JPH0587239B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒトインシユリンの製造方法に関す
る。 ヒトインシユリンを製造するための種々の方法
が知られている。そのような方法の例として、特
に、ヒト膵臓からの抽出、親アミノ酸からの合
成、一般的な工業的プロセスおよび豚インシユリ
ンをヒトインシユリンに変換する方法が挙げられ
る。豚インシユリンをヒトインシユリンに変換す
る方法の中には、豚のデス−オクタペプチド−
（B23−B30）−インシユリンを経由する方法およ
びデス（Ala^B30）−インシユリンを経由する方法
がある。 更に詳しくは、本発明は豚のデス（Ala^B30）−
インシユリンからヒトインシユリンのトレオニン
^Ｂ３０誘導体を経由してヒトインシユリンに変換す
る内容に関する。 糖尿病の治療において、豚又は牛のインシユリ
ンから誘導されたインシユリン製剤が一般に用い
られている。牛、豚およびヒトインシユリンはそ
れらのアミノ酸組成に関しわずかの差異を有する
のみであり、ヒトおよび豚インシユリン間の相違
は一個のアミノ酸に限定されそこにおいてはヒト
インシユリンのB30アミノ酸はトレオニンであ
り、一方豚インシユリンのそれはアラニンであ
る。 デス（Ala^B30）−インシユリンからヒトインシ
ユリンを製造する方法は欧州特許出願No.8010966
に記載されており、またNature280巻 （1979年）、412頁を参照されたい。該特許出願に
よれば、アミド化は０〜65％、好ましくは40〜60
％の有機溶剤を含有する媒体中で好ましく行なわ
れる。更に、好ましい反応温度は20〜40℃であ
り、全実施例中で温度37℃が用いられた。３個の
実施例において、カツプリングの収率はHPLC
（高圧液体クロマトグラフイー）により75，80お
よび約50％と決定された。ネーチヤーの記載によ
れば、収率は73％であつた。 デス（Ala^B30）−インシユリンからヒトインシ
ユリンを得る別の方法は、西ドイル国、ア−ヘン
市で開かれた第二回国際インシユリンシンポジウ
ムの会報に記載されている。該会報によれば、ア
ミド生成は約60％の有機溶剤を含有する媒体中で
行なわれそして反応は38℃で行なわれた。カツプ
リングの収率はHPLCにより67％と決定された。 デス（Ala^B30）−インシユリンからヒトインシ
ユリンを得るための更に別の方法は、1980年デン
マーク国ヘルシンゲル市で開かれた第16回ヨーロ
ツパペプチドシンポジウムの会試に記載されてい
る。該会試によれば、該方法は約60％の有機溶剤
を含有する媒体中で行なわれた。恐らくは、反応
温度は37℃であつたろう。反応時間30分後、収率
は85％であつた。しかし22時間後収率は70％に減
少した。 公知方法による低収率の理由の一つは、好まし
くない副反応、例えばDOI−Thr（R²）−OR¹（式
中、DOIは豚のデス−オクタペプチド−（B23−
B30）−インシユリンを表わし、R¹およびR²は下
記に示す意味を有する）の形成によるインシユリ
ンの損失にある。 本発明の目的は、反応収率を極しく向上せしめ
た、好ましくはおよそ90％以上とする方法を提供
することにある。 驚くべきことに、本発明者らはそのような収率
が公知方法により、反応混合物中、はるかに低い
水の濃度を用いることによつて得られることを見
出し、更に公知方法よりも実質的により低い反応
温度でプロセスを行うことができることを見出し
た。 本発明に係る方法は、デス（Ala^B30）−インシ
ユリン又はその塩もしくはその錯体を一般式： Thr（R²）−OR¹ （式中、R¹はカルボキシル保護基を表わし、
更にR²は水素もしくはヒドロキシル保護基を表
わす）で表わされるＬ−トレオニン誘導体又はそ
れらの塩と、水、水と混和し得る有機溶剤および
トリプシンの混合物中で反応せしめることを含ん
でなる方法であつて、反応混合物中の水の含量が
30〜10％であることを特徴とする。好ましい反応
温度は約０℃ないし室温すなわち約25〜20℃であ
る。 本発明に係る方法は、水および少なくとも１種
の水と混和し得る有機溶剤の混合物中、任意には
酸の存在下にデス（Ala^B30）−インシユリン、式
