JPH0614778A - １−メチルヒダントイナーゼの安定化方法、被分析体を測定するための安定化１−メチルヒダントイナーゼの使用、対応する測定方法、およびこれに適する試薬 - Google Patents
１−メチルヒダントイナーゼの安定化方法、被分析体を測定するための安定化１−メチルヒダントイナーゼの使用、対応する測定方法、およびこれに適する試薬Info
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- G01—MEASURING; TESTING
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、１−メチルヒダントイナーゼ（NM
Hase）を２価金属イオン、ヌクレオシドトリホスフェー
ト、およびこれらの２価金属イオンと結合して錯体を形
成する錯化剤で処理することから成る酵素NMHaseの安定
化方法に関する。さらに、本発明は、１−メチルヒダン
トインが転化される被分析体定量方法における安定化酵
素の使用、並びに対応する試薬に関する。 【効果】 酵素結合NMH の不在下でさえも安定したNMHa
seが得られる。
Hase）を２価金属イオン、ヌクレオシドトリホスフェー
ト、およびこれらの２価金属イオンと結合して錯体を形
成する錯化剤で処理することから成る酵素NMHaseの安定
化方法に関する。さらに、本発明は、１−メチルヒダン
トインが転化される被分析体定量方法における安定化酵
素の使用、並びに対応する試薬に関する。 【効果】 酵素結合NMH の不在下でさえも安定したNMHa
seが得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、１−メチルヒダントイ
ナーゼの安定化方法、被分析体（例えば、クレアチニ
ン）を測定するための安定化１−メチルヒダントイナー
ゼの使用、対応する測定方法、およびこれに適する試薬
に関する。
ナーゼの安定化方法、被分析体（例えば、クレアチニ
ン）を測定するための安定化１−メチルヒダントイナー
ゼの使用、対応する測定方法、およびこれに適する試薬
に関する。
【０００２】
【従来の技術】分析化学、特に臨床化学診断学の分野で
は、天然産物、生物学的代謝産物およびそれらから誘導
される化合物を測定するための酵素学的方法の需要が次
第に強まってきている。その理由としては、酵素により
触媒される物質転化の特異性が非常に高いこと、穏和な
反応条件（通常、水性媒体中15-40 ℃で中性ｐＨ範囲）
で効率よく、迅速に、一定期間反応が起こること、簡単
かつ感度のよい方法で、特に直接または指示薬反応を伴
う光度測定法を使って、それらを定量することができる
ことが挙げられる。
は、天然産物、生物学的代謝産物およびそれらから誘導
される化合物を測定するための酵素学的方法の需要が次
第に強まってきている。その理由としては、酵素により
触媒される物質転化の特異性が非常に高いこと、穏和な
反応条件（通常、水性媒体中15-40 ℃で中性ｐＨ範囲）
で効率よく、迅速に、一定期間反応が起こること、簡単
かつ感度のよい方法で、特に直接または指示薬反応を伴
う光度測定法を使って、それらを定量することができる
ことが挙げられる。
【０００３】また、酵素学的測定方法はとりわけ血清や
尿に含まれる腎臓診断に重要な成分クレアチニンの測定
に有効であり、クレアチニンは以前から知られている酵
素反応でクレアチニンイミノヒドロラーゼ（E.C. 3.5.
4.21)により１−メチルヒダントイン（Ｎ−メチルヒダ
ントイン、NMH ）とアンモニアに転化することができ
る。
尿に含まれる腎臓診断に重要な成分クレアチニンの測定
に有効であり、クレアチニンは以前から知られている酵
素反応でクレアチニンイミノヒドロラーゼ（E.C. 3.5.
4.21)により１−メチルヒダントイン（Ｎ−メチルヒダ
ントイン、NMH ）とアンモニアに転化することができ
る。
【０００４】血清または尿中のクレアチニンを酵素によ
り測定する方法はすでに幾つか知られている（Wahlefel
d, A.W., G. Holz and H.U. Bergmeyer, in H.U. Bergm
eyer: Methoden der enzymatischen Analyse, Third Ed
ition, Volume II, Verlag Chemie, Weinheim 1974, p.
1834-1838; Fossati, P., L. Prencipe and G. Berti,
Clinical Chemistry 29, 1494-1496 (1983); Tanganel
li, E., L. Prencipe,D. Bassi, S. Cambiaghi and E.
Murador, Clinical Chemistry 28, 1461-1464 (198
3)）。しかしながら、それらはすべて反応順序の中間段
階においてクレアチン経由（Wahlefeld et al.; Fossat
i et al.）またはアンモニア経由（Tanganelli et al.
）で進行するという欠点があり、これらの物質はクレ
アチニンと比べて相当多量の可変濃度で分析すべき血清
または尿サンプル中に含まれている。従って、これらの
場合にクレアチニンを測定するためには、２つの別個の
または連続した反応混合物に対して示差測定を実施する
必要があり、第一の反応混合物では最初に遊離クレアチ
ンまたはアンモニアを測定し、第二の反応混合物ではク
レアチニンアミドヒドロラーゼ（E.C. 3.5.2.10 ）また
はクレアチニンイミノヒドロラーゼ（＝クレアチニンデ
イミナーゼ）を加えてクレアチニンから形成された追加
のクレアチンまたはアンモニアを測定する（“サンプル
／サンプルブランク法”または“Ａ1 ／Ａ2 法”）。
り測定する方法はすでに幾つか知られている（Wahlefel
d, A.W., G. Holz and H.U. Bergmeyer, in H.U. Bergm
eyer: Methoden der enzymatischen Analyse, Third Ed
ition, Volume II, Verlag Chemie, Weinheim 1974, p.
1834-1838; Fossati, P., L. Prencipe and G. Berti,
Clinical Chemistry 29, 1494-1496 (1983); Tanganel
li, E., L. Prencipe,D. Bassi, S. Cambiaghi and E.
Murador, Clinical Chemistry 28, 1461-1464 (198
3)）。しかしながら、それらはすべて反応順序の中間段
階においてクレアチン経由（Wahlefeld et al.; Fossat
i et al.）またはアンモニア経由（Tanganelli et al.
）で進行するという欠点があり、これらの物質はクレ
アチニンと比べて相当多量の可変濃度で分析すべき血清
または尿サンプル中に含まれている。従って、これらの
場合にクレアチニンを測定するためには、２つの別個の
または連続した反応混合物に対して示差測定を実施する
必要があり、第一の反応混合物では最初に遊離クレアチ
ンまたはアンモニアを測定し、第二の反応混合物ではク
レアチニンアミドヒドロラーゼ（E.C. 3.5.2.10 ）また
はクレアチニンイミノヒドロラーゼ（＝クレアチニンデ
イミナーゼ）を加えてクレアチニンから形成された追加
のクレアチンまたはアンモニアを測定する（“サンプル
／サンプルブランク法”または“Ａ1 ／Ａ2 法”）。
【０００５】このような方法は手動で行う場合比較的煩
雑であり、またそれらの自動分析システムへの応用は、
特に転化反応の完了に長いインキュベーション時間を必
要とする場合、非常に制限される。原理的には、既知の
酵素学的方法で反応条件を適切に選ぶことにより、いわ
ゆる反応速度論的“一定時間（fixed-time）”法を用い
て、サンプルブランク測定を行わずにクレアチニン測定
を実施することが可能である。しかしながら、これは制
限された温度条件下での極めて厳格な測定時間の固守を
必要とし、このことは自動分析機が十分に精密である場
合にだけ可能であって、逆に手動操作を事実上排除する
ことになる。
雑であり、またそれらの自動分析システムへの応用は、
特に転化反応の完了に長いインキュベーション時間を必
要とする場合、非常に制限される。原理的には、既知の
酵素学的方法で反応条件を適切に選ぶことにより、いわ
ゆる反応速度論的“一定時間（fixed-time）”法を用い
て、サンプルブランク測定を行わずにクレアチニン測定
を実施することが可能である。しかしながら、これは制
限された温度条件下での極めて厳格な測定時間の固守を
必要とし、このことは自動分析機が十分に精密である場
合にだけ可能であって、逆に手動操作を事実上排除する
ことになる。
【０００６】酵素を用いたクレアチニンまたは１−メチ
ルヒダントインの新しい測定方法は欧州特許出願 EP-A
0 154 269 に記載されている。１−メチルヒダントイン
は酵素１−メチルヒダントイナーゼ（NMHase）によりＮ
−カルバモイルサルコシンに加水分解される。この酵素
はその活性のためにヌクレオシドトリホスフェート（好
ましくはＡＴＰ）と２価金属イオンと、いくつかの場合
にはＫ+ イオンおよび／またはＮＨ4 + イオン、を必要
とする。この酵素は H. Yamada et al., FEMSMicrobio
l. Letters 30, 337-340 (1985); S. Shimizu et al.,
Arch. Microbiol. 145, 322-328 (1986) およびS. Shi
mizu et al., Biochem. Biophys. Res.Comm. 142, 1006
-1012 (1987) にも記載されている。
ルヒダントインの新しい測定方法は欧州特許出願 EP-A
0 154 269 に記載されている。１−メチルヒダントイン
は酵素１−メチルヒダントイナーゼ（NMHase）によりＮ
−カルバモイルサルコシンに加水分解される。この酵素
はその活性のためにヌクレオシドトリホスフェート（好
ましくはＡＴＰ）と２価金属イオンと、いくつかの場合
にはＫ+ イオンおよび／またはＮＨ4 + イオン、を必要
とする。この酵素は H. Yamada et al., FEMSMicrobio
l. Letters 30, 337-340 (1985); S. Shimizu et al.,
Arch. Microbiol. 145, 322-328 (1986) およびS. Shi
mizu et al., Biochem. Biophys. Res.Comm. 142, 1006
-1012 (1987) にも記載されている。
【０００７】それは例えばアースロバクター種、ミクロ
コッカス種、モラクセラ種またはブレビバクテリウム種
から得ることができる。この試験の好適な変法では、EP
-A-0 112 571から知られたＮ−カルバモイルサルコシン
アミドヒドロラーゼ（E.C. 3.5.3.59 ）によりＮ−カル
バモイルサルコシンをさらにサルコシンに転化し、その
後サルコシンを、例えばサルコシンオキシダーゼ（E.C.
