JPH0579943B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0579943B2 JPH0579943B2 JP59170962A JP17096284A JPH0579943B2 JP H0579943 B2 JPH0579943 B2 JP H0579943B2 JP 59170962 A JP59170962 A JP 59170962A JP 17096284 A JP17096284 A JP 17096284A JP H0579943 B2 JPH0579943 B2 JP H0579943B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- antibody
- acetylcholinesterase
- antigen
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
- C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/88—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving prostaglandins or their receptors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
［技術の背景］
本発明はイムノアツセイに好適な標識用酵素に
係る。 高等な脊椎動物において、抗原は高い結合エネ
ルギを持つた可逆的複合体を抗体と共に形成する
ことの可能な特異抗体の生成を引き起こし得るこ
とが知られている。ハプテンは、動物に注入され
ると抗体を形成しないが、抗体と反応する低分子
量物質である。ハプテンに対するこれらの抗体
は、例えばハプテン及びタンパク質の複合化合物
を動物又はヒトに注入した時に生成され得る。 抗原−抗体又はハプテン−抗体反応は、酵素免
疫法のような免疫分析法を用いて所与の媒質中で
ハプテン、抗原又は抗体の濃度を測定するために
使用され得る。この場合、反応は抗体、抗原又は
ハプテンと、抗原、抗体又はハプテンのいずれか
であり得る酵素により標識された分子との間で行
なわれる。 酵素により標識された分子の性質に応じて免疫
定量は２つのタイプに分けられる。標識分子が抗
原又はハプテンの時、「競合型定量
（determination by competition）」又は「試薬
量限定型定量（determination in ａ limited
reagent quantity）」が挙げられる。この場合、
定量原理は限定数の抗体部に対して、標識したハ
プテン又は抗原と抗原又はハプテンとを競合させ
ることに基づいている。従つて、免疫定量を行な
うには、一定量の抗体及び限定量の抗原又はハプ
テンの標識分子を可変量のハプテン又は抗原と反
応させることにより検量線を形成する必要があ
る。抗原−抗体平衡形成後、混合物を分別し、溶
液中に遊離している抗原又はハプテンから標識複
合体を分離させ、結合フラクシヨン（複合体）又
は遊離フラクシヨン（標識ハプテン又は抗原）の
酵素活性を測定することにより、異なつた抗原又
はハプテン濃度に対応する活性を測定し、検量線
を表示することができる。検量線が表示される
と、定量中に観察された酵素活性に対応するハプ
テン又は抗原濃度を得るべく同一の方法を適用
し、検量線を参照することにより、試料の抗原又
はハプテン濃度を測定することができる。 標識分子が抗体の時、「免疫測定」法又は「試
薬過剰」定量法が用いられる。この方法にはいく
つかの種類があるが、そのうち最も重要な３種類
の方法について説明する。 「従来型」免疫測定定量法 このタイプの定量法は、放射性物質により標識
された抗体を使用する免疫放射線定量法
（IRMA）として知られている。 第１段階 抗原をヨウ素化された抗体過剰と反応させる。 Ag＋Ac＊AgAc＊＋Ac 第２段階 固相に固定された抗原（抗原過剰）に抗体過剰
を吸着させる。
係る。 高等な脊椎動物において、抗原は高い結合エネ
ルギを持つた可逆的複合体を抗体と共に形成する
ことの可能な特異抗体の生成を引き起こし得るこ
とが知られている。ハプテンは、動物に注入され
ると抗体を形成しないが、抗体と反応する低分子
量物質である。ハプテンに対するこれらの抗体
は、例えばハプテン及びタンパク質の複合化合物
を動物又はヒトに注入した時に生成され得る。 抗原−抗体又はハプテン−抗体反応は、酵素免
疫法のような免疫分析法を用いて所与の媒質中で
ハプテン、抗原又は抗体の濃度を測定するために
使用され得る。この場合、反応は抗体、抗原又は
ハプテンと、抗原、抗体又はハプテンのいずれか
であり得る酵素により標識された分子との間で行
なわれる。 酵素により標識された分子の性質に応じて免疫
定量は２つのタイプに分けられる。標識分子が抗
原又はハプテンの時、「競合型定量
（determination by competition）」又は「試薬
量限定型定量（determination in ａ limited
reagent quantity）」が挙げられる。この場合、
定量原理は限定数の抗体部に対して、標識したハ
プテン又は抗原と抗原又はハプテンとを競合させ
ることに基づいている。従つて、免疫定量を行な
うには、一定量の抗体及び限定量の抗原又はハプ
テンの標識分子を可変量のハプテン又は抗原と反
応させることにより検量線を形成する必要があ
る。抗原−抗体平衡形成後、混合物を分別し、溶
液中に遊離している抗原又はハプテンから標識複
合体を分離させ、結合フラクシヨン（複合体）又
は遊離フラクシヨン（標識ハプテン又は抗原）の
酵素活性を測定することにより、異なつた抗原又
はハプテン濃度に対応する活性を測定し、検量線
を表示することができる。検量線が表示される
と、定量中に観察された酵素活性に対応するハプ
テン又は抗原濃度を得るべく同一の方法を適用
し、検量線を参照することにより、試料の抗原又
はハプテン濃度を測定することができる。 標識分子が抗体の時、「免疫測定」法又は「試
薬過剰」定量法が用いられる。この方法にはいく
つかの種類があるが、そのうち最も重要な３種類
の方法について説明する。 「従来型」免疫測定定量法 このタイプの定量法は、放射性物質により標識
された抗体を使用する免疫放射線定量法
（IRMA）として知られている。 第１段階 抗原をヨウ素化された抗体過剰と反応させる。 Ag＋Ac＊AgAc＊＋Ac 第２段階 固相に固定された抗原（抗原過剰）に抗体過剰
を吸着させる。
【化】
第３段階
２相の分離と上清生成物の計数。
２部位型免疫定量法（サンドイツチ法）
第１段階
抗原を固相に吸着された第１の抗体（抗体過
剰）と反応させる。
剰）と反応させる。
【化】
第２段階
抗原の別の部位を認識する標識抗体（過剰抗
体）の付加。
体）の付加。
【化】
第３段階
洗浄による標識抗体過剰の除去と固相の計数。
固定化抗原を使用する特異抗体の定量
このタイプの測定法は酵素トレーサを使用する
場合、２部位型免疫定量法と同様にELISA法
（Enzymo−Linked−Immuno−Sorbent−
Assay）として知られている。 第１段階 特異抗体を固定化抗原（抗原過剰）と反応させ
る。
場合、２部位型免疫定量法と同様にELISA法
（Enzymo−Linked−Immuno−Sorbent−
Assay）として知られている。 第１段階 特異抗体を固定化抗原（抗原過剰）と反応させ
る。
【化】
第２段階
二標識抗体（又は標識プロテインＡ）固相に固
定された抗体と反応させる。
定された抗体と反応させる。
【化】
第３段階
洗浄による二標識抗体過剰の除去と固相の計
数。 （上記式中、 Ag ：抗原、 Ac1s ：抗原の第１の特異抗体、 Ac1os ：抗原の第１非特異抗体、 Ac2＊ ：第２の標識抗体である。） 上記全方法は以下に示す共通の特徴を有する。 −抗体は直接又は抗体が反応し得る他の標識分子
を介して標識され、これらの抗体の特異的試薬は
「第２抗体」又はStaphylococcus aureusのプロ
テインＡとすることができる。 −抗体又は抗原又はハプテンであり得る反応体の
１個が、反応した抗体を溶液中に遊離している抗
体から分離するために固相に固定される（定量法
、及び参照のこと）。 −抗体又は抗原又はハプテンのいずれかであり得
る反応体の１個以上が１個以上の他の反応剤に比
較して著しく過剰であり、従つて、これらの方法
は「試薬過剰型」方法と呼称される。 上記分類に加えて、酵素免疫定量法の２分類、
即ち「ホモジニアス（homogeneous）」及び「ヘ
テロジニアス（heterogeneous）」定量法の相違
について述べる。ホモジニアス定量法は、対応す
る抗体又は抗原に結合すると標識分子の活性が変
化するという事実を利用している。この場合、反
応混合物の酵素活性は抗原−抗体複合体の形成に
使用される標識分子の割合に直接関係する。従つ
て、分離を行なう必要がなく、酵素活性の測定は
反応媒質中で直接実施され得る。 一方、「ヘテロジアニス」酵素免疫定量法では
複合体の形成に使用された酵素によつて標識され
た分子の酵素活性は変化しないので、分離プロセ
スを使用する必要がある。この場合、複合体、又
は遊離抗原又は抗体の酵素活性を測定するため
に、抗原−抗体複合体を反応媒質から分離するこ
とが必要である。現在最も発達した酵素免疫定量
法は、この分野に該当する。 使用される酵素は定量の性能を決定するので上
記のいずれの定量法でも非常に重要な役割を果た
し、以下の用件を満足し得ることが必要である。 １ 標識抗原、ハプテンは抗体分子が良好な条件
下で生成され得るように純粋状態の酵素を大量
に使用することができる。 ２ 非常に少量の抗原−抗体複合体、従つて、試
料中の非常に少量の抗原、ハプテン又は抗体を
測定することができるように、酵素を高感度で
検出し得る。当然のことながらこの検出感度は
酵素の触媒定数に依存するが、更に酵素反応生
成物の測定感度にも依存する。 ３ 酵素定量が非常に簡単である。 ４ 標識分子を形成すべく抗原、ハプテン又は抗
体と反応し得る反応基が酵素中に存在する。 ５ 標識保存条件下での酵素の安定性。 ６ 酵素の酵素活性が定量媒質の酵素活性と一致
せず、定量の妨げとなる因子を持たない。 ７ 酵素物質の自己消化が最小である。 ［発明の概要］ 研究の結果、Electrophorus Electricus（電気
ウナギ）のアセチルコリンエステラーゼ
（acetylcholinesterase）は免疫酵素定量での使用
に最適な特徴を備える酵素であることが明らかに
なつた。従つて、免疫酵素定量において標識分子
として使用可能な化合物を生成するための前記酵
素の使用方法が提供される。 上記化合物は、抗体、抗原及びハプテンから選
択された分子が共有結合又は可逆的結合により酵
素に結合されたものから成り、酵素が
Electrophorus Electricus（電気ウナギ）のアセ
チルコリンエステラーゼから構成されることを特
徴とする。 前記酵素を使用する結果、良好な条件下で酵素
免疫定量を実施することができる。 アセチルコリンエステラーゼ（E.C.3.1.1.7）は
コリンのエステルを迅速に加水分解する酵素群の
一部であり、アセチルコリンが最良の基質である
ことを特徴とする。アセチルコリンエステラーゼ
は、多数の動物組織及び脊椎動物の中枢及び末梢
神経系に非常に広く分布している。又、
Electrophorus ElectricusやTorpedo
Marmorata等の特定の魚類の電気器官では特に
濃度が高いことが認められている。電気ウナギの
電気器官におけるアセチルコリンエステラーゼの
濃度は鳥類又は哺乳類の脳における濃度の100倍
である。電気ウナギの電気器官に含まれる酵素
は、アフイニテイクロマトグラフイを使用して単
一段階で迅速且つ簡単に精製される。前記精製
は、いずれも少なくとも部分的に疎水性であり且
つ安定性の低いTorpedo Marmorata、鳥類又は
動物のアセチルコリンエステラーゼの精製に較べ
て著しく容易に実施され得る。 更に、電気ウナギのアセチルコリンエステラー
ゼは触媒定数が非常に高いので、比色定量により
約10-13Ｍの濃度まで検出され得る。この検出感
度は、酵素免疫法で使用される主な酵素、即ち
Raifortペルオキシターゼ（E.C.1.11.1.7）、
Escherichia Coli β−ガラクトシダーゼ（E.