で表わされるＬ−トレオニン誘導体およびトリ
プシンを溶解することによつて行うことができ
る。 本発明を行うために適した有機溶剤は、水と混
和し得る極性溶剤であり、好ましくは該溶剤中に
インシユリン化合物およびトレオニンエステルを
高濃度で含有できるような溶剤である。かかる適
当な有機溶剤の例は非プロトン性溶剤、例えば
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサ
メチルホスホトリアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ジオキサン、アセトン、テトラヒドロフラ
ン、ホルムアミドおよびアセトニトリル並びにプ
ロトン性溶剤、例えばエタノール、メタノール、
２−プロパノールおよび１，２−エタンジオール
である。溶剤の性質は、全体として系には影響せ
ず、そして高アミド生成収率をもたらす一の溶剤
に適応した相互関係は別の溶剤に関しては適応し
ないかもしれない。最良の収率の結果は、非プロ
トン性溶剤を用いて得られ、そして非プロトン性
溶剤が本発明の実施に対し最も好ましい。 使用する水と混和し得る有機溶剤、選択した反
応温度および反応混合物中の酸の存在に依存し
て、反応混合物中の水の含量は、約27％（ｖ／
ｖ）以下、好ましくは約25％（ｖ／ｖ）未満であ
り、そして約10％（ｖ／ｖ）以上、好ましくは約
15％（ｖ／ｖ）超である。 反応混合物中の水の量を減少することによる一
つの利点は、それによつて副生成物の形成が減少
することである。同様に、反応混合物の酸の量を
増加させることにより、副生成物の形成を減少さ
せることが可能である。収率の増加は、反応混合
物中の水の低含量に積極的に関係している。低含
量の水を有する反応混合物中の酵素の変性を防止
するためには、好ましくは反応温度はトリプシン
を用いたペプチド合成において伝統的に用いられ
る反応温度より実質的に低い、すなわち約37℃よ
り低くあるべきである。 トリプシンタイプは本発明の実施に対し重要で
はない。トリプシンは主に牛および豚源から、高
純度で商業的に入手できる十分に特徴づけられた
酵素である。更に、トリプシン形、例えば結晶性
トリプシン（可溶性形）、固定化酵素又はトリプ
シン誘導体（トリプシン活性が保持される限り）
は本発明の実施に対し重要でない。本発明で用い
られる語句「トリプシン」は、全ての源からのト
リプシンおよびアミド生成作用を保持する全ての
形のトリプシンを包含するものであり、トリプシ
ン様特異性を有するプロテアーゼ、例えばアクロ
モバクターリテイカス（Achromobacter
lyticus）プロテアーゼ（Agric.Biol.Chem.42，
1443参照）を含むものである。 活性トリプシン誘導体の例として、アセチル化
トリプシン、サクシニル化トリプシン、グルタア
ルデヒド処理されたトリプシンおよび固定化トリ
プシン誘導体が挙げられる。 もしも固定化トリプシンが用いられれば、該ト
リプシンは媒体中に懸濁される。 有機酸もしくは無機酸例えば塩酸、ギ酸、酢
酸、プロピオン酸および酪酸および／又は塩基例
えばピリジン、トリス（TRIS）、Ｎ−メチルモ
ルホリンおよびＮ−エチルモルホリンが適当な緩
衝系をもたらすために添加される。有機酸は好ま
しい。しかし、反応は、そのような添加がなくと
も行うことができる。添加される酸の量は、通常
式で表わされるＬ−トレオニン誘導体の１当量
に対し約10当量以下である。好ましくは、酸の量
は式のＬ−トレオニン誘導体の当量に対し0.5
〜５当量である。例えばカルシウムイオンの如き
トリプシンを安定化するイオンが添加できる。 本法は、37℃ないし反応混合物の凝固点の範囲
にある温度で行なうことができる。トリプシンを
用いた酵素反応は、十分な反応速度を得るため約
37℃で通常行なわれる。しかし、トリプシンの不
活性化を避けるため本発明方法は室温未満の温度
で行なうことが有利である。実際約０℃を超える
反応温度が好ましい。 反応時間は、反応温度、添加されるトリプシン
の量および他の反応条件に依存して通常２，３時
間ないし２，３日の範囲にある。 アミド生成作用を助けそして望ましくないトリ
