JPH0211240B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、インシユリンおよびインシユリン様
化合物のヒトのインシユリンへの変換に関する。 豚又は牛のインシユリンから得られるインシユ
リン製剤は、糖尿病の治療において広く使用され
ている。豚、牛およびヒトのインシユリンはそれ
らのアミノ酸組成に関し弱干の相違を示すが、ヒ
トのインシユリンと豚のインシユリンとの差違
は、ただ１個のアミノ酸にあることが確認されて
おり、そこにおいてはヒトのインシユリンのB30
アミノ酸がトレオニンであるのに対し、豚のイン
シユリンのそれはアラニンである。しかし、ヒト
の治療に対する理想的なインシユリン製剤は、ヒ
トのインシユリンの構造と全く同一の化学構造を
有するインシユリンであることは明らかであろ
う。天然のヒトのインシユリンの製造に対して、
必要量の膵臓は得られていない。 合成ヒトインシユリンは、多大な費用で小規模
で製造されている（Helv.Chim.Acta57巻、2617
頁および60巻、27頁参照）。半合成ヒトインシユ
リンが、豚のインシユリンから手間のかかる工程
によつて製造された（Hoppe−Seyler′s Z.
Physiol.Chem.357巻、759頁およびNature280巻、
412頁参照）。しかるに、本発明は、工業的規模で
ヒトインシユリンを製造する方法に関する。 米国特許第3276961号は半合成ヒトインシユリ
ンの製造方法に関して企図されている。しかる
に、ヒトのインシユリンの収量は悪い。これは、
プロセスが水中で行なわれ、この条件下ではトリ
プシンがArgB22−GlyB23結合の開裂を引きおこす
からである（J.Biol.Chem.236巻、743頁参照）。 ヒトのインシユリンを製造する公知の半合成方
法は、以下の三工程を含む： 第一に、豚のインシユリンをカルボキシペプチ
ダーゼＡにて処理することにより、豚のデス−
（AlaB30）−インシユリンに変換することである
（Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.359巻、799
頁参照）。第二の工程で、豚のデス−AlaB30）−イ
ンシユリンをThr−OButとトリプシン−触媒カ
ツプリングせしめ、これによりヒトのインシユリ
ンThrB30−tert−ブチルエステルが形成する。最
後に、該エステルをトリフルオロ酢酸で処理し、
ヒトのインシユリンを得る（Nature280巻、412
頁参照）。しかし、第一の工程は、AsnA21の部分
脱離を引きおこし、デス−（AlaB30、AsnA21）−イ
ンシユリンを与える。この誘導体は、続く２回の
反応後、得られる半合成ヒトインシユリンにおい
てデス−（AsnA21）−インシユリンの汚染を引き
起こし、この汚染は公知の予備的方法によつて容
易に除去することはできない。デス−（−
AsnA21）−インシユリンは低生物活性（約５％）
を有する（Amer.J.Med.40巻、750頁参照）。 本発明の第一の目的は、ヒト以外のインシユリ
ンをヒトのインシユリンに変える方法に関する。 本発明の第二の目的は、豚のインシユリンおよ
びその中の或る不純物を、ヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステルを経由してヒトのインシ
ユリンに変える方法を提供することにある。 本発明の他の目的および有利な点は、本発明中
で明らかにされるであろう。 本発明は、インシユリン化合物におけるLysB29
のカルボニル基に結合したアミノ酸又はペプチド
鎖がトレオニンエステルと交換され得るという発
見に基づいている。この交換を、本発明において
はペプチド転位と呼ぶ。 本発明において使用される用語「インシユリン
化合物」は、インシユリン並びにヒトのデス
（ThrB30）インシユリン部分を含有するインシユ
リン様化合物を包含するものとし、インシユリン
のB30アミノ酸はアラニン（例えば、豚、犬並び
に通常の鯨およびまつこう鯨における）又はセリ
ン（家兎）である。本発明における用語「インシ
ユリン様化合物」はプロインシユリンからインシ
ユリンへの変転の際の中間物と共に、上記種およ
び上記霊長類のいずれかから誘導されるプロイン
シユリンを包含する。かかる中間物の例として、
分裂プロインシユリン、デスデイペプチドプロイ
ンシユリン、デスノナペプチドプロインシユリン
およびジアルギニンインシユリンが挙げられる
（R.Chance：In Proceedings of the Seventh
Congress of IDF、Buenous Aires1970年、292
〜305頁参照、編集者：R.R.Rodrigues＆J.V.−
Owen、Excerpta Medica、Amsterdam）。 本発明に係るプロセスは、インシユリン化合物
又はその塩もしくは錯体を、水、水と混和し得る
有機溶媒およびトリプシンの混合物中Ｌ−トレオ
ニンエステルもしくはそれらの塩で、ペプチド転
位せしめることを含んでなることを特徴とし、か
つ反応混合物中の水の含量が50％（容量／容量）
未満であり、反応温度は約50℃未満であることを
特徴とする。トリプシンは、そのタンパク質分解
性に対し最も良く知られているが、その分野の研
究者は、トリプシンがデス−（AlaB30）−インシユ
リンおよびトレオニン第三−ブチルエステルとの
カツプリングに触媒作用をすることの可能性を認
めている（Nature280、412頁参照）。本発明方法
において、トリプシンはペプチド転位に触媒作用
せしめるため使用される。 ペプチド転位は、水および少なくとも一種の水
と混和しうる有機溶媒の混合物中、必要により酸
の存在下、(1)インシユリン化合物、(2)Ｌ−トレオ
ニンエステルおよび(3)トリプシンを溶解すること
によつて行なわれる。 好ましい水混和性有機溶剤は、極性溶剤であ
る。かかる溶剤の例として、メタノール、エタノ
ール、２−プロパノール、１，２−エタンジオー
ル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ホルムアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル
ピロリドン、ヘキサメチルホスホトリアミドおよ
びアセトニトリルがあげられる。 どのような水混和性有機溶剤が使用されるか、
反応温度がどのように選択されるかに依り、更に
反応混合物中に酸が存在するかによつて、反応混
合物中の水の含量は約50％（Ｖ／Ｖ）未満、好ま
しくは約40％（Ｖ／Ｖ）未満であり、そして約10
％（Ｖ／Ｖ）超である。 反応混合物中の水の量を減少することによる一
つの有利な点は、それによつて副生成物の形成が
減少することである。同様に、反応混合物中、酸
の量を減少すると、副生成物の形成を減少するこ
とが可能となる。収率の増加は、有機溶媒の高い
％と明らかに相互関係にある。 トリプシンタイプは、本発明の実施に対し重要
ではない。トリプシンは特徴ある酵素であり、こ
れは高純度で、明らかに豚および牛源より商業的
に入手可能である。更に、微生物源のトリプシン
も使用できる。更に、トリプシン形、例えば結晶
性トリプシン（可溶形）、固定化トリプシン又更
にはトリプシン誘導体（トリプシンの活性が保持
される限り）は、本発明の実施に対する原料では
ない。本発明で用いられる用語トリプシンは、全
ての源からのトリプシン並びにトリプシン様特異
性を有するプロテアーゼ、例えばアクロモバクタ
ーリテイカス（Acromobacter lyticus）プロテ
アーゼ（Agric.Biol.Chem.42巻、1443頁参照）を
含めて、ペプチド転位作用を保持する全ての形態
のトリプシンを含むものとする。 活性トリプシン誘導体の例として、アセチル化
トリプシン、サクシニル化トリプシン、グルタル
酸アルデヒド処理トリプシンおよび固定化トリプ
シン誘導体が挙げられうる。 もし固定化トリプシンが用いられる場合、それ
は媒体中で懸濁されている。 塩酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸および酪酸の
如き有機又は無機酸、又はピリジン、TRIS、Ｎ
−メチルモルホリンおよびＮ−エチルモルホリン
の如き塩基が適当な緩衝系をもたらすよう添加さ
れる。有機酸が好ましい。しかし、反応はかかる
添加がなくとも進行し得る。添加される酸の量
は、Ｌ−トレオニンエステルの１当量当たり約10
当量未満が通常である。好ましい酸添加量は、Ｌ
−トレオニンエステルの１当量当たり0.5〜５当
量である。カルシウムイオンの如くトリプシンを
安定化させるイオンも添加できる。 プロセスは、50℃ないし反応混合物の凝固点の
範囲の温度で行なわれる。トリプシンによる酵素
反応は、十分な反応速度を得るため通常約37℃で
行なわれる。しかし、トリプシンの不活性化を避
けるため、室温以下の温度で本発明に係るプロセ
スを行うことが有利である。実際、約０℃超の反
応温度が好ましい。 反応時間は、反応温度、添加トリプシン量およ
び他の反応条件に依つて通常数時間ないし数日の
間である。 反応混合物中におけるトリプシンとインシユリ
ン化合物との重量比は、通常約１対200以上、好
ましくは約１対50以上であり、そして約１対１未
満である。 本発明の実施に対し企図されるＬ−トレオニン
エステルは次の一般式（）： Thr（R5）−OR4 （） （式中、R4はカルボキシル保護基を表わし、R5
は水素又は水酸基保護基又はそれらの塩を表わ
す）で表わされる。 ペプチド転位から得られるヒトのインシユリン
のトレオニンB30エステルは、次の一般式（）： （Thr（R5）−OR4）B30−ｈ−In （） （式中、ｈ−Inはヒトのデス−（ThrB30インシユ
リン部分を表わし、R4およびR5は先に定義され
た意味を表わす） で表わされる。 式で表わされる、適用可能なＬ−トレオニン
エステルは、以下の如きエステルである。すなわ
ち、R4がカルボニル保護基であり、この基は、
インシユリン分子内で非可逆的交換を実質的に引
きおこさない条件のもとで、ヒトのインシユリン
のトレオニンB30から除去され得る。かかるカル
ボキシル保護基の例としてて、例えばメチル、エ
チルおよび第三ブチルの如き低級アルキル；ｐ−
メトキシベンジルおよび２，４，６−トリメチル
ベンジルの如き置換ベンジル基並びにジフエニル
メチル更には一般式−CH2CH2SO2R6（式中、R6
はメチル、エチル、プロピルおよびｎ−ブチルの
如き低級アルキルを表わす）で表わす基が挙げら
れる。適当なヒドロキシル保護基R5は、インシ
ユリン分子内で非可逆的交換を実質的におこさな
い条件下でヒトのインシユリンのトレオニンB30
エステル（式）から除去されうるような保護基
である。かかる基（R5）の例として、第三−ブ
チル基が挙げられる。 低級アルキル基は、７未満の炭素原子、好まし
くは５未満の炭素原子を含有する。 更に、通常使用される保護基は、Wu¨nschによ
つて説明されている：Methoden der
Organischen Chemie（Houben−Weyl）、XV／
１巻、編集者：Eugen Mu¨ller、Georg Thime
Verlag、Stuttgart1974年。 ある種のＬ−トレオニンエステル（式）は、
公知化合物であり、他のＬ−トレオニンエステル
（式）は公知化合物の製造と同様の方法で製造
できる。 式で表わされるＬ−トレオニンエステルは、
遊離塩基でも又はそれらの適当な有機もしくは無
機塩であり、好ましくは、アセテート、プロピオ
ネート、ブチレートおよびヒドロクロリドの如き
ヒドロクロリドであつてもよい。 反応成分、すなわちインシユリン化合物および
Ｌ−トレオニンエステル（式）は高濃度で用い
ることが望ましい。Ｌ−トレオニンエステルとイ
ンシユリン化合物との間のモル比は、約５対１を
超えるのが好ましい。 反応混合物中のＬ−トレオニンエステル（式
）の濃度は、0.1モルを超えるのが好ましい。 ヒトのインシユリンは、ヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステルから公知の方法又はそれ
自体公知方法によつて保護基R4および保護基R5
を除去することによつて得られる。R4がメチル、
エチル、又は基−CH2CH2SO2R6（ここでR6は先
に定義された意味である）である場合、該保護基
は水性媒体中、穏やかな塩基性条件下、好ましく
は約８〜12のPH値、例えば約9.5で除去されうる。
塩基として、アンモニア、トリエチルアミン、又
は水酸化ナトリウムの如きアルカリ金属の水酸化
物が使用できる。 R4が第三−ブチル、ｐ−メトキシベンジルも
しくは２，４，６−トリメチルベンジルの如き置
換ベンジル又はジフエニルメチルである場合、該
保護基は、好ましくはトリフルロオ酢酸を用い
た、アシドリシスによつて除去されうる。トリフ
ルロオ酢酸は、非水でも又は水を含有していても
よく、又はジクロロメタンの如き有機溶媒で希釈
してもよい。R5が第三−ブチルである場合、該
基は、アシドリシスによつて除去できる（上記参
照）。 式で表わされるヒトのインシユリンの好まし
いトレオニンB30エステルは、R5が水素である化
合物であり、これらは式（式中、R5は水素で
ある）で表わされるＬ−トレオニンエステルから
得られる。 インシユリン化合物の、ヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステルへのペプチド転位は、イ
ンシユリン化合物に対しての次式： ｛式中、
化合物のヒトのインシユリンへの変換に関する。 豚又は牛のインシユリンから得られるインシユ
リン製剤は、糖尿病の治療において広く使用され
ている。豚、牛およびヒトのインシユリンはそれ
らのアミノ酸組成に関し弱干の相違を示すが、ヒ
トのインシユリンと豚のインシユリンとの差違
は、ただ１個のアミノ酸にあることが確認されて
おり、そこにおいてはヒトのインシユリンのB30
アミノ酸がトレオニンであるのに対し、豚のイン
シユリンのそれはアラニンである。しかし、ヒト
の治療に対する理想的なインシユリン製剤は、ヒ
トのインシユリンの構造と全く同一の化学構造を
有するインシユリンであることは明らかであろ
う。天然のヒトのインシユリンの製造に対して、
必要量の膵臓は得られていない。 合成ヒトインシユリンは、多大な費用で小規模
で製造されている（Helv.Chim.Acta57巻、2617
頁および60巻、27頁参照）。半合成ヒトインシユ
リンが、豚のインシユリンから手間のかかる工程
によつて製造された（Hoppe−Seyler′s Z.
