JPH06128264A

JPH06128264A - Ｎｇｆ作用増強因子

Info

Publication number: JPH06128264A
Application number: JP4274616A
Authority: JP
Inventors: Yuriko Orii; 由利子折居; Yoji Kawamura; 洋治河村; Fumio Mizobe; 文夫溝部; Noriyoshi Sakai; 則義酒井; Kazunori Hanada; 和紀花田
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-10-13
Filing date: 1992-10-13
Publication date: 1994-05-10

Abstract

(57)【要約】【目的】ＮＧＦ様作用及びＮＧＦの作用増強効果を有す
る新規な生理活性物質を提供し、アルツハイマー型老年
痴呆あるいは脳卒中後遺症の治療薬として用いる際の投
与方法を簡便にすることにある。【構成】式

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は神経成長因子（以下、Ｎ
ＧＦと称する。）様作用とその作用増強効果を有する
新規な生理活性物質に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年増えつつあるアルツハイマー型老年
痴呆においては、大脳基底核神経細胞であるアセチルコ
リン作動性神経の変性、脱落が、記憶障害、知的活動低
下に深く係わっていることが示唆されている［ウィット
ホースら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２１５巻、
第１２３７頁（１９８２年）］。

【０００３】ＮＧＦは、繊維切断によるアセチルコリン
作動性神経の変性、脱落を抑制すること［コーシング
ら、ニューロサイエンスレター（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ
ｎｃｅＬｅｔｔ．）第６６巻、第１７５頁（１９８６
年）］及び老齢ラットの迷路学習障害を改善すると共に
アセチルコリン作動性神経細胞の萎縮を抑制することが
報告されている［茂野卓ら、医学のあゆみ第１４５
巻、第５７９頁（１９８６年）］。これらからＮＧＦが
アルツハイマー型老年痴呆の治療薬となりうることが示
唆される。

【０００４】一方、ＮＧＦは、脳虚血スナネズミの海馬
神経細胞脱落を防ぐことも確かめられており、脳卒中後
遺症治療薬としても有用である。

【０００５】また、本発明のＮＧＦ作用増強因子は、こ
れらと同一の物理化学的性質、および生理活性作用を有
する物質の存在は知られていない新規な物質である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＮＧＦ様の神経細胞保
護活性を示す生体成分は、いくつか発見されているが、
ＮＧＦも含めそのいずれもがタンパク質である。タンパ
ク質はアルツハイマー型老年痴呆あるいは脳卒中後遺症
治療薬として用いる際、その物状から判断すると直接脳
室内投与が必要となることが予想されるため、より簡単
な投与方法が可能な治療薬が望まれている。

【０００７】本発明の目的は、ＮＧＦ様作用及びＮＧＦ
の作用増強効果を有する新規な生理活性物質を提供し、
アルツハイマー型老年痴呆あるいは脳卒中後遺症の治療
薬として用いる際の投与方法を簡便にすることにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために多数の菌株を土壌より分離し、その菌株
の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株
が、ＮＧＦ作用増強効果を有する新規な生理活性物質を
生産することを見いだし本発明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、式（Ｉ）

【００１０】

【００１１】で表される化合物（以下、ＮＧ−１２９と
略称する。）である。

【００１２】本発明のＮＧ−１２９を生産する菌株は、
本発明者らが、埼玉県大宮市吉野町にて採取した落葉か
ら新たに分離した菌株であり、微生物の名称 Stachybo
trysparvispora F-4708 および微生物寄託番号「微工
研条寄第１２６６０号（ＦＥＲＭＰ−１２６６
０）」として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。

【００１３】次に、この菌株の菌学的性状を以下に示
す。［形態］本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、オ
−トミ−ル寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地等で良好に生育
し、また胞子の形成も良好である。本菌株がバレイショ
・ブドウ糖寒天培地上、２６℃、１４日間の培養で形成
したコロニ−を光学顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を
有し高度に分岐しており、ロープ状の菌糸束を多数形成
している。分生子柄は菌糸束から側生し、単生か稀に分
岐する。表面は滑面、無色で隔壁を有し、先端付近に脱
落性の顆粒が多数付着している。高さは４５〜８３μ
ｍ、幅は基部で２．９〜４．８μｍ、先端付近ではやや
先細りとなり１．７〜２．９μｍである。フィアライド
は分生子柄の先端に複数個形成され、棍棒形、表面は滑
面、大きさは６．７〜１１．４×２．９〜４．８μｍ
（膨潤部）である。分生子は長円形、暗灰緑色、大きさ
は３．８〜５．９×２．７〜２．９μｍ、フィアライド
の先端で粘球状の塊となる。また、走査型電子顕微鏡で
分生子の表面を観察すると、わずかに粗面を呈してい
る。