プシンの触媒作用の副作用を抑制するため、トリ
プシンの作用は水および溶剤含量の相互関係、
酸／塩基の割合および反応温度により大いに制御
される。反応混合物中の水の濃度を減少すると双
方に貢献するが、しかしまた不可逆のトリプシン
変性が起こる速度を増加する。しかし、後者は反
応温度を減少させることにより少なくとも部分的
に相殺されうる。反応温度を減少することはまた
アミド生成速度を減少するが、かかる減少は反応
時間を増加することにより相殺される。 反応混合物中のトリプシンおよびデス
（Ala^B30）−インシユリンの重量割合は、通常約
１：200を超え、好ましくは約１：50を超え、そ
して約１：１未満である。 アミド生成から得られるヒトインシユリンのト
レオニン^B30誘導体は一般式： （Thr（R²）−OR¹）^B30−ｈ−In （式中、ｈ−Inはヒトデス（Thr^B30）−インシ
ユリン部分であり、R¹およびR²は先に定義した
意味である） で表わされる。 式で表わされる、適用可能なＬ−トレオニン
誘導体は、インシユリン部分に実質的な不可逆変
化をもたらさない条件のもとで該誘導体中のR₁
がヒトインシユリンのトレオニン^B30エステル
（式）から除去できるカルボニル保護基である
ようなそのような誘導体である。そのようなカル
ボキニル保護基の例として、低級アルキル、例え
ばメチル、エチル、および第三ブチル、例えばｐ
−メトキシベンジルおよび２，４，６−トリメチ
ルベンジルの如き置換ベンジルおよびジフエニル
メチル、並びに一般式−CH₂CH₂SO₂R³（式中、
R³は低級アルキル、例えばメチル、エチル、プ
ロピルおよびｎ−ブチルを表わす）で表わされる
基が挙げられる。適当なヒドロキシ保護基R²は、
インシユリン分子において実質的な不可逆的変更
をもたらさない条件のもとでヒトインシユリンの
トレオニン^B30誘導体（式）から除去され得る
ような基である。そのような基（R²）の例とし
ては、第三ブチルが挙げられる。 低級アルキル基は７個未満、好ましくは５個未
満の炭素原子を含有する。 更に通常使用される保護基は、Wu¨nschによる
次の文献に記載される：Methoden der
Organischen Chemie（Houben−Weyl），Vol，
XV／１，編集者：Eugen Mu¨1ler，Georg
Thieme Verlug Stuttgart，1974年，これは参
考として取り入れられている。 デス（Ala^B30）−インシユリンの製造方法は、
Hoppe−Seylef's Z.Physiol.Chem.359巻（1978
年）799頁以下に記載されている。 式で表わされる幾つかのＬ−トレオニン誘導
体は、公知化合物でありそして残りのＬ−トレオ
ニン誘導体は公知化合物の製造と同様にして製造
できる。 式で表わされるＬ−トレオニン誘導体は、遊
離塩基又はそれらの適当な有機もしくは無機塩で
あり、好ましくはアセテート、プロピオネート、
ブチレートおよびヒドロクロリドの如きハロゲン
化水素酸塩である。 反応物、すなわち式で表わされるデス
（Ala^B30）−インシユリンおよびＬ−トレオニン誘
導体を高濃度で用いることが望ましい。式で表
わされるＬ−トレオニン誘導体およびデス
（Ala^B30）−インシユリンのモル比は好ましくは約
５：１超である。 反応混合物中の式で表わされるＬ−トレオニ
ン誘導体の濃度は0.1モルを超えるのが望ましい。 ヒトインシユリンはヒトインシユリンのトレオ
ニン^B30誘導体（式）から保護基R¹および何ら
かの保護基R²を公知の又は公知に準じた方法に
より除去することにより得ることができる。R¹
がメチル、エチル、又は基−CH₂CH₂SO₂R³（式
中、R³は先に定義した如き意味である）である
場合、該保護基は、水性媒体中穏やかな塩基性の
条件のもと、好ましくは約８〜12のPH値で、例え
ば約9.5で除去できる。塩基として、アンモニア、
トリエチルアミン、ビカルボネート／カルボネー
ト緩衝剤又は水酸化ナトリウムの如きアルカリ金
属の水酸化物が使用できる。R¹が第三ブチル、
置換ベンジル例えばｐ−メトキシベンジルもしく
は２，４，６−トリメチルベンジル又はジフエニ
ルメチルである場合、該基は好ましくはトルフル
