JPH06172378A - ステロイド化合物 - Google Patents
ステロイド化合物Info
- Publication number
- JPH06172378A JPH06172378A JP4324087A JP32408792A JPH06172378A JP H06172378 A JPH06172378 A JP H06172378A JP 4324087 A JP4324087 A JP 4324087A JP 32408792 A JP32408792 A JP 32408792A JP H06172378 A JPH06172378 A JP H06172378A
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- JP
- Japan
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- ngf
- action
- medium
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アルツハイマー型痴呆の原因となる大脳基底
核神経細胞であるアセチルコリン作動性神経の変性・脱
落の抑制、且つ末梢神経損傷の回復を早める作用も持っ
ており、末梢神経障害治療薬としても有用な神経成長因
子（ＮＧＦ）産生促進作用及び神経栄養因子作用を有す
る簡単な投与方法が可能な低分子化合物 【構成】式Ｉ で表されるプレグナ―７―エン−３，６，２０−トリオ
ン。
核神経細胞であるアセチルコリン作動性神経の変性・脱
落の抑制、且つ末梢神経損傷の回復を早める作用も持っ
ており、末梢神経障害治療薬としても有用な神経成長因
子（ＮＧＦ）産生促進作用及び神経栄養因子作用を有す
る簡単な投与方法が可能な低分子化合物 【構成】式Ｉ で表されるプレグナ―７―エン−３，６，２０−トリオ
ン。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は神経成長因子（以下、Ｎ
ＧＦと称する。）産生促進作用及び神経栄養因子作用を
有する新規なステロイド化合物に関する。
ＧＦと称する。）産生促進作用及び神経栄養因子作用を
有する新規なステロイド化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年増えつつあるアルツハイマー型痴呆
においては、大脳基底核神経細胞であるアセチルコリン
作動性神経の変性・脱落が、記憶障害・知的活動低下に
深く係わっていることが示唆されている。
においては、大脳基底核神経細胞であるアセチルコリン
作動性神経の変性・脱落が、記憶障害・知的活動低下に
深く係わっていることが示唆されている。
【０００３】ＮＧＦは繊維切断による中枢性アセチルコ
リン作動性神経の変性・脱落を抑制すること、及び、老
齢ラットの迷路学習障害を改善すると共にアセチルコリ
ン作動性神経細胞の萎縮を抑制することが報告されてい
る。これらのことは、ＮＧＦがアルツハイマー型痴呆の
治療薬となりうることを示している。さらには、ＮＧＦ
は、脳虚血スナネズミの海馬神経細胞死を防ぐことも確
かめられており、脳卒中後遺症治療薬としても有用であ
ると考えられる。
リン作動性神経の変性・脱落を抑制すること、及び、老
齢ラットの迷路学習障害を改善すると共にアセチルコリ
ン作動性神経細胞の萎縮を抑制することが報告されてい
る。これらのことは、ＮＧＦがアルツハイマー型痴呆の
治療薬となりうることを示している。さらには、ＮＧＦ
は、脳虚血スナネズミの海馬神経細胞死を防ぐことも確
かめられており、脳卒中後遺症治療薬としても有用であ
ると考えられる。
【０００４】一方、ＮＧＦは、末梢神経損傷の回復を早
める作用も持っており、末梢神経障害治療薬としても有
用であることが明らかにされている。
める作用も持っており、末梢神経障害治療薬としても有
用であることが明らかにされている。
【０００５】ＮＧＦの他にも、神経細胞の生存・機能維
持作用あるいは変性修復活性を示す生体成分が数多く見
つかっており、神経栄養因子と呼ばれている。従って、
これら神経栄養因子は、神経細胞変性に伴う中枢性神経
障害及び末梢性神経障害の治療薬として有用であると考
えられる。
持作用あるいは変性修復活性を示す生体成分が数多く見
つかっており、神経栄養因子と呼ばれている。従って、
これら神経栄養因子は、神経細胞変性に伴う中枢性神経
障害及び末梢性神経障害の治療薬として有用であると考
えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】神経栄養因子と呼ばれ