C.3.2.1.23）及び子ウシ腸アルカリホスフアター
ゼ（E.C.3.1.3.1）を用いる場合より著しく高い。 加えて、電気ウナギアセチルコリンエステラー
ゼは、酵素学的に使用可能な標識化合物を形成す
べく抗原、ハプテン又は抗体の特定の反応基と反
応し得る反応基、例えばリシル、チロシル、ヒス
チジル、トリプトフアニル及びグルタミル基を有
する。更に、前記酵素は好適な媒質中に保存され
るなら、−20℃又は−173℃で非常に安定である。 従つて、電気ウナギアセチルコリンエステラー
ゼを酵素トレーサとして使用すると、他のアセチ
ルコリンエステラーゼ及び酵素免疫学分野で現在
使用されている他の酵素のいずれと比較しても多
くの利点が生じる。 本発明に従うと、電気ウナギアセチルコリンエ
ステラーゼ（EC3.1.1.7）は電気ウナギの電気器
官から得られ、アフイニテイクロマトグラフイに
より精製される。特に、Bon他によりEur.J.
Biochemical 68，pp.531−539，1976中に開示さ
れた方法を使用することが可能であり、電気ウナ
ギの電気器官１キログラムから数日間で約30mgの
純粋な酵素を獲得することができる。 Bon他によりAnn.Rev.Neurosci.，1982，５，
pp.57106中に開示されているように、アセチルコ
リンエステラーゼはA12、A8、A4、G4、G2及び
G1と呼称される数種類の分子形で存在すること
が知られている。電気ウナギの電気器官では
A12、A8及びG4形が主要であり、純粋酵素が蓄積
されると、A12及びA8形間の共有集合体が自然形
成され得る。 本発明に従うと、化合物はA12、A8及びG4のよ
うな自然分子形、並びにこれらの分解により得ら
れる分子形、即ちA4、G2及びG1、更には非対称
形間の共有集合体から形成され得る。 本発明に従うと、抗原又はハプテンにより構成
される分子は、医薬、例えば鎮痛薬、抗生物質、
抗けいれん剤、抗糖尿病剤、抗高血圧剤、抗腫よ
う剤、バルビツール酸塩、心臓抑制剤、強心配糖
体、幻覚剤、殺虫剤、筋肉弛緩薬、ステロイド、
興奮剤、タバコアルカロイド及びトランキライザ
から選択され得る。前記分子は血しようタンパク
質又はホルモン、例えばポリペプチド、ステロイ
ド又は他の小分子によつても構成され得る。 例えば、抗原はIgG、IgE、ハプトグロビン、
アルフア−２−Ｈ−グロブリン、アルフア−FP、
CEA及びPAM等の血清タンパク質であり得、ホ
ルモンは、HCG、HPL、TSH、インシユリン、
エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾール及
びチロキシンであり得、医薬は、バルビツール酸
塩、阿片剤、メタドン、アンフエタミン、ジゴキ
シン及びゲンタマイシンであり得る。 分子は更に特定の病原体、例えば
Echinococcosisgranulosus、Trichinella
Spiralis、Toxoplasmagondii、Treponema
pallidum、サルモネラＯ抗原、Escherichia
Coli、風疹ウイルス、Trypanosoma brucci、
Trypanosoma cruzi、Schistosoma mansoni、
Schistosoma haematobium、Plasmodium
berghei、Plasmodium knowlesi及びVibrio
choleraeの抗体によつても形成され得る。分子は
特にモノクローナル抗体から形成され得る。 以下、分子としてＰ物質、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、ロイコトリエン、トリイド
チロニン（T3）、抗ヒトIgE抗体を使用した例に
ついて説明する。 本発明に従うと、抗原、ハプテン及び抗体から
選択される分子に電気ウナギアセチルコリンエス
テラーゼを共有結合によつて結合させるために、
酵素に支持された反応基、例えばリシル、チロ
ル、ヒスチジル、トリプトフアニル又はグルタミ
ル基を、抗原、ハプテン又は抗体に支持された反
応基、例えば酸基、アミン基、フエニル基、ヒド
ロキシル基又はケトン基と反応させる。この反応
は特に、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、
ベンジジン、混合アンヒドライド、活性ハプテン
エステル及びパラアミノフエニル酢酸等の試薬を
用いて、一般に使用されている結合反応により実
施され得る。 本発明に従うと、抗原、ハプテン又は抗体間の
結合は、アビジンとビオチン又は抗原と抗体の結
合と同様に、非共有可逆的結合により得られる。 従つて、本発明を利用した抗原、ハプテン及び
抗体から選択された分子を電気ウナギアセチルコ
リンエステラーゼと反応させることから成る。 本発明の一具体例に従うと、分子がＰ物質であ
る時、まずＰ物質をパラアミノフエニル酢酸の活
性エステルと反応させることによりＰ物質の誘導
体を生成し、こうして得られた誘導体を電気ウナ
ギアセチルコリンエステラーゼと反応させる。 本発明を利用した別の具体例に従うと、分子が
プロスタグランジン、トロンボキサン又はトリヨ
ードチロニンである時、まずプロスタグランジン
の活性エステルを生成し、こうして得られたエス
テルを電気ウナギアセチルコリンエステラーゼと
反応させる。 有利な点として、活性エステルは分子の遊離酸
をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させるこ
とにより得られる。 分子がロイコトリエンである場合、電気ウナギ
アセチルコリンエステラーゼと反応させる以前に
分子をジニトロフルオロベンゼンと反応させるこ
とによりまず中間化合物を生成する。 分子が抗体、例えば抗ヒトIgE抗体である場
合、ビオチンの活性エステルを使用してまずビオ
チンを抗体及び電気ウナギアセチルコリンエステ
ラーゼに共有結合で固定する。 抗体と酵素との結合は、ビオチンの分子と結合
して非常に安定な複合物を形成するアビジンを用
いて行なわれる。 本発明を利用した化合物は特に、「ホモジニア
ス」又は「ヘテロジニアス」定量法のいずれかを
使用して試料の抗原、抗体又はハプテン濃度を測
定すべく酵素免疫定量プロセスにおいてマーカ又
はトレーサとして使用され得る。 ヘテロジニアス定量法を使用する場合、酵素−
標識化分子の結合フラクシヨンと遊離フラクシヨ
ンとの分離は、従来方法、例えば第２の抗体を介
して沈降させることにより実施される。同様に、
抗原又は抗体が固定される担体から構成される固
相を使用してもよい。このような定量の場合、ア
セチルコリンエステラーゼの酵素活性は、実施が
格別簡単であり且つ約-13Ｍの酵素濃度を検出す
ることの可能な従来方法、特にEllman他により