Physiol.Chem.357巻、759頁およびNature280巻、
412頁参照）。しかるに、本発明は、工業的規模で
ヒトインシユリンを製造する方法に関する。 米国特許第3276961号は半合成ヒトインシユリ
ンの製造方法に関して企図されている。しかる
に、ヒトのインシユリンの収量は悪い。これは、
プロセスが水中で行なわれ、この条件下ではトリ
プシンがArgB22−GlyB23結合の開裂を引きおこす
からである（J.Biol.Chem.236巻、743頁参照）。 ヒトのインシユリンを製造する公知の半合成方
法は、以下の三工程を含む： 第一に、豚のインシユリンをカルボキシペプチ
ダーゼＡにて処理することにより、豚のデス−
（AlaB30）−インシユリンに変換することである
（Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.359巻、799
頁参照）。第二の工程で、豚のデス−AlaB30）−イ
ンシユリンをThr−OButとトリプシン−触媒カ
ツプリングせしめ、これによりヒトのインシユリ
ンThrB30−tert−ブチルエステルが形成する。最
後に、該エステルをトリフルオロ酢酸で処理し、
ヒトのインシユリンを得る（Nature280巻、412
頁参照）。しかし、第一の工程は、AsnA21の部分
脱離を引きおこし、デス−（AlaB30、AsnA21）−イ
ンシユリンを与える。この誘導体は、続く２回の
反応後、得られる半合成ヒトインシユリンにおい
てデス−（AsnA21）−インシユリンの汚染を引き
起こし、この汚染は公知の予備的方法によつて容
易に除去することはできない。デス−（−
AsnA21）−インシユリンは低生物活性（約５％）
を有する（Amer.J.Med.40巻、750頁参照）。 本発明の第一の目的は、ヒト以外のインシユリ
ンをヒトのインシユリンに変える方法に関する。 本発明の第二の目的は、豚のインシユリンおよ
びその中の或る不純物を、ヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステルを経由してヒトのインシ
ユリンに変える方法を提供することにある。 本発明の他の目的および有利な点は、本発明中
で明らかにされるであろう。 本発明は、インシユリン化合物におけるLysB29
のカルボニル基に結合したアミノ酸又はペプチド
鎖がトレオニンエステルと交換され得るという発
見に基づいている。この交換を、本発明において
はペプチド転位と呼ぶ。 本発明において使用される用語「インシユリン
化合物」は、インシユリン並びにヒトのデス
（ThrB30）インシユリン部分を含有するインシユ
リン様化合物を包含するものとし、インシユリン
のB30アミノ酸はアラニン（例えば、豚、犬並び
に通常の鯨およびまつこう鯨における）又はセリ
ン（家兎）である。本発明における用語「インシ
ユリン様化合物」はプロインシユリンからインシ
ユリンへの変転の際の中間物と共に、上記種およ
び上記霊長類のいずれかから誘導されるプロイン
シユリンを包含する。かかる中間物の例として、
分裂プロインシユリン、デスデイペプチドプロイ
ンシユリン、デスノナペプチドプロインシユリン
およびジアルギニンインシユリンが挙げられる
（R.Chance：In Proceedings of the Seventh
Congress of IDF、Buenous Aires1970年、292
〜305頁参照、編集者：R.R.Rodrigues＆J.V.−
Owen、Excerpta Medica、Amsterdam）。 本発明に係るプロセスは、インシユリン化合物
又はその塩もしくは錯体を、水、水と混和し得る
有機溶媒およびトリプシンの混合物中Ｌ−トレオ
ニンエステルもしくはそれらの塩で、ペプチド転
位せしめることを含んでなることを特徴とし、か
つ反応混合物中の水の含量が50％（容量／容量）
未満であり、反応温度は約50℃未満であることを
特徴とする。トリプシンは、そのタンパク質分解
性に対し最も良く知られているが、その分野の研
究者は、トリプシンがデス−（AlaB30）−インシユ
リンおよびトレオニン第三−ブチルエステルとの
カツプリングに触媒作用をすることの可能性を認
めている（Nature280、412頁参照）。本発明方法
において、トリプシンはペプチド転位に触媒作用
せしめるため使用される。 ペプチド転位は、水および少なくとも一種の水
と混和しうる有機溶媒の混合物中、必要により酸
の存在下、(1)インシユリン化合物、(2)Ｌ−トレオ
ニンエステルおよび(3)トリプシンを溶解すること
によつて行なわれる。 好ましい水混和性有機溶剤は、極性溶剤であ
る。かかる溶剤の例として、メタノール、エタノ
ール、２−プロパノール、１，２−エタンジオー
ル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ホルムアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル
ピロリドン、ヘキサメチルホスホトリアミドおよ
びアセトニトリルがあげられる。 どのような水混和性有機溶剤が使用されるか、
反応温度がどのように選択されるかに依り、更に
反応混合物中に酸が存在するかによつて、反応混
合物中の水の含量は約50％（Ｖ／Ｖ）未満、好ま
しくは約40％（Ｖ／Ｖ）未満であり、そして約10
％（Ｖ／Ｖ）超である。 反応混合物中の水の量を減少することによる一
つの有利な点は、それによつて副生成物の形成が
減少することである。同様に、反応混合物中、酸
の量を減少すると、副生成物の形成を減少するこ
とが可能となる。収率の増加は、有機溶媒の高い
％と明らかに相互関係にある。 トリプシンタイプは、本発明の実施に対し重要
ではない。トリプシンは特徴ある酵素であり、こ
れは高純度で、明らかに豚および牛源より商業的
に入手可能である。更に、微生物源のトリプシン
も使用できる。更に、トリプシン形、例えば結晶
性トリプシン（可溶形）、固定化トリプシン又更
にはトリプシン誘導体（トリプシンの活性が保持
される限り）は、本発明の実施に対する原料では
ない。本発明で用いられる用語トリプシンは、全
ての源からのトリプシン並びにトリプシン様特異
性を有するプロテアーゼ、例えばアクロモバクタ
ーリテイカス（Acromobacter lyticus）プロテ
アーゼ（Agric.Biol.Chem.42巻、1443頁参照）を
含めて、ペプチド転位作用を保持する全ての形態
のトリプシンを含むものとする。 活性トリプシン誘導体の例として、アセチル化
トリプシン、サクシニル化トリプシン、グルタル
酸アルデヒド処理トリプシンおよび固定化トリプ
シン誘導体が挙げられうる。 もし固定化トリプシンが用いられる場合、それ
は媒体中で懸濁されている。 塩酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸および酪酸の
如き有機又は無機酸、又はピリジン、TRIS、Ｎ
−メチルモルホリンおよびＮ−エチルモルホリン
の如き塩基が適当な緩衝系をもたらすよう添加さ
れる。有機酸が好ましい。しかし、反応はかかる
添加がなくとも進行し得る。添加される酸の量
は、Ｌ−トレオニンエステルの１当量当たり約10
当量未満が通常である。好ましい酸添加量は、Ｌ
−トレオニンエステルの１当量当たり0.5〜５当
量である。カルシウムイオンの如くトリプシンを
安定化させるイオンも添加できる。 プロセスは、50℃ないし反応混合物の凝固点の
範囲の温度で行なわれる。トリプシンによる酵素
反応は、十分な反応速度を得るため通常約37℃で
行なわれる。しかし、トリプシンの不活性化を避
けるため、室温以下の温度で本発明に係るプロセ
スを行うことが有利である。実際、約０℃超の反
応温度が好ましい。 反応時間は、反応温度、添加トリプシン量およ
び他の反応条件に依つて通常数時間ないし数日の
間である。 反応混合物中におけるトリプシンとインシユリ
ン化合物との重量比は、通常約１対200以上、好
ましくは約１対50以上であり、そして約１対１未
満である。 本発明の実施に対し企図されるＬ−トレオニン
エステルは次の一般式（）： Thr（R5）−OR4 （） （式中、R4はカルボキシル保護基を表わし、R5
は水素又は水酸基保護基又はそれらの塩を表わ
す）で表わされる。 ペプチド転位から得られるヒトのインシユリン
のトレオニンB30エステルは、次の一般式（）： （Thr（R5）−OR4）B30−ｈ−In （） （式中、ｈ−Inはヒトのデス−（ThrB30インシユ
リン部分を表わし、R4およびR5は先に定義され
た意味を表わす） で表わされる。 式で表わされる、適用可能なＬ−トレオニン
エステルは、以下の如きエステルである。すなわ
ち、R4がカルボニル保護基であり、この基は、
インシユリン分子内で非可逆的交換を実質的に引
きおこさない条件のもとで、ヒトのインシユリン
のトレオニンB30から除去され得る。かかるカル
ボキシル保護基の例としてて、例えばメチル、エ
チルおよび第三ブチルの如き低級アルキル；ｐ−
メトキシベンジルおよび２，４，６−トリメチル
ベンジルの如き置換ベンジル基並びにジフエニル
メチル更には一般式−CH2CH2SO2R6（式中、R6
はメチル、エチル、プロピルおよびｎ−ブチルの
如き低級アルキルを表わす）で表わす基が挙げら
れる。適当なヒドロキシル保護基R5は、インシ
ユリン分子内で非可逆的交換を実質的におこさな
い条件下でヒトのインシユリンのトレオニンB30
エステル（式）から除去されうるような保護基
である。かかる基（R5）の例として、第三−ブ
チル基が挙げられる。 低級アルキル基は、７未満の炭素原子、好まし
くは５未満の炭素原子を含有する。 更に、通常使用される保護基は、Wu¨nschによ
つて説明されている：Methoden der
Organischen Chemie（Houben−Weyl）、XV／
１巻、編集者：Eugen Mu¨ller、Georg Thime
Verlag、Stuttgart1974年。 ある種のＬ−トレオニンエステル（式）は、
公知化合物であり、他のＬ−トレオニンエステル
（式）は公知化合物の製造と同様の方法で製造
できる。 式で表わされるＬ−トレオニンエステルは、
遊離塩基でも又はそれらの適当な有機もしくは無
機塩であり、好ましくは、アセテート、プロピオ
ネート、ブチレートおよびヒドロクロリドの如き
ヒドロクロリドであつてもよい。 反応成分、すなわちインシユリン化合物および
Ｌ−トレオニンエステル（式）は高濃度で用い
ることが望ましい。Ｌ−トレオニンエステルとイ
ンシユリン化合物との間のモル比は、約５対１を
超えるのが好ましい。 反応混合物中のＬ−トレオニンエステル（式
）の濃度は、0.1モルを超えるのが好ましい。 ヒトのインシユリンは、ヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステルから公知の方法又はそれ
自体公知方法によつて保護基R4および保護基R5
を除去することによつて得られる。R4がメチル、
エチル、又は基−CH2CH2SO2R6（ここでR6は先
に定義された意味である）である場合、該保護基
は水性媒体中、穏やかな塩基性条件下、好ましく
は約８〜12のPH値、例えば約9.5で除去されうる。
塩基として、アンモニア、トリエチルアミン、又
は水酸化ナトリウムの如きアルカリ金属の水酸化