1.5.3.1）とペルオキシダーゼ（E.C. 1.11.1.7 ）を用
いて、適当なレドックス指示薬により測光的に検出する
ことができる： クレアチニン＋H2O →1-メチルヒダントイン＋NH3 1-メチルヒダントイン＋ATP ＋2H2O→N-カルバモイルサ
ルコシン＋ADP ＋Pi N-カルバモイルサルコシン＋H2O →サルコシン＋NH3 ＋
CO2 サルコシン＋O2＋H2O →H2O2＋ホルムアルデヒド＋グリ
シン H2O2＋レドックス指示薬（還元体）→H2O ＋レドックス
指示薬（酸化体） クレアチニンを定量するための対応する光度測定法はさ
らにJ. Siedel et al., Anal. Letters 21, 1009-1017
(1988)にも記載されている。
コッカス種、モラクセラ種またはブレビバクテリウム種
から得ることができる。この試験の好適な変法では、EP
-A-0 112 571から知られたＮ−カルバモイルサルコシン
アミドヒドロラーゼ（E.C. 3.5.3.59 ）によりＮ−カル
バモイルサルコシンをさらにサルコシンに転化し、その
後サルコシンを、例えばサルコシンオキシダーゼ（E.C.
1.5.3.1）とペルオキシダーゼ（E.C. 1.11.1.7 ）を用
いて、適当なレドックス指示薬により測光的に検出する
ことができる： クレアチニン＋H2O →1-メチルヒダントイン＋NH3 1-メチルヒダントイン＋ATP ＋2H2O→N-カルバモイルサ
ルコシン＋ADP ＋Pi N-カルバモイルサルコシン＋H2O →サルコシン＋NH3 ＋
CO2 サルコシン＋O2＋H2O →H2O2＋ホルムアルデヒド＋グリ
シン H2O2＋レドックス指示薬（還元体）→H2O ＋レドックス
指示薬（酸化体） クレアチニンを定量するための対応する光度測定法はさ
らにJ. Siedel et al., Anal. Letters 21, 1009-1017
(1988)にも記載されている。
【０００８】１−メチルヒダントインと後続の指示薬反
応の反応生成物は血清や尿の天然成分ではないので、体
液中に存在する内因性物質はこのクレアチニンまたは１
−メチルヒダントインの定量を妨害しないだろう。従っ
て、サンプルブランク測定は必要ないだろう。しかしな
がら、クレアチニン定量におけるNMHaseの使用は２つの
好ましくない酵素特性により制限されることが分かっ
た。NMHaseはその安定性のために酵素結合した１−メチ
ルヒダントインを必要とし（約2-2.5 μmol/kU, U=国際
単位) 、従ってそれ自体の基質によって安定化される。
一般的に、１−メチルヒダントインは酵素の精製中この
酵素に結合したままである。しかしながら、例えばクレ
アチニンの定量方法のように、ヌクレオシドトリホスフ
ェートと２価金属イオン（例．Ｍｇ2+）の存在下では、
それは酵素により完全に分解されて、内因性基質に類似
したブランク反応を引き起こす。
応の反応生成物は血清や尿の天然成分ではないので、体
液中に存在する内因性物質はこのクレアチニンまたは１
−メチルヒダントインの定量を妨害しないだろう。従っ
て、サンプルブランク測定は必要ないだろう。しかしな
がら、クレアチニン定量におけるNMHaseの使用は２つの
好ましくない酵素特性により制限されることが分かっ
た。NMHaseはその安定性のために酵素結合した１−メチ
ルヒダントインを必要とし（約2-2.5 μmol/kU, U=国際
単位) 、従ってそれ自体の基質によって安定化される。
一般的に、１−メチルヒダントインは酵素の精製中この
酵素に結合したままである。しかしながら、例えばクレ
アチニンの定量方法のように、ヌクレオシドトリホスフ
ェートと２価金属イオン（例．Ｍｇ2+）の存在下では、
それは酵素により完全に分解されて、内因性基質に類似
したブランク反応を引き起こす。
【０００９】このブランク反応は、試験でのNMHaseの使
用量が広範囲に変化しうる定量方法（例えば、担体結合
試験の場合）において、特に不利である。酵素結合NMH
によって起こるブランク反応は一方ではNMHaseの使用量
に左右され、他方ではNMHase自体のNMH 含量にも左右さ
れるので、この種の試験の場合には常にブランク反応を
別個に定量することが必要であり、そしてこのブランク
値を測定値から差し引かなければならない。
用量が広範囲に変化しうる定量方法（例えば、担体結合
試験の場合）において、特に不利である。酵素結合NMH
によって起こるブランク反応は一方ではNMHaseの使用量
に左右され、他方ではNMHase自体のNMH 含量にも左右さ
れるので、この種の試験の場合には常にブランク反応を
別個に定量することが必要であり、そしてこのブランク
値を測定値から差し引かなければならない。
【００１０】他方、NMHaseは酵素結合基質なしでは非常
に不安定であり、例えばクレアチニン定量のような酵素
的測定方法には使用することができない。さらに、NMHa
seのATPase副活性がこの反応期間中特にATP を分解する
ので、NMHaseの酵素反応に必要なヌクレオシドトリホス
フェートはNMHaseの存在下で制限された安定性をもつに
すぎない。
に不安定であり、例えばクレアチニン定量のような酵素
的測定方法には使用することができない。さらに、NMHa
seのATPase副活性がこの反応期間中特にATP を分解する
ので、NMHaseの酵素反応に必要なヌクレオシドトリホス
フェートはNMHaseの存在下で制限された安定性をもつに
すぎない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、酵素に結合した１−メチルヒダントインまたは他の
基質類縁体の不在下でさえも安定した酵素が得られるよ
うな方法でNMHaseを安定化する方法を提供することであ
り、またNMHaseにより触媒される反応を用いて検出しう
るクレアチニンまたは他の被分析体の改良された正確な
定量方法を提供することである。
は、酵素に結合した１−メチルヒダントインまたは他の
基質類縁体の不在下でさえも安定した酵素が得られるよ
うな方法でNMHaseを安定化する方法を提供することであ
り、またNMHaseにより触媒される反応を用いて検出しう
るクレアチニンまたは他の被分析体の改良された正確な
定量方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】この目的は特許請求の範
囲に記載した方法を用いて本発明により達成される。驚
いたことに、NMHase反応において補助因子（コファクタ
ー）として作用する２価金属イオンと結合して錯体を形
成する錯化剤を採用することによって、酵素結合基質の
不在下でさえも、NMHaseを安定化できることが判明し
た。
囲に記載した方法を用いて本発明により達成される。驚
いたことに、NMHase反応において補助因子（コファクタ
ー）として作用する２価金属イオンと結合して錯体を形
成する錯化剤を採用することによって、酵素結合基質の
不在下でさえも、NMHaseを安定化できることが判明し
た。
【００１３】本発明によるNMHaseの安定化方法は、この
酵素を２価金属イオン、ヌクレオシドトリホスフェー
ト、およびこれらの金属イオンと結合して錯体を形成す
る錯化剤で処理する点に特徴がある。本発明に従ってNM
Haseを安定化するためには、最初に溶液（好ましくは、
緩衝化されている）に２価金属イオンを加え、次に存在
する２価金属イオンの全部と結合して錯体を形成するの
に十分な錯化剤とヌクレオシドトリホスフェートの混合
物を加える。別法として、最初にNMHase含有溶液にヌク
レオシドトリホスフェートを、次に錯化剤と結合した２
価金属イオンを加えてもよい。もちろん、２価金属イオ
ン、金属イオンと結合して錯体を形成する錯化剤、およ
びヌクレオシドトリホスフェートを同時に添加しても、
NMHaseを安定化することができる。
酵素を２価金属イオン、ヌクレオシドトリホスフェー
ト、およびこれらの金属イオンと結合して錯体を形成す
る錯化剤で処理する点に特徴がある。本発明に従ってNM
Haseを安定化するためには、最初に溶液（好ましくは、
緩衝化されている）に２価金属イオンを加え、次に存在
する２価金属イオンの全部と結合して錯体を形成するの
に十分な錯化剤とヌクレオシドトリホスフェートの混合
物を加える。別法として、最初にNMHase含有溶液にヌク
レオシドトリホスフェートを、次に錯化剤と結合した２
価金属イオンを加えてもよい。もちろん、２価金属イオ
ン、金属イオンと結合して錯体を形成する錯化剤、およ
びヌクレオシドトリホスフェートを同時に添加しても、
NMHaseを安定化することができる。
【００１４】ヌクレオシドトリホスフェートは特にATP
またはGTP を意味し、ATP が好適である。溶解状態のNM
Haseを安定化するためには、ヌクレオシドトリホスフェ
ートの濃度を0.01-50 mmol/l、好ましくは0.1-20 mmol/
l 、特に1-15 mmol/l とすることが適切である。イオン
はNMHaseの補助因子として作用する２価金属イオンが使
用される。イオンＭｇ2+、Ｍｎ2+およびＺｎ2+が好適で
あり、特にＭｇ2+イオンが好ましい。それらは水性媒体
に可溶性の塩（例えば、塩化物、硫酸塩など）の形で、
0.1-10 mmol/l 、好ましくは0.5-5 mmol/lの濃度で使用
することが適切である。
またはGTP を意味し、ATP が好適である。溶解状態のNM
Haseを安定化するためには、ヌクレオシドトリホスフェ
ートの濃度を0.01-50 mmol/l、好ましくは0.1-20 mmol/
l 、特に1-15 mmol/l とすることが適切である。イオン
はNMHaseの補助因子として作用する２価金属イオンが使
用される。イオンＭｇ2+、Ｍｎ2+およびＺｎ2+が好適で
あり、特にＭｇ2+イオンが好ましい。それらは水性媒体
に可溶性の塩（例えば、塩化物、硫酸塩など）の形で、