【００１４】なお、培養を３週間に延長したが有性生殖
器官の形成は認められなかった。

【００１５】［培地上での諸性状］各種培地上で、２６
℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果を次の表１
に示した。なお色の表示は日本規格協会、ＪＩＳ色名帳
（１９８５）の系統色名を引用した。

【００１６】

【表１】

【００１７】［生理的性質］１）生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ４〜１
０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。２）生育温度範囲及び最適温度本菌株はｐＨ６．０のサブロ−液体培地において、１２
〜３１℃の範囲で生育し、最適温度は２４〜２７℃であ
る。３）好気性，嫌気性の区別；好気性

【００１８】以上の形態的特徴および培養上の性状か
ら、本菌株が不完全菌亜門、Stachy-botrys 属の１菌
種であることが明らかであり、宇田川俊一、椿啓介
編『菌類図鑑』（1978年）、M. B. Ellis 著『DEMATI
ACEOUS HYPHOMYCETES』（1971年）および『MORE DEMAT
IACEOUS HYPHOMYCETES』（1976年）、Jong and Davis,
YCOTAXON 第３巻, Ｐ４０９−Ｐ４８５（1976年）に報
告されている多くの既知菌株と比較検討した。その結
果、本菌株は Stachybotrys parvispora hughesに最も
近い性状を示すことが明かとなり、本菌株を「Stachybo
trys parvisporaF-4708」と命名した．

【００１９】ＮＧ−１２９の生産は、大略一般の発酵生
成物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地
で Stachybotrys parvispora F-4708 を好気的条件下で
培養することにより行う。

【００２０】培地は主として液体培地を用い、炭素源、
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは６前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混
合して用いる。無機塩としては、例えば燐酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウ
ムなどを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としては
アデカノール、シリコン化合物などを用いることができ
る。

【００２１】培養方法としては振盪培養、通気撹拌培養
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
０℃で３〜５日間、望ましくはｐＨ５〜７、２５〜２７
℃で４日間培養する。この培養により生産されたＮＧ−
１２９を単離するには、発酵生産物を採取する一般的な
方法に準じて行えばよい。

【００２２】すなわち、培養終了後、遠心分離または濾
過により分離した菌体及び上澄液からＮＧ−１２９を低
級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出し、この
抽出液を減圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチ
ル、ベンゼン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に
転溶し、これを減圧濃縮してシロップ状とする。このシ
ロップを再度酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、ア
セトン、メタノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲ
ルを用いたカラムクロマトグラフィー、逆相分配用シリ
カゲルＯＤＳを充填した高速液体クロマトグラフィー及
びゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付すことにより
ＮＧ−１２９を精製、単離することができる。

【００２３】以上の精製によって得られた本発明の目的
物質であるＮＧ−１２９は、その分子量、紫外線吸収ス
ペクトル、 ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル、¹³Ｃ−ＮＭＲスペ
クトル等の解析結果より化２のように構造式が決定され
た。

【００２４】ＮＧ−１２９の理化学的性質は以下の通り
である。（ａ）ＨＲＥＩマススペクトル実測値４４１．２５１５理論値４４１．２５１５（Ｃ₂₆Ｈ₃₅ＮＯ₅として
計算）（ｂ）ＥＩマススペクトル：ＥＩｍ／ｚ４４１（Ｍ⁺）（ｃ）分子量：４４１（ｄ）分子式：Ｃ₂₆Ｈ₃₅ＮＯ₅ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２１５ｎｍ（ε＝３５３００）２５８ｎｍ（ε＝８１００）３０４ｎｍ（ε＝３１００）（メタノール溶液中で測定）（ｆ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ₃中、４００Ｍ
Ｈｚで測定した結果を図１に示す。（ｇ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ₃中、１００
ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。（ｈ）ＩＲ吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定し
た結果を図３に示す。（ｉ）溶剤に対する溶解性：メタノ−ル、エタノ−ル、
アセトンに可溶ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶水に不溶（ｊ）呈色反応；陽性：Ｈ₂ＳＯ₄、Ｉ₂、ＦｅＣｌ₃ 陰性：ニンヒドリン（ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性（ｌ）物質の色：白色粉末

