JPH0563156B2

JPH0563156B2 -

Info

Publication number: JPH0563156B2
Application number: JP13893988A
Authority: JP
Inventors: Masae Takeuchi; Tooru Yonehara
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1988-06-06
Filing date: 1988-06-06
Publication date: 1993-09-09
Also published as: JPH01309691A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞本発明は、工業的に有利なＤ−アラニンの製造
法に関する。

Ｄ−アラニンは、非天然型アミノ酸であるが、
それ自体試薬としてあるいはペプチドなどの合成
原料として有用な化合物であり近年その需要も増
加している。

＜従来の技術＞従来より、ブレビバクテリウム属に属する微生
物により発酵法によつてDL−アラニンを製造す
る方法は数多く知られている〔アミノ酸発酵（下
巻）第119頁、共立出版（昭和47年出版）〕。

また、DL−アラニンを原料とし、Ｌ−アラニ
ンを酵母に資化させることによるＤ−アラニンを
調製する方法も知られている（Amino Acid・
Nuclic Acid，1967、第15号、89−94）。

＜発明が解決しようとする課題＞しかしながら、DL−アラニンを製造した場合
には、Ｄ−アラニンのみを取得するために何らか
の光学分割操作が不可避であり、また微生物を用
いてDL−アラニンからＬ−アラニンのみを資化
させてＤ−アラニンを得る方法では、原料の約半
分しか有効利用できないことになる。

そこで本発明者らは、微生物を用いてＬ−アラ
ニンを選択的にＤ−アラニンに変換させることに
より、さらに安価で簡便なＤ−アラニンの製造法
を提供することを課題として鋭意研究した。

＜課題を解決するための手段＞その結果、本発明者らは、ブレビバクテリウム
属に属する微生物が驚くべきことにＬ−アラニン
を効率よくＤ−アラニンに変換することを見出
し、本発明を完成した。ところでかかる方法によ
るＤ−アラニンの生産方法はいかなる微生物を用
いるものもいまだ知られておらず、まつたく新規
な技術である。

すなわち本発明は、ブレビバクテリウム属に属
し、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変換する能力
を有する微生物を用いて、Ｌ−アラニンをＤ−ア
ラニンに変換せしめ、生成蓄積したＤ−アラニン
を採取することを特徴とするＤ−アラニンの製造
法に関するものである。なお、Ｌ−アラニンは純
度100％のものを用いる必要はなく任意の割合で
Ｄ体を含むものも使用できる。

次に、本発明を詳細に説明する。

本発明で用いられる微生物は、ブレビバクテリ
ウム属に属し、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変
換する能力を有する微生物であり、かかる性質を
有していれば、他の要求性、薬剤抵抗性の性質を
もつもので本発明の範囲に含まれる。

本発明で用いられる株の代表的なものとして
は、たとえば、ブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンタムDCSR17−２（微工研条寄第2024号）
が挙げられる。この株は、ブレビバクテリウム・
ラクトフアーメンタムATCC13869（ビオチン要求
性）より誘導されたもので、Ｄ−シクロセリンに
対して耐性を有する変異株であり、適当な条件下
でＤ−アラニンを発酵生産することができる。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によつて比
較的容易にできる。すなわち、Ｄ−シクロセリン
に耐性を有する変異株を得るには、親株を紫外線
照射するかあるいは変異誘発剤（たとえば、Ｎ−
メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロシグアニジン、
エチルメタンスルホン酸など）で処理したのち、
親株が十分に生育できないような量のＤ−シクロ
セリンを含む培地で親株に比べて有意に生育可能
な菌株を取得すればよい。

本発明方法で使用する菌を培養する培地として
は、通常微生物の培養に汎用される各種栄養源を
使用できる。たとえば炭素源としてはグルコー
ス、糖蜜、デンプン加水分解液などの糖類、酢酸
などの有機酸、エタノールなどのアルコール類、
安息香酸などの有機化合物、窒素源としては、硫
安、硝安、塩安、リン安、尿素、アンモニア、そ
の他を利用でき、無機アンモニウム塩の種類によ
つてはたとえばリン酸塩、炭酸カルシウムなどの
無機塩を必要とする場合もある。また、上記培地
には微生物の生育をよくするためにたとえば有機
窒素源、ビタミン、微量の金属イオンなどを添加
するのが好ましいが通常安価な味液、コーンスチ
ープリカーなどの添加によつて十分それらの目的
を達成することができる。

本発明において、上記微生物の培養は、培地を
振盪もしくは通気撹拌するごとき好気的条件下に
実施するのが好ましい。培養温度は通常20〜40
℃、とりわけ30℃付近にあることが好ましい。ま
た、培地のPHは通常５〜９であり、好ましくは、
中性付近に維持することが望ましい。

かくして数日間培養したのち、その培養液に直
接もしくは分離菌体を含む反応液にＬ−アラニン
もしくはＬ−アラニンを任意の割合で含むＤ，Ｌ
−アラニンを添加し、さらに数日間培養すれば培
地中にＤ−アラニンが生成蓄積する。

また、培養培地にあらかじめＬ−アラニンを添
加して滅菌し、微生物を接種して数日間培養して
も培地中にＤ−アラニンが生成蓄積する。なお、
Ｌ−アラニンを任意の割合で含むＤ，Ｌ−アラニ
ンを用いても同様な結果が得られる。培養終了
後、生成したＤ−アラニンは、たとえばイオン交
換法、吸着法、沈澱法などの公知の単離精製操作
を組合せて用いることにより容易に採取すること
ができる。