0.1-10 mmol/l 、好ましくは0.5-5 mmol/lの濃度で使用
することが適切である。
【００１５】水溶液中で２価金属イオンと結合して安定
したキレート錯体を形成しうる前記の型の錯化剤として
は、多座配位子、クリプタンド、クラウンエーテルなど
が使用される。多座配位子、特にニトリロ三酢酸、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)、１，２−シクロヘキシレン
ジニトリロ四酢酸、ジエチレン−トリアミン五酢酸、３
−アザ−３（カルボキシ−メチル）ペンタメチレンジニ
トリロ四酢酸、クエン酸、エチレンビス−（オキシエチ
レン−ニトリロ）−四酢酸および類似の化合物はそのま
まで、または水性媒体に可溶性の塩の形で有利であるこ
とが証明された。とりわけ、アルキレンジアミン酢酸、
特にエチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはその塩が好適
である。塩形で存在する錯体形成性酸のために使用でき
る陽イオンは、基本的に、水性媒体に可溶性の塩を形成
ししかもNMHaseの補助因子として作用する２価金属イオ
ンと同程度にまたはそれより強く錯化剤と結合しないも
のである。好ましくはアルカリ金属イオンが使用され、
特にＫ+ イオンが好適である。
したキレート錯体を形成しうる前記の型の錯化剤として
は、多座配位子、クリプタンド、クラウンエーテルなど
が使用される。多座配位子、特にニトリロ三酢酸、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)、１，２−シクロヘキシレン
ジニトリロ四酢酸、ジエチレン−トリアミン五酢酸、３
−アザ−３（カルボキシ−メチル）ペンタメチレンジニ
トリロ四酢酸、クエン酸、エチレンビス−（オキシエチ
レン−ニトリロ）−四酢酸および類似の化合物はそのま
まで、または水性媒体に可溶性の塩の形で有利であるこ
とが証明された。とりわけ、アルキレンジアミン酢酸、
特にエチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはその塩が好適
である。塩形で存在する錯体形成性酸のために使用でき
る陽イオンは、基本的に、水性媒体に可溶性の塩を形成
ししかもNMHaseの補助因子として作用する２価金属イオ
ンと同程度にまたはそれより強く錯化剤と結合しないも
のである。好ましくはアルカリ金属イオンが使用され、
特にＫ+ イオンが好適である。
【００１６】本発明によれば、NMHase安定化用の錯化剤
は、NMHaseの補助因子として作用する２価金属イオンの
全部がそれと結合するような濃度で使用する。それ故
に、錯化剤の濃度は２価金属イオンの濃度、結合部位の
数、錯化剤の錯体形成定数に左右される。必要とされる
錯化剤の濃度は、例えば滴定によって簡単に決定するこ
とができる。
は、NMHaseの補助因子として作用する２価金属イオンの
全部がそれと結合するような濃度で使用する。それ故
に、錯化剤の濃度は２価金属イオンの濃度、結合部位の
数、錯化剤の錯体形成定数に左右される。必要とされる
錯化剤の濃度は、例えば滴定によって簡単に決定するこ
とができる。
【００１７】通常、酵素は水溶液中で安定化される。好
ましくは水溶液を緩衝化して、ｐＨを7.0-9.0 の範囲、
特に7.5-8.5 とする。このｐＨに設定するために使用で
きる物質は前記範囲で十分な緩衝能をもちかつ酵素の活
性を損なわないものであり、例えばトリス、トリエタノ
ールアミンまたはTES 〔２−（（トリス−ヒドロキシメ
チル）メチル））アミノ−エタンスルホン酸〕である。
TES 緩衝剤が特に好ましい。緩衝剤の濃度は通常50-500
mmol/l 、特に好ましくは100-300 mmol/lである。
ましくは水溶液を緩衝化して、ｐＨを7.0-9.0 の範囲、
特に7.5-8.5 とする。このｐＨに設定するために使用で
きる物質は前記範囲で十分な緩衝能をもちかつ酵素の活
性を損なわないものであり、例えばトリス、トリエタノ
ールアミンまたはTES 〔２−（（トリス−ヒドロキシメ
チル）メチル））アミノ−エタンスルホン酸〕である。
TES 緩衝剤が特に好ましい。緩衝剤の濃度は通常50-500
mmol/l 、特に好ましくは100-300 mmol/lである。
【００１８】一般に、緩衝溶液1ml 当たり0.01-40 U の
NMHaseを使用し、好ましくは0.05-25 U 、特に0.10-20
U を使用する。EP-A-0 154 269から、EDTAのような錯化
剤はNMHaseの阻害剤であることが知られている。従っ
て、補助因子として作用する２価金属イオンが錯化剤に
よって完全に結合されるのに、酵素結合１−メチルヒダ
ントインが錯化剤、２価金属イオンおよびヌクレオシド
トリホスフェートの存在下でＮ−カルバモイルサルコシ
ンへ酵素的に完全に分解されるということは驚くべきこ
とであった。酵素分解反応は、生成するＮ−カルバモイ
ルサルコシンをその後分解する別の酵素（例えば、Ｎ−
カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ）の存在下
で続けられる。
NMHaseを使用し、好ましくは0.05-25 U 、特に0.10-20
U を使用する。EP-A-0 154 269から、EDTAのような錯化
剤はNMHaseの阻害剤であることが知られている。従っ
て、補助因子として作用する２価金属イオンが錯化剤に
よって完全に結合されるのに、酵素結合１−メチルヒダ
ントインが錯化剤、２価金属イオンおよびヌクレオシド
トリホスフェートの存在下でＮ−カルバモイルサルコシ
ンへ酵素的に完全に分解されるということは驚くべきこ
とであった。酵素分解反応は、生成するＮ−カルバモイ
ルサルコシンをその後分解する別の酵素（例えば、Ｎ−
カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ）の存在下
で続けられる。
【００１９】また、もはや基質によって安定化されない
NMHase酵素が錯化剤の存在下で長期間その安定性と酵素
活性を維持し、従って安定したNMHaseを必要とする酵素
定量法に有利に使用できるということは非常に驚くべき
ことであった。さらに、使用するヌクレオシドトリホス
フェート（特に、ATP ）が錯化剤の添加後にNMHaseのAT
Pase副活性によりもはや分解されず、従ってNMHaseの存
在下に安定した形で長期間貯蔵できることも驚くべきこ
とであった。文献にはEDTAが酵素ATPaseに対して促進作
用をもつことを示す記載があるので、このことはすべて
予期せざることである（例えば、T.E.Barman, Enzyme H
andbook, Vol.II, 1969,p. 689-690, Springer Verlag
Berlin, Heidelberg, New York ）。
NMHase酵素が錯化剤の存在下で長期間その安定性と酵素
活性を維持し、従って安定したNMHaseを必要とする酵素
定量法に有利に使用できるということは非常に驚くべき
ことであった。さらに、使用するヌクレオシドトリホス
フェート（特に、ATP ）が錯化剤の添加後にNMHaseのAT
Pase副活性によりもはや分解されず、従ってNMHaseの存
在下に安定した形で長期間貯蔵できることも驚くべきこ
とであった。文献にはEDTAが酵素ATPaseに対して促進作
用をもつことを示す記載があるので、このことはすべて
予期せざることである（例えば、T.E.Barman, Enzyme H
andbook, Vol.II, 1969,p. 689-690, Springer Verlag
Berlin, Heidelberg, New York ）。
【００２０】本発明に従って安定化されたNMHaseの溶液
は濃縮することもでき、例えば凍結乾燥を行ってもよ
い。また、NMHaseは固体の状態でも安定したままであ
る。本発明はまた、本発明による安定化NMHaseを使用す
ることを特徴とするNMHaseにより触媒される反応を用い
て被分析体を定量する方法に関する。被分析体は特に血
液、血清、血漿、尿、唾液のような体液中の検出すべき
物質であって、化学または酵素反応によりNMHaseの基質
に転化でき、従ってNMHase反応とその反応生成物の検出
により定量できる物質と解釈される。もちろん、検出す
べき被分析体はNMH それ自体であってもよい。
は濃縮することもでき、例えば凍結乾燥を行ってもよ
い。また、NMHaseは固体の状態でも安定したままであ
る。本発明はまた、本発明による安定化NMHaseを使用す
ることを特徴とするNMHaseにより触媒される反応を用い
て被分析体を定量する方法に関する。被分析体は特に血
液、血清、血漿、尿、唾液のような体液中の検出すべき
物質であって、化学または酵素反応によりNMHaseの基質
に転化でき、従ってNMHase反応とその反応生成物の検出
により定量できる物質と解釈される。もちろん、検出す
べき被分析体はNMH それ自体であってもよい。
【００２１】このような本発明方法の例は、クレアチニ
ンデイミナーゼでクレアチニンを１−メチルヒダントイ
ンに転化し、ヌクレオシドトリホスフェートおよび２価
金属イオン（好ましくは、Ｎ−カルバモイルサルコシン
およびヌクレオシドジホスフェートより過剰である）の
存在下に本発明による安定化１−メチルヒダントイナー
ゼ（NMHase）で１−メチルヒダントインを加水分解し、
そしてＮ−カルバモイルサルコシンを定量することから
成るクレアチニンの定量方法であり、この方法は定量を
行う前に使用する２価金属イオンと結合して錯体を形成
する錯化剤でNMHaseを安定化させ、さらに定量の開始時
に過剰の２価金属イオンを供給する点に特徴がある。
ンデイミナーゼでクレアチニンを１−メチルヒダントイ
ンに転化し、ヌクレオシドトリホスフェートおよび２価
