JPH0587233B2

JPH0587233B2 -

Info

Publication number: JPH0587233B2
Application number: JP25165687A
Authority: JP
Inventors: Tokusue Takeshita; Koji Oosumi
Original assignee: Sumitomo Metal Industries Ltd
Current assignee: Nippon Steel Corp
Priority date: 1987-10-07
Filing date: 1987-10-07
Publication date: 1993-12-15
Also published as: JPH0195770A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は新規な微生物、具体的には、ナフタレ
ンなどの縮合環芳香族炭化水素の芳香環上のアル
キル基をヒドロキシアルキル基に酸化的に変換す
る能力を示す、シユードモナス（Pseudomonas）
属に属する新規な細菌菌株、および有用物質を製
造するためのその培養方法に関する。（従来の技術）従来、芳香族炭化水素、特にコールタール中に
含まれている縮合多環芳香族化合物（例、ナフタ
レン、アントラセン、フエナントレン、あるいは
これらのアルキル置換化合物など）に対する微生
物の作用に関して、環境汚染防止の観点から、微
生物の異化作用によるこれらの化合物の分解につ
いて多くの研究がなされており、芳香族炭化水素
化合物の分解性菌としてシユードモナス属および
アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する細菌
を中心に多数の細菌が知られている。一方、微生物によつて行なわれる省エネルギー
的な物質変換能、すなわち資化作用に着目する
と、コールタール中に含まれる種々の物質を原料
とし、これを微生物の資化作用により有用物質に
転換できれば、資源エネルギーの有効利用の面で
大変有利かつ重要であると考えられる。しかし、
芳香族炭化水素化合物、特に多環芳香族化合物
は、脂肪族化合物と比較して微生物により酵素反
応を受けにくいために、多環芳香炭化水素化合物
を原料とした微生物学的手法による有用物質の生
成に関する研究はそれほど多くない。多環芳香族炭化水素化合物の微生物学的資化に
関する従来技術としては、ナフタレンから微生物
作用により医薬品等の原料であるサリチル酸を製
造することが古くから知られている（特公昭43−
20704号公報）。また、最近になり、シユードモナ
ス属の細菌を利用してビフエニルをヒドロキシ化
し、フエニルフエノールに転換することも提案さ
れている（特公昭60−38116号公報）。上記の従来の微生物学的な多環芳香族化合物の
資化にあつては、原料となる芳香族化合物が置換
基を持たない２環式化合物といつた比較的簡単な
構造の物質である。一方、本発明者らが先に見出した細菌菌株シユ
ードモナス・スツツチエリ（Pseudomonas
stutzeri）5A（微工研菌寄第9118号）（特願昭62−
39925号）およびシユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）９−Ant（微工研菌寄
9350号）（特願昭62−127591号）は、アルキル置
換ナフタレン類あるいはアントラセンやフエナン
トレンといつたより複雑な化合物を酸化的に資化
し、例えばメチルナフタレンをメチルサリチル酸
に変換することができるが、いずれも芳香環自体
に作用するもので、芳香環に結合した置換基に対
する作用を有していない。（発明が解決しようとする問題点）本発明の目的は、コールタール中に含まれるよ
うなアルキル置換ナフタレン類（例、メチルナフ
タレン）に作用し、芳香環に結合したアルキル置
換基をヒドロキシアルキル基に変換させる能力を
有する新規微生物を提供することである。本発明の別の目的は、この新規微生物を利用し
て、アルキル置換ナフタレン類からヒドロキシア
ルキル置換ナフタレン類、すなわちナフチルアル
コール類を製造する微生物培養方法を提供するこ
とである。（問題点を解決するための手段）本発明者らは、上記のような能力を有する微生
物を自然界より検索した結果、シユードモナス属
に属する細菌菌種にこのような能力をもつものが
あることを見出し、本発明を完成させた。本発明により、シユードモナス属に属する細菌
菌株であつて、１−メチルナフタレンなどのアル
キル置換ナフタレン類のアルキル置換基に作用し
てこれをヒドロキシアルキル基に酸化させ、１−
ナフチルメタノールなどのナフチルアルコール類
を生成させる能力を有する、新規菌株シユードモ
ナス・エスピー（Pseudomonas sp.）SA−05B
（微工研菌寄第9632号）が提供される。本発明者らが分離した本発明に係る新規菌株の
菌学的性質を次に記載する。シユードモナス・エスピーSA−05Bの菌学的性
質 (a) 形態細胞の形と大きさ：桿菌、（0.5〜0.6）×（1.3〜1.5）（μm）運動性の有無と鞭毛の着生状態：有り、極
鞭毛（１本）細胞の多形性および胞子の有無：共に無しグラム染色性：陰性 (b) 各種培地における生育状態肉汁寒天平板培養：生育不良、淡黄褐色、
円形、中央部に凸状起伏肉汁寒天斜面培養：生育不良、淡黄色、し
か状のコロニー肉汁液体培養：生育やや不良、表層部で小
片状肉汁ゼラチン穿刺培養：生育不良、表層部
で生育、液化しないリトマス・ミルク：リトマスを還元、アル
カリ性化（微弱） (c) 生理学的性質