＜実施例＞以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。

実施例１（菌株の取得）ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869（ビオチン要求性）の菌体に常法によ
りＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン処理（300μg／ml、30℃で10分）したの
ち、この細胞をＤ−シクロセリン50mg／ｌを添加
した寒天培地（グルコース２％、硫安１％、リン
酸第１カリウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水
和物0.04％、塩化ナトリウム0.05％、尿素0.25％、
硫酸第１鉄・７水和物10mg／ｌ、硫酸マンガン・
４水和物10mg／ｌ、ビオチン50μg／ｌを含む完
全合成培地）に塗布した。次に30℃で５〜７日培
養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離して、Ｄ
−シクロセリン耐性株（ブレビバクテリウム・ラ
クトフアーメンタムDCSR−26）を取得した。

得られたブレビバクテリウム・ラクトフアーメ
ンタムDCSR−26をさらに同様の処理を施し、同
様の培地で培養しＤ−シクロセリン高耐性株（ブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
DCSR17−２）を取得した。

実施例２（分離菌体法）グルコース10％、硫安３％、リン酸第１カリウ
ム0.05％、リン酸第２カリウウ0.05％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.025％、味液２％、炭酸カ
ルシウム３％、ビオチン30μg／ｌを含む培地
（PH7.25）40mlを1lエルレンマイヤーフラスコに
分注し、120℃、10分間オートクレーブ滅菌した
培養培地に、ブレビバクテリウム・ラクトフアー
メンタムDCSR17−２を１白金耳接種し、30℃で
５日間培養した。培養液より菌体を遠心分離し、
グルコース４％、リン酸第１カリウム0.05％、リ
ン酸第２カリウム0.05％、硫酸マグネシウム・７
水和物0.025％、味酸２％、炭酸カルシウム３％、
ビオチン30μg／ｌ、Ｌ−アラニン４％を含む無
アンモニア源反応液（PH7.25）40mlに懸濁し、30
℃で45時間反応した結果、反応液中に38.6ｇ／ｌ
のＤ−アラニンが蓄積した。一方、Ｌ−アラニン
を添加しない反応液を同様に反応させた結果、ア
ラニンの蓄積は0.5ｇ／ｌ以下であつた。

Ｄ体およびＬ体のアラニンの分析は市販のＤ−
アミノ酸オキシダーゼを用いる酵素法によりおよ
び住友化学OA−1000光学分割用カラムを用いて
高速液体クロマトグラフイー（HPLC）で測定し
た。

実施例３（分離菌体法）実施例２と同様の方法で培養後分離したブレビ
バクテリウム・ラクトフアーメンタムDCSR17−
２の菌体をグルコース４％、リン酸第１カリウム
0.05％、リン酸第２カリウム0.05％、硫酸マグネ
シウム・７水和物0.025％、味液２％、炭酸カル
シウム３％、ビオチン30μg／ｌ，Ｄ，Ｌ−アラ
ニン４％を含む無アンモニア源反応液（PH7.25）
40mlに懸濁し、30℃で45時間反応した結果、反応
液中に39.7g／ｌのＤ−アラニンが蓄積した。

一方、Ｄ，Ｌ−アラニンを添加しない反応液を
同様に反応させた結果、アラニンの蓄積は0.5
ｇ／ｌ以下であつた。

Ｄ体およびＬ体のアラニン分析は実施例２と同
様に行つた。

実施例４実施例２と同様の培養培地にブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムDCSR17−２を接種
し、30℃で３日間培養しDL−アラニン20ｇ／ｌ
を添加した。さらに64時間培養した結果、第１図
のごとく培地中に48.8ｇ／ｌのＤ−アラニンが生
成蓄積した。

この培養液200mlから菌体を遠心分離して除去
し得られる上澄液を脱色炭処理した。この脱色炭
処理液を強力カチオン交換樹脂ダイヤイオンSK
−1B（H⁺型）を充填したカラムに通搭してＤ−
アラニンを吸着させ、水洗後2Nアンモニア水で
溶出し、Ｄ−アラニンの分画を濃縮し、得られた
濃縮液にエタノールを加え析出する結晶を口取し
た。この結晶をエタノールにより再結晶すること
によりＤ−アラニンの結晶7.2ｇを得た。

光学純度 99.4％比旋光度〔α〕²⁵ _D＝−14.2°（Ｃ＝６，1N−HCl）Ｄ体およびＬ体のアラニン分析は実施例２と同
様に行つた。

一方、Ｄ，Ｌ−アラニンを添加せずにそのまま
培養した場合、第１図のごとく30.9ｇ／ｌのＤ−
アラニンしか生成蓄積せず、Ｄ，Ｌ−アラニン20
ｇ／ｌよりＤ−アラニン17.9ｇ／ｌが生成蓄積で
きたことになる。

＜発明の効果＞本発明によれば、微生物を用いてＬ−アラニン
をＤ−アラニンに交換することが可能になつた。
そのためDL−アラニンの光学分割あるいはＬ−
アラニンの資化が不要となり、安価かつ簡便に
DL−アラニンを取得することができるようにな
り、その工業的価値は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例４において培養時間と培地中の
Ｄ−アラニン蓄積量との関係を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

１ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
に属し、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変換する
能力を有する微生物を用いて、Ｌ−アラニンをＤ
−アラニンに変換せしめ、生成蓄積したＤ−アラ
ニンを採取することを特徴とするＤ−アラニンの
製造法。