金属イオン（好ましくは、Ｎ−カルバモイルサルコシン
およびヌクレオシドジホスフェートより過剰である）の
存在下に本発明による安定化１−メチルヒダントイナー
ゼ（NMHase）で１−メチルヒダントインを加水分解し、
そしてＮ−カルバモイルサルコシンを定量することから
成るクレアチニンの定量方法であり、この方法は定量を
行う前に使用する２価金属イオンと結合して錯体を形成
する錯化剤でNMHaseを安定化させ、さらに定量の開始時
に過剰の２価金属イオンを供給する点に特徴がある。
【００２２】本発明は特にヒトまたは動物からの生物学
的液体（例えば血液、血清、血漿、尿、唾液）中の、あ
るいはヒトまたは動物組織の液体調製物中のクレアチニ
ンの定量に使用される。本発明はもちろん１−メチルヒ
ダントインそれ自体の定量にも使用できる。本発明によ
るNMHaseの安定化を行わない１−メチルヒダントインと
Ｎ−カルバモイルサルコシンを経るクレアチニンの定量
方法は知られており、このような方法で用いる条件も当
業者に知られていて、本発明の範囲内で適している。そ
れらは例えば欧州特許出願 EP-A-0 154 269 に記載され
ている。
的液体（例えば血液、血清、血漿、尿、唾液）中の、あ
るいはヒトまたは動物組織の液体調製物中のクレアチニ
ンの定量に使用される。本発明はもちろん１−メチルヒ
ダントインそれ自体の定量にも使用できる。本発明によ
るNMHaseの安定化を行わない１−メチルヒダントインと
Ｎ−カルバモイルサルコシンを経るクレアチニンの定量
方法は知られており、このような方法で用いる条件も当
業者に知られていて、本発明の範囲内で適している。そ
れらは例えば欧州特許出願 EP-A-0 154 269 に記載され
ている。
【００２３】好適なクレアチニンの定量方法では、１−
メチルヒダントインの加水分解後に形成されるＮ−カル
バモイルサルコシンをＮ−カルバモイルサルコシンアミ
ドヒドロラーゼを使って加水分解して、サルコシンを形
成させる。形成されたサルコシンの検出には既知のサル
コシンオキシダーゼ反応が特に好適である。形成された
反応生成物の種々の検出反応（例えば、EP-A-0 154 269
に記載されるもの）の中でも、特に好適なものは、2,4,
6-トリブロモ-2- ヒドロキシ安息香酸(TBHB)と4-アミノ
アンチピリンとの酸化カップリングを用いたペルオキシ
ダーゼにより触媒される着色反応において、形成された
H2O2を検出する反応である。この着色反応は例えば光度
測定法により定量することができる。この反応順序は次
の通りである：
メチルヒダントインの加水分解後に形成されるＮ−カル
バモイルサルコシンをＮ−カルバモイルサルコシンアミ
ドヒドロラーゼを使って加水分解して、サルコシンを形
成させる。形成されたサルコシンの検出には既知のサル
コシンオキシダーゼ反応が特に好適である。形成された
反応生成物の種々の検出反応（例えば、EP-A-0 154 269
に記載されるもの）の中でも、特に好適なものは、2,4,
6-トリブロモ-2- ヒドロキシ安息香酸(TBHB)と4-アミノ
アンチピリンとの酸化カップリングを用いたペルオキシ
ダーゼにより触媒される着色反応において、形成された
H2O2を検出する反応である。この着色反応は例えば光度
測定法により定量することができる。この反応順序は次
の通りである：
【００２４】
【表１】
【００２５】本発明に従ってクレアチニン定量を行うた
めに、必要とされる酵素および試薬類は固体または溶解
状態で存在する。
めに、必要とされる酵素および試薬類は固体または溶解
状態で存在する。
【００２６】被分析体定量用の水溶液のｐＨ値は通常ｐ
Ｈ７．０−９．０の範囲、好ましくはｐＨ７．５−８．
５である。これらのｐＨ条件は特にクレアチニンの定量
に適している。ｐＨを設定するために、例えばNMHaseの
安定化のところで述べた緩衝物質を使用してもよい。測
定反応を開始するに当たって、例えばクレアチニンの定
量の場合、本発明による安定化NMHaseを含む試薬溶液ま
たは試薬混合物に、金属イオンの全濃度が錯化剤の濃度
を越えるような量で、すなわち錯化剤によって結合され
ないNMHase反応に必要な２価金属イオンが混合物中に十
分量で存在するように、２価金属イオンを加える。この
場合、錯化剤によって結合されない２価金属イオンの全
濃度は通常0.1-30 mmol/l 、好ましくは0.5-15 mmol/l
である。金属イオンは測定すべき被分析体と一緒に加え
ても、直前または直後に加えてもよい。
Ｈ７．０−９．０の範囲、好ましくはｐＨ７．５−８．
５である。これらのｐＨ条件は特にクレアチニンの定量
に適している。ｐＨを設定するために、例えばNMHaseの
安定化のところで述べた緩衝物質を使用してもよい。測
定反応を開始するに当たって、例えばクレアチニンの定
量の場合、本発明による安定化NMHaseを含む試薬溶液ま
たは試薬混合物に、金属イオンの全濃度が錯化剤の濃度
を越えるような量で、すなわち錯化剤によって結合され
ないNMHase反応に必要な２価金属イオンが混合物中に十
分量で存在するように、２価金属イオンを加える。この
場合、錯化剤によって結合されない２価金属イオンの全
濃度は通常0.1-30 mmol/l 、好ましくは0.5-15 mmol/l
である。金属イオンは測定すべき被分析体と一緒に加え
ても、直前または直後に加えてもよい。
【００２７】特に適した２価金属イオンは、水性媒体に
可溶性の塩（例えば、塩化物や硫酸塩）の形をしたＭｇ
2+、Ｍｎ2+および／またはＺｎ2+イオンであり、好まし
くはＭｇ2+イオンである。本発明に従ってNMHaseを安定
化するためには、とりわけこれにヌクレオシドトリホス
フェートを添加する。本発明による安定化NMHaseを使っ
て被分析体定量の間に形成されたNMH を転化するとき、
このヌクレオシドトリホスフェートの量が不十分である
ならば、比例してより多いヌクレオシドトリホスフェー
トをこの定量法において使用しなければならない。
可溶性の塩（例えば、塩化物や硫酸塩）の形をしたＭｇ
2+、Ｍｎ2+および／またはＺｎ2+イオンであり、好まし
くはＭｇ2+イオンである。本発明に従ってNMHaseを安定
化するためには、とりわけこれにヌクレオシドトリホス
フェートを添加する。本発明による安定化NMHaseを使っ
て被分析体定量の間に形成されたNMH を転化するとき、
このヌクレオシドトリホスフェートの量が不十分である
ならば、比例してより多いヌクレオシドトリホスフェー
トをこの定量法において使用しなければならない。
【００２８】定量反応において、ヌクレオシドトリホス
フェートの、特にATP および／またはGTP の、最終全濃
度は0.01-50 mmol/l、好ましくは0.1-20 mmol/l 、特に
1-15mmol/l であるのが適切である。通常、反応混合物1
ml 当たり0.01-40 U 、好ましくは0.05-25 U 、特に0.1
0-20 U のNMHaseが使用される。
フェートの、特にATP および／またはGTP の、最終全濃
度は0.01-50 mmol/l、好ましくは0.1-20 mmol/l 、特に
1-15mmol/l であるのが適切である。通常、反応混合物1
ml 当たり0.01-40 U 、好ましくは0.05-25 U 、特に0.1
0-20 U のNMHaseが使用される。
【００２９】カリウムおよび／またはアンモニウム塩、
特にアンモニウム塩、の添加はNMHaseの活性を高める上
で有利であることが判明した。この場合、塩は水性媒体
中に可溶性のものであることが理解されよう。これらの
全最終濃度は好ましくは0.1-100 mmol/l、特に5-10 mmo
l/l である。クレアチニン試験に必要な他の酵素および
試薬の濃度は EP-A-0 154 269 に開示されている。ま
た、代表的な値は本出願の実施例にも引用されている。
特にアンモニウム塩、の添加はNMHaseの活性を高める上
で有利であることが判明した。この場合、塩は水性媒体
中に可溶性のものであることが理解されよう。これらの
全最終濃度は好ましくは0.1-100 mmol/l、特に5-10 mmo
l/l である。クレアチニン試験に必要な他の酵素および
試薬の濃度は EP-A-0 154 269 に開示されている。ま
た、代表的な値は本出願の実施例にも引用されている。
【００３０】一般に、酵素や試薬の濃度の上限はそれら
の溶解度と経済的配慮によって決まる。下限は定量反応
に必要な感度によって決まる。本発明による安定化NMHa
seは有利な酵素学的定量法、特にクレアチニン定量法を
提供し、その際１−メチルヒダントインが転化され、必
要条件は安定したNMHaseと安定したヌクレオシドトリホ
スフェートであり、酵素結合した１−メチルヒダントイ
ン（または基質類縁体）はブランク反応によってこの定
量法に影響を及ぼすことがない。
の溶解度と経済的配慮によって決まる。下限は定量反応
に必要な感度によって決まる。本発明による安定化NMHa
seは有利な酵素学的定量法、特にクレアチニン定量法を
提供し、その際１−メチルヒダントインが転化され、必
要条件は安定したNMHaseと安定したヌクレオシドトリホ
スフェートであり、酵素結合した１−メチルヒダントイ
ン（または基質類縁体）はブランク反応によってこの定
量法に影響を及ぼすことがない。
【００３１】好適な方法では、本発明の定量法において
酵素結合NMH が原因で起こるブランク反応を排除するた
めに、測定反応を開始する前にかつ H2O2 指示薬を混合
する前に、本発明による安定化NMHaseと定量反応に必要
とされる酵素類とを接触させる。これらの酵素は特にＮ
−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ、サルコ
シンオキシダーゼ、必要に応じてペルオキシダーゼであ
る。これらと他の多くの市販酵素は痕跡量の H2O2 分解
酵素カタラーゼを含んでいる。必要ならば別個にそれを
