JPH0587231B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、新規な微生物、具体的には、置換お
よび非置換のいずれの縮合多環芳香族炭化水素化
合物をも酸化的に資化して、有用化合物に転換す
る能力を示す、シユードモナス・スツツチエリ
（Pseudomonas stutzeri）種に属する新規な細菌
菌株に関する。 （従来の技術） 従来、芳香族炭化水素、特にコールタール中に
含まれている縮合多環芳香族炭化水素化合物
（例、ナフタレン、アントラセン、フエナントレ
ン、あるいはこれらのアルキル置換化合物など）
に対する微生物の作用に関しては、環境汚染防止
の観点から、微生物の異化作用によるこれらの化
合物の分解について多くの研究がなされており、
芳香族炭化水素化合物の分解性菌としてシユード
モナス（Pseudomonas）属およびアルカリゲネ
ス（Alcaligenes）属に属する細菌を中心に多数
の細菌が知られている。 一方、微生物培養により得られる省エネルギー
的な物質変換能、すなわち資化作用に着目する
と、コールタール中に含まれる種々の物質を原料
とし、これを微生物の資化作用により有用物質に
転換できれば、資源エネルギーの有効利用の面で
大変有利かつ重要であると考えられる。しかし、
芳香族炭化水素化合物、特に多環芳香族炭化水素
化合物は、脂肪族化合物と比較して微生物による
酵素反応を受けにくいために、多環芳香族炭化水
素化合物を原料とした微生物学的手法による有用
物質の生成に関する研究はそれほど多くない。 多環芳香族炭化水素化合物の微生物学的資化に
関する従来技術としては、ナフタレンから微生物
作用により医薬品等の原料であるサリチル酸を製
造することが古くから知られている（特公昭43−
20704号公報）。また、最近になり、シユードモナ
ス属の細菌を利用してビフエニルをヒドロキシ化
し、フエニルフエノールを生成することも提案さ
れている（特公昭60−38116号公報）。 （発明が解決しようとする問題点） 上記の従来の微生物学的な多環芳香族炭化水素
化合物の製造例にあつては、原料となる芳香族炭
化水素化合物が置換基を持たない２環式化合物と
いつた比較的簡単な構造の物質である。これに置
換基が導入された物質を原料とした場合には、微
生物中の酵素が基質特異性を示すために、非置換
化合物と同様に酵素反応を生じさせることは容易
ではない。また、フエナントレン、アントラセン
などの３環以上の縮合多環炭化水素化合物の酵素
反応も、同様の理由から容易ではない。 本発明の目的は、芳香族炭化水素化合物、特に
コールタール中に含まれる芳香族成分のうち、ア
ルキル置換基を有する多環芳香族炭化水素化合
物、あるいはアントラセン、フエナントレンなど
の３環縮合環を有する炭化水素化合物を基質とし
た場合にも成育し、これらの化合物を別の有用化
合物に転換させる能力を有する新規微生物を提供
することである。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、上記のような能力を有する微生
物を自然界より検索した結果、シユードモナス属
に属する細菌菌種にこのような能力をもつものが
あることを見出し、本発明を完成させた。 すなわち、本発明により、シユードモナス属に
属する細菌菌株であつて、非置換ナフタレン、１
−もしくは２−メチルナフタレン、２，３−ジメ
チルナフタレンなどの本菌株は資化できるアルキ
ル置換ナフタレン類、さらにはフエナントレン、
アントラセンなどの３環縮合環芳香族炭化水素化
合物を酸化的に資化する能力を有する、新規菌株
シユードモナス・スツツチエリ（Pseudomonas
stutzeri）5A（微工研菌寄第9118号）が提供され
る。 本発明者らが分離した本発明に係る新規菌株の
菌学的性質を次に記載する。 シユードモナス・スツツチエリ5Aの菌学的性質 (a) 形態 細胞の形と大きさ：桿菌、約0.6×1.7μm 運動性の有無と鞭毛の着生状態：有り、極鞭
毛（１本） 細胞の多形性および胞子の有無：共に無し グラム染色性：陰性 (b) 各種培地における生育状態 肉汁寒天平板培養： （）不定形、黄褐色、コロニー全体がしわ
状、固着性（分離直後） （）円形、なめらかなコロニー、淡黄褐色
（植継時） 肉汁寒天斜面培養：生育良好、淡黄褐色、コ
ロニーの外側に透明帯、周縁部がし わ状 肉汁液体培養：生育やや不良、菌環形成、沈
渣有り 肉汁ゼラチン穿刺培養：表層部で生育、液化
しない リトマス・ミルク：リトマスを還元、アルカ
リ性化（微弱） (c) 生理学的性質

【表】

【表】

【表】 （作用） 本発明者らは、置換および非置換の縮合多環芳
香族炭化水素類を酸化的に資化する能力を有する
