JPS6070357A - 電気ウナギのアセチルコリンエステラ−ゼによつて標識化された化合物、その製法及び酵素免疫定量におけるその使用方法 - Google Patents

電気ウナギのアセチルコリンエステラ−ゼによつて標識化された化合物、その製法及び酵素免疫定量におけるその使用方法

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JPS6070357A
JPS6070357A JP59170962A JP17096284A JPS6070357A JP S6070357 A JPS6070357 A JP S6070357A JP 59170962 A JP59170962 A JP 59170962A JP 17096284 A JP17096284 A JP 17096284A JP S6070357 A JPS6070357 A JP S6070357A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術の背景］ 本発明は酵素により標識された化合物、その製法及び酵
素免疫定量においてトレーサ又はマーカとして例えは標
識抗原、標識ハプテン又は標識抗体の形態で使用する使
用方法に係る。
高等なを椎動物において、抗原は高い結合エネルギを１
１ｆつ／＝　ｎＪ逆的複合体を抗日、と共に形成セろこ
とのｉｉＪ能な特５“ｄ抗体の生成を引き起こし得ろこ
とか知られている。ハプテンＣＪ、動物に注入されると
抗体を形成しないか、抗体と反応４−る紙分″ｒ量物質
である。ハプテンに対４るこれらの抗体は、例えはハプ
テン及びタフバク質の複合化合物を動物又はヒトに注入
した時に生成され得る。
抗原−抗体部（Ｊハブテン−抗体反応は、酵素免疫法の
ような免疫分析法を用いて所与の媒質中でハプテン、抗
原又は抗体の濃度を測定６−るために使用され得る。こ
の場合、反応は抗体、抗原又はハプテンと、抗原、抗体
又はハプテンのいずれかであり得る酵素に３１ユリ標識
され）ごう）子との間で行なわれる。
酵素により標識された分子の性質に応じて免疫定電は２
つのタイプに分（Ｊられる。標識分子か抗１＋、ｉ又ｉ
Ｊハブテンの時、［Ｖ、台型定ｆｆｌ（ｄｅＬｅｒｍｉ
ｎａｔｉｏｎｂｙ　ｃｏｎＢ＋ｃＬｉＬｉｏｎ）　ｌ叉
は［試薬ｔｎ限定型定ｆｆ１（ｄｔ！ＬｅｒｍｉｎａＬ
ｉｏｎ　ｉｎ　ａ　１１ｍ１ｔｅｄ　ｒｅａｇｔ’１ｌ
ｌｔ　ｑｕａ＋ｔｔｉｔｙ）Ｊか挙げらイ１ろ。ごの場
合、定Ｉ″ｌｔ原理は限定数の抗体部に対して、標識し
たハプテン又は抗原と抗原又はハブフーンとを競合さ且
ろことに括づいている。従って、免疫定蛍を行なうには
、一定量の抗体及び限定量の抗原又はハプテンの標識分
子を可変量のハプテン又は抗原と反応さ且ることにより
検量線を形成する必要がある。抗原−抗体平衡形成後、
混合物を分別し、溶液中に遊離している抗原又はハプテ
ンから標識複合体を分離さ且、結合フラクション（複合
体）又は遊離フラクション（標識ハプテン又は抗原）の
酵素活性を測定ずろごとに」、す、異なった抗原又はハ
ブテン濃度に対応４−る活性を測定し、検量線を表示す
ることができる。検量線が表示されると、定量中に観察
されノニ酵素活性に対応するハプテン又（」抗原濃度を
得ろ一＼く同一の方法を適用し、検量線を参照する１、
とにＪす、試オ、−１の抗原又はハプテン濃度を測定４
ろ、二とか−ζさろ。
標識分子か抗体の１１４、Ｉ免疫側＞ｊｔ　Ｊ法叉（Ｊ
汀試薬過剰」定量法が用いられろ。この方法に（」いく
］かの種類があるか、そのうし最ム市要な３種類の方法
について説明する。
月１従来型」免疫測定定１火 このタイプの定量法は、放射性物質により標識さイ１だ
抗体を使用４ろ免疫放射線定量法（ＩＲＭＡ）と１７で
知られている。
第一１一段−階 抗１７７＋をヨウ素化された抗体過剰と反応させる。
Ａｇｌ　八ｃ＊　（＝＝＝丁−−−→　ＡｇＡｃ＊　］
−八へ＊築タ一段−閑− 固相に固定された抗Ｊ＋ｊｉ　（抗原過剰）に抗体過剰
を吸γｉさＵろ。
竿−夫模吊 ２相の分離と上清生成物の３１数。
１１２部−位型免疫定１１に一法（ザン［〉イノカータ