加えてもよい。こうして、NMHaseに結合したNMH の酵素
分解中に上記反応式に従って形成された H2O2 は、遅反
応性カタラーゼが後続の測定反応における指示薬反応を
妨害することなく、実際の測定反応に先立ってカタラー
ゼによって除かれる。
酵素結合NMH が原因で起こるブランク反応を排除するた
めに、測定反応を開始する前にかつ H2O2 指示薬を混合
する前に、本発明による安定化NMHaseと定量反応に必要
とされる酵素類とを接触させる。これらの酵素は特にＮ
−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ、サルコ
シンオキシダーゼ、必要に応じてペルオキシダーゼであ
る。これらと他の多くの市販酵素は痕跡量の H2O2 分解
酵素カタラーゼを含んでいる。必要ならば別個にそれを
加えてもよい。こうして、NMHaseに結合したNMH の酵素
分解中に上記反応式に従って形成された H2O2 は、遅反
応性カタラーゼが後続の測定反応における指示薬反応を
妨害することなく、実際の測定反応に先立ってカタラー
ゼによって除かれる。
【００３２】さらに、本発明は、１−メチルヒダントイ
ナーゼにより触媒される反応を用いて被分析体を定量す
ることから成る上記本発明方法を実施するための１−メ
チルヒダントイナーゼを含有する試薬に関する。この試
薬は２価金属イオン、ヌクレオシドトリホスフェート、
およびこれらの金属イオンと結合して錯体を形成する錯
化剤を含む点に特徴がある。
ナーゼにより触媒される反応を用いて被分析体を定量す
ることから成る上記本発明方法を実施するための１−メ
チルヒダントイナーゼを含有する試薬に関する。この試
薬は２価金属イオン、ヌクレオシドトリホスフェート、
およびこれらの金属イオンと結合して錯体を形成する錯
化剤を含む点に特徴がある。
【００３３】NMHaseを含む被分析体（例えば、クレアチ
ニン）検出用の試薬は、定量すべき被分析体をNMH に転
化する１種または数種の酵素および物質を含むことを特
徴とする。クレアチニンデイミナーゼはクレアチニンの
定量に有利であることが判明した。さらに、本発明によ
る試薬は２価金属イオン、ATP やGTP のようなヌクレオ
シドトリホスフェート、金属イオンと結合する錯化剤、
ｐＨを7.0-9.0 の範囲に設定するための緩衝物質、およ
びＮ−カルバモイルサルコシン検出系を含む。この検出
系は好ましくは酵素Ｎ−カルバモイルサルコシンアミド
ヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを含有す
る。
ニン）検出用の試薬は、定量すべき被分析体をNMH に転
化する１種または数種の酵素および物質を含むことを特
徴とする。クレアチニンデイミナーゼはクレアチニンの
定量に有利であることが判明した。さらに、本発明によ
る試薬は２価金属イオン、ATP やGTP のようなヌクレオ
シドトリホスフェート、金属イオンと結合する錯化剤、
ｐＨを7.0-9.0 の範囲に設定するための緩衝物質、およ
びＮ−カルバモイルサルコシン検出系を含む。この検出
系は好ましくは酵素Ｎ−カルバモイルサルコシンアミド
ヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを含有す
る。
【００３４】この検出系はさらに H2O2 定量用の薬剤を
含むことができる。この系およびＮ−カルバモイルサル
コシンの分解反応生成物を検出する他の系は、例えばH.
U.Bergmeyer, Methoden der enzymat. Analyse, Verlag
Chemie, Weinheim に記載されている。さらに、本発明
試薬は、所望により、Ｋ+ イオンまたはＮＨ4 + イオ
ン、好ましくはＮＨ4 + イオン、を対応する水溶性塩の
形で含んでいてもよい。
含むことができる。この系およびＮ−カルバモイルサル
コシンの分解反応生成物を検出する他の系は、例えばH.
U.Bergmeyer, Methoden der enzymat. Analyse, Verlag
Chemie, Weinheim に記載されている。さらに、本発明
試薬は、所望により、Ｋ+ イオンまたはＮＨ4 + イオ
ン、好ましくはＮＨ4 + イオン、を対応する水溶性塩の
形で含んでいてもよい。
【００３５】上記成分のほかに、本発明試薬は湿潤剤、
リパーゼ、ビルダー、安定剤のような補助物質を含んで
いてもよい。存在しうる試薬成分および試薬成分の可能
な濃度範囲は、本発明による被分析体定量法を実施する
ために上述したものに一致する。本発明試薬は溶液とし
て存在しうる。この場合、必要な試薬成分は水溶液中に
一緒に存在してもよいが、好ましくはそれらは幾つかの
溶液に分配される。従って、本発明はさらに、１−メチ
ルヒダントイナーゼ（NMHase）により触媒される反応を
用いて被分析体を定量するための試薬キットに関する。
本発明のキットは少なくとも２個の容器から成り、第一
の容器は本発明による安定化NMHaseを含み、そして第二
の容器は２価金属イオンと、所望によりＫ+ イオンおよ
び／またはＮＨ4 + イオン、を含む。好ましくは、第一
の容器がさらに定量反応に必要な他の酵素類を含み、第
二の容器が指示薬反応に必要な染料をさらに含むだろ
う。諸成分は水溶液中に溶解した状態で存在しても、例
えば凍結乾燥品として、固体の状態で存在して使用前に
溶解してもよい。この種の試薬キットは、第一の容器中
でサンプルとNMHase調製物とをインキュベートし、その
後第二の容器からの２価金属イオンを添加して定量反応
を開始させるか、あるいは被分析体について試験すべき
サンプルを第二容器からの２価金属イオンと一緒にし、
その後第一容器からの酵素調製物を加えて定量反応を開
始させるのに特に有用である。
リパーゼ、ビルダー、安定剤のような補助物質を含んで
いてもよい。存在しうる試薬成分および試薬成分の可能
な濃度範囲は、本発明による被分析体定量法を実施する
ために上述したものに一致する。本発明試薬は溶液とし
て存在しうる。この場合、必要な試薬成分は水溶液中に
一緒に存在してもよいが、好ましくはそれらは幾つかの
溶液に分配される。従って、本発明はさらに、１−メチ
ルヒダントイナーゼ（NMHase）により触媒される反応を
用いて被分析体を定量するための試薬キットに関する。
本発明のキットは少なくとも２個の容器から成り、第一
の容器は本発明による安定化NMHaseを含み、そして第二
の容器は２価金属イオンと、所望によりＫ+ イオンおよ
び／またはＮＨ4 + イオン、を含む。好ましくは、第一
の容器がさらに定量反応に必要な他の酵素類を含み、第
二の容器が指示薬反応に必要な染料をさらに含むだろ
う。諸成分は水溶液中に溶解した状態で存在しても、例
えば凍結乾燥品として、固体の状態で存在して使用前に
溶解してもよい。この種の試薬キットは、第一の容器中
でサンプルとNMHase調製物とをインキュベートし、その
後第二の容器からの２価金属イオンを添加して定量反応
を開始させるか、あるいは被分析体について試験すべき
サンプルを第二容器からの２価金属イオンと一緒にし、
その後第一容器からの酵素調製物を加えて定量反応を開
始させるのに特に有用である。
【００３６】本発明による被分析体（例えば、クレアチ
ニン）定量法はいわゆる乾式試験（dry test）を使って
も実施することができる。この場合、本発明の試薬は担
体に結合される。乾式試験を行うのに適したデバイスは
当業者に知られており、例えば EP-A-0 016 387 、EP-A
-0 309 883、DE-A-32 47 608または EP-A-0 262 445に
記載されている。それらは一般に試験担体（test carri
er）または試験片（test strip）と呼ばれている。この
場合、試験を行うのに必要な試薬は、ほんの数種の可能
な材料を挙げると、紙、EP-A-0 016 387に記載の開口フ
ィルム、ガラス繊維パッド、多孔質プラスチック膜のよ
うな吸収性材料中または上に、あるいは適当なプラスチ
ックフィルム、ゼラチン、セルロースのような膨潤可能
な材料中または上に、乾燥状態で、すなわち液体中に溶
解されずに存在する。
ニン）定量法はいわゆる乾式試験（dry test）を使って
も実施することができる。この場合、本発明の試薬は担
体に結合される。乾式試験を行うのに適したデバイスは
当業者に知られており、例えば EP-A-0 016 387 、EP-A
-0 309 883、DE-A-32 47 608または EP-A-0 262 445に
記載されている。それらは一般に試験担体（test carri
er）または試験片（test strip）と呼ばれている。この
場合、試験を行うのに必要な試薬は、ほんの数種の可能
な材料を挙げると、紙、EP-A-0 016 387に記載の開口フ
ィルム、ガラス繊維パッド、多孔質プラスチック膜のよ
うな吸収性材料中または上に、あるいは適当なプラスチ
ックフィルム、ゼラチン、セルロースのような膨潤可能
な材料中または上に、乾燥状態で、すなわち液体中に溶
解されずに存在する。
【００３７】試験すべき液体サンプルを試験担体に適用
するとき、または試験担体を液体サンプル中に浸漬する
とき、試験担体中に液体媒体が形成され、そこで試験反
応が進行する。この反応によって生ずる色の形成は肉眼
でまたは光度測定法（例えば、反射光度測定法）により
評価することができる。担体に結合された形の本発明試
薬を製造するためには、濾紙、セルロース、プラスチッ
ク繊維パッドのような適当な担体材料に、易揮発性溶剤
（例えば、水またはエタノール）に溶解した試験担体の
製造に必要な試薬を含浸させる。これは溶液（それぞれ
最終試薬の成分のいくつかを含む）を用いる含浸工程で
実施される。この方法で処理された担体材料はそのまま
使用しても、既知方法でハンドルや固いプラスチックホ
イルに接着させてもよい。また、それぞれの場合に別々