物が使用できる。 R4が第三−ブチル、ｐ−メトキシベンジルも
しくは２，４，６−トリメチルベンジルの如き置
換ベンジル又はジフエニルメチルである場合、該
保護基は、好ましくはトリフルロオ酢酸を用い
た、アシドリシスによつて除去されうる。トリフ
ルロオ酢酸は、非水でも又は水を含有していても
よく、又はジクロロメタンの如き有機溶媒で希釈
してもよい。R5が第三−ブチルである場合、該
基は、アシドリシスによつて除去できる（上記参
照）。 式で表わされるヒトのインシユリンの好まし
いトレオニンB30エステルは、R5が水素である化
合物であり、これらは式（式中、R5は水素で
ある）で表わされるＬ−トレオニンエステルから
得られる。 インシユリン化合物の、ヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステルへのペプチド転位は、イ
ンシユリン化合物に対しての次式： ｛式中、
【式】はヒトのデ
ス（ThrB30）インシユリン部分（ここでGlyA1は
R1で示される置換基に結合しておりさらにLysB29
はR2で示される置換基に結合している）を表わ
し、R2はアミノ酸、又は36個以下のアミノ酸を
含有するペプチド鎖を表わし、更にR1は水素も
しくは一般式R3−Ｘ−（式中、Ｘはアルギニン又
はリシンを表し、R3は35個以下のアミノ酸を含
有するペプチド鎖を表わす）で表わされる基であ
るか、又はR1およびR2中の双方に存在するアミ
ノ酸の数が37未満であることを条件として、R3
はR2と共に一緒になつて35個以下のアミノ酸を
含有するペプチド鎖を表わす｝ を基礎にして更に詳しく説明される。 従つて、本発明のペプチド転位は、上記インシ
ユリン化合物のいずれをもヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステル（式）に変換され、該
エステルは次いでヒトのインシユリンを形成する
ためブロツク解除され得る。 本発明の別の利点は、粗インシユリン内および
ある種の商業的インシユリン製剤内に存し、かつ
式によつてカバーされるインシユリン様化合物
は、本発明のペプチド転位によつてヒトのインシ
ユリンのトレオニンB30エステルに変換され、こ
れは次いでヒトのインシユリンを形成するためブ
ロツク解除され得る。式で表わされるインシユ
リン様化合物の例は次に示される： 豚のジアルギニンインシユリン（R1は水素で
あり、R2は−Ala−Arg−Argである）、豚のプロ
インシユリン（R2と共にR3は、−Ala−Arg−
Arg−Glu−Ala−Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−
Gly−Ala−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−
Leu−Gly−Gly−Leu−Gln−Ala−Leu−Ala−
Leu−Glu−Gly−Pro−Pro−Gln−Lys−であ
り、ここで末端アラニルはLysB29に結合してい
る）、犬のプロインシユリン（R2と共にR3は、−
Ala−Arg−Arg−Asp−Val−Glu−Leu−Ala−
Gly−Ala−Pro−Gly−Glu−Gly−Gly−Leu−
Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ala−
Leu−Gln−Lys−であり、末端アラニルはLysB29
に結合している）、豚の分裂プロインシユリン
（R3はAla−Leu−Glu−Gly−Pro−Pro−Gln−
Lys−であり、さらにR2は−Ala−Arg−Arg−
Glu−Ala−Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−Gly−
Ala−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Leu−
Gly−Gly−Leu−Gln−Ala−Leuである）、豚の
デスジペプチドプロインシユリン（R1は水素で
あり、さらにR2は−Ala−Arg−Arg−Glu−Ala
−Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−Gly−Ala−Val
−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Leu−Gly−Gly
−Leu−Gln−Ala−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly
−Pro−Pro−Glnである）、ヒトのプロインシユ
リン（R2と共にR3は−Thr−Arg−Arg−Glu−
Ala−Glu−Asp−Leu−Gln−Val−Gly−Gln−
Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−
Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−
Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−であ
り、ここで末端トレオニルはLysB29に結合してい
る）、およびサルのプロインシユリン（R2と共に
R3は−Thr−Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp
−Pro−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu
−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser
−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly
−Ser−Leu−Gln−Lys−であり、ここで末端ト
レオニルはLysB29に結合している）。 式によつてカバーされる全てのこれらの不純
物において、R3−Ｘで表わされる置換基R1は水
素と交換される。 本発明の好ましい態様は、インシユリン様化合
物又はそれらの塩もしくは錯体を含有する粗製の
ブタのインシユリンをＬ−トレオニンエステル
（式）又はそれらの塩と、上記条件下で反応さ
せることを含んでなり、しかる後保護基R4およ
びいずれかの保護基R5が除去される。このプロ
セスにより、豚のインシユリンと共にその中のイ
ンシユリン様化合物はヒトのインシユリンに変換
される。 インシユリン化合物（式）の錯体又は塩の例
として、亜鉛錯体又は亜鉛塩があげられる。 上記説明による反応条件を選択しそして以下の
実施例中で得られる結果を考慮すると、ヒトのイ
ンシユリンのトレオニンB30エステルを60％以上、
更には80％以上さえも、又或る好ましい条件下で
は90％以上の収率で得ることが可能である。 従つて、本発明に係るプロセスは、従来技術よ
り優れた以下の点を有する： (a) 例えばカルボキシペプチダーゼにてAlaB30を
除去するための酵素加水分解が省略される。 (b) 豚のデス−（AlaB30）−インシユリンの如き中
間化合物の単離が不要である。 (c) デス（AsnA21）−インシユリン誘導体による
汚染が避けられる。 (d) 豚のインシユリン並びに粗製インシユリン中
に存する他のインシユリン様不純物が、本発明
に係るプロセスにより、ヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステルを経由して、ヒトのイ
ンシユリンに変換され、これによつて収率が増
大する。 (e) 抗原性のインシユリン様化合物（英国特許第
1285023号参照）は、ヒトのインシユリンに変
えられる。 ヒトのインシユリンを製造するための好ましい
手順は、次の如くである： (1) ペプチド転位用に使用される出発原料は、く
えん酸塩緩衝剤を用いて得られる結晶性インシ
ユリンの如き粗製のブタのインシユリンが用い
られる（米国特許第2626228号明細書参照）。 (2) もしもペプチド転位後、トリプシン活性が残
つているならば、トリプシンが不活性である条
件下、例えばPH３未満の酸性媒体中で、トリプ
シンを除くことが好ましい。トリプシンは、分
子量による分離、例えば1M酢酸中の
「Sephadex Ｇ−50」又は「Bio−ge1P−30」
によるゲル過にて除去できる（Nature280
巻、412頁参照）。 (3) 未反応の豚のインシユリンの如き他の不純物
は、アニオンおよび／又はカチオン交換クロマ
トグフイーを用いて除去できる（実施例１およ
び実施例２）。 (4) しかる後、ヒトのインシユリンのトレオニン
Ｂ３０エステルはブロツク解除されそしてヒトの
インシユリンが、例えばそれ自体公知の方法で
結晶化して単離される。 このプロセスにより、医薬として許容され得る
純度のヒトのインシユリンを得ることができ、必
要なら更に精製される。 更に、本発明はヒトのインシユリンの新規なト
レオニンB30エステルに関し、ここにおいてエス
テル部分は第三−ブチルおよびメチルとは異な
る。 使用される略語は、生化学命名に関する
IUPAC−ICB委員会によつて認承された規則
（1974年）に従つている（生化学命名に関する
1UPAC−IUB委員会の暫定的規則および勧告集
第２版、Maryland1975年参照）。 分析試験： 豚のインシユリンおよび豚のプロインシユリン
をヒトのインシユリンエステルに変換すること
は、0.375Mトリス、0.06M HCl、および8M尿素
からなる緩衝剤中の7.5％ポリアミドゲル中で
DISC PAGE電気泳動によつて証明される。緩衝
剤のPHは8.7である。式で表わされるエステル
は、豚のインシユリンのそれの75％の速度で移動
する。豚のインシユリンの速度の55％で移動する
豚のプロインシユリンは、本発明方法によつて同
一生成物に変換される。式で表わされる化合物
との変換生成物の同定は、次の規準による。 (a) 豚のインシユリンに関して式で表わされる
ヒトのインシユリンエステルの電気泳動は、１
個の負の電荷の損失に対応する。 (b) 式の化合物に対応する染色した蛋白帯のア
ミノ酸組成は、ヒトのインシユリンのアミノ酸
組成と同一であり、すなわち、１モルのインシ
ユリンに対して３モルのトレオニンおよび１モ
ルのアラニンである。一方、豚のインシユリン
の組成は、１モルのインシユリンに対して２モ
ルのトレオニンおよび２モルのアラニンであ
る。ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質結
合のアミノ酸組成を分析する技術は、Eur.J.
Biochem.25巻、147頁に説明されている。 (c) 結合したトレオニンがＢ鎖中のＣ−末端アミ
ノ酸として置換される事実は、6Mのグアニジ
ン塩酸塩中インシユリンのＳ−Ｓ結の酸化イオ
ウ分解により、続いて「SPスエフアデツク
（Sephadex）」を用いたイオン交換樹脂による
Ａ鎖およびＢ鎖の分解により証明される。カル
ボキシペプチターゼＡによりＢ鎖のＳ−スルホ
ナートを分解すると、Ｃ−末端アミノ酸のみが
遊離する該技術は、プロインシユリン、インシ
ユリンおよびＣ−ペプチドに関するシンポジユ
ウム（徳島、1978年７月12日〜14日）の会報に
おいてMarkussenによつて説明されている
（編集者：Baba.KanekoおよびYaniahara.Int.
