 B2 JPH0429354 B2 JP H0429354B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phenylalanine
- pyruvate kinase
- strain
- kinase activity
- fluorophenylalanine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
〔発明の目的〕
〈産業上の利用分野〉
本発明は発酵法によるＬ−フエニルアラニン
（以下、フエニルアラニンと記す。）の製造法に関
する。フエニルアラニンはペプチド系甘味料であ
るアスパルテームの原料として重要である。 〈従来の技術〉 従来発酵法によるフエニルアラニンの製造法と
してはブレビバクテリウム属又はミクロコツカス
属細菌のＬ−チロシン要求菌を使用する方法（特
公昭37−6345）、フエニルアラニンアナログに耐
性を有する変異株を使用する方法（特公昭551−
28712）などが知られている。 〈本発明が解決しようとする問題点〉 本発明が解決しようとする問題点は更に安価に
フエニルアラニンを製造することにある。 〔発明の構成〕 〈問題点を解決するための手段〉 本発明者等は発酵法により更に安価にフエニル
アラニンを製造する方法を開発すべく研究を行な
つた結果、ブレビバクテリウム属細菌にフエニル
アラニン生産能とともにピルビン酸キナーゼ活性
の低下という性質を併せ持たせたところ、従来の
ピルビン酸キナーゼ活性の低下を持たないフエニ
ルアラニン生産菌より更に大量にフエニルアラニ
ンを生産することを見い出した。この発明はこの
知見に基づいて更に研究の結果完成されたもので
ある。 本発明のフエニルアラニン製造法において用い
られる微生物は、ブレビバクテリウム属に属しピ
ルビン酸キナーゼ活性が低下していてかつフエニ
ルアラニン生産能に必要な性質、例えばｍ−フロ
ロフエニルアラニン耐性を有する変異株である。
これらの性質の他に更にＬ−チロシン要求性、他
のフエニルアラニンアナログ耐性、チロシンアナ
ログ耐性、５−メチルトリプトフアン耐性、デコ
イニン感受性などを付与すると生産能を更に向上
させることができる。 本発明の変異株の親株は、いわゆるＬ−グルタ
ミン酸生産菌として知られているブレビバクテリ
ウム属の微生物であり、例えば次のような菌株を
あげることができる。 ブレビバクテリウム フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム デイバリカタム ATCC
14020 ブレビバクテリウム ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム ロゼウム ATCC 13825 本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親
株として変異操作を施して、ピルビン酸キナーゼ
活性の低下及びフエニルアラニン生産能を付与す
ることによつて得られる。なお変異操作は通常の
方法、例えば紫外線照射或いはＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、
NGと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理によつて
行なうことができる。 なおピルビン酸キナーゼ活性の低下した変異株
は親株を変異処理し変異処理した菌体のピルビン
酸キナーゼ活性を測定し、選択することによつて
得ることができる（特開昭58−170487）。 以下に本発明の使用菌株の一例ブレビバクテリ
ウムフラバムAJ−12179（FERM−P7913）の具
体的誘導方法を示す。即ち特願昭58−170487記載
のピルビン酸キナーゼ活性低下株ブレビバクテリ
ウムフラバムAJ−11955（FERM−P6665、
FERMBP−2178）を親株として、これよりフエ
ニルアラニンアナログ耐性株を誘導した。ブレビ
バクテリウムフラバムAJ−11955を150μg／mlの
NGで30℃15分間処理した（生残率2.0％）。つい
で第一表に示す合成培地に親株が生育できない濃
度の800μg／mlになるようにフエニルアラニンの
アナログの一つであるDL−ｍ−フロロフエニル
アラニンを添加して平板培地を作製し、これに変
異処理したAJ−11955株を塗布し、30℃10日間放
置後、コロニーとして生育する菌株即ちｍ−フロ
ロフエニルアラニン耐性変異株を採取し、このう
ちフエニルアラニン生産能のすぐれた変異株AJ
−12179（FERM−P7913）（ピルビン酸キナーゼ
低下、ｍ−フロロフエニルアラニン耐性、Ｓ−
（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性）を採
取した。この変異株は実施例に示すようにピルビ
ン酸キナーゼ活性を有するｍ−フロロフエニルア
ラニン耐性フエニルアラニン生産変異株AJ−
12180（FERM−P7914）よりフエニルアラニンを
1.8倍も多く生成した。 次にこの操作によつて得られた変異株AJ−
12179のピルビン酸キナーゼ活性及びｍ−フロロ
フエニルアラニンに対する耐性の度合を親株AJ
−11955、野生株ATCC−14067、ピルビン酸キナ
ーゼ活性を有するフエニルアラニン生産株AJ−
12180と比較した結果をそれぞれ第二表、第三表
に示した。 なお、ピルビン酸キナーゼ活性の測定はAgric.