の溶液を別々の含浸操作で使用して、担体材料上または
中に定量反応に必要な物質を適用することもできる。
するとき、または試験担体を液体サンプル中に浸漬する
とき、試験担体中に液体媒体が形成され、そこで試験反
応が進行する。この反応によって生ずる色の形成は肉眼
でまたは光度測定法（例えば、反射光度測定法）により
評価することができる。担体に結合された形の本発明試
薬を製造するためには、濾紙、セルロース、プラスチッ
ク繊維パッドのような適当な担体材料に、易揮発性溶剤
（例えば、水またはエタノール）に溶解した試験担体の
製造に必要な試薬を含浸させる。これは溶液（それぞれ
最終試薬の成分のいくつかを含む）を用いる含浸工程で
実施される。この方法で処理された担体材料はそのまま
使用しても、既知方法でハンドルや固いプラスチックホ
イルに接着させてもよい。また、それぞれの場合に別々
の溶液を別々の含浸操作で使用して、担体材料上または
中に定量反応に必要な物質を適用することもできる。
【００３８】同一の担体材料の多重含浸の代わりに、異
なる担体材料に本発明試薬の成分を分配して、液体の交
換が被分析体の定量中に可能であるような方法でこれら
の担体材料を互いに接触させることもできる。多層試験
担体を使ってNMHase触媒反応による被分析体の定量を実
施することが好適である。この場合に、本発明に従って
NMHaseを安定化させるのに必要な２価金属イオン、ATP
やGTP のようなヌクレオシドトリホスフェートおよび金
属イオンと結合する錯化剤は、層状の担体材料にNMHase
および試験反応に必要な酵素と共に適用され、そして試
験の開始に必要な追加量（使用する錯化剤に対して過剰
の金属イオンをもたらす）の２価金属イオンは同一の担
体材料の別の層または別の担体材料に適用される。この
場合、両方の層は液体の交換が可能であるように接触し
ているか、またはこのように接触させることが可能であ
る。
なる担体材料に本発明試薬の成分を分配して、液体の交
換が被分析体の定量中に可能であるような方法でこれら
の担体材料を互いに接触させることもできる。多層試験
担体を使ってNMHase触媒反応による被分析体の定量を実
施することが好適である。この場合に、本発明に従って
NMHaseを安定化させるのに必要な２価金属イオン、ATP
やGTP のようなヌクレオシドトリホスフェートおよび金
属イオンと結合する錯化剤は、層状の担体材料にNMHase
および試験反応に必要な酵素と共に適用され、そして試
験の開始に必要な追加量（使用する錯化剤に対して過剰
の金属イオンをもたらす）の２価金属イオンは同一の担
体材料の別の層または別の担体材料に適用される。この
場合、両方の層は液体の交換が可能であるように接触し
ているか、またはこのように接触させることが可能であ
る。
【００３９】試験担体の特に好適な実施態様では、NMHa
se活性および発色団指示薬系を増強させるのに有利なＫ
+ イオンまたはアンモニウムイオンが追加量の２価金属
イオンを含む層に適用される。この試験法での試験担体
上の個々の酵素と試薬の最終全濃度は、溶液定量法のと
ころで上述した濃度範囲の上端にあるのが好ましい。
se活性および発色団指示薬系を増強させるのに有利なＫ
+ イオンまたはアンモニウムイオンが追加量の２価金属
イオンを含む層に適用される。この試験法での試験担体
上の個々の酵素と試薬の最終全濃度は、溶液定量法のと
ころで上述した濃度範囲の上端にあるのが好ましい。
【００４０】本発明による試験担体の特に好適な実施態
様は図１に断面図で示してある。基底ホイル（１）は平
らに置かれた液体吸収層の支持層として役立つ。酵素類
を含む１層または数層（２）、任意の指示薬層（３）お
よび輸送パッド（４）は基底ホイル（１）上の互いの上
面にこの順序で載せる。それらは液体の交換が可能な方
法で互いに接触している。輸送パッドは層（２）および
（３）の面を完全に覆っている。この層構造体の縦方向
の２つの端は適用ゾーン（１０）または検出ゾーン（１
１）を表す。適用ゾーン（１０）を表す輸送パッド
（４）の部分に赤血球分離層（５）を載せ、それを損傷
から保護するためにカバーネット（６）で覆う。輸送パ
ッド（４）、赤血球分離層およびカバーネット（６）並
びに層（２）および（３）はホットメルト接着剤ストリ
ップ（７）を用いて適用ゾーン（１０）に位置する端で
基底ホイル（１）に固定する。
様は図１に断面図で示してある。基底ホイル（１）は平
らに置かれた液体吸収層の支持層として役立つ。酵素類
を含む１層または数層（２）、任意の指示薬層（３）お
よび輸送パッド（４）は基底ホイル（１）上の互いの上
面にこの順序で載せる。それらは液体の交換が可能な方
法で互いに接触している。輸送パッドは層（２）および
（３）の面を完全に覆っている。この層構造体の縦方向
の２つの端は適用ゾーン（１０）または検出ゾーン（１
１）を表す。適用ゾーン（１０）を表す輸送パッド
（４）の部分に赤血球分離層（５）を載せ、それを損傷
から保護するためにカバーネット（６）で覆う。輸送パ
ッド（４）、赤血球分離層およびカバーネット（６）並
びに層（２）および（３）はホットメルト接着剤ストリ
ップ（７）を用いて適用ゾーン（１０）に位置する端で
基底ホイル（１）に固定する。
【００４１】透明フラップ（９）は、外部操作（例え
ば、加圧）によって検出ゾーンにある輸送パッドの部分
と接触させることができるように、１滴のホットメルト
接着剤（８）で基底ホイル（１）に固定する。フラップ
（９）の目的は加圧することによって層（２）、（３）
および（４）に含まれる液体の交換を促進することであ
る。好ましくは、それは可視光線を通すプラスチック製
のホイルから成る。このためにはポリカーボネートホイ
ルが特に好適である。
ば、加圧）によって検出ゾーンにある輸送パッドの部分
と接触させることができるように、１滴のホットメルト
接着剤（８）で基底ホイル（１）に固定する。フラップ
（９）の目的は加圧することによって層（２）、（３）
および（４）に含まれる液体の交換を促進することであ
る。好ましくは、それは可視光線を通すプラスチック製
のホイルから成る。このためにはポリカーボネートホイ
ルが特に好適である。
【００４２】輸送パッド（４）は多数の材料から選ぶこ
とができる。特に、紙、フリース、および多くの毛管空
隙を有する開口構造のために相当の液体吸収能をもつフ
ィルム層が適している。この吸収能は、その後吸収され
る液体の量が試験反応に必要な全ての試薬層を完全に湿
潤させるように、十分高くなければならない。ガラス繊
維が特に好適である。また、ガラス繊維は赤血球分離層
（５）にも適している（EP-A-0 045 476と比較された
い）。
とができる。特に、紙、フリース、および多くの毛管空
隙を有する開口構造のために相当の液体吸収能をもつフ
ィルム層が適している。この吸収能は、その後吸収され
る液体の量が試験反応に必要な全ての試薬層を完全に湿
潤させるように、十分高くなければならない。ガラス繊
維が特に好適である。また、ガラス繊維は赤血球分離層
（５）にも適している（EP-A-0 045 476と比較された
い）。
【００４３】層（２）または（３）は通常個々の試薬
（酵素、指示薬、および他の必要な物質）を含浸させる
吸収特性を備えた材料から成る。このためにはプラスチ
ックまたは天然材料が適している。好適なプラスチック
材料はポリアミド織物であり、ポリエステル織物が特に
好適である。
（酵素、指示薬、および他の必要な物質）を含浸させる
吸収特性を備えた材料から成る。このためにはプラスチ
ックまたは天然材料が適している。好適なプラスチック
材料はポリアミド織物であり、ポリエステル織物が特に
好適である。
【００４４】好適な天然材料は特に紙であり、例えば長
繊維マニラ麻から作られた約10-20g/m2、好ましくは12
g/m2 、の重さのティーバッグ用の紙である。分析を実
施するために、例えば30μl の血液をカバーネット
（６）および赤血球分離層（５）に適用する。サンプル
は下の輸送層（４）、層（２）および（３）にしみ込
み、これにより赤血球を分離する。このように生成され
た血漿は試験担体の縦方向に層（４）、（３）および
（２）を通って検出領域（１１）に輸送される。この方
法では、これらの層で、定量すべきサンプルの成分と層
（２）および（３）に含浸された試薬との間に反応が起
こる。
繊維マニラ麻から作られた約10-20g/m2、好ましくは12
g/m2 、の重さのティーバッグ用の紙である。分析を実
施するために、例えば30μl の血液をカバーネット
（６）および赤血球分離層（５）に適用する。サンプル
は下の輸送層（４）、層（２）および（３）にしみ込
み、これにより赤血球を分離する。このように生成され
た血漿は試験担体の縦方向に層（４）、（３）および
（２）を通って検出領域（１１）に輸送される。この方
法では、これらの層で、定量すべきサンプルの成分と層
（２）および（３）に含浸された試薬との間に反応が起
こる。
【００４５】サンプル適用後一定時間で、指示薬反応を
透明フラップ（９）を押し下げた後で例えば光度測定法
により、例えばレフロトロン（Reflotron ：登録商標、
Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, German Federal
Republic ）を用いて、定量する。以下の実施例におい
てさらに詳しく本発明を説明する。
透明フラップ（９）を押し下げた後で例えば光度測定法
により、例えばレフロトロン（Reflotron ：登録商標、
Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, German Federal
Republic ）を用いて、定量する。以下の実施例におい
てさらに詳しく本発明を説明する。
【００４６】
【実施例】実施例１ 本発明による安定化NMHaseおよび従来技術によるNMHase