Congress SeriesNo.468、Excerpta Medica、
Amsterdam−Oxford）分析は、エステル基が
式で表わされる化合物から分離した後、行な
われる。 これらの三種の分析からヒトのインシユリンへ
の転換が起こつていることが明らかに判明する。 豚のインシユリンおよび豚のプロインシユリン
をヒトのインシユリンエステルへの転換は、逆相
によるHPLC（高圧液体クロマトグラフイー）を
用いて定量的に追跡されうる。A4×300mm「μ
Bondapak C18 column（Waters Ass.）」が用い
られそして溶離は、0.2Mの硫酸アンモニウム
（硫酸でPH3.5に調整されている）を含有しかつ26
〜50％アセトニトリルを含有する緩衝液を用いて
行つた。最適のアセトニトリル濃度は、豚のイン
シユリンから分離が望まれる式のエステルがど
のようなものかに依存する。R4がメチルで、か
つR5が水素である場合、分離は26％（Ｖ／Ｖ）
のアセトニトリルで行なわれる。豚のインシユリ
ンおよび（Thr−OMe）B30−ｈ−In（Meはメチル
である）は、それぞれ4.5および5.9カラム体積の
後、加えて対称ピークに分離した後溶離する。
HPLCカラムに適用する前に、アセトン10容を添
加して反応混合物中のタンパク質を沈殿せしめ
る。沈殿物を、遠心分離して単離し、真空下で乾
燥しそして0.02Mの硫酸に溶解する。 ヒトのインシユリンエステルおよびヒトのイン
シユリンを製造する方法は、以下の実施例によつ
て更に説明されるが、これらに限定されないこと
は勿論である。実施例は、本発明に係る方法の好
ましい態様を示す。 実施例 １ 一度結晶化した豚の粗製インシユリン200mgを、
3.33M酢酸1.8mlに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミドに溶解した2M Thr−OMe（Meは
メチルである）溶液の２mlおよび水0.2mlに溶解
したトリプシン20mgを添加した。37℃で18時間保
存後、アセトン40mlを添加してタンパク質を沈殿
させ、該沈殿物を遠心分離によつて単離した。上
澄みは捨てた。26％アセトニトリルを用いた
HPLCによる沈殿物の分析の結果、豚のインシユ
リンの60％が、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inに転換
していることが判つた。沈殿物を、新たに脱イオ
ンした8Mの尿素８mlに溶解した。PH値を、1Mの
アンモニアにて8.0に調整し、次いで該溶液を、
「QAE Ａ−25 Sephadex」を充填した2.5×25cm
のカラムに適用した。該カラムは、60％（Ｖ／
Ｖ）エタノールを含有し、そのPH値がアンモニア
で8.0に調整されている0.1M塩化アンモニウム緩
衝液で平衡化されている。溶離は、同じ緩衝液を
用いて行なわれ、15mlの分画を集めた。（Thr−
OMe）B30−ｈ−Inは分画番号26〜46において見出
され、そして未反応の豚のインシユリンは、分画
番号90〜120において見出された。分画番号26〜
46を、プールし、エタノールを真空で蒸発させ、
次いで（Thr−OMe）B30−ｈ−InをSchlichtkrull
等によつて説明されたくえん酸塩緩衝液
（Handbuch der inneren Medizin、７／2A、
96、Berlin、Heiderberg、New York、1975年）
で結晶化させた。収率は、同様の方法で結晶化し
た豚のインシユリンと同じ斜方形形状を有する結
晶95mgであつた。アミノ酸組成は、ヒトのインシ
ユリンのそれと同一であることが判明した。更
に、先に「分析試験」のところで説明した分析試
験により、得られた生成物は（Thr−OMe）B30−
ｈ−Inであることが証明された。 実施例 ２ 英国特許第1285023号で説明されている純度を
満さす豚のインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し、しかる後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミドに溶解したトレオニンメチルエステルの
0.2M溶液１ml並びに0.1mlの水に溶解した12mgの
TPCK（トシルフエニルアラニンクロロメチルケ
トン）処理トリプシンを添加した。37℃で24時間
インキユベーシヨンした後、1Mの隣酸４mlを添
加して反応を停止させた。「SP−Sephadex」の
2.5×25cmカラムによるイオンクロマトグラフイ
ー法にて、60％エタノールに溶解した0.09M塩化
ナトリウムおよび0.02Mの燐酸二水素ナトリウム
からなる溶離液（緩衝液のPH値：5.5）を用いて、
生成（Thr−OMe）B30−ｈ−Inを未反応の豚のイ
ンシユリンから分離した。（Thr−OMe）B30−ｈ
−Inを含有する分画を集め、エタノールを真空中
で除去し、生成物を、実施例１で説明した如く、
結晶化した。収率は、（Thr−OMe）B30−ｈ−
In50mgであつた。 実施例 ３ 豚のプロインシユリン100mgを、3.33Mの酢酸
0.9mlに溶解し、次いで（Thr−OMe）B30−ｈ−In
に転換し、実施例１中の豚のインシユリンに対し
て説明した如く精製した。プロインシユリンの
（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転換は、アセトン
沈殿物のHPLC分析の結果73％であることが分か
つた。結晶性の（Thr−OMe）B30−ｈ−Inは54mg
であつた。 実施例 ４ 豚のインシユリン100mgを、水中2.77M酢酸の
0.9mlに溶解し、次いで実施例２で説明した方法
と類似の方法で反応させた。反応完結後、タンパ
ク質を、アセトン10容の添加にて沈殿せしめた。
DISC PAGEによる分析にて、70％が（Thr−
OMe）B30−ｈ−Inに転換していることが分かつ
た。 実施例 ５ 100mgの豚のインシユリンを、3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し、そしてＮ−メチルピロリドンに溶解
した2MのThr−OMe1mlを添加した。実施例４
で説明したと類似の方法で、反応を行つた。
（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転換は20％であつ
た。 実施例 ６ 100mgの豚のインシユリンを、水に溶解した
2.77Mの酢酸0.9mlに溶解し、そしてHMPA（ヘキ
サメチルホスホノトリアミド）に溶解した2Mの
Thr−OMe1mlを添加した。実施例４で説明した
と類似の方法で、反応を行つた。（Thr−OMe）B3
０−ｈ−Inへの転換は80％であつた。 実施例 ７ 100mgの豚のインシユリンを、3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し、そしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドに溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。
実施例４で説明したと類似の方法で、反応を行つ
た。（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転換は80％で
あつた。 実施例 ８ 100mgの豚のインシユリンを、3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し、そしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドに溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。
しかる後、ガラス球１ｇ上に固定化された200U
トリプシン（活性は支持体BAEEに対して測定）
を添加し、次いで37℃で24時間インキユーベーシ
ヨンした後ガラスに結合したトリプシンを過し
た。反応終了後、タンパク質を、アセトン10容を
添加して沈殿させた。DISC PAGEによる分析
で、40％が（Thr−OMe）B30に転換していること
が分かつた。 実施例 ９ 豚のインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9mlに
溶解し、次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中
に溶解した2MのThr−OMe1mlを加えた。しか
る後、200μｇのCNBr活性化「SephadexG−
150」上に固定化した300Uトリプシン（活性は支
持体BAEEについて測定）を添加した。37℃で24
時間インキユーベーシヨンした後、「Sephadex」
に結合したトリプシンを過した。反応終了後、
アセトン10容を添加してタンパク質を添加せしめ
た。DISC PAGEによる分析の結果、70％が
（Thr−OMe）B30−ｈ−Inに転換していることが
分かつた。 実施例 10 エステルとしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut（Butは第三−ブチル
である）を用いて、実施例７に述べた方法をくり
かえした。（Thr−OBut）B30への転化率は80％で
あつた。 実施例 11 エステルとしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut（Butは第三−ブチル
である）を用いて、実施例８に述べた方法をくり
かえした。（Thr−OBut）B30への転化率は30％で
あつた。 実施例 12 エステルとしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut（Butは第三−ブチル
である）を用いて、実施例９に述べた方法をくり
かえした。（Thr−OBut）B30への転化率は70％で
あつた。 実施例 13 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。実
施例４で説明したと類似の方法で、反応を行つ
た。（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は80％
であつた。 実施例 14 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。実
施例８で説明した方法と同様に、固定化したトリ
プシンで混合物を処理した。（Thr−OMe）B30−
ｈ−Inへの転化率は40％であつた。 実施例 15 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。実
施例９で説明した方法と同様に、混合物を固定化
したトリプシンで処理した。（Thr−OMe）B30−
ｈ−Inへの転化率は70％であつた。 実施例 16 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut１mlを添加した。実
施例４で説明したと類似の方法で、反応を行つ
た。（Thr−But）B30−ｈ−Inへの転化率は80％で
あつた。 実施例 17 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut１mlを添加した。実
施例８で説明した方法と同様に、混合物をガラス
ビードに固定化したトリプシンで処理した。
（Thr−OBut）B30−ｈ−Inへの転化率は40％であ
つた。 実施例 18 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut１mlを添加した。実
施例９で説明したと同様に、混合物を、CNBr活
性化「Sephadex Ｇ−150」に固定化されたトリ
プシンで処理した。（Thr−OBut）B30−ｈ−Inへ
の転化率は70％であつた。 実施例 19 豚のインシユリン100mgを6Mの酢酸0.5mlに溶
解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解
した1MのThr−OTmb（Tmbは２，４，６−ト
リメチルベンジルである）１mlを添加した。更
に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド0.5ml並びに
水0.1mlに溶解したTPCK処理トリプシン５mgを
添加した。混合物を、32℃で44時間保存した。反
応終了後、アセトン10容を添加してタンパク質を
沈殿させた。DISC PAGEによる分析の結果、50
％が（Thr−OTmb）B30−ｈ−Inに転換している
ことが分かつた。 実施例 20 豚のインシユリン100mgを3Mの酢酸0.9mlに溶
解し次いでジオキサンに溶解した2MのThr−
OMe1mlを添加した。実施例４で説明したと類似
の方法で、反応を行つた。（Thr−OMe）B30−ｈ
−Inへの転化率は10％であつた。 実施例 21 豚のインシユリン100mgを3Mの酢酸0.9mlに溶
解し次いでアセトニトリルに溶解した2MのThr
−OMe1mlを添加した。実施例４で説明したと類
似の方法で、反応を行つた。（Thr−OMe）B30−
ｈ−Inへの転化率は10％であつた。 実施例 22 （Thr−OMe）B30−ｈ−Inの結晶250mgを水25
mlに分散し次いで1Nの水酸化ナトリウム溶液を
加え溶解せしめ、PH値を10.0とした。PH値を、25
℃で24時間10.0に一定に保持した。塩化ナトリウ
ム２ｇ、酢酸ナトリウム三水和物350mgおよび酢
酸亜鉛2.5mg、二水和物2.5mgを加え、次いでPH値
5.52を得るため1Nの塩酸を加えることによつて、
生成したヒトのインシユリンを結晶化せしめた。
４℃で24時間保存後、斜方形結晶を、遠心分離し
て単離し、水３mlで洗浄し、遠心分離して単離
し、次いで真空で乾燥した。収率：ヒトのインシ
ユリン220mg。 実施例 23 （Thr−OTmb）B30−ｈ−In100mgを、氷冷三フ
ツ素酢酸１mlに溶解し、次いで得られた溶液を０
℃で２時間保存した。生成したヒトのインシユリ
ンを、テトラヒドロフラン10ml並びにテトラヒド
ロフランに溶解した1.03Mの塩酸0.97mlを添加す
ることにより沈殿せしめた。生成沈殿物を、遠心
分離して単離し、テトラヒドロフラン10mlで洗浄
し、遠心分離して単離し次いで真空下で乾燥し
た。沈殿物を、水10mlに溶解し、溶液のPH値を、
1Nの水酸化ナトリウム溶液で2.5に調整した。塩
化ナトリウム1.5ｇを添加してヒトのインシユリ
ンを沈殿せしめ、次いで遠心分離して単離した。
沈殿物を水10mlに溶解し、次いで塩化ナトリウム
0.8mg、酢酸亜鉛二水和物3.7mgおよび酢酸ナトリ
ウム三水和物0.14ｇを添加し続いてPH値5.52を得
るため1Nの水酸化ナトリウムを添加することに
より、前記ヒトのインシユリンを沈殿せしめた。
４℃で24時間保存後、沈殿物を遠心分離して単離
し、水0.9mlで洗浄し、遠心分離して単離し次い
で真空にて乾燥する。収率：ヒトのインシユリン
90mg。 実施例 24 豚のインシユリン100mgを10Mの酢酸0.5mlに溶
解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解
した1.54MのThr−OMe1.3mlを加えた。混合物
を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸カルシウム
0.2mlに溶解したトリプシン10mgを添加した。12
℃で48時間後、アセトン20mlを添加してタンパク