る生体成分は、ＮＧＦを含めその何れもがタンパク質で
ある。タンパク質は、中枢性神経障害治療薬として用い
る際、その物状から判断して、直接脳室内投与が必要と
なることが予想され、実用上問題が多い。従って、より
簡単な投与方法が可能な、神経栄養因子作用自身あるい
は神経栄養因子の産生促進作用を持つ低分子化合物が望
まれている。
る生体成分は、ＮＧＦを含めその何れもがタンパク質で
ある。タンパク質は、中枢性神経障害治療薬として用い
る際、その物状から判断して、直接脳室内投与が必要と
なることが予想され、実用上問題が多い。従って、より
簡単な投与方法が可能な、神経栄養因子作用自身あるい
は神経栄養因子の産生促進作用を持つ低分子化合物が望
まれている。
【０００７】本発明の目的は、ＮＧＦ産生促進作用及び
神経栄養因子作用を有する新規な生理活性物質を提供す
ることにある。
神経栄養因子作用を有する新規な生理活性物質を提供す
ることにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために多数の菌株を土壌より分離し、その菌株
の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株
が、ＮＧＦ産生促進作用及び神経栄養因子作用を有する
新規な生理活性物質を生産することを見い出し本発明を
完成するに至った。
の達成のために多数の菌株を土壌より分離し、その菌株
の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株
が、ＮＧＦ産生促進作用及び神経栄養因子作用を有する
新規な生理活性物質を生産することを見い出し本発明を
完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、式Ｉ
【００１０】
【００１１】で表されるプレグナ―７―エン−３，６，
２０―トリオンである。
２０―トリオンである。
【００１２】本発明の新規生理活性物質ＮＧ−２０３を
生産する菌株は、本発明者らが新潟県佐渡島にて採取し
た枯死植物から新たに分離した菌株であり、微生物の名
称「Cladosporium sp. F-5430」および微生物寄託番号
「微工研菌寄第１３３１０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３１
０）」として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。
生産する菌株は、本発明者らが新潟県佐渡島にて採取し
た枯死植物から新たに分離した菌株であり、微生物の名
称「Cladosporium sp. F-5430」および微生物寄託番号
「微工研菌寄第１３３１０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３１
０）」として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。
【００１３】この菌株の菌学的性状を以下に示す。 １）形態 本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、オートミー
ル寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地、麦芽エキス寒天培地等
の寒天培地上で良好に生育し、また胞子の形成も良好で
ある。本菌株がバレイショ・ブドウ糖寒天培地上、２６
℃、１４日間の培養で形成したコロニーを光学顕微鏡で
観察すると、菌糸は隔壁を有し高度に分岐しており、分
生子柄先端の１〜数個の出芽点から分生子が生じ、さら
にその分生子の先端にも出芽点が生じており、この繰り
返しによって最終的に樹枝状の分生子頭を呈する。分生
子柄は暗灰緑色、長さは２００μｍに達するものもある
が通常はそれよりもはるかに短い。幅は２．０−４．０
μｍである。分生子は樹枝上分生子鎖の基部に相当する
分生子（ramo-conidia）とそれ以外の通常の分生子の２
種に分けられるが、いずれも暗灰緑色、乾性で、脱落し
易く、両端または基部に暗色の分離痕を有する。 ramo-
conidia は多くが０−１隔壁、まれに５隔壁まで、表面
は平滑からわずかに粗面、７．０−３０．０× ２．６
−４．２μｍ。通常の分生子は亜球形，球形，レモン形
で多くは０隔壁、まれに１隔壁で、表面は平滑からわず
かに粗面、３．０−７．０（−１２．０）×３．０−
４．２μｍである。