でクレアチニンを検出するための試薬担体の製造 ａ）酵素結合NMH を前もって分解した後のNMHase（本発
明による安定化NMHase）を含む試薬担体：試験担体を図
１に従って製造する。初めに、酵素紙（２）を作製す
る。以下の成分： 250 mmol/l TES 12 mmol/l EDTA 50 mmol/l ATP 1.5 mmol/l MgCl2 を溶解し、水酸化カリウム溶液でｐＨ値を調整して最終
ｐＨを8.4 とする。これに以下の成分： 150 g/l ショ糖 45 kU/l NMHase（アースロバクター種から） 450 kU/l クレアチニンデイミナーゼ（Crimi) 186 kU/l N-カルバモイルサルコシンアミドヒドロラー
ゼ(CSHase) 150 kU/l サルコシンオキシダーゼ(Sarc-OD) 7800 kU/l ペルオキシダーゼ(POD) 150 kU/l アスコルベートオキシダーゼ(AAO) を攪拌しながら順次溶解する。NMHaseの酵素結合NMH は
この溶液中で10分以内に分解される。
でクレアチニンを検出するための試薬担体の製造 ａ）酵素結合NMH を前もって分解した後のNMHase（本発
明による安定化NMHase）を含む試薬担体：試験担体を図
１に従って製造する。初めに、酵素紙（２）を作製す
る。以下の成分： 250 mmol/l TES 12 mmol/l EDTA 50 mmol/l ATP 1.5 mmol/l MgCl2 を溶解し、水酸化カリウム溶液でｐＨ値を調整して最終
ｐＨを8.4 とする。これに以下の成分： 150 g/l ショ糖 45 kU/l NMHase（アースロバクター種から） 450 kU/l クレアチニンデイミナーゼ（Crimi) 186 kU/l N-カルバモイルサルコシンアミドヒドロラー
ゼ(CSHase) 150 kU/l サルコシンオキシダーゼ(Sarc-OD) 7800 kU/l ペルオキシダーゼ(POD) 150 kU/l アスコルベートオキシダーゼ(AAO) を攪拌しながら順次溶解する。NMHaseの酵素結合NMH は
この溶液中で10分以内に分解される。
【００４７】調製された含浸溶液は吸収紙（長繊維紙、
Schoeller, Germsbach, German Federal Republic, 重
量：12 g/m2 ）に適用するか、または紙を含浸溶液中に
浸漬する。その後これを50℃で5 分間乾かす。これは以
下の成分を含む酵素紙（２）をもたらす： 3.4 g/m2 TES 0.27 g/m2 EDTA 2.1 g/m2 ATP 0.02 g/m2 MgCl2 x 6H2O 9 g/m2 ショ糖 2.81 kU/m2 NMHase 28 kU/m2 Crimi 12 kU/m2 CSHase 9 kU/m2 Sarc-OD 474 kU/m2 POD 9 kU/m2 AAO 指示薬紙（３）を類似の方法で作製する。これは含浸後
次の成分を含む： 0.4 g/m2 2-(3,5- ジ−ｔ−ブチル−ヒドロキシフェ
ニル）-4-(5)-(9-ユロリジノ)-5-(4)-メチル-(1H)-イミ
ダゾール・HCl （EP-A-0 161 436による) 3 g/m2 Synperonic (登録商標) F 68 (ポリエチレ
ングリコール−ポリプロピレングリコールコポリマー;
Serva, Heidelberg, German Federal Republic) 0.8 g/m2 NH4Cl 0.3 g/m2 MgCl2 図１に示すように、厚さ500 μm 、長さ10 cm 、幅6 mm
のポリエステルホイル(ICI Company, Frankfurt, Germa
n Federal Republic)（１）の上に酵素紙（２）（12 mm
x 6 mm) 、指示薬紙（３）（13 mm x 6 mm) 、輸送パ
ッド（４）として重さ25 g/m2 、長さ16 mm 、幅6 mm、
厚さ0.25 mm のガラス繊維パッド、赤血球分離パッド
（５）として重さ60 g/m2 、幅6 mm、長さ6 mm、厚さ70
0 μm のガラス繊維パッド、およびScrynel PE28OHC re
d ( 登録商標）（ポリエチレン、Zuricher Beuteltuchf
abrik AG, Ruschlikon, Switzerland ）から作られたメ
ッシュ寸法200 μm 、6 x 8 mmの保護ネット（６）をこ
の順序でホットメルト接着剤ストリップ（７）を使って
固定することにより試験担体を作製する。
Schoeller, Germsbach, German Federal Republic, 重
量：12 g/m2 ）に適用するか、または紙を含浸溶液中に
浸漬する。その後これを50℃で5 分間乾かす。これは以
下の成分を含む酵素紙（２）をもたらす： 3.4 g/m2 TES 0.27 g/m2 EDTA 2.1 g/m2 ATP 0.02 g/m2 MgCl2 x 6H2O 9 g/m2 ショ糖 2.81 kU/m2 NMHase 28 kU/m2 Crimi 12 kU/m2 CSHase 9 kU/m2 Sarc-OD 474 kU/m2 POD 9 kU/m2 AAO 指示薬紙（３）を類似の方法で作製する。これは含浸後
次の成分を含む： 0.4 g/m2 2-(3,5- ジ−ｔ−ブチル−ヒドロキシフェ
ニル）-4-(5)-(9-ユロリジノ)-5-(4)-メチル-(1H)-イミ
ダゾール・HCl （EP-A-0 161 436による) 3 g/m2 Synperonic (登録商標) F 68 (ポリエチレ
ングリコール−ポリプロピレングリコールコポリマー;
Serva, Heidelberg, German Federal Republic) 0.8 g/m2 NH4Cl 0.3 g/m2 MgCl2 図１に示すように、厚さ500 μm 、長さ10 cm 、幅6 mm
のポリエステルホイル(ICI Company, Frankfurt, Germa
n Federal Republic)（１）の上に酵素紙（２）（12 mm
x 6 mm) 、指示薬紙（３）（13 mm x 6 mm) 、輸送パ
ッド（４）として重さ25 g/m2 、長さ16 mm 、幅6 mm、
厚さ0.25 mm のガラス繊維パッド、赤血球分離パッド
（５）として重さ60 g/m2 、幅6 mm、長さ6 mm、厚さ70
0 μm のガラス繊維パッド、およびScrynel PE28OHC re
d ( 登録商標）（ポリエチレン、Zuricher Beuteltuchf
abrik AG, Ruschlikon, Switzerland ）から作られたメ
ッシュ寸法200 μm 、6 x 8 mmの保護ネット（６）をこ
の順序でホットメルト接着剤ストリップ（７）を使って
固定することにより試験担体を作製する。
【００４８】厚さ200 μm 、長さ15 mm 、幅6 mmの透明
なポリカーボネートホイル (Pokalon ：登録商標、Lonz
a, Rheinfelden, German Federal Republic)（９）をフ
ラップとして、加圧により輸送パッド（４）上に押しつ
けることができるように、１滴のホットメルト接着剤
（８）で担体ホイル（１）上に固定する。酵素紙中のNM
Haseは安定しており、この試験担体は酵素活性の目立っ
た低下なしに室温で少なくとも１年間貯蔵することがで
きる。
なポリカーボネートホイル (Pokalon ：登録商標、Lonz
a, Rheinfelden, German Federal Republic)（９）をフ
ラップとして、加圧により輸送パッド（４）上に押しつ
けることができるように、１滴のホットメルト接着剤
（８）で担体ホイル（１）上に固定する。酵素紙中のNM
Haseは安定しており、この試験担体は酵素活性の目立っ
た低下なしに室温で少なくとも１年間貯蔵することがで
きる。
【００４９】クレアチニンを定量する場合、クレアチニ
ンを含む30μl サンプル（例えば、血液）を保護ネット
（６）に適用する。30秒後透明ホイル（９）に圧力を加
えて、それを輸送パッド（４）、そこに含まれる液体、
下層の指示薬および酵素紙（３）および（２）に押しつ
ける。さらに60秒後、適当な反射フォトメーター（例え
ば、Reflotron ：登録商標、Boehringer Mannheim Gmb
H, Mannheim, German Federal Republic ）を用いて、6
42 nmで透明ホイル（９）を通して反射パーセントを測
定する。既知のクレアチニン濃度による検量線は未知の
濃度を定量するのに役立つ（図２）。
ンを含む30μl サンプル（例えば、血液）を保護ネット
（６）に適用する。30秒後透明ホイル（９）に圧力を加
えて、それを輸送パッド（４）、そこに含まれる液体、
下層の指示薬および酵素紙（３）および（２）に押しつ
ける。さらに60秒後、適当な反射フォトメーター（例え
ば、Reflotron ：登録商標、Boehringer Mannheim Gmb
H, Mannheim, German Federal Republic ）を用いて、6
42 nmで透明ホイル（９）を通して反射パーセントを測
定する。既知のクレアチニン濃度による検量線は未知の
濃度を定量するのに役立つ（図２）。
【００５０】ｂ）本発明により酵素結合NMH を分解して
いないNMHaseを含む試薬担体：酵素紙用の含浸溶液を実
施例１ａに従って調製するが、この溶液はＭｇ2+イオン
を全く含まない。このＭｇ2+不含酵素紙を使って実施例
１ａに類似した試験担体を作製する。実施例２ 実施例１ａによる試薬担体（本発明の試験担体）および
実施例１ｂによる試薬担体（従来技術の試験担体）のブ
ランクシグナルの測定 クレアチニンもNMH も含まない30μl の6%ウシ血清アル
ブミン溶液を実施例１ａの試薬担体（酵素結合NMH を含
まない）および実施例１ｂの試薬担体（まだ酵素結合NM