【表】

【表】（作用）本発明者らは、ナフタレン環に結合したアルキ
ル基をヒドロキシアルキル基に酸化する能力を有
する本発明の細菌菌株（SA−05B）について、
上記の菌学的性質に基づいて、バージーズ・マニ
ユアル・オブ・システマテイツク・バクテリオロ
ジー（Bergey's Mannual of Systematic
Bacteriology），Vol.1（1984）に記載の基準に従
つて公知の菌株との異同を検討した結果、この菌
株はシユードモナス属に属する新規な細菌菌株で
あることが判明したが、本菌株が属する種を見出
せなかつたため、シユードモナス・エスピーSA
−05Bと命名した。この菌株は微工研菌寄第9632
号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託・保管されている。本発明の新規菌株は、１−メチルナフタレンの
ようなモノアルキル置換ナフタレン類のみなら
ず、２，６−ジメチルナフタレンのようなジアル
キルあるいはトリアルキル置換ナフタレンのアル
キル基に対しても同様に作用し、各アルキル基を
ヒドロキシアルキル基に酸化させることができよ
う。本発明の細菌菌株の培養に使用する培地は、こ
の菌株が良好に成育し、かつ原料となる芳香族炭
化水素化合物を基質として十分に微生物反応を進
行させるものであれば、いかなる組成の培地であ
つてもよく、また、菌体増殖用と反応用に異なる
２種類の培地を用いてもよい。この時に用いる培地は、培地成分として、適当
な炭素源、窒素源および無機塩など含有しうる。炭素源としては、反応用の培地の場合、原料と
なるアルキル置換ナフタレン化合物を単独で利用
できる。所望により、さらに本発明の菌株が利用
できる任意の炭素源を追加の炭素源として併用し
うる。かかる追加の炭素源として利用できる有機
物には、上記の菌学的性質において示したよう
に、グリセリン、エタノールなどの有機化合物、
グルコース、フラクトースなどの炭水化物、クエ
ン酸などの有機酸が挙げられる。追加の炭素原と
して好適な有機化合物の例はグリセリンである。
菌体増殖用の培地の場合には、アルキル置換ナフ
タレン化合物に限らず、上述したような本発明の
菌株が利用できる１種または２種以上の炭素化合
物を任意に炭素源として利用できる。窒素源としては、特に限定されないが、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化
合物、およびペプトンなど有機窒素源が利用でき
る。有機窒素化合物を用いる場合、これには炭素
も含まれているので、菌体増殖用培地にあつては
別の炭素源は必ずしも必要でない。無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸マグ
ネシウムなどが使用できる。さらに、微量の重金
属塩（例、鉄塩、マンガン塩など）を培地に含有
させてもよい。培養方法としては、振盪培養法、深部通気攪拌
培養法などの方法により行うことができる。培養
温度は25〜35℃、PHは中性付近、培養日数は反応
の進行に応じて決めることができるが、通常は５
〜10日が適当である。この時に、原料となる芳香
族化合物は水に難溶性であるために、ポリオキシ
エチレンソルビタンなどの各種の界面活性剤を培
地に添加することも可能である。また、必要に応
じて、消泡剤を添加してもよい。培養終了後、培養液からの目的物の分離・精製
は、一般の有機化合物の分離・精製と同様に、溶
媒抽出、カラムクロマトグラフイー、濃縮、結晶
化などの当業者に周知の手段を適宜組合わせて行
うことができる。たとえば、培養液から菌体を遠
心分離によつて除いた後、酢酸エチル、クロロホ
ルムなどの有機溶媒によつて抽出する。得られた
抽出液からカラムクロマトグラフイーあるいは再
結晶などの方法によつて目的物を単離することが
できる。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。実施例１茨城県鹿島郡の製鉄所構内で採取した活性汚泥
（約１cm³）を10cm³の滅菌水に懸濁させ、十分に攪
拌した後、放置した。得られた土壌懸濁液上清