ル寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地、麦芽エキス寒天培地等
の寒天培地上で良好に生育し、また胞子の形成も良好で
ある。本菌株がバレイショ・ブドウ糖寒天培地上、２６
℃、１４日間の培養で形成したコロニーを光学顕微鏡で
観察すると、菌糸は隔壁を有し高度に分岐しており、分
生子柄先端の１〜数個の出芽点から分生子が生じ、さら
にその分生子の先端にも出芽点が生じており、この繰り
返しによって最終的に樹枝状の分生子頭を呈する。分生
子柄は暗灰緑色、長さは２００μｍに達するものもある
が通常はそれよりもはるかに短い。幅は２．０−４．０
μｍである。分生子は樹枝上分生子鎖の基部に相当する
分生子（ramo-conidia）とそれ以外の通常の分生子の２
種に分けられるが、いずれも暗灰緑色、乾性で、脱落し
易く、両端または基部に暗色の分離痕を有する。 ramo-
conidia は多くが０−１隔壁、まれに５隔壁まで、表面
は平滑からわずかに粗面、７．０−３０．０× ２．６
−４．２μｍ。通常の分生子は亜球形，球形，レモン形
で多くは０隔壁、まれに１隔壁で、表面は平滑からわず
かに粗面、３．０−７．０（−１２．０）×３．０−
４．２μｍである。
【００１４】なお、培養を３週間に延長したが有性生殖
器官の形成は認められなかった。
器官の形成は認められなかった。
【００１５】２）培地上での生育状態 各種培地上で、２６℃、１４日間培養した場合の肉眼的
観察結果を次の表１に示した。なお色の表示は日本規格
協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引用し
た。
観察結果を次の表１に示した。なお色の表示は日本規格
協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引用し
た。
【００１６】
【表１】
【００１７】３）生理的性質 生育温度範囲及び最適温度 本菌株はｐＨ６．０のサブロー液体培地において、１１
〜３２℃の範囲で生育し、最適温度は２３〜２７℃であ
る。 生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ 本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ３〜９
の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。 ４）好気性，嫌気性の区別 ； 好気性
〜３２℃の範囲で生育し、最適温度は２３〜２７℃であ
る。 生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ 本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ３〜９
の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。 ４）好気性，嫌気性の区別 ； 好気性
【００１８】以上の形態的特徴および培養上の性状か
ら、本菌株が不完全菌亜門中の、Cladosporium 属の１
菌種であることが明らかであり、宇田川 俊一，椿 啓介
編『菌類図鑑』（1978年）、M. B. Ellis 著『DEMATIAC
EOUS HYPHOMYCETES』（1971年）および 『MORE DEMATIA
CEOUS HYPHOMYCETES』（1976年）に報告されている多く
の既知菌株と比較検討した。その結果、本菌株は C. cl
adosporioides, C. cucumerinum, C. sphaerospermum
などに近い性状を示すことが明かとなったが、種を決定
するには至らなかったので本菌株を「Cladosporium sp.
F-5430」 と命名した。
ら、本菌株が不完全菌亜門中の、Cladosporium 属の１
菌種であることが明らかであり、宇田川 俊一，椿 啓介
編『菌類図鑑』（1978年）、M. B. Ellis 著『DEMATIAC
EOUS HYPHOMYCETES』（1971年）および 『MORE DEMATIA
CEOUS HYPHOMYCETES』（1976年）に報告されている多く
の既知菌株と比較検討した。その結果、本菌株は C. cl
adosporioides, C. cucumerinum, C. sphaerospermum
などに近い性状を示すことが明かとなったが、種を決定
するには至らなかったので本菌株を「Cladosporium sp.