質を沈殿させた。豚のインシユリンの（Thr−
OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLCにより97
％であつた。 実施例 25 豚のインシユリン20mgを、10Mの酢酸0.08mlお
よび水0.14mlの混合物に溶解し次いでＮ，Ｎ−ジ
メチルアセトアミドに溶解した2MのThr−
OMe0.2mlを加えた。混合物を、−10℃に冷却し
た。0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解した
トリプシン２mgを添加した。−10℃で72時間後、
アセトン５mlを添加してタンパク質を沈殿させ
た。豚のインシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−
Inへの転化率は、HPLCにより64％であつた。 実施例 26 豚のインシユリン20mgを水0.1mlに分散し次い
でＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した2M
のThr−OMe0.6mlを加え、インシユリンを溶解
せしめた。混合物を、７℃に冷却した。0.05Mの
酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン２
mgを添加した。７℃で24時間後、アセトン５mlを
添加してタンパク質を沈殿させた。豚のインシユ
リンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、
HPLCにより62％であつた。 実施例 27 豚のインシユリン20mgを4.45Mのプロピオン酸
0.135mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセト
アミドに溶解した1.67MのThr−OMe0.24mlを加
えた。混合物を、37℃で24時間保持した。0.05M
の酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン
２mgを添加した。37℃で24時間後、２−プロパノ
ール10容を添加してタンパク質を沈殿させた。豚
のインシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの
転化率は、HPLCにより75％であつた。 実施例 28 豚のインシユリン20mgを水0.1mlに分散させた。
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した2Mの
Thr−OMe0.4mlを加え、次いで10N塩酸を0.04ml
を加え溶液となした。0.05Mの酢酸カルシウム
0.025mlに溶解したトリプシン２mgを添加した。
混合物を37℃で４時間保持した。豚のインシユリ
ンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、
HPLCにより46％であつた。 実施例 29 豚のインシユリン20mgを0.57Mの酢酸0.175ml
に溶解した。次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドに溶解した2MのThr−OMe0.2mlを加え、次い
で0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlを添加した。
アクロモバクターリテイカス
（Achromobacterlyticus）プロテアーゼの組調製
品10mgを添加した。混合物を37℃で22時間保持し
た。アセトン10容を添加してタンパク質を沈殿さ
せた。豚のインシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ
−Inへの転化率は、HPLCにより12％であつた。 実施例 30 豚のインシユリン20mgを0.5Mの酢酸0.1mlに分
散させた。次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した0.1MのThr−OMe0.2mlを加えインシ
ユリンを溶解した。混合物を、12℃に冷却した。
0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリ
プシン２mgを添加した。12℃で24時間後、豚のイ
ンシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化
率は、HPLCにより42％であつた。 実施例 31 家兎のインシユリン２mgを4.45Mの酢酸0.135
mlに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに
溶解した1.67MのThr−OMe0.24mlを加え次いで
0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリ
プシン1.25mgを添加した。混合物を37℃で４時間
保持した。家兎のインシユリンの（Thr−OMe）
B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLCにより88％であ
つた。家兎のインシユリンは豚のインシユリンの
前にHPLCカラムから溶出するが、家兎のインシ
ユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inに対する溶出
量の割合は0.72である。 実施例 32 豚のジアルギニンインシユリン（ArgB31−
ArgB32−インシユリン）２mgを、4.45M酢酸0.135
mlに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに
溶解した1.67MのThr−OMe0.24mlを加え次いで
0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリ
プシン1.25mgを添加した。混合物を37℃で４時間
保持した。豚のインシユリンの（Thr−OMe）B30
−ｈ−Inへの転化率は、HPLCにより91％であつ
た。ジアルギニンインシユリンは豚のインシユリ
ンの前にHPLCカラムから溶出するが、ジアルギ
ニンインシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inに
対する溶出量の割合は0.50である。 実施例 33 豚の中間物（すなわちデスジペプチド（Lys62
−Arg63）プロインシユリンおよびデスジペプチ
ド（Arg31−Arg32）プロインシユリン）を実施
例32に述べた反応と同様に反応させた。HPLCの
分析の結果、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化
は88％であることが分かつた。 実施例 34 豚のインシユリン20mgを2Mの酢酸0.1mlに溶解
し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解し
た2MのThr−OMe0.2mlを加えた。混合物を、−
18℃に冷却した。0.05Mの酢酸カルシウム0.025
mlに溶解したトリプシン２mgを添加した。混合物
を、−18℃で120時間保持した。（Thr−OMe）B30
−ｈ−Inへの転化率は、HPLCによる分析の結
果、83％であつた。 実施例 35 反応を50℃で４時間行なう条件で、実施例34で
述べた方法をくりかえした。HPLCによる分析の
結果、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は23
％であつた。 実施例 36 豚のインシユリン20mgを3Mの酢酸0.1mlに溶解
した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した
0.33MのThr−Ｏ（CH2）2−SO2−CH3・
CH3COOH（トレオニン２−（メチルスルホニル）
エチルエステルハイドロアセテート）0.3mlを加
えた。混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸
カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン２mgを
添加した。12℃で24時間後、（Thr−Ｏ（CH2）2−
SO2−CH3）B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLCに
より77％であつた。生成物は、（Thr−OMe）B30
の位置でほぼ溶出する。 実施例 37 豚のインシユリン20mgを10Mの酢酸0.1mlに溶
解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解し
た2MのThr−OEt（Etはエチルである）0.2mlを加
えた。混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸
カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン２mgを
添加した。12℃で24時間後（Thr−OEt）B30−ｈ
−Inへの転化率は、HPLCにより75％であつた。
生成物は、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inのそれより
わずかに後の位置で溶出した。 実施例 38 豚のインシユリン20mgを6Mの酢酸0.1mlに溶解
した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した
0.67MのThr（But）OBut（Butは第三級ブチルで
ある）0.3mlを加えた。混合物を、12℃に冷却し
た。0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解した
トリプシン２mgを添加した。12℃で24時間後
（Thr（But）−OBut）B30−ｈ−Inへの転化率は、
HPLCにより77％であつた。生成物は、アセトニ
トリルを27％から40％に連続的に変化させる傾斜
溶離法を適用してHPLCカラムから溶出した。 実施例 39 豚のインシユリン20mgを4Mの酢酸0.1mlに溶解
した。テトラヒドロフランに溶解した1.5Mの
Thr−OMe0.2mlを加え混合物を、12℃に冷却し
た。0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解した
トリプシン２mgを添加した。12℃で４時間後
（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLC
により75％であつた。 実施例 40 豚のインシユリン20mgを4Mの酢酸0.1mlに溶解
し次いで１，２−エタンジオールに溶解した2M
のThr−OMe0.8mlを加えた。混合物を、12℃に
冷却した。0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶
解したトリプシン２mgを添加した。12℃で４時間
後、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、
HPLCにより48％であつた。 実施例 41 豚のインシユリン20mgを4Mの酢酸0.1mlに溶解
した。エタノールに溶解した2MのThr−OMe0.2
mlを加えた。混合物を、12℃に冷却した。0.05M
の酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン
２mgを添加し反応を12℃で４時間行つた。（Thr
−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLCによる
分析の結果46％であつた。 実施例 42 豚のインシユリン20mgを4M酢酸0.1mlに溶解し
た。アセトンに溶解した2MのThr−OMe0.2mlを
加え混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸カ
ルシウム0.025mlに溶解したトリプシン２mgを添
加した。12℃で４時間後、（Thr−OMe）B30−ｈ
−Inへの転化率は、HPLCによる分析の結果48％
であつた。
R1で示される置換基に結合しておりさらにLysB29
はR2で示される置換基に結合している）を表わ
し、R2はアミノ酸、又は36個以下のアミノ酸を
含有するペプチド鎖を表わし、更にR1は水素も
しくは一般式R3−Ｘ−（式中、Ｘはアルギニン又
はリシンを表し、R3は35個以下のアミノ酸を含
有するペプチド鎖を表わす）で表わされる基であ
るか、又はR1およびR2中の双方に存在するアミ
ノ酸の数が37未満であることを条件として、R3
はR2と共に一緒になつて35個以下のアミノ酸を
含有するペプチド鎖を表わす｝ を基礎にして更に詳しく説明される。 従つて、本発明のペプチド転位は、上記インシ
ユリン化合物のいずれをもヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステル（式）に変換され、該
エステルは次いでヒトのインシユリンを形成する
ためブロツク解除され得る。 本発明の別の利点は、粗インシユリン内および
ある種の商業的インシユリン製剤内に存し、かつ
式によつてカバーされるインシユリン様化合物
は、本発明のペプチド転位によつてヒトのインシ
ユリンのトレオニンB30エステルに変換され、こ
れは次いでヒトのインシユリンを形成するためブ
ロツク解除され得る。式で表わされるインシユ
リン様化合物の例は次に示される： 豚のジアルギニンインシユリン（R1は水素で
あり、R2は−Ala−Arg−Argである）、豚のプロ
インシユリン（R2と共にR3は、−Ala−Arg−
Arg−Glu−Ala−Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−
Gly−Ala−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−
Leu−Gly−Gly−Leu−Gln−Ala−Leu−Ala−
Leu−Glu−Gly−Pro−Pro−Gln−Lys−であ
り、ここで末端アラニルはLysB29に結合してい
る）、犬のプロインシユリン（R2と共にR3は、−
Ala−Arg−Arg−Asp−Val−Glu−Leu−Ala−
Gly−Ala−Pro−Gly−Glu−Gly−Gly−Leu−
Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ala−
Leu−Gln−Lys−であり、末端アラニルはLysB29
に結合している）、豚の分裂プロインシユリン
（R3はAla−Leu−Glu−Gly−Pro−Pro−Gln−
Lys−であり、さらにR2は−Ala−Arg−Arg−
Glu−Ala−Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−Gly−
Ala−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Leu−
Gly−Gly−Leu−Gln−Ala−Leuである）、豚の
デスジペプチドプロインシユリン（R1は水素で
あり、さらにR2は−Ala−Arg−Arg−Glu−Ala
−Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−Gly−Ala−Val
