JPH06174694A - 遺伝子分離検出装置 - Google Patents

遺伝子分離検出装置

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JPH06174694A
JPH06174694A JP4329155A JP32915592A JPH06174694A JP H06174694 A JPH06174694 A JP H06174694A JP 4329155 A JP4329155 A JP 4329155A JP 32915592 A JP32915592 A JP 32915592A JP H06174694 A JPH06174694 A JP H06174694A
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cell
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Hideki Kanbara
秀記 神原
Kazunobu Okano
和宣 岡野
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Abstract

(57)【要約】 【構成】ゲル分離部とそれに密着可能な分画分取部およ
びそれに繋がる反応セルおよび分離検出部からなる。 【効果】アガロース等で分離されたDNAを一括して分
画分取,高感度で分析することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はDNAの分離検出装置に
関する。
【0002】
【従来の技術】従来、遺伝子診断あるいはDNAの分離
分析にはサザンブロット法が用いられてきた(Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA Vol.80,PP278−28
2(1983))。すなわち、検体DNAを酵素切断
し、アガロースゲル電気泳動する。泳動分離後、DNA
をセルロース膜などに転写した後、熱変性させて一本鎖
状でセルロース膜上に固定する。放射性元素等で標識さ
れたDNAプローブを相補配列をもつ部分にハイブリダ
イズ(対合)させ、余剰DNAプローブを洗浄除去す
る。写真フィルムをセルロース膜に密着させ、DNAバ
ンド位置をフィルム上に転写する。DNAバンドの位置
およびパターンから検体DNAの同定や、DNA欠陥の
有無などを調べる。
【0003】DNAプローブの標識には放射性同位元
素,化学発光試薬、あるいは蛍光体などを用いることが
出来るが、感度の高い点から放射性標識が多く用いられ
る。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】従来技術では放射性標
識を用いる点やフィルタに転写するなど面倒な点が多
く、簡便で高感度な手法が望まれていた。
【0005】本発明の目的は放射性標識を用いたブロッ
ティング法に代わる高感度DNA分離検出法を提供する
ことにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明ではアガロースゲ
ルで分離した断片DNAをアガロースゲルに密着して配
備された分画セルアレーに分取する。(この分画セルア
レーの底部には細管が取り付けられており、密集したセ
ルアレーに繋がっている。)この第2のセルアレーの底
面には分子ふるい膜あるいはポリアクリルアミドゲル膜
などが設けられている。細管と第2のセルアレーの底面
には分子ふるい膜を介してキャピラリが装着できる構造
となっている。第2のセルアレーは全体の温度を昇温コ
ントロールできるようになっている。キャピラリ先端
(第2セルアレーと反対側)は第2バッファー液槽に浸
されている。
【0007】アガロースゲル電気泳動分離後、アガロー
スゲル泳動部と第2バッファー槽間に電圧をかけDNA
断片を第2セルアレー中に分取する。DNAプローブを
第2セルアレー中に注入し、ハイブリダイズさせる。余
剰のDNAプローブは分子ふるい膜を通して電気泳動除
去する。次いでハイブリダイズしたDNAプローブを昇
温脱離させ、キャピラリ中に流出させて検出する。
【0008】
【作用】分画部をアガロースゲルに密着した粗いセルア
レーとそれに連結された細かいセルアレーで構成するこ
とによりDNA断片を濃縮して分取できる。細かいセル
アレーは反応管としても利用するが体積が小さいので少
量の試薬の使用で済む。分子ふるい膜はハイブリダイズ
したDNAプローブと遊離DNAプローブの分離に用い
る。ハイブリダイズしたDNAプローブを検出するため
に、細かいセルアレーを昇温し、DNAプローブを検体
から遊離した後、キャピラリ管に導く。キャピラリ管は
内径が小さく、測定されるべきDNAプローブの濃度を
上げることができ、高感度が得られる。
【0009】
【実施例】図1は本発明の一実施例の装置の説明図であ
る。泳動槽1にアガロースゲル3をセットし、試料をサ
ンプルウェル17に注入する。一定時間泳動後電極6,
6′間に電圧をかけ、分画アレーセル(第1セル)中にD
NAを分取する。アガロースゲルの長さは10cmで分取
は1mm間隔で行い100ケの分画セル中にDNAは分散
収納される。分画セルは相互に0.1mm の薄膜フィルム
(ペットフィルム)で区画されている。また、分画セルは
アガロースゲルの底面あるいは側面に密着して設置され
ている。分取されたDNAは細管を通して細かいセル
(第2セル)8に流入する。第2セルは8と9が一体と
なり構成されており、境界には分子ふるい膜を挿入した
り、下部9にポリアクリルアミドゲルを保持したりして
いる。大きなDNAはこの部分を通過できないため8の
部分に溜まることになる。キャピラリ7を第2セルから
取はずし、蛍光標識の付いたDNAプローブを注入す
る。相補的なDNA塩基配列を持つDNAが存在する場
合には、これにハイブリダイズする。バイブリダイズ後
に電界をかけると余剰DNAプローブはバッファ槽16
の方へ流出する。途中のキャピラリ等に吸着するのを防
ぐため、キャピラリ11および計測セル12部は40〜
45℃に加熱してある。余剰DNAプローブを除去した
後、第2セルの温度を60〜70℃に上昇させDNAプ