リー來−１一段−１敗− 抗原を同相に吸イ′；された第１の抗体（抗体過剰）。
と反応さＵろ。
第２段階 抗原の別の部位を認識する標識抗体（過剰抗体）の伺加
。
」Ａ豊１ 洗浄による標識抗体過剰の除去と同相の計数。
ｍ　、　ｒｒ　（ｉＢ抗原を使用する特ヱ（杭−Ｋ　Ｏ
＆思□このタイプの測定法は酵素トレーサを使用する場
合、２部位型免疫定量法と同様にＥＬＩＳＡ法（ＩＥｎ
ｚｙ−ｍｏ−Ｌｉｎｋｃｄ−１ｍｍｕｎｏ−８ｏｒｂｅ
ｎｔ−Δ５ｓａｙ）として知られている。。
戟Ｉ段階 特異抗体を固定化抗原（抗原過剰）と反応さＵる。
八Ｃ＋＋１５ 第２一段−」３〜 二標識抗体（又は標識プロティンＡ）を固相に固定され
ノー抗体と反応さ且ろ。
ＡＣ７＊ 第一１３一段−階− 洗ａトによる二標識抗体過剰の除去と同相の計数。
（１−記−戊申、 Ａｇ　抗原、 Ａｃ１５　抗原の第１の特異抗体、 Ａｃ１４６　抗原の第１の非特異抗体、ＡＣ７＊　第２
の標識抗体である１、）１記金ノｊ法（Ｊ以下に小４共
通の特徴をイ〕４−る。
抗体は直接又は抗体が反応し得る他の標識分子を介して
標識さイ］、ごれらの抗体の特異的試薬は１第２抗体−
１又は５Ｌａｐｌ＋ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ
のプロティン八と４ろごとかできろ。
一抗体又は抗原又はハプテンであり得る反応体の１個が
、反応した抗体を溶液中にａ離している抗体から分離す
るために固相に固定される（定量法ｌ、■及びＩＩＩ参
照のこと）。
一抗体又は抗原又はハプテンのいづ゛れかであり得る反
応体の１個以」二が１個以」二の他の反応剤に比較して
著しく過剰であり、従って、これらの方法は「試薬過剰
型」方法と呼称される。
」−配分類に加えて、酵素免疫定量法の２分類、即ち［
ホモジニアス（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）　Ｊ及び［ヘ
テロシニアス（ｈｅ［ｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）ｊ定量法
の相違について述へる。ポモノニアス定ｍ法は、対応づ
−る抗体又（Ｊ抗原に結合すると標識分子の活性か変化
するという事実を利用している。この場合、反応混合物
の酵素活性は抗原−抗体複合体の形成に使用さＡする標
識分子の割合に直接関係４る。、従−・て、分ＮＦを行
なう必要がなく、酵素活性の測定は反応媒質中て直接実
施され得る。
方、］−ヘテＬ’Ｊジニアス」酵素免疫定量法では複合
体のノ１ヨ成に使用されノご酵素によって標識された分
子の酵素活性は変化１．ないので、分離プロセスを使用
４゛る必要がある。この場合、複合体、又は遊離抗原又
は抗体の酵素活性を測定ケるために、抗原　抗体複合体
を反応媒質から分離することが必要である。現（Ｉ−最
ち発達した酵素免疫定量法は、この分野に該当４ろ１゜ 使用される酵素は定量の性能を決定ケるのて−」二記の
い４′れの定ｔｆｋ法てム非；：；；にｍ要な役割を果
たし、以トの要件を＃：ｌ−足しｔυるごとか必要であ
る。
１）標識抗１ｊ；ｉ、ハプテン又は抗体分子か良好な条
（ｌ１１・゛Ｃ生成されｉ−Ｉろように純粋状聾の酵素
を入量に使用４“ろことかできる。
２）、Ｉｆ”畠に少：貰の抗原−抗体複合体、にｉ−っ
て、試１；１中の非゛畠に少量の抗原、ハプテン又は抗
体を測定−４゛ろごとかてきろように、酵素を高感度で
検出し得ろ。当然のごとなからこの検出感度は酵素の触
媒定数に依存するが、更に酵素反応生成物の測定感度に
も依存する。
３）酵素定量か非常に簡単である。
４）標識分子を形成すへく抗原、ハプテン又は抗体と反
応し得る反応基が酵素中に存在する。
５）標準保存条件下での酵素の安定性。
６）酵素の酵素活性か定量媒質の酵素活性と一致Ｕ「、
定量の妨げとｌる因子を１・１ｊたない。
７）酵素物質の自己消化が最小てある。
［発明の概要］ 研究の結果、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｕｓ　Ｅｌｅｃｔ
ｒｉｃｕｓ（電気ウナギ）のアセチルコリンユーステラ