オロ酢酸を用いたアシドリシスによつて除去でき
る。トルフロオロ酢酸は、非水でも又は水を含有
していてもよく、又はジクロロメタンの如き有機
溶剤で希釈してもよい。R²が第三ブチルである
場合、該基はアシドリシスによつて除去できる
（上記参照）。 式で表わされるヒトインシユリンの好ましい
トレオニン^B30誘導体は、R²が水素であるような
化合物であり、そしてこれらは式（式中、R²
は水素である）で表わされるＬ−トレオニン誘導
体から調製できる。 デス（Ala^B30）−インシユリンの錯体又は塩の
例として、亜鉛錯体又は亜鉛塩が挙げられる。 以下の実施例中の反応条件を考慮して、上記説
明による反応条件を選択することにより、ヒトイ
ンシユリンのトレオニン^B30誘導体（式）の収
率を90％以上あるいは95％以上とすることが可能
となる。 ヒトインシユリンのトレオニン^B30誘導体から
ヒトインシユリンを製造する好ましい方法は次の
通りである： １ アミド生成後、もしもトリプシン活性が残つ
ているならば、例えばトリプシンが不活性であ
るような条件のもと、例えばPH値３未満の酸性
媒体中でそれを除去することが好ましい。トリ
プシンは、例えば「Sephadex Ｇ−50」ゲル又
は酢酸中の「Bio−gelp−30」ゲル（上記引用
文中のNature280参照）を用いたゲル過によ
り分子量により分離除去することができる。 ２ 未反応のデス（Ala^B30）−インシユリンの如
き不純物は、アニオンおよび／又はカチオン交
換クロマトグラフイーを用いて除去できる。 ３ しかる後、ヒトインシユリンのトレオニン^B3
０誘導体（式）をブロツク解除しそしてヒト
インシユリンを単離し、例えばそれ自身公知の
方法で結晶化させる。 この方法により、医薬として許容できる純度を
有するヒトインシユリンが得られそして必要なら
更に精製することもできる。 使用した略語は生化学命名に関するIUPAC−
IUB委員会により是認された（1974年）規則によ
る（生化学命名に関するIUPAC−IUB委員会の
Collected Tentative Rules ＆
Recommendations，2nd ed.，Maryland1975）。 本発明でのべられる新規な特徴事項又はそれの
組合わせは本質的なものと考えられる。 ヒトインシユリン誘導体およびヒトインシユリ
ンの製造方法を次の実施例により説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。実施例
は、本発明により方法の幾つかの好ましい態様を
示す。 実施例 １ 豚のデス（Ala^B30）−インシユリン10mgを、
10Mの酢酸100μに溶解した。この溶液50μ
に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した
2MのThr−OMe（Meはメチルを表わす）100μ
、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド60μ、水
15μおよび0.05Mの塩化カルシウムに溶解した
トリプシン（８重量％／溶積）10μを添加し
た。４℃で24時間インキユベーシヨンした後、生
成物をアセトン８mlで沈澱させ、遠心分離で単離
し、アセトン８mlで洗浄し、遠心分離で分離し次
いで真空中で乾燥させる。（Thr−OMe）^B30−ｈ
−Inの収率はHPLCより決定した。生成物を、
1Mの酢酸２mlに溶解し次いで溶離液として26.8
％（容積／容積）アセトニトリルを含有しかつPH
値3.5に調整した0.2Mの硫酸アンモニウム緩衝液
を用い、溶液100μを逆相HPLCに対し４×200
mmの「Nucleosil 5C₁₈カラム」に適用した。毎分
１mlの流速で、18分後にデス（Ala^B30）−インシ
ユリンが溶出し次いで24分後に （Thr−OMe）^B30−ｈ−Inが溶出した。反応の副
生成物、すなわち（Thr−OMe）^B23−デス−ヘプ
タペプチド（B24−B30）−インシユリンが７分
後に溶出した。タンパク質の検出および定量は
280nmでの吸光度に基づいて行なつた。分析の結