F-5430」 と命名した。
【００１９】ＮＧ−２０３の生産は、大略一般の発酵生
成物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地
で Cladosporium sp. F-5430を好気的条件下で培養する
ことにより行う。
成物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地
で Cladosporium sp. F-5430を好気的条件下で培養する
ことにより行う。
【００２０】培地は主として液体培地を用い、炭素源、
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは６前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティー・
リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混合
して用いる。無機塩としては、例えば燐酸一カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムな
どを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としてはアデ
カノール、シリコン化合物などを用いることができる。
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは６前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティー・
リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混合
して用いる。無機塩としては、例えば燐酸一カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムな
どを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としてはアデ
カノール、シリコン化合物などを用いることができる。
【００２１】培養方法としては振盪培養、通気撹拌培養
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
０℃で３〜５日間、望ましくはｐＨ５〜７、２５〜２７
℃で４日間培養する。この培養により生産されたＮＧ−
２０３を単離するには、発酵生産物を採取する一般的な
方法に準じて行えばよい。
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
０℃で３〜５日間、望ましくはｐＨ５〜７、２５〜２７
℃で４日間培養する。この培養により生産されたＮＧ−
２０３を単離するには、発酵生産物を採取する一般的な
方法に準じて行えばよい。
【００２２】すなわち、培養終了後、遠心分離または濾
過により分離した菌体からＮＧ−２０３を低級アルコー
ル、アセトンなどの有機溶媒で抽出し、この抽出液を減
圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、ベンゼ
ン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、こ
れを減圧濃縮してシロップ状とする。このシロップを再
度酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、メ
タノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルを用いた
カラムクロマトグラフィー、逆相分配用シリカゲルＯＤ
Ｓを充填したカラムクロマトグラフィー及び高速液体ク
ロマトグラフィーに付すことによりＮＧ−２０３を精
製、単離することができる。
過により分離した菌体からＮＧ−２０３を低級アルコー
ル、アセトンなどの有機溶媒で抽出し、この抽出液を減
圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、ベンゼ
ン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、こ
れを減圧濃縮してシロップ状とする。このシロップを再
度酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、メ
タノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルを用いた
カラムクロマトグラフィー、逆相分配用シリカゲルＯＤ
Ｓを充填したカラムクロマトグラフィー及び高速液体ク
ロマトグラフィーに付すことによりＮＧ−２０３を精
製、単離することができる。
【００２３】以上の精製によって得られた本発明の目的
物質であるＮＧ−２０３は、その分子量、紫外線吸収ス
ペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、13Ｃ−ＮＭＲスペ
クトル等の解析結果より式Ｉのように構造式が決定され