本発明の細菌菌株について、上記の菌学的性質に
基づきバージーズ・マニユアル・オブ・システマ
テイツク・バクテリオロジー（Bergey's
Mannual of Systematic Bacteriology），Vol.1
（1984）に記載の基準に従つて公知の菌株との異
同を検討した結果、シユードモナス・スツツチエ
リ種に属する新規な菌株と認め、シユードモナ
ス・スツツチエリ5Aと命名した。この菌株は微
工研菌寄第9118号として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託・保管されている。 本発明の細菌菌株の培養に使用する培地は、こ
の菌株が良好に生育し、かつ原料となる芳香族化
合物を基質として十分に微生物反応を進行させる
ものであれば、いかなる組成の培地であつてもよ
く、また、菌体増殖用と反応用に異なる２種類の
培地を用いてもよい。 この時に用いる培地は、培地成分として、適当
な炭素源、窒素源および無機塩などを含有しう
る。 炭素源としては、反応用の培地の場合、原料と
なる縮合多環芳香族炭化水素化合物を単独で利用
できる。所望により、さらに、本発明の菌株が利
用できる任意の炭素源を追加の炭素源として併用
しうる。かかる追加の炭素源として利用できる有
機物には、上記の菌学的性質において示したよう
に、グリセリン、エタノールなどの有機化合物、
グルコース、フラクトースなどの炭水化物、マロ
ン酸、クエン酸などの有機酸が挙げられる。追加
の炭素源として好適な有機化合物の例はグリセリ
ンである。菌体増殖用の培地の場合には、縮合多
環芳香族炭化水素化合物に限らず、上述したよう
な本発明の菌株が利用できる１種または２種以上
の炭素化合物を任意に炭素源として利用できる。 窒素源としては、特に限定されないが、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化
合物、およびペプトンなど有機窒素源が利用でき
る。有機窒素化合物を用いる場合、これには炭素
も含まれているので、別の炭素源は増殖用培地の
場合には必ずしも必要でない。 無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸マグ
ネシウムなどが使用できる。さらに、微量の重金
属塩（例、鉄塩、マンガン塩など）を培地に含有
させてもよい。 培養方法としては、振盪培養法、深部通気攪拌
培養法などの方法により行うことができる。培養
温度は25〜35℃、pHは中性付近、培養日数は反
応の進行に応じて決めることができるが、通常は
５〜10日が適当である。この時に、原料となる芳
香族化合物は水に難溶性であるために、ポリオキ
シエチレンソルビタンなどの各種の界面活性剤を
培地に添加することも可能である。また、必要に
応じて、消泡剤を添加してもよい。 培養終了後、培養液からの目的物の分離・精製
は、一般の有機化合物の分離・精製と同様に行う
ことができる。２，３−ジメチルナフタレンを基
質とした場合の反応生成物は、４，５−ジメチル
−２−ヒドロキシ安息香酸であるが、これは次の
ような方法によつて分離・精製できる。培養液か
ら菌体を遠心分離によつて除いた後、酸性とし、
酢酸エチル、クロロホルムなどの有機溶媒によつ
て抽出する。得られた抽出液からカラムクロマト
グラフイーあるいは再結晶などの方法によつて目
的物を単離できる。その他の原料から得られた反
応生成物の分離・精製も、溶媒抽出、カラムクロ
マトグラフイー、中和、濃縮、結晶化などの当業
者に周知の手段を適宜組合わせることにより実施
できる。 本発明によるシユードモナス・スツツチエリ種
に属する新規菌株は、後出の参考例に例示するよ
うに、ナフタレン、２，３−ジメチルナフタレ
ン、１−メチルナフタレン、２−メチルナフタレ
ン、フエナントレン、アントラセンなどの本菌株
が資化可能な非置換もしくはアルキル置換縮合多
環芳香族炭化水素化合物に酸化的に作用して、開
環および酸化反応により、環の一つ少ない１，２
−ヒドロキシ酸などのヒドロキシル基とカルボキ
シル基がそれぞれ芳香環の隣接炭素原子に結合し
た化合物に変換させることができる。上に列挙し
た縮合多環芳香族炭化水素化合物を基質として本
発明の菌株を培養した場合に得られる生成物は、
それぞれ、サリチル酸（ｏ−ヒドロキシ安息香
酸）、４，５−ジメチル−２−ヒドロキシ安息香
酸、３−メチル−２−ヒドロキシ安息香酸、４−
メチル−２−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキ
シ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフ
トエ酸である。これらの芳香族ヒドロキシ酸は、
医薬品、農薬、染料などの原料として有用であ