ーセにｌｃｐ、ＬｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓＬｅｒａｓｅ）
は免疫酵素定量での使用に最適な特徴を備える酵素であ
ることか明らかになった。
従って、本発明はＩｌｊ定的に（Ｊ免疫酵素定量に」ｊ
いて標識分子として使用可能な化合物を生成するだめの
ｉｆ記酵素の使用方法に係る。
本発明に従う化合物は、抗体、抗原及びハプテンから選
択された分子が共有結合又は可逆的結合により酵素にし
１１合されたしのから成り、酵素が１；１ｅｃＬｒｏｐ
ｌ＋ｏｒｕｓ　ｌシ１ｃｃｔｒｉｃｕｓ（電気ウナギ）
のアセデルコリツユ、ステラーゼから構成されることを
特徴と４′ろ。
前記酵素を使用４−ろ結果、良好な条件下で酵素免役定
量を実施“べろごとができる。
アセチル−ｔリンエステラーゼαＧ、３．１．１．７）
は′：１リンの上ステルを迅速に加水分解紺る酵素「イ
の一部であり、アセデルコリンか最良の括質てあろごと
を４．１ｊ　徴と４゛ろ。アセチルコリンエステラーゼ
は、多数の動物組織及びを１イ１動物の中枢及び末梢神
経系に非、＋ｉ１．に広く分布し−ζいる。又、Ｅｌｃ
ｃｔｒｏ−ｐ　ＩＩ　（ｌ　ｒ　ＬＩ　Ｓ　ｌシｌｔ！
ｃＬｒｉｃｕｓやｌ’ｏｒｐｃｄｏ　Ｍａｒｎ１ｏｒａ
ｔａ盾の！ｌ′１定の魚）、〔Ｉの電気器官で（Ｊ特に
濃度か高いことか認められている。電気ウツギの電気器
官にお（Ｊろアセデルコリツユ、ステラーゼの濃度（」
鳥類又は哺乳類の脳にＪ’；ｔｌろ４１３度の１００倍
である。電気ウナギの゛　電気器官に含まれる酵素は、
アフィニディクロマトグラフィを使用して単一段階で迅
速用つ簡単に精製される。前記精製は、いずれも少なく
とも部分的に疎水性であり且つ安定性の低いＴ　（ｌ　
ｒ　ｐ　ｅ　（１０Ｍａｒｍｏｒａｔａ、鳥類又は動物
のアセチル−Ｊリンエステラーゼの精製に較へて著しく
容易に実施され得る。
更に、電気ウナギのアセチルコリンエステラーゼは触媒
定数が非常に高いので、比色定損により約ｔｏ”Ｍの濃
度まで検出され得る。この検出感度は、酵素免疫法で使
用さイする主な酵素、即らｌ１ａｉ−ｆｏｒＬベルオギ
ノダーゼ（Ｅ、Ｃ，ｉ、１１．１．７）、１ｉｓｃｌ＋
ｅ−ｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１　β−ガラクトンダーセ（
Ｉｉ、Ｃ，：’１．２．１．２３）及びアラン腸アルカ
リホスファターゼ（ｌＥ、ｃ　３１３１）を用いる場合
より著しく高い３、 加えて、電気ウナギアセヂルコリンエステラーゼは、酵
素学的に使用可能な標識化合物を形成ケベく抗原、ハプ
テン又は抗体の特定の反応基と反応し得ろ反応基、例え
ばリノル、チロシル、ヒスデジル、トリプトファニル及
びグルタミル基を有４′る。更に、Ｉ）１ｊ記酵素は好
適な媒質中に保存されるなら、−２０℃又は−１７３°
Ｃて非常に安定である。
に１　＋）ζ、電気ウナギアセチルコリンエステラーゼ
を酵素トレーザとして使用すると、他のアセデルコリン
エステラーゼ及び酵素免疫学分野で現在使用されている
池の酵素のいずれと比較してら多くの桟点か生しろ。
本発明に従うと、電気ウナギアセヂルコリンエステラー
ゼ（１４Ｃ：’１．１．１．７）は電気１クナキの電気
器官から得られ、アフィニティタ【ノマトクラフィに、
１り精製されろ。４１１に、ｌｂｎ＋池により１）旧゛
ｊ旧ｏｃｂｅ−ｍｉｃａｌ　６８．ｐｐ、５３１５３９
．１９７６中に開示された方法を使用１４゛ろごとかＩ
ｌｌ能てあり１．ト気つジギの電気器１″Ｘ１キ「Ｊタ
ラムから数１１間で約３０ｍｇの純粋な酵素を獲得４゛
ろごとがてきろ。
Ｂ（１１１他（コ、］−り八ｎｎ、１ｌｅｖ、Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ、、１９Ｂ２．５．１）ｐ、５７−１０６中に
開示されているように、アセデルコリンエステラーゼは
Ａ１２、Ａ８、Ａ４、Ｇ４、Ｇ２及びＧ、と呼称される
数種類の分子形で存在することが知られている。電気ウ
ナギの電気器官ではＡｌＲ１Ａ３及びＧ４形か主要であ
り、純粋酵素か蓄積されると、八１゜及び八。形量の共
有集合体が自然形成され得る。
本発明に従うと、化合物はＡ１２、Ａ８及びＧ４のよう