Biol.Chem.、48、(5)1189〜1197（1984）に従つて
行なつた。またｍ−フロロフエニルアラニンに対
する耐性の度合は次のように調べた。第一表に示
す合成培地にDL−ｍ−フロロフエニルアラニン
を第三表に示した濃度になるように溶解して、平
板培地（直径8.5cm）を作り、各々の培地に第四
表に示した培地に生育した菌をおよそ107コ接種
した後30℃で４日間培養を行ない生成したコロニ
ー数を調べた。 第二表及び第三表に示すようにAJ−12179株は
ピルビン酸キナーゼの低下及びｍ−フロロフエニ
ルアラニンに対して耐性の両性質を有しているこ
とが判明した。なお本発明で言うｍ−フロロフエ
ニルアラニン耐性とは上記培養条件下でDL−ｍ
−フロロフエニルアラニンを3000μg／ml含む上
記培地に微生物をおよそ107コ接種し30℃で４日
間培養後1000コ以上のコロニーを生成する場合を
言う。 フエニルアラニン生産用の培養培地は特に制限
するところはなく、炭素源、窒素源、無機塩及び
必要ならば有機微量栄養素を含有する通常の培地
である。炭素源としては炭水化物（グルコース、
フラクトース或いはデンプン、セルロース等の加
水分解物、糖蜜等）、有機酸（酢酸、クエン酸
等）、アルコール（グリセリン、エタノール等）、
或いは炭化水素（ノルマルパラフイン等）が使用
できる。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、アンモニアガス、その他を、無
機塩としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、マンガン塩、その他微量金属塩等
を必要に応じて使用する。有機微量栄養素として
は、栄養要求性のある場合には該当するアミノ
酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量
添加し、必要に応じて更に生育促進物質としてア
ミノ酸、ビタミン、味液（登録商標、大豆加水分
解物）、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等が
使用できる。 培養条件は通常の方法でPH５ないし９、温度は
20ないし40℃で好気的条件下に24ないし72時間培
養すれば良い。培養中にPHが下がる場合には炭酸
カルシウムを別殺菌して加えるか又はアンモニア
水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。又
有機酸を炭素源とする場合はPHの上昇を鉱酸又は
有機酸で中和する。 フエニルアラニンの単離採取は常法によつて行
いうる。得られたものはペーパークロマトグラム
のRf値及び微生物定量法による生物活性値によ
り、フエニルアラニン標品のそれらと一致するこ
とを確めフエニルアラニンと同定した。 フエニルアラニンの定量はロイコノストツクメ
センテロイデス（ATCC8042）を用いる微生物定
量法に従つて行なつた。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第五表に示した組成のフエニルアラニン生
産用培地20mlを500mlのフラスコに分注し、これ
に第六表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつ
け30℃で72時間振盪培養した。それぞれの培養液
中のフエニルアラニン生成量は第六表の如くであ
つた。 第一表 合成培地組成 グルコース 20g／ 硫酸アンモニウム ５ 〃 尿 素 ２〃 リン酸１カリウム １ 〃 硫酸マグネシウム １ 〃 硫酸第１鉄 10mg／ 硫酸マンガン ８ 〃 ｄ−ビオチン 50μg／ ビタミンB1・塩酸塩 2000μg／ 寒 天 20g／ PH6.6
（以下、フエニルアラニンと記す。）の製造法に関
する。フエニルアラニンはペプチド系甘味料であ
るアスパルテームの原料として重要である。 〈従来の技術〉 従来発酵法によるフエニルアラニンの製造法と
してはブレビバクテリウム属又はミクロコツカス
属細菌のＬ−チロシン要求菌を使用する方法（特
公昭37−6345）、フエニルアラニンアナログに耐
性を有する変異株を使用する方法（特公昭551−
28712）などが知られている。 〈本発明が解決しようとする問題点〉 本発明が解決しようとする問題点は更に安価に