Biochemical Pharmacology 1961，Vol.7，
pp.88−95中に記載されている方法を用いて測定
され得る。 ［発明の実施例］ 本発明の他の特徴及び利点は、添付図面を参考
に非限定的な例示として与えられる以下の実施例
から明らかになろう。 実施例 １： Ｐ物質（SP）の免疫酵素定量用
酵素トレーサの生成。 前記物質は下記のアミノ酸配列順序に対応す
る。Arg−Pro−Lys−Pro−Gln−Gln−Phe−
Phe−Gly−Leu−Met−NH2。 Ｐ物質と電気ウナギアセチルコリンエステラー
ゼと共有結合化合物を生成するために、パラアミ
ノフエニル酢酸（PAPA）との共役によりＰ物質
の中間誘導体を生成すること、及びこうして得ら
れた誘導体をジアゾニウム塩を介して酵素と結合
させることから成る２段階を使用した。 ａ Ｐ物質の中間誘導体の生成。 まず、下記の反応式に従いＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（NHS）を用いてパラアミノフエニ
ル酢酸（PAPA）の活性エステルを生成した。
数。 （上記式中、 Ag ：抗原、 Ac1s ：抗原の第１の特異抗体、 Ac1os ：抗原の第１非特異抗体、 Ac2＊ ：第２の標識抗体である。） 上記全方法は以下に示す共通の特徴を有する。 −抗体は直接又は抗体が反応し得る他の標識分子
を介して標識され、これらの抗体の特異的試薬は
「第２抗体」又はStaphylococcus aureusのプロ
テインＡとすることができる。 −抗体又は抗原又はハプテンであり得る反応体の
１個が、反応した抗体を溶液中に遊離している抗
体から分離するために固相に固定される（定量法
、及び参照のこと）。 −抗体又は抗原又はハプテンのいずれかであり得
る反応体の１個以上が１個以上の他の反応剤に比
較して著しく過剰であり、従つて、これらの方法
は「試薬過剰型」方法と呼称される。 上記分類に加えて、酵素免疫定量法の２分類、
即ち「ホモジニアス（homogeneous）」及び「ヘ
テロジニアス（heterogeneous）」定量法の相違
について述べる。ホモジニアス定量法は、対応す
る抗体又は抗原に結合すると標識分子の活性が変
化するという事実を利用している。この場合、反
応混合物の酵素活性は抗原−抗体複合体の形成に
使用される標識分子の割合に直接関係する。従つ
て、分離を行なう必要がなく、酵素活性の測定は
反応媒質中で直接実施され得る。 一方、「ヘテロジアニス」酵素免疫定量法では
複合体の形成に使用された酵素によつて標識され
た分子の酵素活性は変化しないので、分離プロセ
スを使用する必要がある。この場合、複合体、又
は遊離抗原又は抗体の酵素活性を測定するため
に、抗原−抗体複合体を反応媒質から分離するこ
とが必要である。現在最も発達した酵素免疫定量
法は、この分野に該当する。 使用される酵素は定量の性能を決定するので上
記のいずれの定量法でも非常に重要な役割を果た
し、以下の用件を満足し得ることが必要である。 １ 標識抗原、ハプテンは抗体分子が良好な条件
下で生成され得るように純粋状態の酵素を大量
に使用することができる。 ２ 非常に少量の抗原−抗体複合体、従つて、試
料中の非常に少量の抗原、ハプテン又は抗体を
測定することができるように、酵素を高感度で
検出し得る。当然のことながらこの検出感度は
酵素の触媒定数に依存するが、更に酵素反応生
成物の測定感度にも依存する。 ３ 酵素定量が非常に簡単である。 ４ 標識分子を形成すべく抗原、ハプテン又は抗
体と反応し得る反応基が酵素中に存在する。 ５ 標識保存条件下での酵素の安定性。 ６ 酵素の酵素活性が定量媒質の酵素活性と一致
せず、定量の妨げとなる因子を持たない。 ７ 酵素物質の自己消化が最小である。 ［発明の概要］ 研究の結果、Electrophorus Electricus（電気
ウナギ）のアセチルコリンエステラーゼ
（acetylcholinesterase）は免疫酵素定量での使用
に最適な特徴を備える酵素であることが明らかに
なつた。従つて、免疫酵素定量において標識分子
として使用可能な化合物を生成するための前記酵
素の使用方法が提供される。 上記化合物は、抗体、抗原及びハプテンから選
択された分子が共有結合又は可逆的結合により酵
素に結合されたものから成り、酵素が
Electrophorus Electricus（電気ウナギ）のアセ
チルコリンエステラーゼから構成されることを特
徴とする。 前記酵素を使用する結果、良好な条件下で酵素
免疫定量を実施することができる。 アセチルコリンエステラーゼ（E.C.3.1.1.7）は
コリンのエステルを迅速に加水分解する酵素群の
一部であり、アセチルコリンが最良の基質である
ことを特徴とする。アセチルコリンエステラーゼ
は、多数の動物組織及び脊椎動物の中枢及び末梢
神経系に非常に広く分布している。又、
Electrophorus ElectricusやTorpedo
Marmorata等の特定の魚類の電気器官では特に
濃度が高いことが認められている。電気ウナギの
電気器官におけるアセチルコリンエステラーゼの
濃度は鳥類又は哺乳類の脳における濃度の100倍
である。電気ウナギの電気器官に含まれる酵素
は、アフイニテイクロマトグラフイを使用して単
一段階で迅速且つ簡単に精製される。前記精製
は、いずれも少なくとも部分的に疎水性であり且
つ安定性の低いTorpedo Marmorata、鳥類又は
動物のアセチルコリンエステラーゼの精製に較べ
て著しく容易に実施され得る。 更に、電気ウナギのアセチルコリンエステラー
ゼは触媒定数が非常に高いので、比色定量により
約10-13Ｍの濃度まで検出され得る。この検出感
度は、酵素免疫法で使用される主な酵素、即ち
Raifortペルオキシターゼ（E.C.1.11.1.7）、
Escherichia Coli β−ガラクトシダーゼ（E.
C.3.2.1.23）及び子ウシ腸アルカリホスフアター
ゼ（E.C.3.1.3.1）を用いる場合より著しく高い。 加えて、電気ウナギアセチルコリンエステラー
ゼは、酵素学的に使用可能な標識化合物を形成す
べく抗原、ハプテン又は抗体の特定の反応基と反
応し得る反応基、例えばリシル、チロシル、ヒス
チジル、トリプトフアニル及びグルタミル基を有
する。更に、前記酵素は好適な媒質中に保存され
るなら、−20℃又は−173℃で非常に安定である。 従つて、電気ウナギアセチルコリンエステラー
ゼを酵素トレーサとして使用すると、他のアセチ
ルコリンエステラーゼ及び酵素免疫学分野で現在
使用されている他の酵素のいずれと比較しても多
くの利点が生じる。 本発明に従うと、電気ウナギアセチルコリンエ
ステラーゼ（EC3.1.1.7）は電気ウナギの電気器
官から得られ、アフイニテイクロマトグラフイに
より精製される。特に、Bon他によりEur.J.
