JPS6291191A - Ｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、Ｌ−イソロイシンの製造法に関するものであ
る。

本発明によればＤ−α−アミノ酪酸もしくはＤＬ−α−
アミノ酪酸から収率よくＬ−イソロイシンを製造するこ
とができる。

Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸として、人間および動
物の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医療、食
品、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつ
ある。

先行技術 Ｌ−イソロイシンの工業的製造法としては、他のアミノ
酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成法
ではＬ体のみの製造は困難であり、主に発酵法により生
産が行なわれている。発酵法としてはＤＬ−α−アミノ
酪酸、スレオニン等のＬ−イソロイシンの前駆物質を使
用する方法（＃公昭４３−８７０９、同４０−２８８０
各号公法等）と前駆物質を特に加えない所謂直接発酵法
（特公昭３８−７０９１、特開昭４９−９３５８６各号
公報等）がある。

その中でα−アミノ酪酸を前氾体とするＬ−イソロイシ
ンの製造法では、α−アミノ酪酸は化学合成法によりＤ
Ｌ体が最も容易に、安価に入手できるので前、躯体とし
てＤＬ−α−アミノ酪酸がよく用いられる。

しかしながら、Ｄ−もしくはＤＬ−α−アミン酪酸を用
いるＬ−イソロイシンの発酵法においては、Ｌ体のα−
アミノ酪酸はすみやかに消費され、Ｌ−イソロイシンの
蓄積が認められるが、一方り体のアミノ酪酸からのＬ−
イソロイシンの生産速度は非常に低いことが判明した。

従ってＤ−又はＤＬ−α−アミノ酪酸を前駆体として用
いる場合には、Ｄ−α−アミノ酪酸からのＬ−イソロイ
シンの生成速度を増大させることにより、全体としてさ
らに効率的にＬ−イソロイシンを製造することが期寺さ
れる。

発明の要旨 本発明者らは、上記課題を解決すべくＤ−又はＤＬ−α
−アミノ酪酸を前駆体とする、培養法によるＬ−イソロ
イシンの製造法につき鋭意検討を行い本発明を完成した
。

即ち、本発明は、Ｄ−α−アミノ酪酸もしくはＤＬ−α
−アミノ酪酸を添加した培地に微生物を培養してＬ−イ
ソロイシンを製造する方法において、該培地にＤ−α−
アミノ酪酸をラセミ化する酵素又は該酵素を含有する微
生物又はその処理物を共存させることを特徴とするＬ−
イソロイシンの製造法を提供するものである。

発明の効果 本発明の方法によれば、工業的に安価に入手可能なり一
又はＤＬ−α−アミノ酪酸から、高い生産性で収率よく
製造することができる。しかも、本発明の方法に用いら
れるし一インロイシンを生成する微生物は、変異株等の
特殊の微生物だと殊に優れた上記効果を奏するが、これ
らの微生物でなくても優れた上記効果を奏する。

発明の詳細な説明 本発明に用いられるＤ−α−アミノ酪酸もしくはＤＬ−
α−アミノ酪酸を添加した培地において培養するとＬ−
イソロイシンを生成する微生物としては、特に限定され
るものではないが例えば、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（ｉ工研菌寄第３０６８号、特公昭５７
−２６７５５号参照）あるいは、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（微工研菌寄第３８
１２号、特公昭５９−２８３９８号参照）等が好適に用
いられる。

又、Ｄ−α−アミノ酪酸をラセミ化する酵素又は該酵素
を含有する微生物又はその処理物としては、Ｄ−α−ア
ミノ酪酸に作用し、Ｌ−イソロイシンに作用しない性質
を有しているものであれば自身又はその処理物又はこれ
らから得られたラセミ化酵素がある。

本発明において用いられる培地の組成は、Ｄ−α−アミ
ノ酪酸もしくはＤＬ−α−アミノ酪酸を含有するもので
あれば、炭素源、窒素源、無機塩等は公知のα−アミノ
酪酸を用いて発酵法によりＬ−イソロイシンを製造する
時に使用されるもの等が、窒素源としてはアンモニア、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いること
が出来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−イソロイノン生成に必要であれば、ペ
プトン、陶工そス、酵母エキス、コーンステイープリカ
ー、カザばノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
し用いることもできる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行ない、培養
温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行なう
。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近に
て行ない、培養中のｐＨの調整に（ｌ−ｉ酸、アルカリ
を添加して行なう。

ＤＬ−α−アミノ酪酸又はＤ−α−アミノ酪酸の添加１
農度は、０．１〜５俄１％、好ましくは０．２５〜３重
１％である。

Ｄ−α−アミノ酪酸をラセミ化する酵素の添加は、培養
初期から添加してもよく、もしくは培養液中のＤ−α−
アミノ酪酸の比率の上昇に見会って添加してもよい。ま
た該酵飛は酵素の形暢で添加しても、該酵素を含む菌体
の形憧もしくはこれらを固定したものを用いてもよい。