ローブを脱離させ泳動分離するDNAプローブはその塩
基配列の違いにより標識蛍光体の種類を変化させたり、
DNAプローブの長さそのものを変化させることで識別
しながら検出できる。泳動分離用キャピラリは内径0.
1〜0.2mmの石英管で構成される。検出部は図2に示
したように泳動路と光照射路が直交しており、照射部の
長さは40mmである。この範囲内にキャピラリに接続し
た泳動路を100本確保することができる。すべての泳
動路を同時に照射し、得られる線状蛍光像をラインセン
サあるいは二次元検出器で検出する。励起用レーザとし
てHe−Ne(594nm)を用いた。蛍光体としてテキサ
ス レッド(Texas Red:発光波長615nm)などを
用いることができる。複数のレーザで交互に照射した
り、複数蛍光体を使用して、発光を分光しながら検出す
ることにより、多くのプローブがハイブリダイズするか
否かを一度に調べることができる。この方法では長い検
査対象のDNAは第2セル部に保持されたままとなるの
でプローブの種類を変えてくり返しハイブリダイズさせ
検査できる利点がある。
【0010】計測部のキャピラリの管径は0.1mm とし
た。これによりDNAバンドの体積を小さくでき高感度
が得られる。すなわち、DNAプローブのバンド中は約
0.5mmであり、DNAバンドの体積は約4nlである。
背景光強度は5×10-11 MのTexas Red に相当する信
号を与えたがこの1/20の蛍光強度をS/N〜2以上
で計測することができた。すなわち、1×10-20 モル
のDNAをS/N〜2で計測することができ、これは通
常のブロッティングと同等かそれ以上の検出感度であ
る。
【0011】上記実施例では一次元に分離したDNA断
片を分画し、DNAプローブで検査する例を示したが、
DNA断片を二次元展開して分画して分取し検査しても
よい。
【0012】本発明の他の実施例を、図2を用いて説明
する。長さが10cmのアガロース製の分離用ゲル(他
に、アクリルアミドゲルや、アガロースとアクリルアミ
ドの共重合物等、DNAを分離できる担体であれば、D
NAのサイズ等に応じて使用することができる。)10
1の試料注入部102に試料を注入し、電極105と1
06の間に200vの電圧をかけて泳動する。DNAは
分子サイズの小さいものから順にゲルの陽極側から溶出
する。陽極側の電極槽はDNA溶出用のセルを兼ねてお
り、溶出液槽107の溶出液が液送ポンプ108によ
り、順次、供給される。溶出液はプローブ溶液槽111
の蛍光標識プローブ溶液と合流し、反応槽112で混合
される。蛍光標識プローブは標的となるDNA毎に長さ
や蛍光抗体の種類が変えてあり、複数の標的DNAとハ
イブリダイズできるようにしてある。もちろん1種類の
蛍光標識プローブのみを用いても差し支えないので、本
実施例では試料としてM13mp8の一本鎖DNAとプ
ローブとしてTexas Red(スルホローダミン101 酸塩
化物)で蛍光標識した化1に示す構造のオリゴヌクレオ
チドを用いた。
【0013】
【化1】 CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 反応槽112には温度調節器113が取り付けてあり、
加熱により、分離されたDNAとプローブが変性され
る。反応槽112を通過した反応液は分画分離セル12
0に添加される。各文画分離セルへの反応液の分配は、
移動装置130を用いて液送チューブの先端を移動させ
ることによる。分画分離セル120は温度調整器114
により40〜45℃に温調されており、分離されたDN
Aにプローブがハイブリダイズする。分画分離セル(第
1アレーセル)120は直線あるいは円周上に配置され
たアレー形状をしている。これを前の実施例と同様に細
管を用いて密に配置された分離検出用第2アレーセル1
21と結合し、前記実施例と同様の測定をする。第1ア
レーセルと第2アレーセルの結合はオフライン結合でも
よい。
【0014】第2アレーセルの下部には分離用ゲル12
2が取付けてある。このゲルはゲル濃度が16%で未反
応のプローブは通過するが、分離されたDNAとプロー
ブの複合体は通過しづらい。分離検出用のゲルの温度が
上がらないように泳動すると、未反応のプローブは泳動
されて除かれる。分離されたDNAとプローブの複合体
は第2アレーセルに残る。
【0015】次に、温度調節器114の温度を80℃に
上げ、さらに泳動を行うと、DNAに結合していたプロ
ーブが遊離する。DNAに結合していたプローブは、分
離検出用ゲル中を泳動され、レーザ発信機131から照
射されるレーザビーム132を横切る。この時に発する
蛍光をホトダイオードアレー光検出器133で検出し、
蛍光量をデータ処理装置135で演算処理して求める。
本実施例を用いても、0.01amol のDNAをS/N
=2で検出できた。
【0016】
【発明の効果】本発明ではゲル分離したDNA断片を分
画分取し、小さなセル中に導入してDNAプローブをハ
イブリダイズさせる。このためDNAプローブ等の量を
少なくできる他、DNAプローブ検出部の体積を小さく
できるので微量のDNAプローブを検出することができ
る。すなわち、一次元分離したDNA断片の分離パター
ンをセルロースフィルタに転写して放射性標識されたD
NAプローブを用いてオートラジオクラフィ検出するな
どをすることなく蛍光標識DNAプローブを用いて高感
度に手軽に目的DNAの検出をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施例の説明図。
【図2】本発明の第二の実施例の説明図。
【符号の説明】
1…上部バッファ槽、2…バッファ液、3…アガロース
ゲル分離板、4…分画分取セル、5…泳動分離電圧、
6,6′…分取用電界印加電極、7…細管、8…反応セ
ル、9…分離キャピラリ保持具、10…中間バッファ
液、11…分離用キャピラリ、12…光計測部、13…
レーザ、14…蛍光検出用カメラ、15…データ処理
器、16…下部バッファ液、17…試料注入ウェル。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 8931−4B C12N 15/00 A