Biochemical 68，pp.531−539，1976中に開示さ
れた方法を使用することが可能であり、電気ウナ
ギの電気器官１キログラムから数日間で約30mgの
純粋な酵素を獲得することができる。 Bon他によりAnn.Rev.Neurosci.，1982，５，
pp.57106中に開示されているように、アセチルコ
リンエステラーゼはA12、A8、A4、G4、G2及び
G1と呼称される数種類の分子形で存在すること
が知られている。電気ウナギの電気器官では
A12、A8及びG4形が主要であり、純粋酵素が蓄積
されると、A12及びA8形間の共有集合体が自然形
成され得る。 本発明に従うと、化合物はA12、A8及びG4のよ
うな自然分子形、並びにこれらの分解により得ら
れる分子形、即ちA4、G2及びG1、更には非対称
形間の共有集合体から形成され得る。 本発明に従うと、抗原又はハプテンにより構成
される分子は、医薬、例えば鎮痛薬、抗生物質、
抗けいれん剤、抗糖尿病剤、抗高血圧剤、抗腫よ
う剤、バルビツール酸塩、心臓抑制剤、強心配糖
体、幻覚剤、殺虫剤、筋肉弛緩薬、ステロイド、
興奮剤、タバコアルカロイド及びトランキライザ
から選択され得る。前記分子は血しようタンパク
質又はホルモン、例えばポリペプチド、ステロイ
ド又は他の小分子によつても構成され得る。 例えば、抗原はIgG、IgE、ハプトグロビン、
アルフア−２−Ｈ−グロブリン、アルフア−FP、
CEA及びPAM等の血清タンパク質であり得、ホ
ルモンは、HCG、HPL、TSH、インシユリン、
エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾール及
びチロキシンであり得、医薬は、バルビツール酸
塩、阿片剤、メタドン、アンフエタミン、ジゴキ
シン及びゲンタマイシンであり得る。 分子は更に特定の病原体、例えば
Echinococcosisgranulosus、Trichinella
Spiralis、Toxoplasmagondii、Treponema
pallidum、サルモネラＯ抗原、Escherichia
Coli、風疹ウイルス、Trypanosoma brucci、
Trypanosoma cruzi、Schistosoma mansoni、
Schistosoma haematobium、Plasmodium
berghei、Plasmodium knowlesi及びVibrio
choleraeの抗体によつても形成され得る。分子は
特にモノクローナル抗体から形成され得る。 以下、分子としてＰ物質、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、ロイコトリエン、トリイド
チロニン（T3）、抗ヒトIgE抗体を使用した例に
ついて説明する。 本発明に従うと、抗原、ハプテン及び抗体から
選択される分子に電気ウナギアセチルコリンエス
テラーゼを共有結合によつて結合させるために、
酵素に支持された反応基、例えばリシル、チロ
ル、ヒスチジル、トリプトフアニル又はグルタミ
ル基を、抗原、ハプテン又は抗体に支持された反
応基、例えば酸基、アミン基、フエニル基、ヒド
ロキシル基又はケトン基と反応させる。この反応
は特に、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、
ベンジジン、混合アンヒドライド、活性ハプテン
エステル及びパラアミノフエニル酢酸等の試薬を
用いて、一般に使用されている結合反応により実
施され得る。 本発明に従うと、抗原、ハプテン又は抗体間の
結合は、アビジンとビオチン又は抗原と抗体の結
合と同様に、非共有可逆的結合により得られる。 従つて、本発明を利用した抗原、ハプテン及び
抗体から選択された分子を電気ウナギアセチルコ
リンエステラーゼと反応させることから成る。 本発明の一具体例に従うと、分子がＰ物質であ
る時、まずＰ物質をパラアミノフエニル酢酸の活
性エステルと反応させることによりＰ物質の誘導
体を生成し、こうして得られた誘導体を電気ウナ
ギアセチルコリンエステラーゼと反応させる。 本発明を利用した別の具体例に従うと、分子が
プロスタグランジン、トロンボキサン又はトリヨ
ードチロニンである時、まずプロスタグランジン
の活性エステルを生成し、こうして得られたエス
テルを電気ウナギアセチルコリンエステラーゼと
反応させる。 有利な点として、活性エステルは分子の遊離酸
をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させるこ
とにより得られる。 分子がロイコトリエンである場合、電気ウナギ
アセチルコリンエステラーゼと反応させる以前に
分子をジニトロフルオロベンゼンと反応させるこ
とによりまず中間化合物を生成する。 分子が抗体、例えば抗ヒトIgE抗体である場
合、ビオチンの活性エステルを使用してまずビオ
チンを抗体及び電気ウナギアセチルコリンエステ
ラーゼに共有結合で固定する。 抗体と酵素との結合は、ビオチンの分子と結合
して非常に安定な複合物を形成するアビジンを用
いて行なわれる。 本発明を利用した化合物は特に、「ホモジニア
ス」又は「ヘテロジニアス」定量法のいずれかを
使用して試料の抗原、抗体又はハプテン濃度を測
定すべく酵素免疫定量プロセスにおいてマーカ又
はトレーサとして使用され得る。 ヘテロジニアス定量法を使用する場合、酵素−
標識化分子の結合フラクシヨンと遊離フラクシヨ
ンとの分離は、従来方法、例えば第２の抗体を介
して沈降させることにより実施される。同様に、
抗原又は抗体が固定される担体から構成される固
相を使用してもよい。このような定量の場合、ア
セチルコリンエステラーゼの酵素活性は、実施が
格別簡単であり且つ約-13Ｍの酵素濃度を検出す
ることの可能な従来方法、特にEllman他により
Biochemical Pharmacology 1961，Vol.7，
pp.88−95中に記載されている方法を用いて測定
され得る。 ［発明の実施例］ 本発明の他の特徴及び利点は、添付図面を参考
に非限定的な例示として与えられる以下の実施例
から明らかになろう。 実施例 １： Ｐ物質（SP）の免疫酵素定量用
酵素トレーサの生成。 前記物質は下記のアミノ酸配列順序に対応す
る。Arg−Pro−Lys−Pro−Gln−Gln−Phe−
Phe−Gly−Leu−Met−NH2。 Ｐ物質と電気ウナギアセチルコリンエステラー
ゼと共有結合化合物を生成するために、パラアミ
ノフエニル酢酸（PAPA）との共役によりＰ物質
の中間誘導体を生成すること、及びこうして得ら
れた誘導体をジアゾニウム塩を介して酵素と結合
させることから成る２段階を使用した。 ａ Ｐ物質の中間誘導体の生成。 まず、下記の反応式に従いＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（NHS）を用いてパラアミノフエニ
ル酢酸（PAPA）の活性エステルを生成した。
【化】
次に下式に従いこの誘導体をＰ物質と反応させ
た。
た。
【化】
活性エステルを生成するために、15.1mgの
PAPAと11.5mgのNSHと20.6mgのジシクロカルボ
ジイミド（DCC）とを暗所中22℃で18時間、２
mlのジメチルホルムアミド（DMF）中で反応さ
せた。形成された沈降物を遠心分離によつて除去
し、得られた反応混合物の20μ（lμmol）を、
1μmolのＰ物質を含む100μの0.1MPH９ホウ酸
塩緩衝液／DMF（容量／容量）に付加し、中間誘
導体を生成すべく暗所中４℃で１時間反応させ
た。 ｂ SP−PAPA複合体と酵素との結合。 この結合反応は下式に対応する。
PAPAと11.5mgのNSHと20.6mgのジシクロカルボ
ジイミド（DCC）とを暗所中22℃で18時間、２
mlのジメチルホルムアミド（DMF）中で反応さ
せた。形成された沈降物を遠心分離によつて除去
し、得られた反応混合物の20μ（lμmol）を、
1μmolのＰ物質を含む100μの0.1MPH９ホウ酸
塩緩衝液／DMF（容量／容量）に付加し、中間誘
導体を生成すべく暗所中４℃で１時間反応させ
た。 ｂ SP−PAPA複合体と酵素との結合。 この結合反応は下式に対応する。
【化】
約130pmolの予め得られたSA−PAPAを含む
100μの1N HClに、処理温度４℃で50μの0.5
％NaNO2水溶液を加えた。１分後にこの水溶液
を、酵素（100μｇ）の0.5M（PH９）炭酸塩緩衝液
溶液１mlに加えた。反応は暗所中＋４℃で30分間
行なつた。ヒスチジン（100μｇ）の炭酸塩緩衝
液溶液100μをを付加することにより、酵素に
結合しなかつた過剰SP−PAPA試薬を中和させ
た。15分後に、TRIS 10-2Ｍ緩衝液、MgCl2
5.10-2Ｍ及び1M NaCl（PH7.4）を順次溶離液とし
て使用して、２×40cmの（G25）Sephadexカラ
ムを通して反応混合物を過した。この処理の目
的は、酵素に結合しなかつたＰ物質を除去するこ
とである。 次に、収集された異なるフラクシヨンの酵素活
性を測定し、こうして酵素活性の溶離特性を決定
した。フラクシヨンを合わせて数個の冷凍チユー
ブに分配し、液体窒素中に保存した。次に、ゲル
過を使用して異なる酵素形（集合形−A8−A12
及びG4形）に対応する化合物を精製した。なお、
90×1.5cmカラム中でA15mゲル（Biorad）を使
用し、溶離液としては前出のTRIS緩衝液を使用
した。酵素活性の溶離特性を得た後、異なる形の
溶離に対応するピークの異なるフラクシヨンを一
つにした。使用時までこの酵素トレーサを液体窒
素中に保存した。 実施例 ２： プロスタサイクリン代謝物である
６−ケト−PGF1〓の酵素免疫定量用酵素トレーサ
の生成。 ６−ケト−PGF1〓は下式に対応する。
100μの1N HClに、処理温度４℃で50μの0.5
％NaNO2水溶液を加えた。１分後にこの水溶液
を、酵素（100μｇ）の0.5M（PH９）炭酸塩緩衝液
溶液１mlに加えた。反応は暗所中＋４℃で30分間