培養液からのＬ−イソロイシンの回収は、培養液を遠心
分離等にかけて菌体等の除却後、公知の手法、すなわち
イオン交換樹脂処理法あるいは、沈澱法等により容易に
行なうことが出来る。

実験例 以下の実験例において、Ｌ−イソロイシンの定性ハ、ペ
ーパークロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動度、
微生物定量法による生物活性値により確認した。定量は
ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ８０４２
を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速抜本クロマト
グラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）とを併用して行なった。

また下記の例において％と表わしたのは電縫％を意味す
る。

参考例１　　（Ｄ−α−アミノ酪酸ラセミ化酵素の調製
） 下記培地組成Ａの培地１００ａ＃を５００ｄ容三角フラ
スコに分注して１２０℃、１５分間滅菌処理したものに
、シュードモナス・プチダＩＦＯ１２９９６を一白金耳
量接種し、３０℃にて２４時間振盪培養（前培養とする
）後、上記と同じ培地組成Ａの培地１ｔを５を容三角フ
ラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したもの
に前培養物の２１１１を接種したものを更に３０℃にて
２４時間振盪培養した。

培養終了液１ｔを遠心分離して菌体を集め、これを純水
に懸濁せしめて２０ｄとし、これに４．２２のアクリル
アミド、０．２８ｆのＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アク
リルアミド、４％β−（ジメチルアミノ）−プロピオニ
トリル３ｄおよび２％禍塩素酸カリウム２ｄを加えて室
温にて１５分間靜装して反応させて菌体を保有する重合
物を得た。次いでこの重合物である反応生成物を粉砕し
、純水で洗浄することにより、固定比菌体３０ｆを得、
これをＤ−α−アミノ酪酸ラうミ叱酵素源とした。

なお、菌体の固定化操作はすべて無菌操作で実施した。

培地組成人 肉エキス　　１％ ペプトン　　１％ ＮａｃｔＯ，５％ ｐＩ（７，２ 実施例１ 前培養地（尿ｆｉ　０．４％、硫酸アンモニウム１．４
％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％
、Ｍｇ５Ｏｔ・７ＨｚＯｏ、ｏ　５％、ＣａＣ１Ｉ＆　
０２　ｐｐｍ　。

Ｆｅ５Ｏａ・７Ｈ２０２ｐｐｍ、　Ｍｎ５０４１〜６Ｈ
２０２ｐｐｍ。

ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｒｎ％　　Ｎａｃｔ２ｐｐ
ｍ、　　ビオチン２００７１９／Ａｓ　チアミン−）Ｉ
ｃｔｌ　００ｐ９／ｌ。

カザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１０−を２
４８犬型試験管に分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）した
後ＭＪ　−２３３−ＡＢ−４１（微工研菌寄第３８１２
号）を植菌し、無菌的にエタノールを０．３４加え、３
０℃にて２日間振盪培養を行なった。

次に本培養培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．
４％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５
％、Ｍｇ５Ｏ４ｅ７Ｈ２００，０５％、０℃１ｚ１１２
Ｈ２０２ｐｐｍ。

ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐ７Ｈ２Ｏ２ｐｐ・４〜６Ｈ
２０２ｐｐ６Ｈ２Ｏ２ｐｐ・７Ｈｚ０２　ｐｐｍ、　Ｎ
ａＣｔ２　ｐｐｍ、　　ビオチン２００μ？／１１　チ
アミンｅＨＣｔ　１００μ２／１１コーンステイープリ
カー１０厘ｔ／ｌ、ＤＬ−α−アミノ酪酸０．５％）１
０ｄを、２４０大型試験管に分注、滅菌後（滅菌ｔ＆　
ｐＨ’ｒ、０　）Ｎ　前培養液を０．１　ｄと参考例１
で調製した固定化菌体２？を添加し、無菌的にエタノー
ルを０．３　ｄ加え、３０℃にて５日間振盪培養を行な
う。エタノールは消費にともない添加する。（この時エ
タノールは３容敬％を越えないようにする。また全エタ
ノール消費量は６．５容計％であった。）培養５白目に
Ｌ−イソロイシンが培養液１を当抄５．５　を蓄積され
た。

培養液から菌体その他不純物を除いた濾液を、強酸性陽
イオン交換樹脂（Ｈ型）のカラムに通して、Ｌ−イソロ
イシンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶
出したのち、Ｌ−イソロイシン画分を凝縮し、冷エタノ
ールでＬ−イソロイシンの結晶を析出させ、培養液１を
当り３．６２の粗結晶を得た。

なお、参考例１で調製した固定化菌体を添加しない場合
には、培地中のし一インロイシンの蓄積は培養液１を当
り３．０１であった。

実施例２ 実施例１と同様の条件で前培養を行った。次に本培養培
地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ２
ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ４Ｇ、０５％、ＭｇＳＯ
４・７Ｈ２００，０５％、Ｃａｃｔｚ　・２Ｈ２０２ｐ
ｐｍ。

ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、　Ｍｎ５Ｏｔ　・４〜
６Ｈ２０２ｐｐｍ。

ＺｎＳＯ４・７Ｈｚ０２ｐｐｍ、　　Ｎａｃｔ２ｐｐｍ
、　　ビオチン２００μｔ７ｔ、　チアミン＠ＨＣ２１
００μ？／１１コーンステイブリカー１０　ｌｌｌ１／
　ＬＸＤ−α−アミノ酪酸０．２５％）１０−を、２４
ｆｆ大型試験管に分注、滅菌後（滅菌後ｐＨ７，０）、
前培養液を０．１ｄ植菌し、無菌的にエタノールをＱ、
３　ｓＬｌ加え、３０℃にて５日間振盪培養を行なう。

エタノールは消費にともない添加する。（この時エタノ
ールは３容量％を越えないようにする。また全エタノー
ル消費量は６．５容量％であった。）培養５日目にＬ−
イソロイシンが培養液ＩＬ当り３．Ｏｆ蓄積された。

実施例１と同様の操作によりＬ−イソロイシンの結晶を
析出させたところ、培養液１を当り２．０２の粗結晶で
あった。

なお、参考例１で調製した固定化菌体を添加しない場合
には、培養液１を当り０．２ｆのし一イソロイシンが生
成蓄積された。

実施例３ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（微工研菌
寄第３０６８号）を用いた以外は実施例１と同様の条件
で前培養を行った。次に本培養培地（尿素Ｏ１’　％Ｎ
　ｆＡ酸アンモニウム１．４％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５
％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，１０
０，０５％、　ＣａＣ６２ｅ２Ｈ２０２ｐｐｍ、　　Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、　ＭｎＳＯ４ｍ　４〜６
Ｈ２０２ｐｐｍＸＺｎ５Ｏ＋−７Ｈ２０２ｐｐｍＸＮａ
Ｃｔ２　ｐｐｍ、　　ビオチン２００１’ｆ／ｌｚ　ｆ
　７　イン・ＨＣＩ　１００　ｆｉｔ　／　ｔ、　コ−
ンステイプリカ−１０ｗ／　４　　Ｄ　Ｌ−α−アミノ
酪酸Ｏ，Ｓ％）１０ｄを、２４戸大型試験管に分注、滅
菌後（滅菌後ｐＨ７，０）、前培養液を０．１−植菌し
、無菌的にエタノールを０．３ｄ加え、３０℃にて５日
間振盪培養を行なう。エタノールは消費にともない添加
する。（この時エタノールは３容量％を越えないように
する。また全エタノール消費量は６．５６盪％であった
。）培養５日目にＬ−イソロイシンが培養液１を当り３
．８２蓄積された。

実施例１と同様の操作によりＬ−イソロイシンの結晶を
析出させたところ、培養液１を当り２．４ｔの粗帖晶で
あった。

なお、参考例１で調製した固定化菌体を添加しない場合
には、培養液１を当り２．２２のＬ−イソロイシンが生
成蓄積された。

実施例４ 実施例３と同様の条件で前培養を行った。次に本培養培
地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ２
ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、ＭｇＳＯ
４・７ＨｓＯＯ，０５％、ＣａＣ１ｚ　拳２Ｈｓ　Ｏ２
ｐｐｍ　％ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２０２ｐｐｍＸＭｎＳＯ４
・４〜６Ｈ２０２ｐｐｍｓＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐ
ｍ、　ＮａＣ１２ｐｐｍ、　　ビオチン２００　ｐ？／
ｌ、チアミニ／　−ＨＣｌ２００　ｐ？／ｌ。

コーンステイープリカー１０ｍｌ／　Ｌ、　　Ｄ　　ａ
−７ミノ酪酸０．２５％）１ＯＮｌを、２４８大型試験
管に分注、滅菌後（滅菌後ｐｆ（７，０）、前培養液を
０．１−と参考例１で調製した固定化菌体２ｔを添加し
、無菌的にエタノールを０．３４加え、３０℃にて５日
間振盪培養を行なう。エタノールは消費にともない添加
する。（この時エタノールば３容量％を越えないように
する。また全エタノール消費量は６．５容量％であった
。）培養５日目にＬ−イソロイシンが培養液１を当り１
．７を蓄積された。

培養液から菌体その他不純物を除いた濾液を、強酸性陽
イオン交換樹脂（Ｈ型）のカラムに通して、Ｌ−イソロ
イシンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶
出したのち、Ｌ−イソロイシン画分を凝縮し、冷エタノ
ールでＬ−イソロイシンの結晶を析出させ、培養ｉ１を
当ｊｌ）　１．１９の粗結晶を得た。

なお、参考例１で調製した固定化菌体を添加しない場合
には、培地中のし一インロイシンの蓄積は培養液１を当
り０．２２でちった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｄ−α−アミノ酪酸もしくはＤＬ−α−アミノ酪
   酸を添加した培地に微生物を培養してＬ−イソロイシン
   を製造する方法において、該培地にＤ−α−アミノ酪酸
   をラセミ化する酵素又は該酵素を含有する微生物又はそ
   の処理物を共存させることを特徴とするＬ−イソロイシ
   ンの製造法。