る。 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。 実施例 １ 茨城県鹿島で採取した土壌（約0.5g）を10cm³の
滅菌水に懸濁し、十分に攪拌した後、放置した。
得られた土壌懸濁液上清（１cm³）を、0.1％の２，
３−ジメチルナフタレンを加えた下記組成のSN
培地からなる分離用培地（50cm³）に加え、30℃で
７日間振盪培養した（集積培養Ｉ）。SN培地は、
pH調節後に濾過および滅菌してから使用した。 SN培地の組成 硫酸アンモニウム 5g リン酸水素２カリウム 2g リン酸２水素ナトリウム 2g 硫酸マグネシウム・７水塩 0.1g 硫酸第一鉄・７水塩 0.1g 硫酸マンガン・７水塩 0.1g 酵母エキス 10mg イオン交換水 １ pH ８ 集積培養で得られた培養液の上清（１cm³）
を、0.1％の２，３−ジメチルナフタレンおよび
0.01％のグリセリンを添加したSN培地に加え、
集積培養と同様の培養条件で培養した（集積培
養）この集積培養で得られた培養液の１白金
耳を滅菌水で希釈した後、SCD寒天培地（大五
栄養(株)製）上に展開し、30℃で２日間培養した。
生じたコロニーの形状・色合い等の外観を目視に
より識別し、６種類の菌株を得た。これらの菌株
をそれぞれ集積培養と同様の培地に植菌し、30
℃での培養を続けて２，３−ジメチルナフタレン
に対する反応性を検討し、この化合物を変換させ
る能力を有するNo.５菌を得た。No.５菌を肉汁培地
で培養後、この培養液の１白金耳を滅菌水で希釈
してから、再度SCD寒天培地上に展開し、30℃
で２日間培養した。得られたコロニーを観察する
ことによつて、２種類の菌株（5Aおよび5B）を
得た。両者の２，３−ジメチルナフタレンに対す
る反応性の検討より、この化合物の変換能力を有
するNo.5A菌を得た。この菌株を、上記のように
シユードモナス・スツツチエリ5Aと命名した。 次の参考例は、本発明の新規菌株の培養による
酵素反応の例を示すものである。 参考例 １ 本参考例は、本発明の菌株を利用した２，３−
ジメチルナフタレンの４，５−ジメチル−２−ヒ
ドロキシ安息香酸への変換を例示する。 実施例１に示したSN培地に0.01％のグリセリ
ンを添加した菌体増殖用培地50cm³に、実施例１の
方法で得られたシユードモナス・スツツチエリ
5Aの菌株１白金耳を接種し、30℃で１夜培養し
た。得られた培養液を3.5の同様な培地を仕込
んだ容量５のジヤー・フアーメンターに添加
し、同時に基質として２，３−ジメチルナフタレ
ン0.2％を添加して培養を行つた。培養条件は、
温度30℃、pH7.6、攪拌数200rpm、通気量1v／
ｖ／Ｍであつた。２，３−ジメチルナフタレンの
代謝産物は接種後７日目より急激に増加したた
め、さらに10日間の培養を続けた。 培養終了後、遠心分離によつて菌体を除き、減
圧下で100cm³に濃縮し、100cm³の酢酸エチルで３回
抽出を行つた。酢酸エチル層を合わせて蒸発乾固
し、アセトン：水の１：１混合溶媒により再結晶
させて、345mgの精製物を得た。また、水層は塩
酸によりpH1とした後、酢酸エチルにより上と同
様に抽出処理し、蒸発乾固後に1N HC：エタ
ノールの１：１混合溶媒より再結晶させて、403
mgの結晶を得た。高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）分析において、この２種類の生成物は
同一物質であつた。 得られた物質は、元素分析およびNMR測定に
よつて、４，５−ジメチル−２−ヒドロキシ安息
香酸と確認された。 元素分析値（C₉H₁₀O₃） 計算値：C65.05％、H6.06％ 実測値：C65.15％、H6.15％¹³ Ｃ−NMR（単位：ppm、測定溶媒 DMSO−
d₆） メチル基： 18.3，19.8 カルボキシル基：171.8 芳香環： 110.0，117.6，127.0，130.1， 145.3，159.3 参考例 ２ 本参考例は、本発明の菌株を利用した１−メチ
ルナフタレンの３−メチル−２−ヒドロキシ安息
香酸（３−メチルサリチル酸）への変換を例示す
る。 実施例１に示したSN培地に0.05％のグリセリ
ンを添加した培地50cm³を使用し、シユードモナ
ス・スツツチエリ5A菌株を30℃で振盪培養した。
１夜培養後、基質として１−メチルナフタレン50
mgを添加し、酵素反応を開始した。基質添加後８
日目に培養液中の３−メチルサリチル酸の生成量
は83mg／であつた。 培養液からの３−メチルサリチル酸の分離・精
製は次のようにして行つた。培養液を80℃で30分
間熱処理した後、遠心分離によつて菌体および変
性タンパク質を除去した。上清に硫酸を加えて
pHを１とした後、この酸性溶液よりクロロホル