行なつた。ヒスチジン（100μｇ）の炭酸塩緩衝
液溶液100μをを付加することにより、酵素に
結合しなかつた過剰SP−PAPA試薬を中和させ
た。15分後に、TRIS 10-2Ｍ緩衝液、MgCl2
5.10-2Ｍ及び1M NaCl（PH7.4）を順次溶離液とし
て使用して、２×40cmの（G25）Sephadexカラ
ムを通して反応混合物を過した。この処理の目
的は、酵素に結合しなかつたＰ物質を除去するこ
とである。 次に、収集された異なるフラクシヨンの酵素活
性を測定し、こうして酵素活性の溶離特性を決定
した。フラクシヨンを合わせて数個の冷凍チユー
ブに分配し、液体窒素中に保存した。次に、ゲル
過を使用して異なる酵素形（集合形−A8−A12
及びG4形）に対応する化合物を精製した。なお、
90×1.5cmカラム中でA15mゲル（Biorad）を使
用し、溶離液としては前出のTRIS緩衝液を使用
した。酵素活性の溶離特性を得た後、異なる形の
溶離に対応するピークの異なるフラクシヨンを一
つにした。使用時までこの酵素トレーサを液体窒
素中に保存した。 実施例 ２： プロスタサイクリン代謝物である
６−ケト−PGF1〓の酵素免疫定量用酵素トレーサ
の生成。 ６−ケト−PGF1〓は下式に対応する。
【化】
それぞれ６−ケト−PGF1〓の活性エステルを形
成する段階と、次に活性エステルを酵素に結合さ
せる段階とから成る２段階により化合物を得た。 ａ 活性エステルの生成。 5.1μmolのＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（NHS）を含む10μのDMFと5.1μmolのジシク
ロカルボジイミド（DCC）を含む10μのDMF
とを、5.1μmolの６−ケト−PGF1〓を含む100μ
の無水DMFに加え、暗所中22℃で18時間反応さ
せ、下式に従い６−ケト−PGF1〓の活性エステル
を形成した。
成する段階と、次に活性エステルを酵素に結合さ
せる段階とから成る２段階により化合物を得た。 ａ 活性エステルの生成。 5.1μmolのＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（NHS）を含む10μのDMFと5.1μmolのジシク
ロカルボジイミド（DCC）を含む10μのDMF
とを、5.1μmolの６−ケト−PGF1〓を含む100μ
の無水DMFに加え、暗所中22℃で18時間反応さ
せ、下式に従い６−ケト−PGF1〓の活性エステル
を形成した。
【化】
ｂ ６−ケト−PGF1〓と酵素との結合。
段階ａで得られた活性エステルの50倍稀釈
DMF溶液2μ（即ち約10mmolの活性エステル）
を、250μｇのアセチルコリンエステラーゼを含
む500μの0.1M（PH９）ホウ酸塩緩衝液に加え
た。＋４℃で１時間反応を持続させ、１mlの0.1M
リン酸塩緩衝液、0.4M NaCl、10-3Ｍエチレン
アミノテトラ酢酸及び0.5％BSAを加えることに
より、エステル過剰を中和させた。この結果、下
式に従い酵素の結合が得られた。
DMF溶液2μ（即ち約10mmolの活性エステル）
を、250μｇのアセチルコリンエステラーゼを含
む500μの0.1M（PH９）ホウ酸塩緩衝液に加え
た。＋４℃で１時間反応を持続させ、１mlの0.1M
リン酸塩緩衝液、0.4M NaCl、10-3Ｍエチレン
アミノテトラ酢酸及び0.5％BSAを加えることに
より、エステル過剰を中和させた。この結果、下
式に従い酵素の結合が得られた。
【化】
次に、実施例１で記載した方法に従い、ゲル
過を使用して酵素の各形態に対応する化合物を精
製した。 実施例 ３，４及び５ 同一の合成方法を使用することにより電気ウナ
ギアセチルコリンエステラーゼによつて標識され
たPGD2−MO、トロンボキサンB2及びトリヨー
ドチロニンを生成すべく、実施例２の方法を実施
した。 実施例 ６： ロイコトリエン、例えばロイコト
リエンC4の免疫酵素定量用酵素トレーサの生成。 ロイコトリエンC4（LTC4）は下式に対応する。
過を使用して酵素の各形態に対応する化合物を精
製した。 実施例 ３，４及び５ 同一の合成方法を使用することにより電気ウナ
ギアセチルコリンエステラーゼによつて標識され
たPGD2−MO、トロンボキサンB2及びトリヨー
ドチロニンを生成すべく、実施例２の方法を実施
した。 実施例 ６： ロイコトリエン、例えばロイコト
リエンC4の免疫酵素定量用酵素トレーサの生成。 ロイコトリエンC4（LTC4）は下式に対応する。
【化】
それぞれLTC4の活性誘導体を形成する段階と
次にこの誘導体を酵素に結合させる段階とから成
る２段階で化合物を生成した。 ａ LTC4の活性誘導体の生成。 50μｇのLTC4（0.1M、PH7.4）を含む100μの
りん酸塩緩衝液に、200μｇのDFDB（ジフルオロ
ジニトロベンゼン）を含む60μのメタノールを
加えた。22℃で30分間反応を行なつた。メタノー
ルを真空下で蒸発させ、DFDB過剰を３×0.5ml
のエーテルにより抽出した。エーテル過剰を窒素
中で蒸発させた。 ｂ LTC4と酵素との結合。 予め得られた試薬の60μを、約100μｇの酵素
を含む250μのホウ酸塩緩衝液（0.1M、PH９）
に加えた。22℃で４時間反応させた後、200μ
のリン酸塩緩衝液、BSAを加えた。実施例１に
記載の方法に従いA15mゲル過（Biorad）を用
いて結合生成物を精製した。 実施例 ７： アビジン−ビオチン系を介してア
セチルコリンエステラーゼ−標識化抗ヒトIgE抗
体を使用するヒトIgE定量用酵素トレーサの生
成。 結合原理は、卵白から抽出されたタンパク質で
あるアビジンとビタミンであるビオチンとの非常
に強力な反応に基づいている。アビジンは数個の
ビオチン分子を固定し得るという特性を備えてお
り、従つて、予めビオチンが固定されている２個
の分子を結合すべく機能し得る。 ビオチンは下式に対応する。
次にこの誘導体を酵素に結合させる段階とから成
る２段階で化合物を生成した。 ａ LTC4の活性誘導体の生成。 50μｇのLTC4（0.1M、PH7.4）を含む100μの
りん酸塩緩衝液に、200μｇのDFDB（ジフルオロ
ジニトロベンゼン）を含む60μのメタノールを
加えた。22℃で30分間反応を行なつた。メタノー
ルを真空下で蒸発させ、DFDB過剰を３×0.5ml
のエーテルにより抽出した。エーテル過剰を窒素
中で蒸発させた。 ｂ LTC4と酵素との結合。 予め得られた試薬の60μを、約100μｇの酵素
を含む250μのホウ酸塩緩衝液（0.1M、PH９）
に加えた。22℃で４時間反応させた後、200μ
のリン酸塩緩衝液、BSAを加えた。実施例１に
記載の方法に従いA15mゲル過（Biorad）を用
いて結合生成物を精製した。 実施例 ７： アビジン−ビオチン系を介してア
セチルコリンエステラーゼ−標識化抗ヒトIgE抗
体を使用するヒトIgE定量用酵素トレーサの生
成。 結合原理は、卵白から抽出されたタンパク質で
あるアビジンとビタミンであるビオチンとの非常
に強力な反応に基づいている。アビジンは数個の
ビオチン分子を固定し得るという特性を備えてお
り、従つて、予めビオチンが固定されている２個
の分子を結合すべく機能し得る。 ビオチンは下式に対応する。
【化】
ビオチンで抗体と酵素とを共有結合により標識
するために、分子の活性エステルを使用した。例
えばこの活性エステルは、実施例３で記載された
条件と同様の条件下で生成されたＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドであり得る。実施例２と同様の方
法でエステルと抗体及び酵素とを反応させた。 定量時に以下の方法で抗体と酵素とを結合させ
た。他の非標識化抗IgE抗体を介して予め固体担
体に固定化されたヒトIgEに、ビオチン標識化抗
IgE抗体を反応させた。反応後、及び反応しなか
つた標識化抗体過剰を除去した後、アビジン過剰
を付加し、ビオチン−標識化抗体に固定させた。
反応しなかつたアビジン過剰を除去後、ビオチン
−標識化アセチルコリンエステラーゼを付加し、
標識化抗体に結合したアビジン分子に固定させ、
こうして抗体と酵素とを結合させた。 実施例 ８ 実施例４で得られた化合物を、トロンボキサン
B2（TXB2）の酵素免疫定量に使用した。 試験用として、A8−A12形電気ウナギアセチル
コリンエステラーゼに標識されたTXB2、抗
TXB2ウサギ抗血清から構成される第１の抗体、
及びウサギ抗ガンマグロブリンブタ抗血清から構
成される第２の抗体を使用した。第２の抗体を固
体相に固定した。 以下の方法に従い、免疫試験を行なつた。 ａ 第２の固体化抗体の生成。 ImmunoNune96F微量滴定プレートの各キヤビ
テイ又は凹部に、２％のグルタルアルデヒドを含
むアフイニテイクロマトグラフイ（10μｇ／ml）
により精製された抗ウサギIgEのリン酸塩緩衝液
（10-2Ｍ、PH7.4）溶液300μを添加した。22℃で
12時間インキユベートした後、各キヤビテイ内の
溶液を除去し、上記記載のB5Aリン酸塩緩衝液
300μを付加した。 ｂ 酵素免疫反応。 各キヤビテイの内容物を除去し、それぞれに、
50μの酵素トレーサ溶液、50μの抗TXB2抗体
溶液及び50μの異なる濃度のTXB2又は50μの
定量すべき試料を付加した。 ＋４℃で12時間インキユベートした後、各キヤ
ビテイの内容物を除去し、200μの酵素基質
（Ellmann試薬）を付加した。22℃で１時間酵素
反応を行なつた後、各キヤビテイでマルチスキヤ
ンTITEXKTEK（Flow Laboratories）分光光
度計を用いて414nmの吸光度を測定した。第１図
の曲線１は実施例４の化合物をトレーサとして使
用したTXB2の酵素免疫定量の検量線であり、試
料のTXB2濃度を決定することができる。 第１図の横軸はTXB2の用量（pg／キヤビテ
イ）、縦軸はＢ／Bo百分率（ＢはTXB2の存在下
の抗体に結合した酵素の酸素活性、BoはTXB2
の不在下の酵素活性を示す）を表わしている。総