果、次の化合物の分配が得られた。 （Thr−OMe）^B30−ｈ−In ：97.1％ デス（Ala^B30）−インシユリン ：2.5％ （Thr−OMe）^B23−デス−ヘプタ ペプチド（B²⁴−B³⁰）−インシユリン ：0.4％ 実施例２〜16 第１表に示すように反応のパラメータを変えて
実施例１におけると同様に操作し、ことの実施例
２〜16を行なつた。しかし、全ての実施例におい
て、水溶液に溶解した８％トリプシン10μ、式
で表わされるトレオニン誘導体を含有する有機
溶剤100μおよび20％デス（Ala^B30）−インシユ
リンを含有する酢酸50μを添加した。該有機溶
剤および該酢酸に溶解した式で表わされるトレ
オニン誘導体のモル濃度は第１表に示される。反
応時間は24時間であつた。第１表において以下の
記号が用いられている。 HOAcは酢酸であり、DMAAはＮ，Ｎ−ジメ
チルアセトアミドであり、DMFはＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミドであり、DMSOはジメチルス
ルホキシドであり、NMPはＮ−メチルピロリド
ンでありそしてTHFはテトラヒドロフランであ
る。 （Thr−OBu^t）^B30−ｈ−Inを合成する場合、実
施例15を参照されたいが、HPLCによる溶出は、
26.8％から40％（ｖ／ｖ）に変わるアセトニトリ
ルのこう配溶出法が適用された。

【表】

【表】 実施例17〜34 ４時間の反応時間のもと、実施例１〜16と同様
に操作して実施例17〜34を行なつた。これらの
各々の実施例中、収量は実施例１〜16でそれぞれ
得られたものと同じであつた。 実施例１〜16と実施例17〜34とをそれぞれ比較
し同じ収率で得られそしてこれは、特に該実施例
で説明された新規な方法を、上記の第16回ヨーロ
ツパペプチドシンポジウムの会報に記載されてい
る公知方法と区別するものである。 実施例 35 結晶（Thr−OMe）^B30−ｈ−In250mgを水250ml
に分散し次いで1Nの水酸化ナトリウム溶液を添
加して溶解しPH値10.0とした。PH値を25℃で24時
間10.0の一定値に保持した。得られたヒトインシ
ユリンを、塩化ナトリウム２ｇ、酢酸ナトリウム
三水和物350mgおよび酢酸亜鉛二水和物2.5mgを添
加し続いてPH値5.52を得るため1N塩酸を添加す
ることにより結晶させた。４℃で24時間貯蔵後、
菱面体の結晶を遠心分離で単離し、水３mlで洗浄
し、遠心分離で単離し次いで真空中で乾燥した。
収率：ヒトインシユリン220mg。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 豚のデス（Ala^B30）−インシユリン又はその
   塩もしくはその錯体を、次の一般式： Th_R（R²−OR¹ （式中、R¹はカルボキシル保護基を表わし、
   更にR²は水素もしくはヒドロキシル保護基を表
   わす）で表わされるＬ−トレオニン誘導体又はそ
   れらの塩とを、水、水と混和し得る有機溶剤およ
   びトロプシンの混合物中で反応させることによつ
   てヒトインシユリン又はヒトインシユリンのトレ
   オニン誘導体又はそれらの塩もしくはそれらの錯
   体を製造する方法において、反応混合物中の水含
   量が27〜10％（容量／容量）でありかつ反応温度
   が酸の所望の存在下約37℃よりもより低く、しか
   る後得られた誘導体を所望によりブロツク解除し
   ヒトインシユリンを生成することを特徴とする前
   記方法。 ２ 前記反応混合物中の式のＬ−トレオニン誘
   導体の濃度が0.1モルを超え、反応温度が反応混
   合物の凝固点を超えかつ反応混合物が式で表わ
   されるＬ−トレオニン誘導体の１当量に対し酸の
   10当量以下を含有する、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３ 前記反応温度が約室温未満であり、かつ約０
   ℃を超える特許請求の範囲第１項又は第２に記載
   の方法。 ４ 反応混合物中の水の含量が25％未満（容量／
   容量）である、特許請求の範囲第１項から第３項
   までのいずれかに記載の方法。 ５ 反応混合物中の水の含量が15％（容量／容