な自然分子形、並びにこれらの分解により得られる分子
形、即ちＡ、　、Ｇ２及びＧ１、更には非対称形間の共
有集合体から６形成され得る。
本発明に従うと、抗原又はハプテンにより構成される分
子は、医薬、例えば鎮痛薬、抗生物質、抗υいれん剤、
抗糖尿病剤、抗商血圧剤、抗腫よう剤、バルビッール酸
塩、心臓抑制剤、強心配糖体、幻覚剤、殺虫剤、筋肉弛
緩薬、ステ［ノイド、興奮剤、タバコアルカロイド及び
トランキライザから選択され得る。前記分子は血しょう
タンパク質又はホルモン、例えばボリペプヂト、ステロ
イド又は池の小分子によっても構成され得る。
例えは、抗原はＩｇＧ、　ＩｇＥ、ハプトグロビン、ア
ル）γ−２−ＩＩ−タ（！プリン、アルファーｔａｒ’
、　ｃｐ、八及び１）ΔＭ等の血ｌＰｆタンパク質であ
り得、ホルモンは、肛に、＋１１）１．、’ｌ’　Ｓ　
ＩＩ、インノ、リン、エストロゲン、プロゲステロン、
コルチゾール及びチロギノンであり（１，１、医薬（」
、バルビッール酸塩、阿片剤、メタトン、アノフェタミ
ノ、ジゴキシン及びゲンタマイシンであり得ろ。
分子は更に特定の病原体、例工ｉｆ　Ｅｃｈｉｎｏｃｏ
ｃｃｏｓｉｓｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、’ｌ’ｒｉｃｌ＋
１ｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍ
ａｇＯｎｄ　ｉ　ｉ、ｌ’ｒ（！ｐｏｎｅｍａ　ｐａｌ
ｌｉｄｕｍｌ　ザルモネラＯ抗１ｊ４、ｌ：ｓｃｌ＋ｔ
）ｒｉｃｌ＋１ＸＩＣｏｌｉ、風疹ウ　（ルス、′ｌ’
　ｒ　ｙ　ｐ　ａ　ＩＩ　（ｌ　Ｓ　（ｌ　Ｉｌｌ　ａ
ｂｒｕｃｃｉ、’ｌ’ｒｙ１＋ａｎｏｓｏｎｕ　ｃｒｕ
ｚｉ、ＳｃｈｉｓＬｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉ。
Ｓｃｌ＋１ｓｌｏｓｏｎｔａ　ｈａ（ゝｍａＬｏｌ＋ｉ
ｕｍ、　ｌ’ｌａｓｎｔｏｄｉｕｍ　ｌ＋ｃｒｇｌ＋ｅ
ｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｋｎｏｗｌｃｓｉ及びＶｉ
ｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｃｒａｅの抗体によ−てら形成され
ｉすろ。分子は特にモノクロ−づル抗体から形成され得
る。
以下、分子としてＰ物質、プロスタグランジン、１−ロ
ンポキザン、ロイコトリエン、トリプトファニル（’ｌ
’　２　’）、抗ヒｌ−１ｇＢ抗体を使用した例につ（
１て説明する。
本発明に従うと、抗原、）入ブテン及び抗体から選択さ
れる分子に電気ウナギアセチルコリンゴ、ステラーゼを
共有結合ににつで結合さＵるために、酵素に支持された
反応基、例えはリンノ、チロシル、ヒスチノル、）・リ
プトファニル又はりＪレタミル基を、抗原、ハプテン又
は抗体に支持された反応基、例えば酸括、アミン基、フ
ェニル基、ヒドロキシル貼又はケトンノルと反応さ且る
。この反応は特に、カルボッイミド、クルタルアルフ゛
ヒト、ｌ＼ンノノノ１．見合アンヒ１ζライト、活性ノ
飄フー１ｉ−ン」−ステル及びパラ）′ミノツー１−ニ
ル耐酸等の試薬を用いて、一般に使用されている結合反
応に、１り実施され得る。
本発明に従うと、抗原、ノ＼ブテン又は抗体間の結合は
、アヒジンとビオチン又は抗原と抗体の結合と同様に、
非凡Ｏｒ　ｉ−Ｊ逆鉤結合により得られる。
従、て、本発明の方法は抗原、ハプテン及び抗体から選
択された分子を電気ウナギアセチルコリン」、ステラー
ゼと反応さＵ−ることがら成る。
本発明の−・具体例に従うと、分子がＰ物質である時、
よツ′１）物質をバラアミノフェニル酢酸の活性」、ス
テルと反応さ且るごとにより１）物質−の誘導体を生成
し、こうして得られた誘導体を電気ウナギアセデルコリ
ンエステラーゼ表尺応さ０ろ。
本発明方法の別の具体例に従うと、分子がプロスタクラ
ンノン、トロノボギザン又はトリヨード千【１〜ノであ
る時、」：４−プロスタクランノンの活性」−ステルを
７１成し、こうして得られノーエステル全市電ウナギア
セヂルニＪリン」、スジ°ラーゼと反応さＤろ、。