活性の５％未満の非特異的結合値は省略した。 実施例 ９ 実施例２で得た化合物を６−ケト−PGF1〓の酵
素免疫定量に使用した。試験方法は実施例８のト
ロンボキサンの場合と同様である。この定量に関
する検量線を第１図の曲線２に示した。 実施例 10 実施例３で得た化合物をPGD2−NOの酵素免
疫定量に使用した。試験方法は実施例８の場合と
同様である。この定量に関する検量線を第１図の
曲線３に示した。 実施例 11 実施例５で得られた化合物ををトリヨードチロ
ニン（T3）の酵素免疫定量に使用した。試験方
法は実施例８の場合と同様である。この定量に関
する検量線を第２図に示した。 実施例 12 いろいろな酵素によるヘテロジニアスEIAで得
られた比較結果 操作 １ 表１の各酵素ごとに稀釈系列（1mg／ml〜
1pg／ml）を用意した。これらの溶液の10μを
各分析媒質190μに加えた。酵素反応の30分後、
各溶液の光学密度を412nm（アセチルコリンエス
テラーゼ、420nm（β−ガラクトシダーゼ）、
405nm（アルカリ性ホスフアターゼ）において読
み取つた。ホーセラデツシユペルオキシターゼの
場合は、494nmでの吸収測定の前に1N蓚酸50μ
を添加した。これらの実験を96ウエルマイクロタ
イタープレート（NUNC製、IMMUNONUNC
）で実施した。 吸収値の測定は、Multiskan MC リーダ
（Flow ラボラトリー、ヘルシンキ、フインラン
ド）により行つた。各酵素ごとに、無視しえない
信号を測定できる最大希釈を測定した。酵素の対
応モル量を、表１に挙げられている分子量値によ
り換算した。 結果を、検出限界として表１に示した。0.2ml
容量、0.5cm行路で１時間の間に0.01の吸光度を
上昇できる酵素の量として検出限界を恣意的に定
義した。これらの条件は、EIAがマイクロテイト
レーシヨンプレートで実施されたときの条件を利
用した（Pradelles等1985参照）。 これらの分析に利用される酵素は、次のもので
ある。 ホーセラデイシユパーオキシダーゼをSigma
（St.Louis，USA，Ref p8375）から得た。β−
ガラクトシダーゼとアルカリホスフアターゼは
Boerhinger Mannhim，FRG（Ref 745731と
567752）から得た精製アセチルコリンエステラー
ゼを自分の研究室内で調製した。 色々な分析媒質組成物は次の通りである。 アセチルコリンエステラーゼ：7.5×10-4Ｍアセ
チルコリンヨーダイド、10-1Ｍリン酸塩緩衝液PH
＝7.4中５，5′−ジチオビスニトロ安息香酸５×
10-4Ｍ ホーセラデイシユパーオキシダーゼ：9.3×10-3
Ｍオルトフエニレンジアミン、５×10-2Ｍクエン
酸塩緩衝液PH＝6.5中過酸化水素10-2Ｍ 酵素反応は1Nシユウ酸を加えることにより止
めた。 β−ガラクトシダーゼ：2.66×10-3オルトニトロ
フエニルβ−ガラクトピラノサイド、10-2Mβ−
メルカプトエタノール10-3Ｍ MgSO4、10-1Ｍ
リン酸塩緩衝液PH＝７中MnSO4 ２×10-4 アルカリホスフアターゼ：1.5Mトリス／HClPH
＝８中ｐ−ニトロフエニルホスフアート8.9×
10-4Ｍ
するために、分子の活性エステルを使用した。例
えばこの活性エステルは、実施例３で記載された
条件と同様の条件下で生成されたＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドであり得る。実施例２と同様の方
法でエステルと抗体及び酵素とを反応させた。 定量時に以下の方法で抗体と酵素とを結合させ
た。他の非標識化抗IgE抗体を介して予め固体担
体に固定化されたヒトIgEに、ビオチン標識化抗
IgE抗体を反応させた。反応後、及び反応しなか
つた標識化抗体過剰を除去した後、アビジン過剰
を付加し、ビオチン−標識化抗体に固定させた。
反応しなかつたアビジン過剰を除去後、ビオチン
−標識化アセチルコリンエステラーゼを付加し、
標識化抗体に結合したアビジン分子に固定させ、
こうして抗体と酵素とを結合させた。 実施例 ８ 実施例４で得られた化合物を、トロンボキサン
B2（TXB2）の酵素免疫定量に使用した。 試験用として、A8−A12形電気ウナギアセチル
コリンエステラーゼに標識されたTXB2、抗
TXB2ウサギ抗血清から構成される第１の抗体、
及びウサギ抗ガンマグロブリンブタ抗血清から構
成される第２の抗体を使用した。第２の抗体を固
体相に固定した。 以下の方法に従い、免疫試験を行なつた。 ａ 第２の固体化抗体の生成。 ImmunoNune96F微量滴定プレートの各キヤビ
テイ又は凹部に、２％のグルタルアルデヒドを含
むアフイニテイクロマトグラフイ（10μｇ／ml）
により精製された抗ウサギIgEのリン酸塩緩衝液
（10-2Ｍ、PH7.4）溶液300μを添加した。22℃で
12時間インキユベートした後、各キヤビテイ内の
溶液を除去し、上記記載のB5Aリン酸塩緩衝液
300μを付加した。 ｂ 酵素免疫反応。 各キヤビテイの内容物を除去し、それぞれに、
50μの酵素トレーサ溶液、50μの抗TXB2抗体
溶液及び50μの異なる濃度のTXB2又は50μの
定量すべき試料を付加した。 ＋４℃で12時間インキユベートした後、各キヤ
ビテイの内容物を除去し、200μの酵素基質
（Ellmann試薬）を付加した。22℃で１時間酵素
反応を行なつた後、各キヤビテイでマルチスキヤ
ンTITEXKTEK（Flow Laboratories）分光光
度計を用いて414nmの吸光度を測定した。第１図
の曲線１は実施例４の化合物をトレーサとして使
用したTXB2の酵素免疫定量の検量線であり、試
料のTXB2濃度を決定することができる。 第１図の横軸はTXB2の用量（pg／キヤビテ
イ）、縦軸はＢ／Bo百分率（ＢはTXB2の存在下
の抗体に結合した酵素の酸素活性、BoはTXB2
の不在下の酵素活性を示す）を表わしている。総
活性の５％未満の非特異的結合値は省略した。 実施例 ９ 実施例２で得た化合物を６−ケト−PGF1〓の酵
素免疫定量に使用した。試験方法は実施例８のト
ロンボキサンの場合と同様である。この定量に関
する検量線を第１図の曲線２に示した。 実施例 10 実施例３で得た化合物をPGD2−NOの酵素免
疫定量に使用した。試験方法は実施例８の場合と
同様である。この定量に関する検量線を第１図の
曲線３に示した。 実施例 11 実施例５で得られた化合物ををトリヨードチロ
ニン（T3）の酵素免疫定量に使用した。試験方
法は実施例８の場合と同様である。この定量に関
する検量線を第２図に示した。 実施例 12 いろいろな酵素によるヘテロジニアスEIAで得
られた比較結果 操作 １ 表１の各酵素ごとに稀釈系列（1mg／ml〜
1pg／ml）を用意した。これらの溶液の10μを
各分析媒質190μに加えた。酵素反応の30分後、
各溶液の光学密度を412nm（アセチルコリンエス
テラーゼ、420nm（β−ガラクトシダーゼ）、
405nm（アルカリ性ホスフアターゼ）において読
み取つた。ホーセラデツシユペルオキシターゼの
場合は、494nmでの吸収測定の前に1N蓚酸50μ
を添加した。これらの実験を96ウエルマイクロタ
イタープレート（NUNC製、IMMUNONUNC
）で実施した。 吸収値の測定は、Multiskan MC リーダ
（Flow ラボラトリー、ヘルシンキ、フインラン
ド）により行つた。各酵素ごとに、無視しえない
信号を測定できる最大希釈を測定した。酵素の対
応モル量を、表１に挙げられている分子量値によ
り換算した。 結果を、検出限界として表１に示した。0.2ml
容量、0.5cm行路で１時間の間に0.01の吸光度を
上昇できる酵素の量として検出限界を恣意的に定
義した。これらの条件は、EIAがマイクロテイト
レーシヨンプレートで実施されたときの条件を利
用した（Pradelles等1985参照）。 これらの分析に利用される酵素は、次のもので
ある。 ホーセラデイシユパーオキシダーゼをSigma
（St.Louis，USA，Ref p8375）から得た。β−
ガラクトシダーゼとアルカリホスフアターゼは
Boerhinger Mannhim，FRG（Ref 745731と
567752）から得た精製アセチルコリンエステラー
ゼを自分の研究室内で調製した。 色々な分析媒質組成物は次の通りである。 アセチルコリンエステラーゼ：7.5×10-4Ｍアセ
チルコリンヨーダイド、10-1Ｍリン酸塩緩衝液PH
＝7.4中５，5′−ジチオビスニトロ安息香酸５×
10-4Ｍ ホーセラデイシユパーオキシダーゼ：9.3×10-3
Ｍオルトフエニレンジアミン、５×10-2Ｍクエン
酸塩緩衝液PH＝6.5中過酸化水素10-2Ｍ 酵素反応は1Nシユウ酸を加えることにより止
めた。 β−ガラクトシダーゼ：2.66×10-3オルトニトロ
フエニルβ−ガラクトピラノサイド、10-2Mβ−
メルカプトエタノール10-3Ｍ MgSO4、10-1Ｍ
リン酸塩緩衝液PH＝７中MnSO4 ２×10-4 アルカリホスフアターゼ：1.5Mトリス／HClPH
＝８中ｐ−ニトロフエニルホスフアート8.9×
10-4Ｍ
【表】
【表】
ａ 検出限界は0.2ml容量、0.5cm行路で１時間の
間に0.01の吸光度増加を生む酵素の量と恣意的
に定めた。これらの条件は、EIAをマイクロテ
イトレーシヨンプレートで行うとき用いる条件
に対応する（PRADELLESら、1985参照）。こ
の検出限界は、市販の精製酵素の希釈剤を用い
て各酵素について実験的に定めた。 操作 ２ 各酵素80ng／ml溶液100μをエルマン媒質
900μに添加した。エルマン媒質は、705×10-4
Ｍのヨウ化アセチルチオコリン、10-1Ｍ燐酸塩緩
衝溶液中５，5′−ジチオビスニトロ安息香酸
（DING）５×10-4Ｍ溶液からなる。 １分の酵素反応後、溶液の光学密度を412nm
（行路１cm）で測定した。電気うなぎからのアセ
チルコリンエステラーゼ（AChE）を自分の研究
室中で精製した。電気エイ、ラツト、チキンから
の精製アセチルコリンエステラーゼをドクターJ.