   量）を超える、特許請求の範囲第１項から第４項
   までのいずれかに記載の方法。 ６ 前記式で表わされるＬ−トレオニン誘導体
   とデス（Ala^B30）−インシユリンとのモル比が
   ５：１を超える、特許請求の範囲第１項から第５
   項までのいずれかに記載の方法。 ７ 前記水と混和し得る有機溶剤がメタノール、
   エタノール、２−プロパノール、１，２−エタン
   ジオール、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロ
   フラン、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
   アミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メ
   チルピロリドン、ヘキサメチルホスホトリアミ
   ド、アセトニトリル又はDMSOである、特許請
   求の範囲第１項から第６項までのいずれかに記載
   の方法。 ８ 前記溶剤が、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
   ルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
   ド、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルホスホ
   トリアミド、アセトニトリル又はDMSOである、
   特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれか
   に記載の方法。 ９ 前記酸が有機酸、好ましくは蟻酸、酢酸、プ
   ロピオン酸又は酪酸である、特許請求の範囲第１
   項から第８項までのいずれかに記載の方法。 １０ 前記反応混合物中の酸の量が、前記式で
   表わされるＬ−トレオニン誘導体の１当量に対し
   0.5〜５当量である、特許請求の範囲第１項から
   第９項までのいずれかに記載の方法。 １１ 前記反応混合物中のトリプシンおよびデス
   （Ala^B30）−インシユリンの重量比が１：200を超
   え、好ましくは１：50を超え、そして１：１未満
   である、特許請求の範囲第１項から第１０項まで
   のいずれかに記載の方法。 １２ 反応がカルシウムイオンの存在下で行なわ
   れる、特許請求の範囲第１項から第１１項までの
   いずれかに記載の方法。 １３ 反応が緩衝系中で行なわれる、特許請求の
   範囲第１項から第１２項までのいずれかに記載の
   方法。 １４ 前記式で表わされるＬ−トレオニン誘導
   体がアセテート、プロピオネート、ブチレート又
   は塩酸塩の如きハロゲン化水素酸塩として添加さ
   れる、特許請求の範囲第１項から第１３項までの
   いずれかに記載の方法。 １５ 前記反応温度および水の含量および反応混
   合物中の酸が、反応混合物中のヒトインシユリン
   のトレオニン^B30誘導体の収量が90％以上、好ま
   しくは95％以上であるように選ばれる、特許請求
   の範囲第１項から第１４項までのいずれかに記載
   の方法。 １６ 前記R¹が低級アルキル、置換ベンジルも
   しくはジフエニルメチル又は式−CH₂CH₂SO₂R³
   （式中、R³は低級アルキルを表わす）で表わされ
   る基である、特許請求の範囲第１項から第１５項
   までのいずれかに記載の方法。 １７ 前記R¹がメチル、エチル、第三−ブチル、
   ｐ−メトキシベンジル、２，４，６−トリメチル
   ベンジル又は式−CH₂CH₂SO₂R³（式中、R³はメ
   チル、エチル、プロピル又はｎ−ブチルである）
   で表わされる基である、特許請求の範囲第１項か
   ら第１６項までのいずれかに記載の方法。 １８ 前記ブロツク解除を、塩基の存在下水性媒
   体中、好ましくは約８〜12のPH値で行なう、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １９ 前記ブロツク解除を、アシドリシスによ
   り、好ましくはトリフルオロ酢酸を用いて行な
   う、特許請求の範囲第１項記載の方法。