た。
物質であるＮＧ−２０３は、その分子量、紫外線吸収ス
ペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、13Ｃ−ＮＭＲスペ
クトル等の解析結果より式Ｉのように構造式が決定され
た。
【００２４】ＮＧ−２０３の理化学的性質は以下の通り
である。
である。
【００２５】（ａ）ＨＲＥＩマススペクトル 実測値 ３２８．２０３５ 理論値 ３２８．２０３８ （Ｃ21Ｈ28Ｏ3として計
算） （ｂ）ＥＩマススペクトル： ＥＩ ｍ／ｚ ３２８ （Ｍ+） （ｃ）ＣＩマススペクトル： ＣＩ ｍ／ｚ ３２９ （Ｍ＋Ｈ+） （ｄ）分子量： ３２８ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２０５ｎｍ（ε＝１９００） ２４５ｎｍ（ε＝３２００） （メタノール溶液中で測定） （ｆ）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定し
た結果を図１に示す。 （ｇ）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ3中、４００Ｍ
Ｈｚで測定した結果を図２に示す。 （ｈ）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ3中、１００
ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。 （ｉ）溶剤に対する溶解性：ヘキサン、クロロホルム、
酢酸エチルに可溶 エタノ−ル、メタノ−ルに難溶 水に不溶 （ｊ）呈色反応； 陽性：Ｈ2ＳＯ4、Ｉ2 陰性：ニンヒドリン、ＦｅＣｌ3 （ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：中性 （ｌ）物質の色：白色粉末
算） （ｂ）ＥＩマススペクトル： ＥＩ ｍ／ｚ ３２８ （Ｍ+） （ｃ）ＣＩマススペクトル： ＣＩ ｍ／ｚ ３２９ （Ｍ＋Ｈ+） （ｄ）分子量： ３２８ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２０５ｎｍ（ε＝１９００） ２４５ｎｍ（ε＝３２００） （メタノール溶液中で測定） （ｆ）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定し
た結果を図１に示す。 （ｇ）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ3中、４００Ｍ
Ｈｚで測定した結果を図２に示す。 （ｈ）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ3中、１００
ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。 （ｉ）溶剤に対する溶解性：ヘキサン、クロロホルム、
酢酸エチルに可溶 エタノ−ル、メタノ−ルに難溶 水に不溶 （ｊ）呈色反応； 陽性：Ｈ2ＳＯ4、Ｉ2 陰性：ニンヒドリン、ＦｅＣｌ3 （ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：中性 （ｌ）物質の色：白色粉末
【００２６】
【発明の効果】ＮＧＦは、ある種の神経細胞の生存・機
能維持を担っており、変性修復・保護作用を有してい
る。本発明の化合物ＮＧ−２０３は、ＮＧＦ産生促進活
性を示すばかりでなく、それ自身による培養大脳皮質神
経細胞の生存延長活性をも示している。従って、ＮＧ−
２０３は、生体内で、直接、間接に神経細胞に働き、神
経変性に伴う神経障害の改善・治療効果を示すことが期
待される。例えば、外傷性、アルコールや抗癌剤などの
薬剤性、炎症性、糖尿病などに見られる代謝性、さらに
は特発性の末梢性神経変性に伴う症状・疾患の改善・治
療薬として用いることができる。また、中枢性神経変性
に伴う症状・疾患、例えば、アルツハイマー型及び脳血
管性痴呆、ダウン症候群、パーキンソン病、ハンチント
ン舞踏病、脳虚血・脳梗塞・脳出血・頭部外傷などの後
遺症、健忘症、脊髄性神経麻ひ症などの改善・治療薬と
しても用いることができる。
能維持を担っており、変性修復・保護作用を有してい
る。本発明の化合物ＮＧ−２０３は、ＮＧＦ産生促進活
性を示すばかりでなく、それ自身による培養大脳皮質神
経細胞の生存延長活性をも示している。従って、ＮＧ−
２０３は、生体内で、直接、間接に神経細胞に働き、神
経変性に伴う神経障害の改善・治療効果を示すことが期
待される。例えば、外傷性、アルコールや抗癌剤などの
薬剤性、炎症性、糖尿病などに見られる代謝性、さらに
は特発性の末梢性神経変性に伴う症状・疾患の改善・治
療薬として用いることができる。また、中枢性神経変性
に伴う症状・疾患、例えば、アルツハイマー型及び脳血
管性痴呆、ダウン症候群、パーキンソン病、ハンチント
ン舞踏病、脳虚血・脳梗塞・脳出血・頭部外傷などの後
遺症、健忘症、脊髄性神経麻ひ症などの改善・治療薬と
しても用いることができる。
【００２７】