ムで３−メチルサリチル酸を抽出分離し、抽出液
を減圧濃縮することによつて粗結晶を得た。この
粗結晶をｎ−ヘキサンより再結晶することによつ
て白色針状結晶を得た。 得られた白色針状結晶は、元素分析および融点
によつて３−メチルサリチル酸と確認された。 元素分析値（C₈H₈O₃） 計算値：C63.15％、H5.30％ 実測値：C63.26％、H5.29％ 融点：167〜169℃（文献値：167℃） 参考例 ３ 本参考例は、本発明の菌株を利用した２−メチ
ルナフタレンの４−メチル−２−ヒドロキシ安息
香酸（４−メチルサリチル酸）への変換を例示す
る。 基質として２−メチルナフタレン50mgを使用し
て、参考例２と同様の方法によりシユードモナ
ス・スツツチエリ5Aを培養し、酵素反応を実施
した。基質添加後７日目の培養液中の４−メチル
サリチル酸の生成量は613mg／であつた。 生成物の分離・精製は参考例２と同様の方法に
より行い、白色針状結晶を得た。得られた物質
は、元素分析および融点により、４−メチルサリ
チル酸と確認された。 元素分析値（C₈H₈O₃） 計算値：C63.15％、H5.30％ 実測値：C62.51％、H5.36％ 融点：174〜176℃（文献値：177℃） 参考例 ４ 本参考例は、本発明の菌株を利用したフエナン
トレンの１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への変
換を例示する。 基質としてフエナントレン50mgを使用して、参
考例２と同様の方法によりシユードモナス・スツ
ツチエリ5Aを培養し、酵素反応を実施した。基
質添加後８日目の培養液中の１−ヒドロキシ−２
−ナフトエ酸の生成量は183mg／であつた。 生成物の分離・精製は参考例２と同様の方法に
より行い、白色針状結晶を得た。得られた物質
は、元素分析およびNMRにより、１−ヒドロキ
シ−２−ナフトエ酸と確認された。 元素分析値（C₁₁H₈O₃） 計算値：C70.45％、H4.12％ 実測値：C69.50％、H4.15％¹³ Ｃ−NMR（単位：ppm、測定溶媒 DMSO−
d₆） カルボキシル基：172.8 芳香環： 160.2，136.6，129.4，127.6， 125.9，124.8，124.0.122.9， 118.3，105.9 参考例 ５ 本参考例は、本発明の菌株を利用したアントラ
センの３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への変換
を例示する。 基質としてアントラセン50mgを使用して、参考
例２と同様の方法によりシユードモナス・スツツ
チエリ5Aを培養し、酵素反応を実施した。基質
添加後８日目の培養液中の３−ヒドロキシ−２−
ナフトエ酸の生成量は23mg／であつた。 次に示す高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）および薄層クロマトグラフイー
（TLC）分析の結果から、この酵素酸化反応の生
成物は３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸であるこ
とが確認された。

【表】 参考例 ６ 本参考例は、本発明の菌株を利用したナフタレ
ンのｏ−ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸）への
変換を例示する。 基質としてナフタレン50mgを使用して、参考例
２と同様の方法によりシユードモナス・スツツチ
エリ5Aを培養し、酵素反応を実施した。基質添
加後７日目の培養液中のサリチル酸の生成量は、
HPLC分析の結果、380mg／であつた。 （発明の効果） 本発明による新規微生物、シユードモナス・ス
ツツチエリ5A菌株は、上に例示したように、非
置換ナフタレンのみならず、従来は酵素反応を受
けさせにくかつたメチル置換などのアルキル置換
ナフタレンや縮合３環芳香族化合物（フエナント
レン、アントラセン）を基質として培養すること
ができ、それにより、従来は高温、高圧下で化学
的に合成されていた医農薬品、染料などの原料と
して有用な各種の芳香族ヒドロキシ酸を、経済的
な微生物酸化作用により生産することが可能とな
る。 また、上記の基質はコールタールに含まれる成
分であるので、本発明によりコールタール成分の
有効利用も図られる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス・スツツチエリ種に属する細
   菌菌株であつて、非置換およびアルキル置換縮合
   多環芳香族炭化水素化合物を酸化的に資化する能
   力を有する、微工研菌寄第9118号として寄託され
   た新規菌株シユードモナス・スツツチエリ５Ａ
   菌。