（Ｊ利な点゛どして、活性エステルは分子の）！１離酸
をＮヒトｌ：Ｊ　：ｌ−シスクシンイミドと反応さｌｉ
−ることにより得られる。
分子がロイコトリエンである場合、電気ｉフナギアセチ
ルコリンエステラーゼと反応さ且る以前？こ分子をンニ
トロフルオロヘンセンと反応させることによりまず中間
化合物を生成４′る。
分子が抗体、例えば抗ヒｔ−１ｇ１ｉ抗体である場合、
ビオチンの活性エステルを使用（７てまリーヒオヂンを
抗体及び電気フナギアセチルコリンエステラーゼに共何
結合で固定する。
抗体と酵素との結合（Ｊ、ビオチンの分子と結合して非
常に安定な複合物を形成するアヒジンを用いて行なわれ
る。
本発明に従う化合物は特に、［ホモンニアス−１又は１
ヘテロノニアス」定量法のいずれかを使用して試ネ１の
抗原、抗体又はハプテン濃度を測定すべく酵素免役定量
プロセスにおいてマーカ又はトレーサとして（実用され
得る。
ヘテロジニアス定量法を使用する場合、酵素−１〕：？
識化分子の結合フラクションと遊離フラクションとの分
ｋ”ｌｆｆ　ｆＪ、従来方法、例えば第２の抗体を介し
て沈降さＵることにより実施される。同様に、抗原又は
抗体か固定される担体から構成される固相を使用してら
よい。このような定量の場合、アセヂルコリノ」−ステ
ラーゼの酵素活性は、実施が格別簡Ｑ４−ζあり１１つ
約１０−１３Ｍの酵素濃度を検出す’ｌ　コとノーＩＪ
能な従来方法、特にＩｉ　ｌ　ｌ　ｍ　ａ　ｎ　ｌｌｈ
に上りＢｉｏｃｈｃｍｉｃａｌ　ｌ’ｌ＋ａｒｍａｃｏ
ｌｏｇ）’　１９６１．Ｖｏｌ、７，１）Ｉ）、８８−
９５中に記載されＣいる方法を用いてａｌｌ＋定され替
る。
１発明の実施例１ 本発明の他の特徴及び利点は、添イ・］図面を参考に非
限定的な例小としてＪ）えられろ以［・の実施例から明
らか１こムろっ５゜ 実施例ＩＭＰ物′ｃ′［（８１つの免疫酵素定ｉｌ用酵
素トレー４」の１１成、１ １１１１記物質は１・記のアミノ酸配列順序に対応する
。
八ｒｇ　ｌ’ｒｏ−Ｌｙｓ　ｌ’ｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ
−１’ｈｅ−１’ｈｔニーＧｌｙ−Ｌｅｕ−ＭｅＬ−Ｎ
ｌｌ、。
Ｐ物質と電気フナギアセチルコリンエステラーゼとの共
有結合化合物を生成するために、バラアミノフェニル酢
酸（ＰＡｒ’Ａ）との兵役によりＩ）物質の中間誘導体
を生成すること、及びこうして得られた誘導体をンアソ
ニウム塩を介して酵素と結合させることから成る２段階
を使用した。
ａ）　Ｐ物質の中間誘導体の生成。
まず、下記の反応式にｊｉＬいＮ−ヒト（Ｊキノスタノ
ンイミ）・（ＮＩＩＳ）を用いてパラアミ、ノフゴニル
耐酸（Ｐ　ＡＰ八）の活性」−ステルを生成しノこ。
次にＦ式にｆｔいごの誘彩体を１）物質と反応ざしノこ
　。
Ｈ − ０°呵 ｌｔ’ｒ　Ｉ’ｌ　Ｊ’、ステルを生成４′ろノこめに
、１５．１１１９の１）八））八と１１５＋重のＮｌｌ
５と２０　、６　Ｉ＋！のンノタ〔ノカルボノイミト（
１）ＣＣ）とを暗所中２２℃で１８時間、２　ｍｉ！の
ノメチルホルノ・）′ミド（１）肛用ドζ反応さ０た。
形成された沈降物４遠心分離によって除去し、得られた
反応混合物の２０メ及（ｌｊＪ＋＋＋ｏｌ）を、１７１
ｍｏｌの１）物質（ＳＰ）を含む１００成のＯ，１Ｍ　
１１１１９ホウ酸塩緩衝液／ＤＭＦ（容量／容量）にイ
；］加し、中間誘導体を生成づ゛べく暗所中４℃で１時
間反応させた。
ｂ）　５Ｐ−ＰＡＰＡ複合体と酵素との結合。
この結合反応は下式に対応４−る。
約１３０ｐｍｏｌの予めｉＧＪられた５Ａ−ＰＡＰΔを
含むＩ　００　／ＪのＩＮ　ｌｌＣｌに、処理温度４°
Ｃて５０成の０５％ＮａＮＯ７水溶液を加えた。１分後
にこの水溶液を、酵素（（００μｇ）の［１，５Ｍ（ｐ
Ｈ９）炭酸塩緩衝液溶液］　＋ｌ＋９に加えた。
反応は暗所中＋４°Ｃて３０分間行なった。ヒスチノノ
＜＋０Ｏｕｙ、）の炭酸塩緩衝液溶液１００７７を（９
１加するこ々により、酵素に結合しなかった過剰５Ｐ−
ＰＡＰＡ試薬を中和さＵだ、、１５分後に、゛「旧Ｓ１
ヒ２Ｍ緩衝液、Ｍｌｉｔ：ｌ、　５．１Ｏ−２）Ａ及び
１λｌ　ＮａＣ１（ｐＨ７，４）を順次溶離液としてイ