【実施例】以下、実施例及び試験例を示し、本発明を更
に詳細に説明する。
に詳細に説明する。
【００２８】実施例 １００ｍｌ当りグルコース２ｇ、肉エキス０．３ｇ、塩
化ナトリウム０．３ｇ、オ−トミ−ル２．０ｇ、硫酸第
二鉄０．０４ｇ、塩化マンガン０．０４ｇ、炭酸カルシ
ウム０．３ｇからなるｐＨ７の無菌液体培地にCladospo
rium sp. F-5430株を接種し、２６℃、９６時間振盪培
養した。次に１５０Ｌ容培養ジャーファ−メンタ−１基
を用いて、種培養と同じ組成の無菌培地１２０Ｌに前記
種培養液１Ｌを接種し２６℃、９６時間撹拌通気培養し
た。
化ナトリウム０．３ｇ、オ−トミ−ル２．０ｇ、硫酸第
二鉄０．０４ｇ、塩化マンガン０．０４ｇ、炭酸カルシ
ウム０．３ｇからなるｐＨ７の無菌液体培地にCladospo
rium sp. F-5430株を接種し、２６℃、９６時間振盪培
養した。次に１５０Ｌ容培養ジャーファ−メンタ−１基
を用いて、種培養と同じ組成の無菌培地１２０Ｌに前記
種培養液１Ｌを接種し２６℃、９６時間撹拌通気培養し
た。
【００２９】培養終了後吸引濾過により上澄液と菌体に
分けた。得られた菌体をアセトン１５Ｌで２回抽出し、
この抽出液を合わせ、減圧下溶媒留去後得られた水層を
酢酸エチル５Ｌで３回抽出し、この抽出液を合わせ無水
硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し褐色のシロッ
プ状物質８５ｇを得た。
分けた。得られた菌体をアセトン１５Ｌで２回抽出し、
この抽出液を合わせ、減圧下溶媒留去後得られた水層を
酢酸エチル５Ｌで３回抽出し、この抽出液を合わせ無水
硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し褐色のシロッ
プ状物質８５ｇを得た。
【００３０】この褐色シロップ状物質３０ｇをクロロホ
ルムに溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［ワ
コーゲルＣ−２００（和光純薬社製）］の１Ｌのカラム
に吸着させた。クロロホルム２．８Ｌで洗浄後、この区
分を除去した。さらにクロロホルム２．４Ｌで溶出を行
い、この分画を減圧乾固し褐色物質６．２ｇを得た。
ルムに溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［ワ
コーゲルＣ−２００（和光純薬社製）］の１Ｌのカラム
に吸着させた。クロロホルム２．８Ｌで洗浄後、この区
分を除去した。さらにクロロホルム２．４Ｌで溶出を行
い、この分画を減圧乾固し褐色物質６．２ｇを得た。
【００３１】この褐色物質を少量のメタノ−ルに溶解
し、逆相分配用シリカゲルのクロマトレックス（富士デ
ヴィソン化学社製）の４００ＭＬのカラムに吸着させ
た。６０％メタノ−ルで溶出し、得られた活性区分を集
め減圧乾固し褐色物質２００ｍｇを得た。この褐色物質
をメタノ−ルに溶解し、この溶液を６０％メタノ−ルを
移動相とした分取高速液体クロマトグラフィ−［使用装
置：ウオ−タ−ズ社製Ｍ６００Ｅ型；カラム：センシュ
−パックＯＤＳ−４２５１−Ｎ（１０φ×２５０ｍ
ｍ）］を用い、ＵＶ吸収２４５ｎｍでモニタ−しながら
流速４．５ｍｌ／ｍｉｎ条件で１１．０〜１２．０ｍｉ
ｎに溶出されるピ−クを分取した。得られた区分を合わ
せ減圧濃縮乾固してＮＧ−２０３の白色粉末３５ｍｇを
得た。
し、逆相分配用シリカゲルのクロマトレックス（富士デ
ヴィソン化学社製）の４００ＭＬのカラムに吸着させ
た。６０％メタノ−ルで溶出し、得られた活性区分を集
め減圧乾固し褐色物質２００ｍｇを得た。この褐色物質
をメタノ−ルに溶解し、この溶液を６０％メタノ−ルを
移動相とした分取高速液体クロマトグラフィ−［使用装
置：ウオ−タ−ズ社製Ｍ６００Ｅ型；カラム：センシュ
−パックＯＤＳ−４２５１−Ｎ（１０φ×２５０ｍ
ｍ）］を用い、ＵＶ吸収２４５ｎｍでモニタ−しながら
流速４．５ｍｌ／ｍｉｎ条件で１１．０〜１２．０ｍｉ
ｎに溶出されるピ−クを分取した。得られた区分を合わ
せ減圧濃縮乾固してＮＧ−２０３の白色粉末３５ｍｇを
得た。
【００３２】試験例１ ［ＮＧＦ産生促進作用試験］ ＮＧＦ産生促進作用は、以下の方法を用いて評価した。 （検体）実施例で得られた白色粉末をＤＭＳＯに溶解
し、ＮＧ−２０３を０．６ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ
とした。 （試験細胞）マウス前脳由来アストログリア細胞（ＮＧ
Ｆ産生細胞）
し、ＮＧ−２０３を０．６ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ
とした。 （試験細胞）マウス前脳由来アストログリア細胞（ＮＧ
Ｆ産生細胞）
【００３３】（試験方法）マウス前脳より調製したアス
トログリア細胞を、２０％牛胎児血清、１００ユニット
／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシ
ンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社
製、高グルコース含有）にて、８×１０5細胞／ｍｌに
調製し、９６孔プレート（培養孔あたりの面積0.32c
m2、ファルコン社製）へ０．１ｍｌ／孔ずつまき、３７
℃、５％ＣＯ2 で培養した。７２時間後、培地を除き、
新たに０．５％牛アルブミン粉末（アーマー社製）、１
００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌスト
レプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地
０．１ｍｌ／孔を加えた後、３７℃、５％ＣＯ2 で培養
した。７２時間後、各種濃度の検体を含む上記培地０．
１ｍｌ／孔と交換した。ここで、本発明化合物はＤＭＳ
Ｏに溶解し、最終濃度が下記表２に示す各種濃度となる
ように添加した。なお、比較として、ＤＭＳＯのみを加
えた培地（対照）も調製した。
トログリア細胞を、２０％牛胎児血清、１００ユニット
／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシ
ンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社
製、高グルコース含有）にて、８×１０5細胞／ｍｌに
調製し、９６孔プレート（培養孔あたりの面積0.32c
m2、ファルコン社製）へ０．１ｍｌ／孔ずつまき、３７
℃、５％ＣＯ2 で培養した。７２時間後、培地を除き、
新たに０．５％牛アルブミン粉末（アーマー社製）、１
００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌスト
レプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地
０．１ｍｌ／孔を加えた後、３７℃、５％ＣＯ2 で培養
した。７２時間後、各種濃度の検体を含む上記培地０．
１ｍｌ／孔と交換した。ここで、本発明化合物はＤＭＳ
Ｏに溶解し、最終濃度が下記表２に示す各種濃度となる
ように添加した。なお、比較として、ＤＭＳＯのみを加
えた培地（対照）も調製した。
【００３４】各種培地にて２４時間培養した後、培地中
のＮＧＦ濃度を酵素免疫測定法［古川ら： ジャ−ナル
オブ ニュ−ロケミストリ−、第４０巻、第７３４頁
〜第７４４頁、（１９８４年）］によって測定した。本
発明化合物のＮＧＦ産生促進活性は、対照（ＤＭＳＯ）
のＮＧＦ量を１．０としたときの比で表した。
のＮＧＦ濃度を酵素免疫測定法［古川ら： ジャ−ナル
オブ ニュ−ロケミストリ−、第４０巻、第７３４頁
〜第７４４頁、（１９８４年）］によって測定した。本
発明化合物のＮＧＦ産生促進活性は、対照（ＤＭＳＯ）
のＮＧＦ量を１．０としたときの比で表した。
【００３５】（結果）結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】試験例２ ［神経栄養因子作用試験］ 神経栄養因子作用は、以下の方法を用いて評価した。 （検体）実施例で得られた白色粉末をＤＭＳＯに溶解
し、ＮＧ−２０３を１０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌと
した。 （試験細胞）胎生１８日ラット大脳皮質由来神経細胞
し、ＮＧ−２０３を１０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌと
した。 （試験細胞）胎生１８日ラット大脳皮質由来神経細胞
【００３８】（試験方法）試験細胞を、２０％牛胎児血
清を含有するダルベッコの最少必須培地（ギブコ社製）
及びハムＦ−１２培地（ギブコ社製）を等量混合したＤ
Ｆ培地にて、３．２×１０6細胞／ｍｌに調製し、ポリ
エチレンイミンを塗布した２４孔プレ−ト（培養孔あた
りの面積２cm2、コーニング社製）へ、０．５ｍｌ／孔
ずつまき、３７℃、５％ＣＯ2 で培養した。２４時間
後、培地を除き、新たに各種濃度の検体、５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、２０ｆｍ
ｏｌｅ／ｍｌプロゲステロンを含有する無血清の上記Ｄ
Ｆ培地０．５ｍｌ／孔を加えた。ここで、本発明化合物
はＤＭＳＯに溶解し、最終濃度が下記表３に示す各種濃
度となるように添加した。なお、比較として、ＤＭＳＯ
のみを加えた培地も調製した。各種培地にて７２時間培
養後、培養液を除き、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し
たＭＴＴ （3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphe
nyl Tetrazolium Bromide 、シグマ社製）溶液０．２ｍ
ｌ／孔を加えた。４時間放置後、ＭＴＴ溶液を除き、Ｄ
ＭＳＯ（０．２ｍｌ／孔）にて反応生成物を抽出し、吸
光度測定（波長：５１０ｎｍ）により定量した。
清を含有するダルベッコの最少必須培地（ギブコ社製）