フエニルアラニンを製造することにある。 〔発明の構成〕 〈問題点を解決するための手段〉 本発明者等は発酵法により更に安価にフエニル
アラニンを製造する方法を開発すべく研究を行な
つた結果、ブレビバクテリウム属細菌にフエニル
アラニン生産能とともにピルビン酸キナーゼ活性
の低下という性質を併せ持たせたところ、従来の
ピルビン酸キナーゼ活性の低下を持たないフエニ
ルアラニン生産菌より更に大量にフエニルアラニ
ンを生産することを見い出した。この発明はこの
知見に基づいて更に研究の結果完成されたもので
ある。 本発明のフエニルアラニン製造法において用い
られる微生物は、ブレビバクテリウム属に属しピ
ルビン酸キナーゼ活性が低下していてかつフエニ
ルアラニン生産能に必要な性質、例えばｍ−フロ
ロフエニルアラニン耐性を有する変異株である。
これらの性質の他に更にＬ−チロシン要求性、他
のフエニルアラニンアナログ耐性、チロシンアナ
ログ耐性、５−メチルトリプトフアン耐性、デコ
イニン感受性などを付与すると生産能を更に向上
させることができる。 本発明の変異株の親株は、いわゆるＬ−グルタ
ミン酸生産菌として知られているブレビバクテリ
ウム属の微生物であり、例えば次のような菌株を
あげることができる。 ブレビバクテリウム フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム デイバリカタム ATCC
14020 ブレビバクテリウム ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム ロゼウム ATCC 13825 本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親
株として変異操作を施して、ピルビン酸キナーゼ
活性の低下及びフエニルアラニン生産能を付与す
ることによつて得られる。なお変異操作は通常の
方法、例えば紫外線照射或いはＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、
NGと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理によつて
行なうことができる。 なおピルビン酸キナーゼ活性の低下した変異株
は親株を変異処理し変異処理した菌体のピルビン
酸キナーゼ活性を測定し、選択することによつて
得ることができる（特開昭58−170487）。 以下に本発明の使用菌株の一例ブレビバクテリ
ウムフラバムAJ−12179（FERM−P7913）の具
体的誘導方法を示す。即ち特願昭58−170487記載
のピルビン酸キナーゼ活性低下株ブレビバクテリ
ウムフラバムAJ−11955（FERM−P6665、
FERMBP−2178）を親株として、これよりフエ
ニルアラニンアナログ耐性株を誘導した。ブレビ
バクテリウムフラバムAJ−11955を150μg／mlの
NGで30℃15分間処理した（生残率2.0％）。つい
で第一表に示す合成培地に親株が生育できない濃
度の800μg／mlになるようにフエニルアラニンの
アナログの一つであるDL−ｍ−フロロフエニル
アラニンを添加して平板培地を作製し、これに変
異処理したAJ−11955株を塗布し、30℃10日間放
置後、コロニーとして生育する菌株即ちｍ−フロ
ロフエニルアラニン耐性変異株を採取し、このう
ちフエニルアラニン生産能のすぐれた変異株AJ
−12179（FERM−P7913）（ピルビン酸キナーゼ
低下、ｍ−フロロフエニルアラニン耐性、Ｓ−
（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性）を採
取した。この変異株は実施例に示すようにピルビ
ン酸キナーゼ活性を有するｍ−フロロフエニルア
ラニン耐性フエニルアラニン生産変異株AJ−
12180（FERM−P7914）よりフエニルアラニンを
1.8倍も多く生成した。 次にこの操作によつて得られた変異株AJ−
12179のピルビン酸キナーゼ活性及びｍ−フロロ
フエニルアラニンに対する耐性の度合を親株AJ
−11955、野生株ATCC−14067、ピルビン酸キナ
ーゼ活性を有するフエニルアラニン生産株AJ−
12180と比較した結果をそれぞれ第二表、第三表
に示した。 なお、ピルビン酸キナーゼ活性の測定はAgric.