H を含む）に適用し、反射シグナル変化の時間への依存
性を記録する。
いないNMHaseを含む試薬担体：酵素紙用の含浸溶液を実
施例１ａに従って調製するが、この溶液はＭｇ2+イオン
を全く含まない。このＭｇ2+不含酵素紙を使って実施例
１ａに類似した試験担体を作製する。実施例２ 実施例１ａによる試薬担体（本発明の試験担体）および
実施例１ｂによる試薬担体（従来技術の試験担体）のブ
ランクシグナルの測定 クレアチニンもNMH も含まない30μl の6%ウシ血清アル
ブミン溶液を実施例１ａの試薬担体（酵素結合NMH を含
まない）および実施例１ｂの試薬担体（まだ酵素結合NM
H を含む）に適用し、反射シグナル変化の時間への依存
性を記録する。
【００５１】
【表２】
【００５２】60秒後に安定した測定シグナルが確立され
る。実施例１ａの試薬担体を使うと反射シグナルがほと
んど未変化のままであるが、実施例１ｂの試薬担体は酵
素結合NMH の分解による有意な反応を示す。このブラン
クシグナルは血清中の0.07 mmol/l クレアチニンの濃度
に近似している。血清中のクレアチニンの測定範囲の下
限、約0.04 mmol/l では、この種のシグナルがクレアチ
ニンの定量を誤らせる。NMHaseの安定化において、EDTA
を異なる他の錯化剤と置き換えた実施例１ａの試薬担体
を使った場合にも、同様の安定した測定シグナルが得ら
れる。
る。実施例１ａの試薬担体を使うと反射シグナルがほと
んど未変化のままであるが、実施例１ｂの試薬担体は酵
素結合NMH の分解による有意な反応を示す。このブラン
クシグナルは血清中の0.07 mmol/l クレアチニンの濃度
に近似している。血清中のクレアチニンの測定範囲の下
限、約0.04 mmol/l では、この種のシグナルがクレアチ
ニンの定量を誤らせる。NMHaseの安定化において、EDTA
を異なる他の錯化剤と置き換えた実施例１ａの試薬担体
を使った場合にも、同様の安定した測定シグナルが得ら
れる。
【００５３】
【表３】
【００５４】実施例３ NMHaseの安定性 ａ）酵素結合NMH を含まない ｂ) Ｍｇ2+イオンとATP の存在下に酵素結合NMH を含む ｃ）本発明に従ってEDTA、Ｍｇ2+イオンおよびATP で安
定化後酵素紙用の含浸溶液を実施例１ａに従って調製し
た。
定化後酵素紙用の含浸溶液を実施例１ａに従って調製し
た。
【００５５】ａ）酵素結合NMH 不含45 U/ml NMHase EDTAおよびMgCl2 不在 ｂ）酵素結合NMH 含有45 U/ml NMHase EDTAおよびMgCl2 不在 ｃ）酵素結合NMH 含有45 U/ml NMHase EDTAおよびMgCl2 を含む本発明による含浸溶液 ３種類の含浸溶液中のNMHaseの酵素活性の時間経過をEP
-A-0 154 269に従って測定した。
-A-0 154 269に従って測定した。
【００５６】
【表４】
【００５７】この結果によると、酵素結合NMH を含まな
いNMHaseは著しい不安定性を示し、もはや処理不能であ
る。一方、酵素結合NMH 含有NMHaseは安定しているが、
実施例１ｂにおけるブランク反応を示す。対照的に、本
発明に従って処理したNMHaseは、酵素結合NMH をもはや
含まなくとも、優れた安定性を示す。実施例４ ATP の安定性 ａ）本発明による安定化NMHaseの存在下 ｂ）EDTA処理を行わないNMHaseの存在下 ２種類の酵素含浸溶液を実施例１ａに従って調製した： ａ）EDTAを含む ｂ）EDTAを含まない その後ATP 濃度の時間経過を測定した。
いNMHaseは著しい不安定性を示し、もはや処理不能であ
る。一方、酵素結合NMH 含有NMHaseは安定しているが、
実施例１ｂにおけるブランク反応を示す。対照的に、本
発明に従って処理したNMHaseは、酵素結合NMH をもはや
含まなくとも、優れた安定性を示す。実施例４ ATP の安定性 ａ）本発明による安定化NMHaseの存在下 ｂ）EDTA処理を行わないNMHaseの存在下 ２種類の酵素含浸溶液を実施例１ａに従って調製した： ａ）EDTAを含む ｂ）EDTAを含まない その後ATP 濃度の時間経過を測定した。
【００５８】
【表５】
【００５９】本発明による含浸溶液ａ）中のATP は十分
に安定した状態で残存するが、EDTAを含まない含浸溶液
ｂ）では短時間でATP が分解された。以下の値はEDTAを
他の異なる錯化剤と置き換えた含浸溶液中の24時間後の
ATPの濃度（％）を示す。( 最初のATP 濃度：100%）
に安定した状態で残存するが、EDTAを含まない含浸溶液
ｂ）では短時間でATP が分解された。以下の値はEDTAを
他の異なる錯化剤と置き換えた含浸溶液中の24時間後の
ATPの濃度（％）を示す。( 最初のATP 濃度：100%）
【００６０】
【表６】
【図１】本発明による好適な試験担体の断面図。
【図２】未知のクレアチニン濃度を定量するための既知
クレアチニン濃度による検量線図。
クレアチニン濃度による検量線図。
１ 基底ホイル ２ 酵素含有層 ３ 指示薬層 ４ 輸送パッド ５ 赤血球分離層 ６ カバーネット ７ ホットメルト接着剤ストリップ ８ １滴のホットメルト接着剤 ９ 透明フラップ １０ 適用ゾーン １１ 検出ゾーン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユルゲン ミステル ドイツ連邦共和国 マンハイム 81 ディ −6800 マックスドルフェルシュトラーセ 30
Claims (15)
- 【請求項１】 １−メチルヒダントイナーゼ（NMHase)
を２価金属イオン、ヌクレオシドトリホスフェート、お
よびこれらの２価金属イオンと結合して錯体を形成する
錯化剤で処理することから成る、１−メチルヒダントイ
ンを含んでいてもよい、１−メチルヒダントイナーゼの
安定化方法。 - 【請求項２】 ２価金属イオンとしてＭｇ2+、Ｍｎ2+お
よび／またはＺｎ2+を使用する、請求項１の方法。 - 【請求項３】 錯化剤としてエチレンジアミン四酢酸ま
たはその塩を使用する、請求項１または２の方法。 - 【請求項４】 ヌクレオシドトリホスフェートとしてＡ
ＴＰを使用する、請求項１−３のいずれか１項の方法。 - 【請求項５】 NMHaseにより触媒される反応を用いて被
分析体を測定する方法であって：請求項１−４のいずれ
か１項に記載の方法により安定化されたNMHaseを使用
し、 錯化剤に対して過剰の２価金属イオン、および所望によ
りＫ+ および／またはＮＨ4 + イオン、を用いてNMHase
反応を開始させ、そしてＮ−カルバモイルサルコシンを
適当な方法で測定する、ことから成る方法。 - 【請求項６】 Ｎ−カルバモイルサルコシンアミドヒド
ロラーゼとサルコシンオキシダーゼを使ってＮ−カルバ
モイルサルコシンを測定する、請求項５の方法。 - 【請求項７】 １−メチルヒダントイナーゼ（NMHase）
により触媒される反応を用いて被分析体を測定するため
の試薬であって：NMHase、２価金属イオン、ヌクレオシ
ドトリホスフェート、これらの２価金属イオンと結合し
て錯体を形成する錯化剤、および所望によりＫ+ および
／またはＮＨ4 + イオン、を含む試薬。 - 【請求項８】 クレアチニンを測定するための試薬であ
って：NMHase、クレアチニンデイミナーゼ、２価金属イ
オン、ヌクレオシドトリホスフェート、これらの２価金
属イオンと結合して錯体を形成する錯化剤、および所望
によりＫ+ および／またはＮＨ4 + イオン、並びにＮ−
カルバモイルサルコシンの検出系、およびｐＨを７．０
−９．０に設定するための緩衝物質を含む試薬。 - 【請求項９】 Ｎ−カルバモイルサルコシン検出系とし
てＮ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ、サ
ルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびH2O2
検出試薬を含む、請求項８の試薬。 - 【請求項１０】 カタラーゼをさらに含む、請求項９の
試薬。 - 【請求項１１】 担体に含浸されている、請求項７−１
０のいずれか１項の試薬。 - 【請求項１２】 少なくとも２個の容器から成る１−メ
チルヒダントイナーゼ（NMHase）により触媒される反応
を用いて被分析体を測定するための試薬キットであっ
て：第一の容器がNMHase、２価金属イオン、ヌクレオシ
ドトリホスフェート、これらの２価金属イオンと結合し
て錯体を形成する錯化剤、および所望によりＫ+および
／またはＮＨ4 + イオン、を含み、そして第二の容器が
２価金属イオン、および所望によりＫ+ および／または
ＮＨ4 + イオン、を含む試薬キット。 - 【請求項１３】 第一の容器がさらに酵素類Ｎ−カルバ
モイルサルコシンアミドヒドロラーゼ、サルコシンオキ
シダーゼ、および所望によりペルオキシダーゼを含み、
そして第二の容器がさらにH2O2検出試薬を含む、請求項
１２の試薬キット。 - 【請求項１４】 NMHaseにより触媒される反応を用いて
被分析体を測定するための多層試験担体であって：１つ
の層中に、NMHaseと共に、２価金属イオン、ヌクレオシ
ドトリホスフェート、これらの２価金属イオンと結合し
て錯体を形成する錯化剤、ｐＨを７．０−９．０とする
ための緩衝物質、および所望によりこの測定反応に必要
とされる他の酵素、を含み、そして液体の交換が可能な
状態でNMHase含有層と接触しているか、あるいはこのよ
うに接触させることができるもう１つの層中に、過剰量
の錯化剤を越える追加量の２価金属イオンを含む多層試
験担体。 - 【請求項１５】 NMHase、２価金属イオン、ヌクレオシ
ドトリホスフェート、およびこれらの２価金属イオンと
結合して錯体を形成しうる錯化剤を溶解した状態でまた
は固体の状態で含む酵素製剤。
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