及びハムＦ−１２培地（ギブコ社製）を等量混合したＤ
Ｆ培地にて、３．２×１０6細胞／ｍｌに調製し、ポリ
エチレンイミンを塗布した２４孔プレ−ト（培養孔あた
りの面積２cm2、コーニング社製）へ、０．５ｍｌ／孔
ずつまき、３７℃、５％ＣＯ2 で培養した。２４時間
後、培地を除き、新たに各種濃度の検体、５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、２０ｆｍ
ｏｌｅ／ｍｌプロゲステロンを含有する無血清の上記Ｄ
Ｆ培地０．５ｍｌ／孔を加えた。ここで、本発明化合物
はＤＭＳＯに溶解し、最終濃度が下記表３に示す各種濃
度となるように添加した。なお、比較として、ＤＭＳＯ
のみを加えた培地も調製した。各種培地にて７２時間培
養後、培養液を除き、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し
たＭＴＴ （3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphe
nyl Tetrazolium Bromide 、シグマ社製）溶液０．２ｍ
ｌ／孔を加えた。４時間放置後、ＭＴＴ溶液を除き、Ｄ
ＭＳＯ（０．２ｍｌ／孔）にて反応生成物を抽出し、吸
光度測定（波長：５１０ｎｍ）により定量した。
【００３９】本発明化合物の神経栄養因子活性は、対照
（ＤＭＳＯ）の吸光度を１．０としたときの比で表し
た。 （結果）結果を表３に示す。
（ＤＭＳＯ）の吸光度を１．０としたときの比で表し
た。 （結果）結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【図１】臭化カリウム錠中で測定したＮＧ−２０３の赤
外線吸収スペクトルを示す。
外線吸収スペクトルを示す。
【図２】ＣＤＣｌ3中、４００ＭＨｚで測定したＮＧ−
２０３の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
２０３の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】ＣＤＣｌ3中、１００ＭＨｚで測定したＮＧ−
２０３の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
２０３の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 溝部 文夫 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 酒井 則義 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 花田 和紀 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内
Claims (1)
- 【請求項１】 式 で表されるプレグナ―７―エン−３，６，２０―トリオ
ン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4324087A JPH06172378A (ja) | 1992-12-03 | 1992-12-03 | ステロイド化合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4324087A JPH06172378A (ja) | 1992-12-03 | 1992-12-03 | ステロイド化合物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06172378A true JPH06172378A (ja) | 1994-06-21 |
Family
ID=18162013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4324087A Pending JPH06172378A (ja) | 1992-12-03 | 1992-12-03 | ステロイド化合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06172378A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009520006A (ja) * | 2005-12-20 | 2009-05-21 | トロフォ | コレスト−４−エン−３−オンオキシムの新規誘導体、それを含む医薬組成物及び製造方法 |
-
1992
- 1992-12-03 JP JP4324087A patent/JPH06172378A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009520006A (ja) * | 2005-12-20 | 2009-05-21 | トロフォ | コレスト−４−エン−３−オンオキシムの新規誘導体、それを含む医薬組成物及び製造方法 |
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