【００２５】

【発明の効果】ＮＧＦ様作用及びＮＧＦ作用増強効果を
有する本発明の化合物ＮＧ−１２９は、アルツハイマ
ー型老年痴呆などの抗痴呆薬及び脳卒中後遺症治療薬と
して有用である。

【００２６】

【実施例】以下、実施例及び試験例を示し、本発明を更
に詳細に説明する。

【００２７】実施例１００ｍｌ当りグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５
ｇ、酵母エキス０．２ｇ、リン酸一カリウム０．１ｇ、
硫酸マグネシウム０．０５ｇからなるｐＨ６の無菌液体
培地に Stachybotrys sp．F-4708株を接種し、２６℃、
９６時間振盪培養した。次に５０Ｌ容培養ジャー３基及
び２００Ｌ容培養タンクを用いて、種培養と同じ組成の
無菌培地２１０Ｌに前記種培養液２．１Ｌを接種し２６
℃、９６時間撹拌通気培養した。培養終了後遠心分離機
で上澄液と菌体に分離した。得られた上澄液をＨＰ−２
０（商品名、三菱化成社製）の１０Ｌカラムに通過吸着
させた。水５Ｌでカラムを洗浄後、アセトン３０Ｌで溶
出し、これを濃縮後その濃縮液を半量の酢酸エチルで４
回抽出した。また、遠心分離により得られた菌体をアセ
トンで２回抽出し、これを減圧濃縮してアセトンを除去
した後、半量の酢酸エチルで４回抽出した。この抽出液
を合わせ無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し
褐色シロップ２８４．６ｇを得た。

【００２８】この褐色シロップ状物質をクロロホルムに
溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［ワコーゲ
ルＣ−２００（商品名、和光純薬社製）］の８Ｌカラム
に吸着させた。クロロホルムで洗浄後、クロロホルム−
メタノール（９８：２）の混合溶媒で溶出し、この区分
を除去した。次にクロロホルム−メタノ−ル（９６：
４）の混合溶媒で溶出を行い、それを減圧乾固し褐色物
質５０ｇを得た。

【００２９】シリカゲルカラム精製で得られた褐色物質
を少量のヘキサンーアセトン（９０：１０）の混合溶媒
に溶解し、ヘキサンーアセトン（９０：１０）の混合溶
媒で調製したシリカゲル［ワコーゲルＣ−２００（商品
名、和光純薬社製）］のカラム１Ｌに吸着させた。ヘキ
サンーアセトン（９０：１０、８５：１５、８０：２
０）の混合溶媒で順次溶出しこの区分を除去した。次に
ヘキサンーアセトン（５０：５０）の混合溶媒で溶出を
行い、この区分を減圧乾固し褐色物質２．３８ｇを得
た。

【００３０】この褐色物質を少量のクロロホルムーメタ
ノール（１：１）の混合溶媒に溶解し、セファデックス
ＬＨ−２０（商品名：ファルマシア社製）を用いクロロ
ホルムーメタノ−ル（１：１）の混合溶媒でゲル濾過
し、得られた活性区分を集め減圧乾固し褐色物質１．６
５ｇを得た。

【００３１】ゲル濾過で得られた褐色物質をアセトニト
リルに溶解し、この溶液を５５％アセトニトリルを移動
相とした分取高速液体クロマトグラフィ−［使用装置：
センシュ−科学社製３１１０；カラム：センシュ−パッ
クＯＤＳ−４２５１−Ｎ（２０φ＊２５０ｍｍ）］を用
い、ＵＶ吸収２１５ｎｍでモニタ−しながら流速１０ｍ
ｌ／ｍｉｎ条件で１８．０〜２１．０ｍｉｎに溶出され
るピ−クを分取した。この区分を減圧濃縮乾固してＮＧ
−１２９の粗精製粉末１．０ｇを得た。

【００３２】ＮＧ−１２９の粗精製粉末を少量のクロロ
ホルムーヘキサン（１：５）の混合溶媒に溶解し、クロ
ロホルムーヘキサン（１：５）の混合溶媒で調製したシ
リカゲル［ワコーゲルＣ−２００（商品名、和光純薬社
製）］のカラム３００ｍｌに吸着させた。クロロホルム
ーメタノールーヘキサン（１：０：５、１．５：０：
０．５、２：０：５）の混合溶媒で順次溶出し、この区
分を除去した。次にクロロホルムーメタノールーヘキサ
ン（２：０．５：５）の混合溶媒で溶出を行い、この区
分を減圧濃縮乾固しＮＧ−１２９の白色粉末５３６ｍｇ
を得た。