（１cm³）を、0.1％の１−メチルナフタレンを加え
た下記組成のSN培地からなる分離用培地（50cm³）
に加え、30℃で７日間振盪培養した（集積培養）。
SN培地は、PH調節後に濾過および滅菌してから
使用した。 SN培地の組成硫酸アンモニウム 5g リン酸水素２カリウム 2g リン酸２水素ナトリウム 2g 硫酸マグネシウム・７水塩 0.1g 硫酸第一鉄・７水塩 0.1g 硫酸マンガン・７水塩 0.1g 酵母エキス 10mg イオン交換水１ PH ８集積培養で得られた培養液の上清（１cm³）を、
0.1％の１−メチルナフタレンを添加したSN培地
に加え、再度同様の培養条件で培養した。この集
積培養で得られた培養液を１白金耳を滅菌水で希
釈した後、SCD寒天培地（大五栄養(株)製）上に
展開し、30℃で２日間培養した。生じたコロニー
の形状・色合い等の外観を目視により識別し、２
種類の菌株を得た。これらの菌株をそれぞれ集積
培養と同様の培地に植菌し、30℃での培養を続け
て１−メチルナフタレンに対する反応性を検討
し、この化合物のアルキル基を酸化的に変換させ
る能力を有するSA−05B菌を得た。次の実施例２は、本発明の新規菌株の培養を利
用した有用物質の製造例を示す。参考例１本参考例は、本発明の菌株を利用した１−メチ
ルナフタレンの１−ナフチルメタノールへの変換
を例示する。実施例１に示したSN培地に0.1％のグリセリン
を添加した菌体増殖用培地50cm³に、実施例１で分
離されたSCD寒天斜面培地上のシユードモナ
ス・エスピ−SA−05Bの１白金耳を接種し、30
℃で１夜振とう培養を行つた。これを、0.2％
SCD培地３を入れた５容量のジヤーフアー
メンターに植菌し、30℃、PH7.5〜7.6、攪拌機回
転数300rpm、通気量３／minの条件でさらに
１夜培養を行つた。その後、基質として１−メチ
ルナフタレン6gを添加し、上と同様の培養条件
でさらに８日間培養を行つた。培養終了後、遠心
分離によつて菌体を除き、減圧濃縮により乾固し
た。得られた残渣をクロロホルムで抽出した後、
抽出液を再度減圧濃縮により乾固した。乾固物を
ｎ−ヘキサン／クロロホルム（容量比10／１）で
再結晶すると、１−ナフチルメタノール149mgが
得られた。融点59.0〜60.0℃。（標品の融点：58.0
〜58.5℃）元素分析：C₁₁H₁₀Ｏ計算値：Ｃ 83.52％Ｈ 6.37％実測値：Ｃ 81.46％Ｈ 6.19％¹ H−NMR（CDC₃）：δ＝1.78（1H），5.14
（2H），7.33〜8.14（7H）。（発明の効果）本発明による新規微生物、シユードモナス・エ
スピーSA−05B菌株は、上に例示したように、
アルキル置換ナフタレンを基質として培養するこ
とができ、それによりナフチルメタノールなどの
芳香族置換アルコールが微生物学的手法で生産さ
れる。ナフチルメタノールなどの芳香族置換アル
コール類は、医農薬品、染料などの原料として有
用な化学品である。従来、例えば１−ナフチルメ
タノールの製法としては、１−ナフタレンアルデ
ヒドの還元もしくは１−クロロメチルナフタレン
の加水分解による方法が知られているが、これら
の方法は原料自体が高価であるため、生成物も高
価とならざるを得ない。一方、本発明の培養方法
で原料として利用する１−メチルナフタレンなど
のアルキル置換ナフタレン類は、コールタールに
含まれる成分であるので、コールタールからの分
離により安価に取得することができる。しかし、
このアルキル置換基に対して化学的手法によりヒ
ドロキシル基を導入することは非常に困難であ
る。本発明の方法によると、コールタールから分
離された安価な原料を利用し、省エネルギー的な
微生物酸化法で目的とする芳香族置換アルコール
類を製造することができるので、芳香族置換アル
コールを安価に提供することが可能となる。ま
た、この方法により、コールタール成分の有効利
用も同時に図られる。

Claims

【特許請求の範囲】

１シユードモナス属に属する細菌菌株であつ
て、ナフタレン環上のアルキル基をヒドロキシア
ルキル基に酸化的に変換する能力を有する、微工
研菌寄第9632号として寄託された新規菌株シユー
ドモナス・エスピー・SA−05B菌。