−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Leu−Gly−Gly
−Leu−Gln−Ala−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly
−Pro−Pro−Glnである）、ヒトのプロインシユ
リン（R2と共にR3は−Thr−Arg−Arg−Glu−
Ala−Glu−Asp−Leu−Gln−Val−Gly−Gln−
Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−
Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−
Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−であ
り、ここで末端トレオニルはLysB29に結合してい
る）、およびサルのプロインシユリン（R2と共に
R3は−Thr−Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp
−Pro−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu
−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser
−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly
−Ser−Leu−Gln−Lys−であり、ここで末端ト
レオニルはLysB29に結合している）。 式によつてカバーされる全てのこれらの不純
物において、R3−Ｘで表わされる置換基R1は水
素と交換される。 本発明の好ましい態様は、インシユリン様化合
物又はそれらの塩もしくは錯体を含有する粗製の
ブタのインシユリンをＬ−トレオニンエステル
（式）又はそれらの塩と、上記条件下で反応さ
せることを含んでなり、しかる後保護基R4およ
びいずれかの保護基R5が除去される。このプロ
セスにより、豚のインシユリンと共にその中のイ
ンシユリン様化合物はヒトのインシユリンに変換
される。 インシユリン化合物（式）の錯体又は塩の例
として、亜鉛錯体又は亜鉛塩があげられる。 上記説明による反応条件を選択しそして以下の
実施例中で得られる結果を考慮すると、ヒトのイ
ンシユリンのトレオニンB30エステルを60％以上、
更には80％以上さえも、又或る好ましい条件下で
は90％以上の収率で得ることが可能である。 従つて、本発明に係るプロセスは、従来技術よ
り優れた以下の点を有する： (a) 例えばカルボキシペプチダーゼにてAlaB30を
除去するための酵素加水分解が省略される。 (b) 豚のデス−（AlaB30）−インシユリンの如き中
間化合物の単離が不要である。 (c) デス（AsnA21）−インシユリン誘導体による
汚染が避けられる。 (d) 豚のインシユリン並びに粗製インシユリン中
に存する他のインシユリン様不純物が、本発明
に係るプロセスにより、ヒトのインシユリンの
トレオニンB30エステルを経由して、ヒトのイ
ンシユリンに変換され、これによつて収率が増
大する。 (e) 抗原性のインシユリン様化合物（英国特許第
1285023号参照）は、ヒトのインシユリンに変
えられる。 ヒトのインシユリンを製造するための好ましい
手順は、次の如くである： (1) ペプチド転位用に使用される出発原料は、く
えん酸塩緩衝剤を用いて得られる結晶性インシ
ユリンの如き粗製のブタのインシユリンが用い
られる（米国特許第2626228号明細書参照）。 (2) もしもペプチド転位後、トリプシン活性が残
つているならば、トリプシンが不活性である条
件下、例えばPH３未満の酸性媒体中で、トリプ
シンを除くことが好ましい。トリプシンは、分
子量による分離、例えば1M酢酸中の
「Sephadex Ｇ−50」又は「Bio−ge1P−30」
によるゲル過にて除去できる（Nature280
巻、412頁参照）。 (3) 未反応の豚のインシユリンの如き他の不純物
は、アニオンおよび／又はカチオン交換クロマ
トグフイーを用いて除去できる（実施例１およ
び実施例２）。 (4) しかる後、ヒトのインシユリンのトレオニン
Ｂ３０エステルはブロツク解除されそしてヒトの
インシユリンが、例えばそれ自体公知の方法で
結晶化して単離される。 このプロセスにより、医薬として許容され得る
純度のヒトのインシユリンを得ることができ、必
要なら更に精製される。 更に、本発明はヒトのインシユリンの新規なト
レオニンB30エステルに関し、ここにおいてエス
テル部分は第三−ブチルおよびメチルとは異な
る。 使用される略語は、生化学命名に関する
IUPAC−ICB委員会によつて認承された規則
（1974年）に従つている（生化学命名に関する
1UPAC−IUB委員会の暫定的規則および勧告集
第２版、Maryland1975年参照）。 分析試験： 豚のインシユリンおよび豚のプロインシユリン
をヒトのインシユリンエステルに変換すること
は、0.375Mトリス、0.06M HCl、および8M尿素
からなる緩衝剤中の7.5％ポリアミドゲル中で
DISC PAGE電気泳動によつて証明される。緩衝
剤のPHは8.7である。式で表わされるエステル
は、豚のインシユリンのそれの75％の速度で移動
する。豚のインシユリンの速度の55％で移動する
豚のプロインシユリンは、本発明方法によつて同
一生成物に変換される。式で表わされる化合物
との変換生成物の同定は、次の規準による。 (a) 豚のインシユリンに関して式で表わされる
ヒトのインシユリンエステルの電気泳動は、１
個の負の電荷の損失に対応する。 (b) 式の化合物に対応する染色した蛋白帯のア
ミノ酸組成は、ヒトのインシユリンのアミノ酸
組成と同一であり、すなわち、１モルのインシ
ユリンに対して３モルのトレオニンおよび１モ
ルのアラニンである。一方、豚のインシユリン
の組成は、１モルのインシユリンに対して２モ
ルのトレオニンおよび２モルのアラニンであ
る。ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質結
合のアミノ酸組成を分析する技術は、Eur.J.
Biochem.25巻、147頁に説明されている。 (c) 結合したトレオニンがＢ鎖中のＣ−末端アミ
ノ酸として置換される事実は、6Mのグアニジ
ン塩酸塩中インシユリンのＳ−Ｓ結の酸化イオ
ウ分解により、続いて「SPスエフアデツク
（Sephadex）」を用いたイオン交換樹脂による
Ａ鎖およびＢ鎖の分解により証明される。カル
ボキシペプチターゼＡによりＢ鎖のＳ−スルホ
ナートを分解すると、Ｃ−末端アミノ酸のみが
遊離する該技術は、プロインシユリン、インシ
ユリンおよびＣ−ペプチドに関するシンポジユ
ウム（徳島、1978年７月12日〜14日）の会報に
おいてMarkussenによつて説明されている
（編集者：Baba.KanekoおよびYaniahara.Int.
Congress SeriesNo.468、Excerpta Medica、
Amsterdam−Oxford）分析は、エステル基が
式で表わされる化合物から分離した後、行な
われる。 これらの三種の分析からヒトのインシユリンへ
の転換が起こつていることが明らかに判明する。 豚のインシユリンおよび豚のプロインシユリン
をヒトのインシユリンエステルへの転換は、逆相
によるHPLC（高圧液体クロマトグラフイー）を
用いて定量的に追跡されうる。A4×300mm「μ
Bondapak C18 column（Waters Ass.）」が用い
られそして溶離は、0.2Mの硫酸アンモニウム
（硫酸でPH3.5に調整されている）を含有しかつ26
〜50％アセトニトリルを含有する緩衝液を用いて
行つた。最適のアセトニトリル濃度は、豚のイン
シユリンから分離が望まれる式のエステルがど
のようなものかに依存する。R4がメチルで、か
つR5が水素である場合、分離は26％（Ｖ／Ｖ）
のアセトニトリルで行なわれる。豚のインシユリ
ンおよび（Thr−OMe）B30−ｈ−In（Meはメチル
である）は、それぞれ4.5および5.9カラム体積の
後、加えて対称ピークに分離した後溶離する。
HPLCカラムに適用する前に、アセトン10容を添
加して反応混合物中のタンパク質を沈殿せしめ
る。沈殿物を、遠心分離して単離し、真空下で乾
燥しそして0.02Mの硫酸に溶解する。 ヒトのインシユリンエステルおよびヒトのイン
シユリンを製造する方法は、以下の実施例によつ
て更に説明されるが、これらに限定されないこと
は勿論である。実施例は、本発明に係る方法の好
ましい態様を示す。 実施例 １ 一度結晶化した豚の粗製インシユリン200mgを、
3.33M酢酸1.8mlに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミドに溶解した2M Thr−OMe（Meは
メチルである）溶液の２mlおよび水0.2mlに溶解
したトリプシン20mgを添加した。37℃で18時間保
存後、アセトン40mlを添加してタンパク質を沈殿
させ、該沈殿物を遠心分離によつて単離した。上
澄みは捨てた。26％アセトニトリルを用いた
HPLCによる沈殿物の分析の結果、豚のインシユ
リンの60％が、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inに転換
していることが判つた。沈殿物を、新たに脱イオ
ンした8Mの尿素８mlに溶解した。PH値を、1Mの
アンモニアにて8.0に調整し、次いで該溶液を、
「QAE Ａ−25 Sephadex」を充填した2.5×25cm
のカラムに適用した。該カラムは、60％（Ｖ／
Ｖ）エタノールを含有し、そのPH値がアンモニア
で8.0に調整されている0.1M塩化アンモニウム緩
衝液で平衡化されている。溶離は、同じ緩衝液を
用いて行なわれ、15mlの分画を集めた。（Thr−
OMe）B30−ｈ−Inは分画番号26〜46において見出
され、そして未反応の豚のインシユリンは、分画
番号90〜120において見出された。分画番号26〜
46を、プールし、エタノールを真空で蒸発させ、
次いで（Thr−OMe）B30−ｈ−InをSchlichtkrull
等によつて説明されたくえん酸塩緩衝液
（Handbuch der inneren Medizin、７／2A、
96、Berlin、Heiderberg、New York、1975年）
で結晶化させた。収率は、同様の方法で結晶化し
た豚のインシユリンと同じ斜方形形状を有する結
晶95mgであつた。アミノ酸組成は、ヒトのインシ
ユリンのそれと同一であることが判明した。更
に、先に「分析試験」のところで説明した分析試
験により、得られた生成物は（Thr−OMe）B30−
ｈ−Inであることが証明された。 実施例 ２ 英国特許第1285023号で説明されている純度を
満さす豚のインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し、しかる後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミドに溶解したトレオニンメチルエステルの
0.2M溶液１ml並びに0.1mlの水に溶解した12mgの
TPCK（トシルフエニルアラニンクロロメチルケ
トン）処理トリプシンを添加した。37℃で24時間
インキユベーシヨンした後、1Mの隣酸４mlを添
加して反応を停止させた。「SP−Sephadex」の
2.5×25cmカラムによるイオンクロマトグラフイ
ー法にて、60％エタノールに溶解した0.09M塩化
ナトリウムおよび0.02Mの燐酸二水素ナトリウム
からなる溶離液（緩衝液のPH値：5.5）を用いて、
生成（Thr−OMe）B30−ｈ−Inを未反応の豚のイ
ンシユリンから分離した。（Thr−OMe）B30−ｈ
−Inを含有する分画を集め、エタノールを真空中
で除去し、生成物を、実施例１で説明した如く、
結晶化した。収率は、（Thr−OMe）B30−ｈ−
In50mgであつた。 実施例 ３ 豚のプロインシユリン100mgを、3.33Mの酢酸
0.9mlに溶解し、次いで（Thr−OMe）B30−ｈ−In
に転換し、実施例１中の豚のインシユリンに対し
て説明した如く精製した。プロインシユリンの
（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転換は、アセトン
沈殿物のHPLC分析の結果73％であることが分か
つた。結晶性の（Thr−OMe）B30−ｈ−Inは54mg
であつた。 実施例 ４ 豚のインシユリン100mgを、水中2.77M酢酸の
0.9mlに溶解し、次いで実施例２で説明した方法
と類似の方法で反応させた。反応完結後、タンパ
ク質を、アセトン10容の添加にて沈殿せしめた。
DISC PAGEによる分析にて、70％が（Thr−
OMe）B30−ｈ−Inに転換していることが分かつ
た。 実施例 ５ 100mgの豚のインシユリンを、3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し、そしてＮ−メチルピロリドンに溶解
した2MのThr−OMe1mlを添加した。実施例４
で説明したと類似の方法で、反応を行つた。
（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転換は20％であつ
た。 実施例 ６ 100mgの豚のインシユリンを、水に溶解した
2.77Mの酢酸0.9mlに溶解し、そしてHMPA（ヘキ
サメチルホスホノトリアミド）に溶解した2Mの
Thr−OMe1mlを添加した。実施例４で説明した
と類似の方法で、反応を行つた。（Thr−OMe）B3
０−ｈ−Inへの転換は80％であつた。 実施例 ７ 100mgの豚のインシユリンを、3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し、そしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドに溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。
実施例４で説明したと類似の方法で、反応を行つ
た。（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転換は80％で
あつた。 実施例 ８ 100mgの豚のインシユリンを、3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し、そしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドに溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。
しかる後、ガラス球１ｇ上に固定化された200U
トリプシン（活性は支持体BAEEに対して測定）
を添加し、次いで37℃で24時間インキユーベーシ
ヨンした後ガラスに結合したトリプシンを過し
た。反応終了後、タンパク質を、アセトン10容を
添加して沈殿させた。DISC PAGEによる分析
で、40％が（Thr−OMe）B30に転換していること
が分かつた。 実施例 ９ 豚のインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9mlに
溶解し、次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中
に溶解した2MのThr−OMe1mlを加えた。しか
る後、200μｇのCNBr活性化「SephadexG−
150」上に固定化した300Uトリプシン（活性は支