Massoulie（Laboratoire de Neurobiologie，
Ecole Normale Superieure）からもらつたもの
である。 結果を下表に示す。下表から電気うなぎからの
アセチルコリンエステラーゼは優れた標識である
ことが解る。 取得源 器官 光学密度 電気うなぎ 電気器官 １ 電気えい 脳 0.61 ラツト 脳 0.30 チキン 脳 0.24 実施例 13 トリヨードシロニン（T3）の酵素免疫学的定
量法に好適なAChE−トリヨードシロ酢酸の結合
体の合成 ３，3′，５−トリヨードシロ（thyro）酢酸
（TRIAC）つまりトリヨードシロニンの類似体を
用いて合成は行われた。 電気うなぎから得られたアセチルコリンエステ
ラーゼとのカツプリング体がTRIACの活性Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルと上記酵素の
１級アミノ基とを反応させることによつて得られ
た。 TRIACのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルの調製 TRIACの無水ジメチルホルムアミド（DMF）
溶液の10μモル／mlの100μへ、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド10μモル／mlの100μとＮ，N′−
ジシクロヘキシルカルボジイミドの無水DMF溶
液10μモル／mlの100μを添加した。反応は４℃
で22時間暗闇中にて実施した。この段階で、トリ
ヨードシロ酢酸の活性エステルの濃度は3.3μモ
ル／mlに近かつた。 アセチルコリンエステラーゼとTRIAC活性エス
テルとのカツプリング 純粋なアセチルコリンエステラーゼ50μへ連
続的に燐酸塩緩衝液0.1モルPH9.4の250μと
TRIAC活性エステル53.4μ（178nモル）とを添
加し。緩衝液と活性エステルとを添加する前に
AChE調製体の酵素活性は356400エルマン単位／
mlであつた。30分反応させた後、暗闇にて、室温
で0.1％ウシ血清アルブミンを含む燐酸塩緩衝液
146.6μを添加し、その混合物の酵素活性を再び
測定した。この段階で、上記と活性値は変わらな
かつた。燐酸緩衝液と活性エステルとの添加によ
つて導入された希釈を考慮するとこれは初期活性
の95％以上を対応している。その結合物を
Blogel Ａ 15mカラムを用いる分子ふるいクロ
マトによつて生成し、余計な試薬を除去した。
AChE活性を含む画分を溜め、結合体の酵素活性
を調べた。精製によつて酵素活性は無視できるほ
どしか損失しないのが観察された。適当な条件で
貯蔵したとき、（−20℃で凍結、４℃で凍結乾
燥）、結合物の免疫学的活性同様に酵素活性は少
なくとも６か月以上変化しなかつた。この結合物
は競争的酵素イムノアツセイにおいて大変好適な
トレーサと考えられる。 上記のデータによると、電気うなぎからのアセ
チルコリンエステラーゼは遊離のときもハプテン
に結合したときも、同じ特性、特に同じ活性を示
すことが解る。AChE以外の任意の酵素は、ハプ
テンに結合したときの活性は結合していない時の
活性よる大きくすることは不可能である。
間に0.01の吸光度増加を生む酵素の量と恣意的
に定めた。これらの条件は、EIAをマイクロテ
イトレーシヨンプレートで行うとき用いる条件
に対応する（PRADELLESら、1985参照）。こ
の検出限界は、市販の精製酵素の希釈剤を用い
て各酵素について実験的に定めた。 操作 ２ 各酵素80ng／ml溶液100μをエルマン媒質
900μに添加した。エルマン媒質は、705×10-4
Ｍのヨウ化アセチルチオコリン、10-1Ｍ燐酸塩緩
衝溶液中５，5′−ジチオビスニトロ安息香酸
（DING）５×10-4Ｍ溶液からなる。 １分の酵素反応後、溶液の光学密度を412nm
（行路１cm）で測定した。電気うなぎからのアセ
チルコリンエステラーゼ（AChE）を自分の研究
室中で精製した。電気エイ、ラツト、チキンから
の精製アセチルコリンエステラーゼをドクターJ.
Massoulie（Laboratoire de Neurobiologie，
Ecole Normale Superieure）からもらつたもの
である。 結果を下表に示す。下表から電気うなぎからの
アセチルコリンエステラーゼは優れた標識である
ことが解る。 取得源 器官 光学密度 電気うなぎ 電気器官 １ 電気えい 脳 0.61 ラツト 脳 0.30 チキン 脳 0.24 実施例 13 トリヨードシロニン（T3）の酵素免疫学的定
量法に好適なAChE−トリヨードシロ酢酸の結合
体の合成 ３，3′，５−トリヨードシロ（thyro）酢酸
（TRIAC）つまりトリヨードシロニンの類似体を
用いて合成は行われた。 電気うなぎから得られたアセチルコリンエステ
ラーゼとのカツプリング体がTRIACの活性Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルと上記酵素の
１級アミノ基とを反応させることによつて得られ
た。 TRIACのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルの調製 TRIACの無水ジメチルホルムアミド（DMF）
溶液の10μモル／mlの100μへ、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド10μモル／mlの100μとＮ，N′−
ジシクロヘキシルカルボジイミドの無水DMF溶
液10μモル／mlの100μを添加した。反応は４℃
で22時間暗闇中にて実施した。この段階で、トリ
ヨードシロ酢酸の活性エステルの濃度は3.3μモ
ル／mlに近かつた。 アセチルコリンエステラーゼとTRIAC活性エス
テルとのカツプリング 純粋なアセチルコリンエステラーゼ50μへ連
続的に燐酸塩緩衝液0.1モルPH9.4の250μと
TRIAC活性エステル53.4μ（178nモル）とを添
加し。緩衝液と活性エステルとを添加する前に
AChE調製体の酵素活性は356400エルマン単位／
mlであつた。30分反応させた後、暗闇にて、室温
で0.1％ウシ血清アルブミンを含む燐酸塩緩衝液
146.6μを添加し、その混合物の酵素活性を再び
測定した。この段階で、上記と活性値は変わらな
かつた。燐酸緩衝液と活性エステルとの添加によ
つて導入された希釈を考慮するとこれは初期活性
の95％以上を対応している。その結合物を
Blogel Ａ 15mカラムを用いる分子ふるいクロ
マトによつて生成し、余計な試薬を除去した。
AChE活性を含む画分を溜め、結合体の酵素活性
を調べた。精製によつて酵素活性は無視できるほ
どしか損失しないのが観察された。適当な条件で
貯蔵したとき、（−20℃で凍結、４℃で凍結乾
燥）、結合物の免疫学的活性同様に酵素活性は少
なくとも６か月以上変化しなかつた。この結合物
は競争的酵素イムノアツセイにおいて大変好適な
トレーサと考えられる。 上記のデータによると、電気うなぎからのアセ
チルコリンエステラーゼは遊離のときもハプテン
に結合したときも、同じ特性、特に同じ活性を示
すことが解る。AChE以外の任意の酵素は、ハプ
テンに結合したときの活性は結合していない時の
活性よる大きくすることは不可能である。
第１図及び第２図は本発明に従う酵素免疫定量
の検量線を示す図である。
の検量線を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵素免疫定量用の標識試薬であつて、抗体、
ハプテン及び抗原の中から選択された分子に結合
する電気うなぎ（Electrophorus Electricus）の
アセチルコリンエステラーゼからなる標識試薬。 ２ 前記アセチルコリンエステラーゼが分子形
A8，A12、G4は凝集体のアセチルコリンエステラ
ーゼである特許請求の範囲第１項に記載のアセチ
ルコリンエステラーゼからなる標識試薬。 ３ 分子がプロスタグランジン、トロンボキサン
又はロイコトリエンである特許請求の範囲第１項
に記載のアセチルコリンエステラーゼからなる標
識試薬。 ４ プロスタグランジンが６−ケト−PGF1〓又は
PGD2−MOである特許請求の範囲第３項のアセ
チルコリンエステラーゼからなる標識試薬。 ５ トロンボキサンがトロンボキサンB2である
特許請求の範囲第３項に記載のアセチルコリンエ
ステラーゼからなる標識試薬。 ６ ロイコトリエンがロイコトリエンC4である
特許請求の範囲第３項に記載のアセチルコリンエ
ステラーゼからなる標識試薬。 ７ 分子がトリヨードチロニン（T3）である特
許請求の範囲第１項に記載のアセチルコリンエス
テラーゼからなる標識試薬。 ８ 分子が抗ヒトIgE抗体である特許請求の範囲
第１項に記載のアセチルコリンエステラーゼから
なる標識試薬。 ９ 分子がモノクローナル抗体である特許請求の
範囲第１項に記載のアセチルコリンエステラー
ゼ。 １０ 分子がＰ物質である特許請求の範囲第１項
に記載のアセチルコリンエステラーゼからなる標
識試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8313389 | 1983-08-17 | ||
| FR8313389A FR2550799B1 (fr) | 1983-08-17 | 1983-08-17 | Compose marque par une enzyme, son procede de preparation et son utilisation en enzymoimmunologie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6070357A JPS6070357A (ja) | 1985-04-22 |
| JPH0579943B2 true JPH0579943B2 (ja) | 1993-11-05 |
Family
ID=9291658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59170962A Granted JPS6070357A (ja) | 1983-08-17 | 1984-08-16 | 電気ウナギのアセチルコリンエステラ−ゼによつて標識化された化合物、その製法及び酵素免疫定量におけるその使用方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5047330A (ja) |
| EP (1) | EP0139552B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6070357A (ja) |
| DE (1) | DE3476700D1 (ja) |
| ES (1) | ES8504928A1 (ja) |
| FR (1) | FR2550799B1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6111664A (ja) * | 1984-06-28 | 1986-01-20 | Ono Pharmaceut Co Ltd | プロスタグランジン類の酵素免疫測定用試薬組成物及び該組成物を用いたプロスタグランジン類の測定方法 |
| US6461825B1 (en) * | 1987-09-30 | 2002-10-08 | Sanofi (Societe Anonyme) | Immunometric assay kit and method applicable to whole cells |