史月１して、２Ｘ４０ｃｍの（Ｇ２５）Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘプＪラノ、を通して反応混合物をｄｊ過した。　この
処理の目的（ｊ、酵素に結合（−なか−たＰ物質を除去
４−ろことてｉ＋、７１　Ｌ＋ 次に、収集された異なるフラクシヨンの酵素活１’ｌを
測定１２、こ−〕して酵素活１／１の溶離時ＩＩＩを決
定（、八。−ノラクノニｌンを〆合１）　１！で数個の
冷凍子〇。
−ブに分配し、液体窒素中−Ｃ保（Ｙ　ｌ−刀こ。次に
、ケルｏ１過を使用シて１Ｉ１１！なる酵素形（集合形
−Δ。−Ａｌ。
及びＧ　、　Ｉ（’；月一対応ｉろ化合物を精製した。
ムお、９０Ｘ１．５ｃ＋＋カシｌ、中でＡｌ５ｍケル（
Ｈｉｏｒａｄ）を使用し、溶離液として（Ｊ前出の′１
１目Ｓ緩衝液を使用した。酵素活（’ｌの溶離１冒１１
をｊリフ−後、５−１なる形の溶離にｌＪｌ、仁、・）
ろビータの５１ｄム′るフラクシヨンを一つにし）こ。
使用時までこの酵素トレーサを液体窒素中に保存し　ノ
こ　。
害ｖ辻−ブロスタサイタリン代謝物である６−ケド−Ｐ
ＧＦ１．の酵素免疫定屯用酵素トレー→ノーの／：（＝
成。
６−ケドーＰＧＦ、＋１は下式に対応する。
６ケトーＰＧＦ＋ａ Ｈ Ｈ それぞれ６ケ）・　ｌｌＣｌ”、、の活性〕−，ステル
を形成−４−る段階と、次に活性ニーステルを酵素に１
１九合さ１１ろ段階とから成る２段階により化合物を得
た３、ａ）活性」−ステルの生成。
５１μ１ＬｌｏｌのＮ−ヒト［ノキノスクノノイミＦ’
（ｌｌｌｔｓ）を含む１ＯＩＩのＤ肛と５１μｍＯ１の
ンノタｖ１ブＪ）しΣ１ξジイミド（ＤＣＣ）を含むＩ
［１ｄ０′）ＤＭＦとを、５．Ｉμｍｏｌの６−ケｌ−
１’ＧＦ、、を含む１００成の無水１）Ｍ　Ｐに加え、
’ｌｆ’ｆ　ｉＪ’（ｒｌ」２２℃で１８時間反応さ且
、Ｆ式に従い６−ケｌ−−ＰＧＦ、。
の活性」−ステルを形成した。
Ｈ １））６ケト　１）Ｇ１・、と酵素との結合。
段階ａ）で得られた活性エステルの５０倍昂択１）Ｍ　
Ｐ溶液２Ｉｉ（即し約１０ｍｍｏｌの活性エステル）を
、２５ｏ／１ｇのアセチルコリンエステラーゼを含む５
００　／７の０１Ｍ（＋１１１９）ホウ酸塩緩衝液に加
えた３、−）４°Ｃで１時間反応を持続さｌ、ｌ　ｒ＋
＋Ｑ　ｏ）０　、　ｌ　Ｍ　’Ｊ　：／酸４　緩衝液、
０．４ＭＮａＣ１，ｉｏ＝Ｍエチレンジアミノテトラ＾
′１酸及び０５％ＵＳＡを加えることにより、ユ、ステ
ル過剰を中和させた。この結果、下式に従い酵素の結合
が得られノこ。
次に、実施例１て記載した方法に従い、ケルｐ過を使用
して酵素の各形態に対応４−ろ化合物を精製　し　ノこ
　。
実施例３．４及び５ 同一の合成方法を使用４−るごとにより電気ウナギアセ
デルコリンエステラーゼによって標識されノニＩＩＧ＋
１．　Ｍ（１，Ｉ・「ｌンポギザン１３２及びトリヨー
トチ１ノニンを生成４′べく、実施例２の方法を実施し
た。
実施−例−ｑ−（１イニ＋　ｌ−リ」−ン、例えばロイ
コトす」、ンＣ４の免疫酵素定検用酵素トレーザの生成
。
（Ｊイコトリュ、ンＣ４（＋、Ｔｃ、　）は１−′戊に
対応４′る。
それぞれ１．１（：４の活性誘導体を形成する段階と次
にごの誘導体を酵素に結合さＵろ段階とから成る２　１
”Ｑ　ｌ’！〜゛ζ化合物を１１成した。
ａ）１．巨；１の活）１１．誘導体の４１成１゜５０　
ｔｔｙ、のｔ、１ｃ、（ｏ、ｖ、ｐＨ７，４）を含む１
００成のリン酸塩緩衝液に、２００１ノｇの１）目）１
）（ジフルオ［７ノニト１）へノセン）を含む６０１Ｊ
１のメタノールを加えた。２２℃′ζ：（０分間反応を
ｌＪ／；Ｊニー、た。メタノールを真空Ｆてｉ７６発さ
ｌ、国’　１）１１過剰を３Ｘ０．５＋＋＋ｊ！のエー
テルにより抽出した。エーテル過剰を窒素中て蒸発さ且
た。
ｂ）　Ｌ゛ｌ’Ｃ，と酵素との結合。
予め得られた試薬の６０成を、約１００１１ｇの酵素を
含む２５０ハのポウ酸塩緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ９）
に加えた。
２２℃で４時１１４ｊ反応させた後、２０　Ｄ　ＪＩの
リン酸塩緩衝液、ＢＳＡを加えた。実施例１に記載の方
法にｊ；ＬいΔ１５ｍケル濾過（Ｂｉｏｒａｄ）を用い
て結合生成物を精製し　ノこ　。
Ｌｌｍ　（Ｍｊ　？−アヒノン　ヒオチン系を介してア
セチルコリンエステラーゼ−標識化抗ヒｌ−１ｇ１ｉ抗
体を使用４”るヒト１ｇ１〕定槍用酵素トレーザの牛１
戊。
結合原理（ｊ、卵白から抽出さイ１ツユタンパク質であ
る）２ヒジノとヒタミノであるヒ′２ザンとの非’ｔ：
ｊに強力な反応にＪＩ（−）いている、、　−ｊ’ヒノ
ン（Ｊ数１１１・１のピオチン分子を固定し得るという
特１１１を！（ｉ：ｉえており、従って、予めピオチン
か固定されている２個の分子を結合ずべく機能し得る。
ピオチンは下式に対応針る。
ヒオチンーζ抗体と酵素とを共合結合により標識４′ろ
ために、分ｊ″−の活慴エステルを使用した。例えばこ
の〆１η性エステルは、実施例３て記載された条件と同
様の条件士で生成されたＮ−ヒトロキノスタノンイミト
てあり得る。実施例２と同様の方法て」、ステルと抗体
ノにひ酵素とを反応ざｌた。
定７１１時に以］・の方法で抗体と酵素とを結合さＵ八
。他の非標識化抗１ｇＢ抗体を介してｒめ固体担１本に
固定化されノこヒｌ−１ｇ１ｉに、ヒオチン標識化抗１
ｇＥ抗体を反応させた。反応後、及び反応しなか−、／
−ｔｒｉ識化抗体過刺を除去した後、アビジン過剰を１
・ｊ加し、ヒオチンー標識化抗体に固定さ且−た。反応
しなかっ）、、、Ｔｌ’ヒンン過剰を除去後、ビオチノ
ー標識化アセチルー１リンエステラーゼを（；Ｉ加し、
標識化抗体に結合したアビジン分子に固定させ、こうし
て抗体と酵素とを結合させた。
実施例８ 実施例４で得られた化合物を、トロンポギザンＢ　、　
（’ｌ’　Ｘ　Ｂ　、）の酵素免疫定量に使用した。
試験用として、八。Δ、２形電気ウナつアセチルコリン
エステラーゼに標識されたＩＸＢ２、抗１’　Ｘ　Ｂ　
２ウザギ抗血清から構成される第１の抗体、及びウザキ
抗カンマグロブリノブタ抗血清から構成される第２の抗
体を使用した。第２の抗体を固体用に固定しノこ。
以下の方法に従い、免疫試験を行なった。
ａ）第２の固定化抗体の生成。
ｉ　ｍ　ｍ　ｕ　ｎ　ｏ　Ｎ　ｕ　ｎ　ｅ　９６　Ｆ微
量滴定ブレートの各キャビティ又は凹部に、２％のクル
タルアル−ノーヒトを含む）′フィニティク〔ｌマトク
ラフィ（１０ｌ１ｇ／　ｒｔｍ　）により精製された抗
つザギＩ　ｇ　［；のリン酸塩緩衝液（１０−’Ｍ、ｐ
Ｈ７，４）溶液３００　／Ａを添加した。２２℃で１２
時間インギコベーＩ・した後、各ギャヒティ内の溶液を
除去し、Ｊ、記記載の１３５Δリン酸塩緩衝液３００　
／Ｊを（＝１加し）こ。
１１）酵素免疫反応。
各キＸ・ヒナイの内容物を除去し、それぞれに、５０１
ｉｐ、ノ酵素トレーザ溶液、５０／Ｊ＋７）抗１’　Ｘ
　Ｂ　、抗体溶液及Ｕ　５０　／４の異なる濃度のＴ　
Ｘ　Ｂ　２又は５０成の定量ずべ、）試ｆ−１を付加し
た。
１４℃で１２時間インキュへ−１・した後、各キャビテ
ィの内容物を除去し、２００１１１の酵素基質（Ｅｌｆ
Ｉｌｌ　；１１１１１試薬）を付加しノー。２２℃で１
ｌＩ４ｊ間酵素反応を行ｉｆ・ｋ後、各ギトピフ“イて
マルチスギ−トンｌ’　ｌ　１’　１１　Ｋｌ’１４Ｋ
（ｌ’ｌＯｗ　１．ａｌ）ｏｒａｔｏｒｉｔ！ｓ）分光
光１ｉＨ１を川しビＣ４１４旧ｌの吸光度を測定ｔ−）
二、第１図の曲線１ｔ、、Ｊ実施例４Ｕ）化合物をトレ
ー→ノとして使用し人−ＩＸＢ、の酵素免疫定量の倹１
１１線−ごあり、試オ；１のｌ’　Ｘ　Ｂ　、濃度を決
定するごとｈゾζきろ。１ 第１図の横軸ｔＪ、　ｌ’　Ｘ　１１　＋の用量（ｐｇ
／ギャヒティ）、縦軸はＢ／Ｂｏ百分率（ＢはＴＸＢ、
の存在ドの抗体に結合示す）を表わしている。総活性の
５％末に１もの非特異的結合値は省略した。
寒湾を上側一 実施例２て得た化合物を６ケト−１’Ｇｌ’、いの酵素
免疫定量に使用しノ搗試験方法（Ｊ実施例８の１・〔ｌ
ノポギザンの場合と同様である。この定量に関４る検量
線を第１図の曲線２に示しノー。
うく）Ｉ！（Ｑ−１−０ 実施例３て得た化合物をＰ　Ｇ　Ｄ　２　Ｍ　Ｏの酵素
免疫定（八に使用しノー。試験方法は実施例８の場合と
同様である。この定ｔｉｔに関４”る検ｊｌ（線を第１
図の曲線３に示しノニ。
γ−輿護１」 実施例５て得られた化合物を）・リョーｌζチｃ＋　＝
ン（１３）の酵素免疫定量に使用しノー。試験方法は実
施例８の場合と同櫛である。この定量に関４′ろ検Ｉｉ
線を第２図に示した。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第２図は本発明に従う酵素免疫定量の検噴線
を、」で４−図である。 代理人弁理士今　村　元

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）抗原、ハブフーン及び抗体から選択されに分」′
    ・を共イｆ結合又は１Ｊ逆的枯合により酵素に結合さＵ
    ζ成る化合物において、酵素かＥｌｅｃＬｒｏｐＨ（＋
    ｒｕｓ旧（・ｃｔｒｉｃｕｓ（電気ウナギ）のアセデル
    コリン」−ステラーゼ（あることを４’Ｅ？　？Ｈとづ
    “ろ！ｊ’ｌ　ｎＱ化合物。 （２）化合物か分子−形Δ１３、Ａ１２、Ｇ、、又ｔＪ
    集合体ノアセチル二Ｉリン」−スアラーセを含（］４′
    る化合物の１１４合物−ζあろごとを１．ｌｉ徴と４ろ
    ’ｌｌＩ’　Ｒ’ｌ”、　：：ｉ’（−’ｌ＜の・範囲
    第１項に記載の化合物。 （ｊ３）　分子・かプロスタクランジン、１・ＵＪンポ
    ギザノ又（」１ノイー１　トリエンであるごとを特徴と
    する特６′１請求の範囲第１項に記載の化合物。 （４）プロスタクランジンが６−ケドーＰＧｌ’、、、
    又はＰＧＤ、−ＭＯであることを特徴とする特Ｆ１請求
    の範囲第３項に記載の化合物。 （５）　トロンポキザンがトロンポギザノ１３．である
    ことを特徴とする特許 化合物。 （６）　ロイコ１・リエンがロイコトリ上ンＣ４である
    ことを特徴と４−る特許請求の範囲第３項に記載の化合
    物。 （７）　分子か１・リョードヂロエン（１’３）である
    ことを特徴と４゛る特５’Ｆ　請求の範囲第１項に記載
    の化合物。 （８）分Ｊ′が抗ヒｔー１ｇｌ；抗体であることを↑｝
    Ｊ徴と４ろＩＩ＋１．’ｌ請求の範囲第１項に記載の化
    合物。 （９）分子かモノクローナル抗体であるごとを特徴と４
    ろ’ＩＷＩ．ｉ’ｌ請求の範囲第１槙に記載の化合物。 （１０）分子が１）物質であることを特徴と４′る特１
    １′１請求の範囲第１項に記載の化合物。 （１１）抗原、ハプテン及び抗体から選択された分子・
    を電気ウナギアセチルコリン上ステラーゼと反応さＵる
    ことを特徴とする特３′１請求の範囲第１項に記載の化
    合物の製法。 （１２）　Ｐ物質をパラアミノフェニル酢酸の活性エス
    テルと反応させることにより１）ＩＪ記物質の誘導体を
    生成すること及びこうして得られノ、誘導体を電気ウナ
    キアセヂルコリンエステラーゼと反応させろことを特徴
    とする特許請求の範囲第１０項に記載の化合物の製法。 （１：（）　プロスタクランジン、トロン７ｊ；キザン
    又は１〜リヨードチロニンの活性ユースナルを生成し、
    ごうして得られた活性エステルを電気ウナギアセチルニ
    １リンエスアラーセと反応さＵろごとを１１１徴と４ろ
    特ル′１請求の範囲第３項乃〒第５項及び第７項のい４
    ゛れかに記載の化合物の製θ、。 （１４）　プロスタクランジンをＮ−ヒドロギノスクノ
    ンイミドと反応さ且ることによりプロスタクランジンの
    活性ニスデルを生成することを特徴とする特許請求の範
    囲第１３項に記載の方法。 （１５）使用されるトレーサか特許請求の範囲第１項、
    ３項、７項、９項及び１０項のいずれかに記載の化合物
    であることを特徴とする抗原、ハプテン及び抗体から選
    択された分子の酵素免疫定は法。
JP59170962A 1983-08-17 1984-08-16 電気ウナギのアセチルコリンエステラ−ゼによつて標識化された化合物、その製法及び酵素免疫定量におけるその使用方法 Granted JPS6070357A (ja)

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