持体BAEEについて測定）を添加した。37℃で24
時間インキユーベーシヨンした後、「Sephadex」
に結合したトリプシンを過した。反応終了後、
アセトン10容を添加してタンパク質を添加せしめ
た。DISC PAGEによる分析の結果、70％が
（Thr−OMe）B30−ｈ−Inに転換していることが
分かつた。 実施例 10 エステルとしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut（Butは第三−ブチル
である）を用いて、実施例７に述べた方法をくり
かえした。（Thr−OBut）B30への転化率は80％で
あつた。 実施例 11 エステルとしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut（Butは第三−ブチル
である）を用いて、実施例８に述べた方法をくり
かえした。（Thr−OBut）B30への転化率は30％で
あつた。 実施例 12 エステルとしてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut（Butは第三−ブチル
である）を用いて、実施例９に述べた方法をくり
かえした。（Thr−OBut）B30への転化率は70％で
あつた。 実施例 13 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。実
施例４で説明したと類似の方法で、反応を行つ
た。（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は80％
であつた。 実施例 14 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。実
施例８で説明した方法と同様に、固定化したトリ
プシンで混合物を処理した。（Thr−OMe）B30−
ｈ−Inへの転化率は40％であつた。 実施例 15 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OMe1mlを添加した。実
施例９で説明した方法と同様に、混合物を固定化
したトリプシンで処理した。（Thr−OMe）B30−
ｈ−Inへの転化率は70％であつた。 実施例 16 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut１mlを添加した。実
施例４で説明したと類似の方法で、反応を行つ
た。（Thr−But）B30−ｈ−Inへの転化率は80％で
あつた。 実施例 17 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut１mlを添加した。実
施例８で説明した方法と同様に、混合物をガラス
ビードに固定化したトリプシンで処理した。
（Thr−OBut）B30−ｈ−Inへの転化率は40％であ
つた。 実施例 18 豚のプロインシユリン100mgを3.33Mの酢酸0.9
mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した2MのThr−OBut１mlを添加した。実
施例９で説明したと同様に、混合物を、CNBr活
性化「Sephadex Ｇ−150」に固定化されたトリ
プシンで処理した。（Thr−OBut）B30−ｈ−Inへ
の転化率は70％であつた。 実施例 19 豚のインシユリン100mgを6Mの酢酸0.5mlに溶
解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解
した1MのThr−OTmb（Tmbは２，４，６−ト
リメチルベンジルである）１mlを添加した。更
に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド0.5ml並びに
水0.1mlに溶解したTPCK処理トリプシン５mgを
添加した。混合物を、32℃で44時間保存した。反
応終了後、アセトン10容を添加してタンパク質を
沈殿させた。DISC PAGEによる分析の結果、50
％が（Thr−OTmb）B30−ｈ−Inに転換している
ことが分かつた。 実施例 20 豚のインシユリン100mgを3Mの酢酸0.9mlに溶
解し次いでジオキサンに溶解した2MのThr−
OMe1mlを添加した。実施例４で説明したと類似
の方法で、反応を行つた。（Thr−OMe）B30−ｈ
−Inへの転化率は10％であつた。 実施例 21 豚のインシユリン100mgを3Mの酢酸0.9mlに溶
解し次いでアセトニトリルに溶解した2MのThr
−OMe1mlを添加した。実施例４で説明したと類
似の方法で、反応を行つた。（Thr−OMe）B30−
ｈ−Inへの転化率は10％であつた。 実施例 22 （Thr−OMe）B30−ｈ−Inの結晶250mgを水25
mlに分散し次いで1Nの水酸化ナトリウム溶液を
加え溶解せしめ、PH値を10.0とした。PH値を、25
℃で24時間10.0に一定に保持した。塩化ナトリウ
ム２ｇ、酢酸ナトリウム三水和物350mgおよび酢
酸亜鉛2.5mg、二水和物2.5mgを加え、次いでPH値
5.52を得るため1Nの塩酸を加えることによつて、
生成したヒトのインシユリンを結晶化せしめた。
４℃で24時間保存後、斜方形結晶を、遠心分離し
て単離し、水３mlで洗浄し、遠心分離して単離
し、次いで真空で乾燥した。収率：ヒトのインシ
ユリン220mg。 実施例 23 （Thr−OTmb）B30−ｈ−In100mgを、氷冷三フ
ツ素酢酸１mlに溶解し、次いで得られた溶液を０
℃で２時間保存した。生成したヒトのインシユリ
ンを、テトラヒドロフラン10ml並びにテトラヒド
ロフランに溶解した1.03Mの塩酸0.97mlを添加す
ることにより沈殿せしめた。生成沈殿物を、遠心
分離して単離し、テトラヒドロフラン10mlで洗浄
し、遠心分離して単離し次いで真空下で乾燥し
た。沈殿物を、水10mlに溶解し、溶液のPH値を、
1Nの水酸化ナトリウム溶液で2.5に調整した。塩
化ナトリウム1.5ｇを添加してヒトのインシユリ
ンを沈殿せしめ、次いで遠心分離して単離した。
沈殿物を水10mlに溶解し、次いで塩化ナトリウム
0.8mg、酢酸亜鉛二水和物3.7mgおよび酢酸ナトリ
ウム三水和物0.14ｇを添加し続いてPH値5.52を得
るため1Nの水酸化ナトリウムを添加することに
より、前記ヒトのインシユリンを沈殿せしめた。
４℃で24時間保存後、沈殿物を遠心分離して単離
し、水0.9mlで洗浄し、遠心分離して単離し次い
で真空にて乾燥する。収率：ヒトのインシユリン
90mg。 実施例 24 豚のインシユリン100mgを10Mの酢酸0.5mlに溶
解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解
した1.54MのThr−OMe1.3mlを加えた。混合物
を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸カルシウム
0.2mlに溶解したトリプシン10mgを添加した。12
℃で48時間後、アセトン20mlを添加してタンパク
質を沈殿させた。豚のインシユリンの（Thr−
OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLCにより97
％であつた。 実施例 25 豚のインシユリン20mgを、10Mの酢酸0.08mlお
よび水0.14mlの混合物に溶解し次いでＮ，Ｎ−ジ
メチルアセトアミドに溶解した2MのThr−
OMe0.2mlを加えた。混合物を、−10℃に冷却し
た。0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解した
トリプシン２mgを添加した。−10℃で72時間後、
アセトン５mlを添加してタンパク質を沈殿させ
た。豚のインシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−
Inへの転化率は、HPLCにより64％であつた。 実施例 26 豚のインシユリン20mgを水0.1mlに分散し次い
でＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した2M
のThr−OMe0.6mlを加え、インシユリンを溶解
せしめた。混合物を、７℃に冷却した。0.05Mの
酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン２
mgを添加した。７℃で24時間後、アセトン５mlを
添加してタンパク質を沈殿させた。豚のインシユ
リンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、
HPLCにより62％であつた。 実施例 27 豚のインシユリン20mgを4.45Mのプロピオン酸
0.135mlに溶解し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセト
アミドに溶解した1.67MのThr−OMe0.24mlを加
えた。混合物を、37℃で24時間保持した。0.05M
の酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン
２mgを添加した。37℃で24時間後、２−プロパノ
ール10容を添加してタンパク質を沈殿させた。豚
のインシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの
転化率は、HPLCにより75％であつた。 実施例 28 豚のインシユリン20mgを水0.1mlに分散させた。
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した2Mの
Thr−OMe0.4mlを加え、次いで10N塩酸を0.04ml
を加え溶液となした。0.05Mの酢酸カルシウム
0.025mlに溶解したトリプシン２mgを添加した。
混合物を37℃で４時間保持した。豚のインシユリ
ンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、
HPLCにより46％であつた。 実施例 29 豚のインシユリン20mgを0.57Mの酢酸0.175ml
に溶解した。次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドに溶解した2MのThr−OMe0.2mlを加え、次い
で0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlを添加した。
アクロモバクターリテイカス
（Achromobacterlyticus）プロテアーゼの組調製
品10mgを添加した。混合物を37℃で22時間保持し
た。アセトン10容を添加してタンパク質を沈殿さ
せた。豚のインシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ
−Inへの転化率は、HPLCにより12％であつた。 実施例 30 豚のインシユリン20mgを0.5Mの酢酸0.1mlに分
散させた。次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
に溶解した0.1MのThr−OMe0.2mlを加えインシ
ユリンを溶解した。混合物を、12℃に冷却した。
0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリ
プシン２mgを添加した。12℃で24時間後、豚のイ
ンシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化
率は、HPLCにより42％であつた。 実施例 31 家兎のインシユリン２mgを4.45Mの酢酸0.135
mlに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに
溶解した1.67MのThr−OMe0.24mlを加え次いで
0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリ
プシン1.25mgを添加した。混合物を37℃で４時間
保持した。家兎のインシユリンの（Thr−OMe）
B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLCにより88％であ
つた。家兎のインシユリンは豚のインシユリンの
前にHPLCカラムから溶出するが、家兎のインシ
ユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inに対する溶出
量の割合は0.72である。 実施例 32 豚のジアルギニンインシユリン（ArgB31−
ArgB32−インシユリン）２mgを、4.45M酢酸0.135
mlに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに
溶解した1.67MのThr−OMe0.24mlを加え次いで
0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリ
プシン1.25mgを添加した。混合物を37℃で４時間
保持した。豚のインシユリンの（Thr−OMe）B30
−ｈ−Inへの転化率は、HPLCにより91％であつ
た。ジアルギニンインシユリンは豚のインシユリ
ンの前にHPLCカラムから溶出するが、ジアルギ
ニンインシユリンの（Thr−OMe）B30−ｈ−Inに
対する溶出量の割合は0.50である。 実施例 33 豚の中間物（すなわちデスジペプチド（Lys62
−Arg63）プロインシユリンおよびデスジペプチ
ド（Arg31−Arg32）プロインシユリン）を実施
例32に述べた反応と同様に反応させた。HPLCの
分析の結果、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化
は88％であることが分かつた。 実施例 34 豚のインシユリン20mgを2Mの酢酸0.1mlに溶解
し次いでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解し
た2MのThr−OMe0.2mlを加えた。混合物を、−
18℃に冷却した。0.05Mの酢酸カルシウム0.025
mlに溶解したトリプシン２mgを添加した。混合物
を、−18℃で120時間保持した。（Thr−OMe）B30
−ｈ−Inへの転化率は、HPLCによる分析の結
果、83％であつた。 実施例 35 反応を50℃で４時間行なう条件で、実施例34で
述べた方法をくりかえした。HPLCによる分析の
結果、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は23
％であつた。 実施例 36 豚のインシユリン20mgを3Mの酢酸0.1mlに溶解
した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した
0.33MのThr−Ｏ（CH2）2−SO2−CH3・
CH3COOH（トレオニン２−（メチルスルホニル）
エチルエステルハイドロアセテート）0.3mlを加
えた。混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸
カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン２mgを
添加した。12℃で24時間後、（Thr−Ｏ（CH2）2−
SO2−CH3）B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLCに
より77％であつた。生成物は、（Thr−OMe）B30