【００３３】試験例１［ＮＧＦ作用増強効果試験］ＮＧＦ作用増強効果は、ＰＣ−１２細胞の突起伸張で評
価した。

【００３４】ＰＣ−１２細胞は、ＮＧＦに反応して神経
突起の伸張、神経伝達物質の生合成に関する酵素活性の
上昇などを示し、神経様細胞へと分化する。この性質を
利用し、本培養細胞へＮＧＦ存在下で本発明化合物を作
用させ、本発明化合物のＮＧＦ作用増強効果を調べた。（検体）実施例で得られたＮＧ−１２９の白色粉末をメ
タノ−ルに溶解し、３００μｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌと
した。（試験細胞）ＰＣ−１２細胞ラット褐色細胞腫（ＮＧＦ応答細胞）

【００３５】（試験方法）ＰＣ−１２細胞を１０％牛胎
児血清、５％馬血清、５０ユニット／ｍｌペニシリン、
５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッ
コ改変イーグル培地（Gibco社製，高グルコース含有）
にて、２×１０⁴細胞／ｍｌに調製し、コラーゲンコー
ト２４孔プレート（培養孔あたりの面積２cm²,Corning
社製）へ、０．５ｍｌ／孔ずつまき、３７℃、５％ＣＯ
₂で培養した。２４時間後、培地を除き、新たにＮＧＦ
（Sigma社製、２．５ｓ）と各種濃度の検体を含む上記
培地０．３ｍｌ／孔を加えた。ここで、ＮＧＦは最終濃
度が０．５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。また、本
発明化合物はメタノールに溶解し、最終濃度が下記表２
に示す各種濃度となるように添加した。なお、比較とし
て、ＮＧＦ，本発明化合物共に加えない培地、本発明化
合物のみ加えない対照培地も調製した。

【００３６】このような各種培地下で４８時間培養した
後、ＰＣ−１２細胞の神経突起の伸張を、顕微鏡下に観
察した。

【００３７】観察結果を細胞の突起長で４段階に分類
し、形態変化のない細胞を０点、突起の伸張を伴わず形
態変化を起こした細胞を１点、細胞体の直径以内の突起
を持つ細胞を２点、細胞体の直径以上の突起を持つ細胞
を３点とし、１００細胞の合計点を突起伸張活性とし
た。（結果）結果を表２に示す。

【００３８】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】臭化カリウム錠中で測定したＮＧ−１２９の赤
外線吸収スペクトルを示す。

【図２】ＣＤＣｌ₃中、４００ＭＨｚで測定したＮＧ−
１２９の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図３】ＣＤＣｌ₃中、１００ＭＨｚで測定したＮＧ−
１２９の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

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【手続補正書】

【提出日】平成４年１０月１４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】本発明のＮＧ−１２９を生産する菌株は、
本発明者らが、埼玉県大宮市吉野町にて採取した落葉か
ら新たに分離した菌株であり、微生物の名称 Stachybo
trysparvispora F-4708 および微生物寄託番号「微工
研菌寄第１２６６０号（ＦＥＲＭＰ−１２６６
０）」として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１０月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２４】ＮＧ−１２９の理化学的性質は以下の通り
である。（ａ）ＨＲＥＩマススペクトル実測値４４１．２５１５理論値４４１．２５１５（Ｃ₂₆Ｈ₃₅ＮＯ₅として
計算）（ｂ）ＥＩマススペクトル：ＥＩｍ／ｚ４４１（Ｍ⁺）（ｃ）分子量：４４１（ｄ）分子式：Ｃ₂₆Ｈ₃₅ＮＯ₅ （ｅ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２１５ｎｍ（ε＝３５３００）２５８ｎｍ（ε＝８１００）３０４ｎｍ（ε＝３１００）（メタノール溶液中で測定）（ｆ）ＩＲ吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定し
た結果を図１に示す。（ｇ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ 3中、４００Ｍ
Ｈｚで測定した結果を図２に示す。（ｈ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：ＣＤＣｌ₃中、１００
ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。（ｉ）溶剤に対する溶解性：メタノ−ル、エタノ−ル、
アセトンに可溶ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶水に不溶（ｊ）呈色反応；陽性：Ｈ₂ＳＯ₄、Ｉ₂、ＦｅＣｌ₃ 陰性：ニンヒドリン（ｋ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性（ｌ）物質の色：白色粉末

フロントページの続き (72)発明者酒井則義東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内 (72)発明者花田和紀東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式で表される化合物。