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ゲルで分離されたDNA断片を一括して同
    時に分画する手段を有する装置において、DNAの抜き
    取りが分離泳動方向と直交してかけられた電界あるいは
    送液により、分画用アレーセル中に取り込むことにより
    成されることを特徴とする遺伝子分離検出装置。
  2. 【請求項2】請求項1において、前記分画用アレーセル
    が反応セルアレーと連結されている遺伝子分離検出装
    置。
  3. 【請求項3】請求項1または2において、前記反応セル
    アレーの下部にキャピラリ管から成る分離計測部を具備
    する遺伝子分離検出装置。
  4. 【請求項4】請求項1または2において、反応セルの下
    部に平板ゲルからなる分離計測部を具備する遺伝子分離
    検出装置。
  5. 【請求項5】請求項2,3または4において、前記反応
    セル部と前記分離計測部が分子ふるい膜あるいは細かい
    網目のゲルで区分されている遺伝子分離検出装置。
  6. 【請求項6】ゲルで分離されたDNA断片を経時的に分
    画分取する装置において、分画対象を光学的に計測する
    手段を具備することを特徴とする遺伝子分離検出装置。
  7. 【請求項7】請求項6において、分画用アレーセルを具
    備しそれが計測信号と連動する遺伝子分離検出装置。
  8. 【請求項8】請求項6において、分画用アレーセルの底
    部にキャピラリ管からなる分離計測部を装着可能である
    遺伝子分離検出装置。
  9. 【請求項9】請求項2において前記反応セルが温度コン
    トロール手段を具備する遺伝子分離検出装置。
  10. 【請求項10】請求項6において、前記分画用アレーセ
    ルが温度コントロール手段を具備する遺伝子分離検出装
    置。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007524069A (ja) * 2003-09-24 2007-08-23 アジレント・テクノロジーズ・インク フレームを使用した分子の抽出
KR101023040B1 (ko) * 2008-11-13 2011-03-24 한국항공대학교산학협력단 고속 입자분리 장치 및 그 방법

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JP2007524069A (ja) * 2003-09-24 2007-08-23 アジレント・テクノロジーズ・インク フレームを使用した分子の抽出
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