の位置でほぼ溶出する。 実施例 37 豚のインシユリン20mgを10Mの酢酸0.1mlに溶
解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解し
た2MのThr−OEt（Etはエチルである）0.2mlを加
えた。混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸
カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン２mgを
添加した。12℃で24時間後（Thr−OEt）B30−ｈ
−Inへの転化率は、HPLCにより75％であつた。
生成物は、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inのそれより
わずかに後の位置で溶出した。 実施例 38 豚のインシユリン20mgを6Mの酢酸0.1mlに溶解
した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解した
0.67MのThr（But）OBut（Butは第三級ブチルで
ある）0.3mlを加えた。混合物を、12℃に冷却し
た。0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解した
トリプシン２mgを添加した。12℃で24時間後
（Thr（But）−OBut）B30−ｈ−Inへの転化率は、
HPLCにより77％であつた。生成物は、アセトニ
トリルを27％から40％に連続的に変化させる傾斜
溶離法を適用してHPLCカラムから溶出した。 実施例 39 豚のインシユリン20mgを4Mの酢酸0.1mlに溶解
した。テトラヒドロフランに溶解した1.5Mの
Thr−OMe0.2mlを加え混合物を、12℃に冷却し
た。0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶解した
トリプシン２mgを添加した。12℃で４時間後
（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLC
により75％であつた。 実施例 40 豚のインシユリン20mgを4Mの酢酸0.1mlに溶解
し次いで１，２−エタンジオールに溶解した2M
のThr−OMe0.8mlを加えた。混合物を、12℃に
冷却した。0.05Mの酢酸カルシウム0.025mlに溶
解したトリプシン２mgを添加した。12℃で４時間
後、（Thr−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、
HPLCにより48％であつた。 実施例 41 豚のインシユリン20mgを4Mの酢酸0.1mlに溶解
した。エタノールに溶解した2MのThr−OMe0.2
mlを加えた。混合物を、12℃に冷却した。0.05M
の酢酸カルシウム0.025mlに溶解したトリプシン
２mgを添加し反応を12℃で４時間行つた。（Thr
−OMe）B30−ｈ−Inへの転化率は、HPLCによる
分析の結果46％であつた。 実施例 42 豚のインシユリン20mgを4M酢酸0.1mlに溶解し
た。アセトンに溶解した2MのThr−OMe0.2mlを
加え混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸カ
ルシウム0.025mlに溶解したトリプシン２mgを添
加した。12℃で４時間後、（Thr−OMe）B30−ｈ
−Inへの転化率は、HPLCによる分析の結果48％
であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトインシユリンまたはヒトインシユリンの
トレオニンB30エステル又はその塩もしくはその
錯体を製造する方法において、ヒトインシユリン
のトレオニンB30エステル、その塩又はその錯体
に変換し得るインシユリン化合物又は該化合物の
塩もしくは該化合物の錯体を、水、水と混合し得
る有機溶媒、およびトリプシンからなる混合物中
のＬ−トレオニンエステル又はその塩でペプチド
転位することを含んでなり、かつ反応混合物中の
水の含量が50％（容量／容量）未満であり、反応
温度が50℃未満であり、更に所望により酸の存在
下で反応させ、その後、所望により得られたヒト
インシユリンのトレオニンB30エステルをブロツ
ク解除することを特徴とする、前記方法。 ２ 前記反応混合物中のＬ−トレオニンエステル
の濃度が0.1モルを超え、反応温度が反応混合物
の凝固点を超え、かつ反応混合物がＬ−トレオニ
ンエステルの１当量当たり酸の０ないし10当量を
含有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 前記インシユリン化合物が、豚、犬、まつこ
う鯨、通常の鯨、および家兎の各インシユリン、
豚のジアルギニンインシユリン、豚の分裂プロイ
ンシユリン、豚のデスデイペプチドプロインシユ
リン、豚、犬、猿およびヒトの各プロインシユリ
ン、並びにそれらの混合物である、特許請求の範
囲第１項又は第２項記載の方法。 ４ 前記インシユリン化合物が豚から得られるも
のである、特許請求の範囲第１項〜第３項のいず
れかに記載の方法。 ５ 比較的粗製のインシユリンが、インシユリン
化合物として用いられる、特許請求の範囲第４項
記載の方法。 ６ 前記反応温度が、37℃未満、好ましくは室温
未満であり、そして０℃を超えている、特許請求
の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の方法。 ７ 前記反応混合物中の水の含量が、10％（容
量／容量）ないし40％（容量／容量）の間にあ
る、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに
記載の方法。 ８ 前記Ｌ−トレオニンエステルとインシユリン
化合物とのモル比が、５対１を超えるものであ
る、特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに
記載の方法。 ９ 前記有機溶媒が、極性溶媒である特許請求の
範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の方法。 １０ 前記溶媒が、メタノール、エタノール、２
−プロパノール、１，２−エタンジオール、アセ
トン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ホルム
アミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ
−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリド
ン、ヘキサメチルホスホトリアミド、又はアセト
ニトリルである、特許請求の範囲第９項に記載の
方法。 １１ 前記酸が、有機酸、好ましくはギ酸、酢
酸、プロピオン酸、および酪酸である、特許請求
の範囲第１項ないし第１０項のいずれかに記載の
方法。 １２ 前記反応混合物中の酸の量が、Ｌ−トレオ
ニンエステルの１当量当たり0.5ないし５の範囲
にある、特許請求の範囲第１項〜第１１項のいず
れかに記載の方法。 １３ 前記反応混合物中のトリプシンとインシユ
リン化合物との重量比が、約１対200超好ましく
は１対50超であり、更に１対１未満である、特許
請求の範囲第１項〜第１２項のいずれかに記載の
方法。 １４ 前記ペプチド転位が、カルシウムイオンの
存在下で行なわれる、特許請求の範囲第１項〜第
１３項のいずれかに記載の方法。 １５ 前記ペプチド転位が、緩衝系中で行なわれ
る、特許請求の範囲第１項〜第１４項のいずれか
に記載の方法。 １６ 前記Ｌ−トレオニンエステルが、アセテー
ト、もしくはプロピオナート、プチレート、又は
ヒドロクロリドの如きヒドロハライドとして添加
される、特許請求の範囲第１項〜第１５項のいず
れかに記載の方法。 １７ 前記反応温度並びに反応混合物中の水の含
量および酸の含量が、ヒトのインシユリンのトレ
オニンB30エステルの収率が60％以上、好ましく
は80％、最も好ましくは90％以上であるように選
ばれる、特許請求の範囲第１項〜第１６項のいず
れかに記載の方法。 １８ 前記インシユリン化合物が、 ｛式中、【式】はヒトのデ ス（ThrB30）インシユリン部分（該部分中GlyA1
はR1で示される置換基に結合しておりさらに
LysB29はR2で示される置換基に結合している）を
表わし、 R2はアミノ酸、又は36個以下のアミノ酸を含
有するペプチド鎖を表わし、更にR1は水素もし
くは一般式R3−Ｘ−（式中、Ｘはアルギニン又は
リシンを表わし、R3は35個以下のアミノ酸を含
有するペプチド鎖を表わす）で表わされる基であ
るか、又はR1およびR2中の双方に存在するアミ
ノ酸の合数が37未満であることを条件として、
R3とR2は共に一緒になつて35個以下のアミノ酸
を含有するペプチド鎖を表わす｝ で表わされる化合物である、特許請求の範囲第１
又は第２項、又は第６項〜第１７項のいずれかに
記載の方法。 １９ 前記R1が水素であり、R2が−Ala、−Ser、
−Ala−Arg−Arg又は−Ala−Arg−Arg−Glu
−Ala−Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−Gly−Ala
−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Leu−Gly
−Gly−Leu−Gln−Ala−Leu−Ala−Leu−Glu
−Gly−Pro−Pro−Gln、であり、R3はAla−
Leu−Glu−Gly−Pro−Pro−Gln−Lys−であ
り、そしてR2は−Ala−Arg−Arg−Glu−Ala−
Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−Gly−Ala−Val−
Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Leu−Gly−Gly−
Leu−Gln−Ala−Leuであるか、又はR3とR2は
共に一緒になつて−Ala−Arg−Arg−Glu−Ala
−Glu−Asn−Pro−Gln−Ala−Gly−Ala−Val
−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Leu−Gly−Gly
−Leu−Gln−Ala−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly
−Pro−Pro−Gln−Lys−（ここで、末端アラニ
ルはLysB29に結合している）、−Ala−Arg−Arg
−Asp−Val−Glu−Leu−Ala−Gly−Ala−Pro
−Gly−Glu−Gly−Gly−Leu−Gln−Pro−Leu
−Ala−Leu−Glu−Gly−Ala−Leu−Gln−Lys
−（ここで、末端アラニルはLysB29に結合してい
る）、−Thr−Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp
−Leu−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu
−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser
−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly
−Ser−Leu−Gln−Lys−（ここで、末端アラニ
ルはLysB29に結合している）又は−Thr−Arg−
Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Pro−Gln−Val−
Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−
Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−
Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−
Lya−（ここで、末端トレオニルはLysB29に結合
している）である、特許請求の範囲第１８項記載
の方法。 ２０ 前記R1が水素であり、R2がアラニンであ
る、特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１ 前記Ｌ−トレオニンエステルが、次の一般
式（）： Thr（R5）−OR4 （） （式中、R4はカルボキシル保護基を表わし、R5
は水素又はヒドロキシル保護基を表わす） を有する、特許請求の範囲第１項〜第２０項のい
ずれかに記載の方法。 ２２ 前記R4が低級アルキル、置換ベンジルも
しくはジフエニルメチル又は一般式−
CH2CH2SO2R6（式中、R6は低級アルキルを表わ
す）で表わされる基である、特許請求の範囲第２
１項記載の方法。 ２３ 前記R4がメチル、エチル、第三−ブチル、
ｐ−メトキシ−ベンジル、２，４，６−トリメチ
ルベンジル、又は式−CH2CH2SO2R6（式中、R6
はメチル、エチル、プロピル又はｎ−ブチルであ
る）で表わされる基である、特許請求の範囲第２
２項記載の方法。 ２４ 前記インシユリン化合物が豚のインシユリ
ン又は豚のプロインシユリンであり、Ｌ−トレオ
ニンエステルがThr−OMe、Thr−OButもしく
はThr−OTmbであり、水と混和し得る有機溶剤
がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＮ，Ｎ−ジメチ
ルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサ
メチルホスホトリアミド、ジオキサンもしくはア
セトニトリルであり、反応温度が約32〜37℃の範
囲内にあり、反応混合物中の水の含量が21％ない
し43％の範囲にあり、トリプシンとインシユリン
化合物との重量比が約１対８〜１対27の範囲内に
あり、Ｌ−トレオニンエステルとインシユリン化
合物とのモル比が約60対１〜180対１の範囲内に
あり、さらにＬ−トレオニンエステル１当量当た
り酢酸が約1.25ないし3.0当量の範囲で添加され
る、特許請求の範囲第１、２、８、９、１１、１
２、１４〜１８又は２１項のいずれかに記載の方
法。 ２５ 前記インシユリン化合物が豚のインシユリ
ンであり、Ｌ−トレオニンエステルがThr−
OMeもしくはThr−OButであり、水と混和し得
る有機溶剤がＮ，Ｎ−ジメチルアミド又はＮ，Ｎ
−ジメチルアセトアミドであり、反応温度が約37
℃であり、反応混合物中の水の含量が41％ないし
43％の範囲にあり、トリプシンとインシユリン化
合物との重量比が約１対８であり、Ｌ−トレオニ
ンエステルとインシユリン化合物とのモル比が約
120対１であり、さらにＬ−トレオニンエステル
１当量当たり酢酸が1.2ないし1.5当量の範囲で添
加される、特許請求の範囲第２４項に記載の方
法。 ２６ 反応混合物中の水含量が、43〜21％（容
量／容量）の範囲内にある、特許請求の範囲第１
項〜第６項のいずれかに記載の方法。 ２７ 前記ブロツク解除が、塩基の存在中、好ま
しくはPH８ないし12の値で、水性媒体中で行なわ
れる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２８ 前記ブロツク解除が、アシドリシスによ
り、好ましくは三フツ素酢酸で行なわれる、特許
請求の範囲第１項記載の方法。
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