| FR2773802B1 (fr) * | 1998-01-22 | 2000-04-28 | Pasteur Institut | Polypeptide de fusion comprenant une acetylcholinesterase monomerique liee a un recepteur proteique et polynucleotide codant pour un tel polypeptide. application a la detection de molecules ligand |
| FR2791357B1 (fr) | 1999-03-26 | 2003-05-16 | Didier Raoult | Diagnostic de la maladie de whipple |
| FR2822238B1 (fr) * | 2001-03-16 | 2003-08-29 | Gemac | Methode et trousse pour le suivi des maladies neurodegeneratives |
| US7189366B2 (en) * | 2001-05-25 | 2007-03-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Interior | Molecular tag reader |
| FR2865541B1 (fr) | 2003-05-20 | 2006-08-11 | Commissariat Energie Atomique | Procede de detection de fluorure ou de fluorure d'hydrogene et trousse de detection |
| US20070287991A1 (en) * | 2006-06-08 | 2007-12-13 | Mckay William F | Devices and methods for detection of markers of axial pain with or without radiculopathy |
| US8420054B2 (en) * | 2009-09-18 | 2013-04-16 | The Procter & Gamble Company | Noninvasive method for measuring histamine from skin as an objective measurement of itch |
| DE102011055265A1 (de) | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Karl-Heinz Kellner | Automatenfähiger Immunoassay für biogene Amine |
| JP6212485B2 (ja) * | 2011-06-02 | 2017-10-11 | キノイン・ゼー・エル・テー | プロスタグランジンアミドの新規製造方法 |
| EP2931238A2 (en) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | The Procter & Gamble Company | Antiperspirant and deodorant compositions |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (nl) * | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| US3654090A (en) * | 1968-09-24 | 1972-04-04 | Organon | Method for the determination of antigens and antibodies |
| USRE29169E (en) * | 1971-02-10 | 1977-04-05 | Akzona Incorporated | Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other |
| USRE31006E (en) * | 1968-09-24 | 1982-08-03 | Akzona Incorporated | Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other |
| NL154598B (nl) * | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| US4152411A (en) * | 1977-07-27 | 1979-05-01 | Akzona Incorporated | High specific activity labeled substances |
| US4228237A (en) * | 1978-09-21 | 1980-10-14 | Calbiochem-Behring Corp. | Methods for the detection and determination of ligands |
| DK159276C (da) * | 1980-03-31 | 1991-02-18 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fremgangsmaade til isolering af specifikke antistoffer og enzym-immunbestemmelsesmetode med anvendelse af det isolerede antistof |
| GB2090598B (en) * | 1980-12-11 | 1984-03-21 | Mini Agriculture & Fisheries | Enzyme-immunoassay method |
| JPS5818167A (ja) * | 1981-07-24 | 1983-02-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | 分析フイルム及びこれを用いる分析方法 |
| US4411989A (en) * | 1981-08-13 | 1983-10-25 | Midwest Research Institute | Processes and devices for detection of substances such as enzyme inhibitors |
-
1983
- 1983-08-17 FR FR8313389A patent/FR2550799B1/fr not_active Expired
-
1984
- 1984-08-13 EP EP84401664A patent/EP0139552B1/fr not_active Expired
- 1984-08-13 DE DE8484401664T patent/DE3476700D1/de not_active Expired
- 1984-08-16 JP JP59170962A patent/JPS6070357A/ja active Granted
- 1984-08-16 ES ES535198A patent/ES8504928A1/es not_active Expired
-
1988
- 1988-01-06 US US07/142,247 patent/US5047330A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES535198A0 (es) | 1985-05-01 |
| ES8504928A1 (es) | 1985-05-01 |
| EP0139552A1 (fr) | 1985-05-02 |
| DE3476700D1 (en) | 1989-03-16 |
| FR2550799B1 (fr) | 1986-02-21 |
| EP0139552B1 (fr) | 1989-02-08 |
| FR2550799A1 (fr) | 1985-02-22 |
| JPS6070357A (ja) | 1985-04-22 |
| US5047330A (en) | 1991-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2858534B2 (ja) | 変性タンパク質に対するモノクローナル抗体 | |
| US4214048A (en) | Reagent suitable for enzyme immuno assay | |
| JPS6343711B2 (ja) | ||
| JPH01227061A (ja) | イオン捕捉イムノアッセイ法および装置 | |
| JPH0814579B2 (ja) | 特異的結合性物質の測定法及び試薬 | |
| JP3363166B2 (ja) | 相互に対する極めて高い特異的親和性を有するペプチド対をイン・ビトロ診断分野に使用する方法 | |
| JPS61502417A (ja) | ポリクロナ−ル抗体、製法と用途 | |
| JPH0579943B2 (ja) | ||
| JPH0467914B2 (ja) | ||
| JPH05203652A (ja) | 抗体酵素免疫分析法 | |
| JPH06506058A (ja) | 分離方法 | |
| JP3413415B2 (ja) | イムノアッセイ試薬およびそれを用いたイムノアッセイ法 | |
| JPS60192263A (ja) | 免疫複合体測定用標準物質及びそれを用いた免疫複合体の測定法 | |
| US6225043B1 (en) | Separation and analysis | |
| EP0088974A2 (en) | Homogeneous immunoassay with labelled monoclonal anti-analyte | |
| US5437981A (en) | Method for the immunological determination of ligands | |
| JPS60155129A (ja) | 固定化抗原または抗体の製造方法 | |
| US5527715A (en) | Method and kit for pyridinoline assay | |
| EP0338045B1 (en) | Solid-phase non-separation enzyme assay | |
| JPH07509780A (ja) | ピリジニウム架橋検定のための方法及びキット | |
| JPH0727763A (ja) | １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 | |
| JPH03503566A (ja) | 天然結合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアツセイ | |
| AU601674B2 (en) | A method for determining a ligand | |
| Guesdon | Amplification systems for enzyme immunoassay | |
| JP3541701B2 (ja) | 酵素抗体結合物及び該結合物を含む酵素免疫測定用キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |