JPH06181781A - 酵素反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 希薄微生物菌体濃度条件下における酵素反応
安定性および目的産物収量の向上。 【構成】 ガラス容器を用い、希薄濃度の微生物菌体お
よび例えば牛血清アルブミン等の蛋白質を存在させて、
例えばアスパルターゼを用いたＬ−アスパラギン酸産生
反応等の酵素反応を行う、酵素反応法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素の反応方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】酵素反応を工業的規模で行うにあたっ
て、菌体当たりの酵素活性の強い、即ち比活性の高い菌
体を用いることは重要な要素である。近年では、遺伝子
操作技術の進歩により、目的酵素遺伝子を高発現化して
比活性の高い菌体が容易に得られるようになった。それ
に伴い、反応液中の高活性菌体の濃度も、低活性菌の濃
度の数十分の一から数百分の一にまで低減することが可
能となった。また、従来から酵素溶液に関して、著しく
希薄な酵素溶液がその活性を速やかに失うこと、および
この活性の喪失は比較的高濃度で他の蛋白質、通常は牛
血清アルブミンを添加することで防止し得ることが知ら
れている。また、蛋白質はガラス容器壁に吸着する傾向
を有しているが、この吸着現象も牛血清アルブミン等の
添加により防止できることは、［例えばロバート・Ｋ・
スコープス著、タンパク質精製法−理論と実際、シュプ
リンガー・フェアラーク東京刊（昭和６０年）、１９３
頁などにより］公知である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これに対し、微生物菌
体自体を反応に用いる際には、可溶性蛋白質が菌体内に
約１００ mg/mlという高濃度で存在することから、菌体
濃度が希薄であっても上記の問題は起こらないと考えら
れてきた。しかし実際には、希薄な菌体濃度において、
高い比活性を有する菌体の反応安定性が、特にガラス容
器を用いた場合に、低活性菌よりも劣る現象が観察され
る。本発明者らはこの問題を解決すべく鋭意研究を重
ね、反応液中に蛋白質を存在させることにより、希薄な
菌体濃度における酵素反応の安定性を向上し得ることを
見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ガラス容器を
用い、反応液中に希薄濃度の微生物菌体および蛋白質を
存在させて酵素反応を行うことにより酵素反応の安定性
を向上させる酵素反応方法を提供する。本発明で言う
“ガラス容器”とは、反応液に接する部分が実質的にガ
ラス製であるような反応容器を意味し、例えば反応容器
が完全にガラス製であるもの、ステンレスの外壁の内部
をガラスで被覆したいわゆるグラスライニング容器、ス
テンレスとガラスとを接ぎ合わせたもの等が含まれる。

【０００５】本発明に用いることのできる蛋白質として
は、目的とする酵素反応に支障を来さない限り特に制限
はないが、通常は牛血清アルブミンまたは鶏卵アルブミ
ン等のアルブミン類、牛または馬由来のラクトグロブリ
ン等のグロブリン類等、畜獣由来の水溶性蛋白質が好適
に用いられる。これらの蛋白質は単独で、もしくは二種
以上組み合わせて存在させることができる。また、蛋白
質の反応液中の濃度は、通常０.１〜５０ g/l、好まし
くは０.１〜３０ g/lである。

【０００６】本発明に用いることのできる酵素反応とし
ては、以下の反応が例示できる。１．Ｌ−アスパラギン酸を産生する反応 アスパルターゼを用いてフマル酸またはその塩、および
アンモニアまたはその塩よりＬ−アスパラギン酸を産生
することができる。アスパルターゼ(EC 4.3.1.1)を産生
する微生物としては、アスパルターゼ活性を有する限り
特に制限はないが、エシェリヒア（Escherichia）属に
属する微生物、例えばエシェリヒア・コリ（E. Coli）
Ｋ−１２系菌株 ATCC27325、同Ｂ系菌株 ATCC11303、同
Ｗ系菌株 ATCC 9637；ブレビバクテリウム(Brevibacter
ium)属に属する微生物、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバム（B. flavum）MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）、
同 MJ-233-AspB（FERM P-12228）等が好適に用いられ
る。該菌株またはその処理物の存在下での上記酵素反応
は、フマル酸またはその塩とアンモニアまたはその塩と
を反応させて行うことができる。該酵素反応は水性溶媒
中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、反応温度
約０〜６０℃、好ましくは約２０〜５０℃で、通常約３
〜４８時間行われる。酵素反応液の組成には、例えばフ
マル酸を０.５〜２モル/１０００ｍｌ、好ましくは１〜
１.５モル/１０００ｍｌ、並びにアンモニアを１〜１０
モル/１０００ｍｌ、好ましくは２〜６モル/１０００ｍ
ｌ含有することができる。その際、該反応液に添加され
るこれら２成分のモル比は、１：１〜５の範囲内である
ことが好ましい。本反応液には、さらに塩化カルシウ
ム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を１〜５０ミリモ
ル/１０００ｍｌ、好ましくは５〜３０ミリモル/１００
０ｍｌの濃度で用いることができる。

【０００７】２．Ｌ−リンゴ酸を産生する反応 フマラーゼを用いてフマル酸またはその塩に水を付加
し、Ｌ−リンゴ酸を産生することができる。フマラーゼ
(EC 4.2.1.2)を産生する微生物としては、例えば、ブレ
ビバクテリウム属（Brevibacterium）、エシェリヒア属
（Escherichia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）
属、プロテウス（Proteus）属等に属する微生物が知ら
れており、ブレビバクテリウム属に属する微生物、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム（B. flavum）MJ-23
3（FERM BP-1497）、同 MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）
が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存在下
での上記酵素反応は、フマル酸またはその塩を水溶液中
で反応させることにより行うことができる。該酵素反応
は水性溶媒中、ｐＨ４〜１０、反応温度約１５〜６０
℃、好ましくは約２０〜５０℃で通常約０.５〜４８時
間行われる。本酵素反応は水溶媒中で行われるが、水の
他にリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の溶媒を１０〜
５００ｍＭの濃度で用いることもできる。また、反応液
のｐＨを４〜１０に調節するために、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等のアルカリ類、および／または塩
酸、硫酸等の無機酸を添加することもできる。酵素反応
液中のフマル酸またはその塩の反応時の使用量には特に
制限はないが、一般には０.５〜３０％（Wt/V）の範囲
で使用するのが好ましい。

【０００８】３．Ｌ−トリプトファンを産生する反応 トリプトファナーゼを用いてインドール、ピルビン酸ま
たはその塩、およびアンモニアおよびその塩からＬ−ト
リプトファンを産生することができる。トリプトファナ
ーゼ(EC 4.1.99.1)を産生する微生物としては、例え
ば、エシェリヒア（Escherichia）属に属するエシェリ
ヒア・コリ（E. Coli）、プロテウス（Proteus）属に属
するプロテウス・レットゲリ（P. rettgeri）、アエロモ
ナス（Aeromonas）属に属するアエロモナス・リケファ
シエンス(A. liquefaciens)が知られており、好適には
エシェリヒア・コリ（E. Coli）が挙げられる。該菌体
またはその処理物の存在下での上記酵素反応は、インド
ール、ピルビン酸またはその塩、およびアンモニアまた
はその塩とを反応させることで行うことができる。該酵
素反応は、０.１Ｍリン酸緩衝液あるいは水溶媒中、ｐ
Ｈ７.５〜１０、反応温度約２０〜５０℃、好ましくは
３０〜４０℃で通常２〜７２時間行われる。反応液中の
インドール；ピルビン酸またはその塩、例えば、ピルビ
ン酸ナトリウム等；およびアンモニアまたはアンモニウ
ムイオン、例えば、塩化アンモニウム等の添加量は特に
制限されないが、通常０.１〜２０％（Wt/V）、好まし
くは０.５〜１０％（Wt/V）である。本反応液中に添加
するインドール/ピルビン酸またはその塩／アンモニア
またはその塩のモル比も、特に制限されないが、通常
１：１〜１００：１〜３００の範囲、好ましくは１：５
〜５０：５〜１００の範囲で使用される。

【０００９】４．Ｌ−チロシンを産生する反応 β−チロシナーゼを用いてフェノールとＬ−セリンまた
はＤＬ−セリンから、あるいはフェノールとピルビン酸
またはその塩とアンモニアまたはその塩からＬ−チロシ
ン産生することができる。β−チロシナーゼ（EC 4.1.9
9.2）を産生する微生物としては、例えば、エシェヒリ
ア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）
属、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、エアロ
バクター（Aerobacter）属、エルビニア（Erwinia）
属、プロテウス（Proteus）属、シトロバクター（Citor
obacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、
サルモネラ（Salmonella）属等に属する微生物が知られ
ており、エシェヒリア（Escherichia）属に属する微生
物が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存在
下での上記酵素反応は、フェノールとＬ−セリンとの反
応、あるいはフェノールとピルビン酸またはその塩とア
ンモニアまたはその塩との反応により行うことができ
る。該酵素反応は、通常の酵素反応と同様に、例えば、
０.１Ｍリン酸緩衝液あるいは水性溶媒中、ｐＨ６.０〜
１０.０、反応温度約２０〜５０℃、好ましくは３０〜
４０℃で通常２〜７２時間行われる。反応中は、撹拌し
続けることが望ましい。本反応液中のフェノール濃度は
特に厳密に限定されるものではないが、反応液における
濃度が常に１.０％（Wt/V）に維持されるように、連続
的または断続的に培地に添加して反応させることが特に
望ましい。また、その総添加量も特に限定されないが、
通常０.１〜１０％（Wt/V）、好ましくは０.５〜５％
（Wt/V）である。基質のＬ−またはＤＬ−セリンあるい
はピルビン酸またはその塩とアンモニアまたはその塩
は、一般には各々０.１〜２０％（Wt/V）の濃度範囲で
使用するのが適当である。

【００１０】５．Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンを
産生する反応 β−チロシナーゼを用いてカテコールとＬ−セリンから
Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンを産生することがで
きる。β−チロシナーゼ（EC 4.1.99.2）を産生する微
生物としては、上記４の反応と同様の微生物を挙げるこ
とができ、エシェヒリア（Escherichia）属に属する微
生物が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存
在下での上記酵素反応は、カテコールとＬ−セリンとの
反応により行うことができる。また、該酵素反応の反応
条件も、上記４の反応と同様である。基質のＬ−または
ＤＬ−セリンの添加濃度は、一般には各々０.１〜２０
％（Wt/V）が好ましい。また、カテコールの添加濃度
は、特に限定されないが、反応液における濃度が常に
１.０％（Wt/V）に維持されるように、連続的または断
続的に培地に添加して反応させることが望ましい。

【００１１】６．Ｌ−アラニンを産生する反応 アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を用いて、Ｌ−アスパラ
ギン酸またはその塩よりＬ−アラニンを生成することが
できる。アスパラギン酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.12）を
産生する微生物としては、例えば、シュードモナス（Ps
eudomonas）属に属するシュードモナス・ダクネー（P. d
acunhae）IAM1152、同 ATCC21192、シュードモナス・プ
チダ（P. putida）IAM1506、同 ATCC21812、シュードモ
ナス・フルオレッセンス(P. fluorescens）IF03081、シ
ュードモナス・アエルギノーサ（P. aeruginosa）IAM10
54 等が知られており、好適にはシュードモナス・ダク
ネー（P. dacunhae）が用いられる。該菌体またはその
処理物の存在下での上記酵素反応は、少なくともＬ−ア
スパラギン酸またはその塩を含有する水性溶媒中、ｐＨ
４.３〜５.０、好ましくは４.５〜４.８、反応温度約２
０〜５０℃、好ましくは４０〜４７℃で通常３〜４８時
間行われる。本反応液に添加されるＬ−アスパラギン酸
またはその塩の添加濃度は０.５〜５０％（Wt/V）、好
ましくは３〜３０％（Wt/V）である。なお、Ｌ−アスパ
ラギン酸は、溶解して存在（溶解状態）しても、粉末で
存在（不溶解状態）していてもよい。本水性溶媒には、
さらにピリドキサール５'−リン酸を０.０００５〜０.
０５％（Wt/V）、好ましくは０.００１〜０.０１％（Wt
/V）添加して用いることができる。さらに必要に応じ
て、ピルビン酸、α−ケト酪酸等のα−ケト酸を０.０
０１〜０.５％（Wt/V）、好ましくは０.０１〜０.１％
（Wt/V）添加することができる。また、本反応液のｐＨ
を調整するためにアルカリ溶液、例えばアンモニア水、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることがで
きる。以上の例示は本発明に従い希薄濃度の微生物菌体
および蛋白質の存在下に行う酵素反応について具体的な
認識を得る一助に過ぎず、本発明の範囲を些かも限定す
るものではない。

【００１２】

【実施例】以下実施例により本発明を具体的に説明す
る。参考例−１ アスパルターゼ含有菌体の調整 培地（尿素０.４％、硫酸アンモニウム１.４％、リン酸
一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム０.０５％、硫
酸マグネシウム・７水塩０.０５％、塩化カルシウム・
２水塩 ２ppm、硫酸第一鉄・７水塩 ２ppm、硫酸マンガ
ン・４〜６水塩２ppm、硫酸亜鉛・７水塩 ２ppm、塩化
ナトリウム ２ppm、ビオチン２００μg/l、チアミン塩
酸１００μg/l、カザミノ酸０.１％、酵母エキス０.１
％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、
滅菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後、ブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３−
ＡＢ−４１（FERM BP-1498）ならびにアスパルターゼ高
活性菌であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡｓｐＢ（FERM P-12228）をそれぞれ植菌し、無菌
的に５０％（Wｔ/V）グルコースを４ｍｌ添加して、３
０℃にて２日間振盪培養を行った。

【００１３】次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２.
３％、リン酸一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム
０.０５％、硫酸マグネシウム・７水塩０.０５％、硫酸
第一鉄・７水塩２０ppm、硫酸マンガン・４〜６水塩２
０ppm、ビオチン２００μg/l、チアミン塩酸１００μg/
l、カザミノ酸０.３％、酵母エキス０.３％）１０００
ｍｌを、２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、滅菌(１２０℃、
２０分)後、５０％（Wt/V）グルコース４０ｍｌと前記
培養物２０ｍｌを添加して、回転数１０００rpm、通気
量１vvm、温度３３℃、ｐＨ７.６にて４８時間培養を行
った。なお、グルコースは培養中培地の濃度が１％（Wt
/V）を越えないように注意しつつ、約１〜２時間ごと断
続的に５０％（Wt/V）グルコースを添加した。培養終了
後、培養物１０００ｍｌから遠心分離して集菌した。

【００１４】参考例−２ アスパルターゼ含有菌体の前
処理 アスパルターゼ含有菌体内にはアスパルターゼの他に副
反応酵素フマラーゼが共存するため、原料のフマル酸が
一部リンゴ酸に変換される問題が生じるので、下記のと
おりフマラーゼ活性の除去処理を行った。上記参考例１
で調製した菌体５０ｇを処理液〔Ｌ−アスパラギン酸１
００ｇ、アンモニア水（２８％アンモニア含有水溶液）
８０ｍｌ、塩化カルシウム２水塩 ５.５ｇ、ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート０.８ｇに蒸留水を
添加して全量１ｌとして調製〕１ｌに懸濁後、５０℃に
て２時間加熱処理を行った。処理物を遠心分離して集菌
し、これをアスパルターゼ含有菌体として使用した。

【００１５】実施例−１ 上記参考例−２で調製した菌体０.２５ｇを０.１Ｍのト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）に懸濁させて全量を１０
０ｍｌとした。該菌体懸濁液２ｍｌと１８ｍｌの酵素反
応液［フマル酸１５０ｇ、アンモニア水（２８％アンモ
ニア含有水溶液）２２０ｍｌ、塩化カルシウム２水塩
２.２ｇ、および表１に示した蛋白質１ｇに蒸留水を添
加して全量９００ｍｌとして調製］を、５０ｍｌ容共栓
付三角フラスコに加えて４５℃で３０時間振とうしなが
ら反応を行った。反応終了後、遠心分離にて菌体を除去
し、上清中の生成Ｌ−アスパラギン酸を高速液体クロマ
トグラフィーにより定量した。その結果を表１に示す。
結果は、蛋白質を存在させずに同様条件で反応を行った
際の生成Ｌ−アスパラギン酸量を１００とする相対値で
示した。なお、反応液中には菌体からの蛋白質の漏洩は
認められなかった。

【００１６】

【表１】

【００１７】実施例−２ 反応液中の菌体濃度を表２に示した各濃度に設定し、且
つ蛋白質として牛血清アルブミンを表２に示した濃度に
設定した以外は実施例−１と同様の条件で反応を行い、
同様に生成Ｌ−アスパラギン酸を定量した。その結果を
表２に示す。結果は、蛋白質を存在させずに同様の条件
で反応を行った際の生成Ｌ−アスパラギン酸量を１００
とする相対値で示した。

【００１８】

【表２】

【００１９】

【発明の効果】上記の試験結果から明らかな如く、本発
明に従い酵素反応液に低濃度の蛋白質を存在させること
により、Ｌ−アスパラギン酸生成量が顕著に増加する。
この結果は、菌体濃度が希薄な場合に、低濃度の蛋白質
の存在でアスパルターゼ酵素反応の安定性が向上したこ
とによりもたらされたものと考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ガラス容器を用い、反応液中に希薄濃度
   の微生物菌体および蛋白質を存在させて酵素反応を行う
   ことを特徴とする、酵素反応方法。
2. 【請求項２】 反応液中の微生物菌体の濃度が０.０１
   〜０.５％（Ｗt／Ｖ）である、請求項１に記載の酵素反
   応方法。
3. 【請求項３】 反応液中の蛋白質の濃度が０.０１〜５
   ％（Ｗt／Ｖ）である、請求項１に記載の酵素反応方
   法。