Biol.Chem.、48、(5)1189〜1197（1984）に従つて
行なつた。またｍ−フロロフエニルアラニンに対
する耐性の度合は次のように調べた。第一表に示
す合成培地にDL−ｍ−フロロフエニルアラニン
を第三表に示した濃度になるように溶解して、平
板培地（直径8.5cm）を作り、各々の培地に第四
表に示した培地に生育した菌をおよそ107コ接種
した後30℃で４日間培養を行ない生成したコロニ
ー数を調べた。 第二表及び第三表に示すようにAJ−12179株は
ピルビン酸キナーゼの低下及びｍ−フロロフエニ
ルアラニンに対して耐性の両性質を有しているこ
とが判明した。なお本発明で言うｍ−フロロフエ
ニルアラニン耐性とは上記培養条件下でDL−ｍ
−フロロフエニルアラニンを3000μg／ml含む上
記培地に微生物をおよそ107コ接種し30℃で４日
間培養後1000コ以上のコロニーを生成する場合を
言う。 フエニルアラニン生産用の培養培地は特に制限
するところはなく、炭素源、窒素源、無機塩及び
必要ならば有機微量栄養素を含有する通常の培地
である。炭素源としては炭水化物（グルコース、
フラクトース或いはデンプン、セルロース等の加
水分解物、糖蜜等）、有機酸（酢酸、クエン酸
等）、アルコール（グリセリン、エタノール等）、
或いは炭化水素（ノルマルパラフイン等）が使用
できる。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、アンモニアガス、その他を、無
機塩としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、マンガン塩、その他微量金属塩等
を必要に応じて使用する。有機微量栄養素として
は、栄養要求性のある場合には該当するアミノ
酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量
添加し、必要に応じて更に生育促進物質としてア
ミノ酸、ビタミン、味液（登録商標、大豆加水分
解物）、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等が
使用できる。 培養条件は通常の方法でPH５ないし９、温度は
20ないし40℃で好気的条件下に24ないし72時間培
養すれば良い。培養中にPHが下がる場合には炭酸
カルシウムを別殺菌して加えるか又はアンモニア
水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。又
有機酸を炭素源とする場合はPHの上昇を鉱酸又は
有機酸で中和する。 フエニルアラニンの単離採取は常法によつて行
いうる。得られたものはペーパークロマトグラム
のRf値及び微生物定量法による生物活性値によ
り、フエニルアラニン標品のそれらと一致するこ
とを確めフエニルアラニンと同定した。 フエニルアラニンの定量はロイコノストツクメ
センテロイデス（ATCC8042）を用いる微生物定
量法に従つて行なつた。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第五表に示した組成のフエニルアラニン生
産用培地20mlを500mlのフラスコに分注し、これ
に第六表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつ
け30℃で72時間振盪培養した。それぞれの培養液
中のフエニルアラニン生成量は第六表の如くであ
つた。 第一表 合成培地組成 グルコース 20g／ 硫酸アンモニウム ５ 〃 尿 素 ２〃 リン酸１カリウム １ 〃 硫酸マグネシウム １ 〃 硫酸第１鉄 10mg／ 硫酸マンガン ８ 〃 ｄ−ビオチン 50μg／ ビタミンB1・塩酸塩 2000μg／ 寒 天 20g／ PH6.6
【表】
【表】
第四表 シード培養培地
グルコース 20g／
硫酸アンモニウム 10g／
尿 素 3g／
リン酸１カリウム 1g／
硫酸マグネシウム 0.4g／
硫酸第１鉄 10mg／
硫酸マンガン ８mg／
ｄ−ビオチン 300μg／ ビタミンB1・塩酸塩 100μg／
PH7.3
第五表 フエニルアラニン生産用培地
グルコース 130g／
硫酸アンモニウム 25g／
フマル酸 12g／
酢 酸 ３ml／
リン酸１カリウム 1g／
硫酸マグネシウム 1g／
硫酸第１鉄 10mg／
硫酸マンガン ８mg／
ｄ−ビオチン 200μg／
ビタミンB1・塩酸塩 2000μg／
「味液」 50ml／ 炭酸カルシウム（別殺菌） 50g／
PH6.5
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キ
ナーゼ活性が低下し、かつＬ−フエニルアラニン
生産能を有する微生物を液体培地中に好気的に培
養し、培養液中にＬ−フエニルアラニンを生成蓄
積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−
フエニルアラニンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25004184A JPS61128897A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25004184A JPS61128897A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61128897A JPS61128897A (ja) | 1986-06-16 |
| JPH0429354B2 true JPH0429354B2 (ja) | 1992-05-18 |
Family
ID=17201942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25004184A Granted JPS61128897A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61128897A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2202607C2 (ru) | 2000-03-03 | 2003-04-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Штамм бактерий methylophilus methylotrophus - продуцент l-фенилаланина (варианты), способ получения l-фенилаланина |
| CN103319349A (zh) * | 2013-07-02 | 2013-09-25 | 南京大学 | 一种间硝基苯胺生产工艺 |
-
1984
- 1984-11-27 JP JP25004184A patent/JPS61128897A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61128897A (ja) | 1986-06-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |